JPH11509742A

JPH11509742A - シリカ磁気粒子を使用する生物学的目標物質の分離法

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Publication number: JPH11509742A
Application number: JP10534674A
Authority: JP
Inventors: クレイグイースミス; チャールズケイヨーク
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-21
Publication date: 1999-08-31
Anticipated expiration: 2018-01-21
Also published as: DE69817484D1; DK1367137T3; US6027945A; US20040086930A1; JP3253638B2; EP0895546A4; EP0895546B1; EP1367137A1; CA2249393A1; DE69841555D1; EP1367137B1; AU732756B2; BR9805897A; EP0895546A1; WO1998031840A1; US6368800B1; US6673631B1; DE69817484T2; AU6647598A; DE895546T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、シリカ磁気粒子を使用して、媒体中で、その他の物質から、生物学的目標物質、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド分子の様な核酸を単離する為の方法を提供する。本発明方法は、媒体と粒子の混合物中でシリカ磁気粒子と生物学的目標物質の複合体を形成し、外部磁力を使用して混合物から複合体を分離し、複合体から生物学的目標物質を溶出させる事から成る。本発明の方法及びキットで使用される磁気シリカ粒子の好ましい実施態様は、粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇを持つ複合体を形成する事が出来、且つ本発明方法の溶出工程において、複合体から生物学的目標物質の少なくとも６０％を放出する事が出来る。本発明方法は、単離された生物学的目標物質を造り、この物は更なる処理又は分析を妨害し得る混入物、例えば、金属又は高分子物質を実質的に含まない。

Description

【発明の詳細な説明】シリカ磁気粒子を使用する生物学的目標物質の分離法関連出願の相互参照「磁気基体上のシリカ吸着剤」と言う発明の名称の米国特許出願が同時に行われており、ここにその全体を参照として導入する。発明の分野本発明は、媒体中で、他の物質から生物学的目標物質を分離又は単離し、更なる処理又は分析の為に十分な純度の単離物質を製造する方法に関する。本発明は、特に、その物質を可逆的に結合する事の出来る磁気的応答性粒子を使用して、生物学的目標物質を分離又は単離する方法に関する。本発明は、尚詳細には、生物学的目標物質を可逆的に結合するシリカ、又は、シリカゲルの様なシリカ誘導体を含む、少なくと１つの磁気的応答性粒子を使用して、生物学的目標物質を分離又は単離する方法に関する。発明の背景多数の分子生物学的方法、例えば、逆転写、クローニング、制限分析及び配列決定は、生物学的物質の処理又は分析を含む。これらの方法は、一般に、その様な物質には、その様な処理又は分析方法を妨害する混入物が実質的に存在しない事を要求する。その様な混入物としては、一般に、化学反応（例えば、分子生物学的方法で使用される、核酸又はタンパク質ハイブリダイゼーション、酵素的に触媒される反応、及びその他の反応）を妨害又は抑制する物質、対象の核酸又はその他の生物学的物質の劣化又は解重合を触媒する物質、或いは、実際に、核酸が試料中に存在しない場合に、対象の生物学的目標物質の定量サンプル中で存在を示す「背景（バックグランド）」を用意する物質が挙げられる。又、混入物は、対象の核酸物質が単離されるin vivo 又はin vitro媒体からの高分子物質、酵素の様な高分子物質、他のタイプのタンパク質、多糖類、又はポリヌクレオチド、及び脂質の様な低分子量物質、低分子量酵素抑制剤又はオリゴヌクレオチドを含む。また、混入物は、化学品、又は、その他の物質からその物質を単離する為に使用するその他の物質から、目標の生物学的物質中に導入されてくる。この最後のタイプの通常の混入物は、痕跡の金属、染料及び有機溶媒を含む。分子生物学的用途の為に、混入物が殆ど無いＤＮＡ又はＲＮＡを得る事は、ＤＮＡ又はＲＮＡが一般に見出される複雑な系の為に困難なものである。これらの系、例えば、組織からの細胞、血液、リンパ液、ミルク、尿、便、精液等の体液からの細胞、培養中の細胞、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、又は、目標の核酸増幅が行われている溶液は、対象のＤＮＡ又はＲＮＡが、分子生物学的方法に使用される前に単離されなければならない相当量の混入物を含む。細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを得る為の通常の手順は、文献に記載されている。例えば、F.Ausubel et al.，eds.，Curent Protocol in Molecular Biology，Wi ley-Interscience，New York（1993）の二章（ＤＮＡ）及び四章（ＲＮＡ）を参照。通常のＤＮＡ単離手順は、一般に、溶液中への細胞の懸濁、及び細胞を徐々に溶解して、細胞内に含まれるＤＮＡを、得られる溶解産物(lysate)中に放出させる為の酵素及び／又は化学品の使用を伴う。ＲＮＡ単離の為に、通常の溶解及び可溶化方法は、リボヌクレアーゼ、及びＤＮＡを含むＲＮＡから分離されるべき混入物の抑制の為の測定を含む。又、今日使用されている多くの通常の手順は、上述の如くにして造られた通常の溶解産物からタンパク質及び脂質の様な追加の細胞物質を抽出する為に、フェノール又は、フェノールとクロロホルムとを含む有機溶媒混合物の使用を伴う。フェノール／クロロホルム抽出工程は、この後、一般に、抽出された水性相にエタノールを添加して、抽出された水性相中に残留している核酸物質を沈殿させる工程が続く。沈殿物は、一般に、遠心分離によって溶液から除去され、得られた沈殿物のペレットは、更なる処理又は分析の為に、水又は緩衝溶液に再懸濁される前に乾燥される。通常の核酸単離方法は、重大な欠点を有している。それらの欠点の内には、抽出に必要な多段処理工程の為に費やされる時間及びフェノール又はクロロホルムの使用の危険性がある。フェノールは、接触によって危険な発火の原因となる。クロロホルムは高揮発性で、毒性があり、可燃性である。これらの性質は、フェノールの取扱い及びフェノール／クロロホルム抽出が、ヒュームフード中で行われ事を要求する。フェノール／クロロホルム抽出のその他の望ましくない性質は、フェノールの酸化生成物が核酸を損傷させる事である。唯一、新鮮に再蒸留されたフェノールだけが有効に使用出来、核酸はフェノールの存在でなくなる事はない。又、一般に、多段工程方法は、フェノール／クロロホルム抽出後にＲＮＡを単離する事を必要とする。エタノール（又はイソプロパノール）沈殿は、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出水溶液からＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡから残留フェノール及びクロロホルムを除去する為に採用されなければならない。更に、エタノール（又はイソプロパノール）沈殿は、ＤＮＡからヌクレオシドトリホスフェート及び短い（即ち、約３０塩基又は塩基対未満）一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオシド混入物を除去する事が必要である。更に、最上の環境下において、その様な方法は、単離された核酸物質及び／又は不純物で汚染された単離核酸物質の収量が比較的低い。分子生物学的方法を使用する操作の為に、十分にＤＮＡ及び／又はＲＮＡを単離する為の、従来のフェノール／クロロホルム抽出／エタノール沈殿法よりも単純で安全な、或いは一層効果的な方法に対して、当該技術分野において認識された必要性が存在する。サイズによって細胞から回収されるＤＮＡの画分化は、多くの分子生物学的方法にとって必要なものである。その様な画分化は、一般に、アガロース又はポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって達成される。画分化後に分子生物学的方法による分析又は処理の為に、対象の画分中のＤＮＡは、その様な電気泳動で使用されるゲル中の混入物、例えば、アガロース、その他の多糖類、ポリアクリルアミド、アクリルアミド又はアクリル酸から分離されなければならない。この様に、その様な分離を達成する為の方法に対する要求が、又、当該技術分野には存在する。核酸又はそのセグメントの増幅の為の方法、例えば、良く知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書参照）は、酵素、ヌクレオシドトリホスフェート、オリゴヌクレオチド、及びその他の核酸の複雑な混合物の溶液を生成する。一般に、この方法は、一本鎖核酸セグメント（「目標セグメント」）を多量に得る為に実施される。この増幅法が実施された後では、この溶液中のその他の成分からこの目標セグメントを分離する事がしばしば必要である。この様に、これらの分離を達成する為の簡単な方法に対する要望が、当該技術分野において、更に存在する。ガラス粒子、例えば、ガラス粉、シリカ粒子、及びガラス繊維フィルター紙を粉砕して造られるガラス微細繊維、及び珪藻土を含めたシリカ物質は、カオトロピック塩の水溶液と組合わせて、その他の物質からＤＮＡを分離して、分子生物学的方法での使用に適したＤＮＡとするのに使用されている。米国特許第５，０７５，４３０号明細書及びそこに引用されている参照例、Marko et al.,Anal．B iochem．121，382-387(1982)及びVogelstein et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． (USA)76，615-619（1979）参照。又、Boom et al.，J．Clin．Mocrobiol．28，4 95-503(1990)参照。その他の物質からＤＮＡを分離する為に、カオトロピック剤の水溶液との組合わせで使用された元のガラス繊維フィルターに関しては、Chen and Thomas，Anal．Biochem．101，339-341(1980)を参照。先のVogelstein et al．は、シリカゲルが、ＤＮＡ分離での使用には適さない事を示唆している。シリカ物質とカオトロピック剤を使用するＲＮＡの分離に関しては、Gillespie et al.の米国特許第５，１５５，０１８号明細書を参照。ガラス粒子、シリカ粒子、シリカゲル及び上記の混合物は、カオトロピック剤の存在下で、核酸物質を含有する媒体と接触される場合、核酸物質を可逆的に結合する事の出来るマトリックスを造る為に、様々の異なる形態で構成されている。その様なマトリックスは、核酸物質に結合したまま、一方で、マトリックスは、外部の力、例えば、遠心分離又は真空濾過に曝されて、残留媒体成分からマトリックス及びそれに結合した核酸物質を分離する様に設計されている。核酸は、次いで、マトリックスを溶出溶液、例えば、水又は溶出バッファーに曝す事によってマトリックスから溶出される。遠心分離及び／又は濾過単離系での使用の為に設計されたシリカ基体マトリックスは、多数が市販品として販売されている。例えば、Promega Corp．(Madison，Wisconsin，U.S.A.)からの、製品のWizard D NA 精製系ライン、或いは、Qiagen Corp.(Chatsworth，California，U.S.A.)からのＤＮＡ単離系のQiaPrepライン。磁気応答性粒子（以後、「磁気粒子」と言う）は、タンパク質又は抗体の様なポリペプチド分子の単離又は精製の為に通常使用されている。然しながら、最近では、磁気粒子及び磁気粒子を使用する方法が、核酸物質の単離の為に開発されてきている。核酸単離での使用の為に設計された幾つかの異なるタイプの磁気粒子が文献に記載されており、それらのタイプの粒子の多くは、市販品として利用可能である。その様な磁気粒子は、一般に、２つの範疇のいずれか、即ち、核酸物質を、直接に、可逆的に結合する様に設計されているものか、又は、少なくと１つの中間物質を通過する様に設計されているものの何れかに分けられる。中間物質は、ここでは、「ラベル」と称する。核酸を間接的に結合する様に設計されている磁気粒子は、一般に、以下の基本的な単離方法によって、特定の核酸物質、例えば、ｍＲＮＡを単離する為に使用される。先ず初めに、核酸物質を含有する媒体が、対象の核酸物質に結合する事の出来るラベルと接触させられる。例えば、普通一般に使用されるラベルの１つであるビオチン化オリゴヌクレオチドデオキシチミジン（オリゴ−ｄＴ）は、媒体中で、ｍＲＮＡ分子のポリ−アデノシン末端で水素結合を形成する。その様に使用される各ラベルは、適当な結合条件下で磁気反応性粒子との接触下に置かれた場合には、磁気反応性粒子と結合する様に設計される。例えば、ビオチン化オリゴ−ｄＴ／ｍＲＮＡ複合体のビオチン末端は、ストレプトアビジンを被覆した磁気反応性粒子の表面上のストレプトアビジン部位に結合する事が出来る。幾つかの異なる市販品は、ストレプトアビジン磁気粒子及び、上述のビオチン化オリゴ−ｄＴを使用するｍＲＮＡ単離で使用されるように設計された試薬に利用する事が出来る。例えば、Promega Corp．からの、PolyATtract Series 9600 mRNA I solation System;或いは、Bangs Laboratories(Carmel，Indiana，U.S.A.) からの、ストレプトアビジン被覆微粒子のProActive lineを参照。又、磁性粒子及びラベル系として、核酸の他のタイプ、例えば、二本鎖及び一本鎖ＰＣＲテンプレートを間接的に結合して単離する事の出来るものが開発されている。例えば、Advanced Magnetics，Inc.(Cambridge，Massachusetts，U.S.A,)からの、BioM ag superparamagnetic particleを参照。核酸単離又は分離の為の間接結合磁気分離系は、全て、少なくとも３つの成分、即ち、磁気粒子、ラベル、及び対象の核酸物質を含有する媒体を必要とする。ラベル／核酸結合反応及びラベル／粒子結合反応は、互いに異なる溶液及び／又は温度反応条件を必要とする。各追加成分又は核酸単離方法で使用される溶液は、ヌクレアーゼ、金属、及びその他の有害物質によって、単離最終生成物の汚染の危険性を増す。又、二三のタイプの磁気粒子が、生物学的物質、特に、核酸の直接的結合及び単離での使用の為に開発されている。その様な粒子タイプの１つに、磁気応答性ガラスビーズ、好ましくは孔径が調節されている磁気応答性ガラスビーズがある。例えば、CPG Inc.(Lincoln Park，New Jersey，U.S.A.)からの、Magnetic Por ous Glass（MPG）particle；又は、米国特許第４，３９５，２７１号明細書；第４，２３３，１６９号明細書；又は第４，２９７，３３７号明細書に記載の多孔性磁気ガラス粒子を参照。然しながら、核酸物質は、それに一度結合したら除去するのが困難となる程ガラスに緊密に結合する傾向がある。従って、磁気ガラス粒子からの溶出効率は、シリカの様に、核酸結合物質を少ない量で含む粒子からの溶出効率と比較すると、低くなる傾向にある。生物学的物質、特に、核酸の直接的結合及び単離での使用の為に設計された磁気応答性粒子の第２のタイプは、小さな強磁性粒子が埋め込まれた、ガラスで被覆されたアガロースから成る粒子である。例えば、米国特許第５,３９５,４９８号明細書参照。酵素、タンパク質、ホルモン又は抗体を直接結合する事の出来る磁気応答性粒子の第３のタイプは、磁気物質を、重合性シリコンジキサイド化合物のマトリックス中に導入する事によって造られる。例えば、ドイツ特許第４３０７２６２Ａ１号参照。後の２つのタイプの磁気粒子、即ち、アガロース粒子及び重合性シリコンジオキサイドマトリックスは、生物学的物質をそれぞれのその様な粒子に直接結合するのに必要な条件下で、鉄を媒体中に浸出させる傾向がある。又、それらに結合した核酸物質の迅速且つ効率的な単離を高める為に、十分に均一で且つ磁気容量の濃いその様な粒子を製造する事は困難である。必要とされるものは、生物学的存在物、特に、核酸を、分子生物学的方法で使用する為に、十分に混入物の無いその様な存在物を迅速に、且つ効率よく直接に単離する事の出来る磁気応答性粒子を使用して単離する為の方法である。発明の要旨要するに、１つの観点では、本発明は、媒体中で、他の物質から生物学的目標物質を単離する方法であって、生物学的目標物質を含む媒体を用意し、シリカ磁気粒子を用意し、シリカ磁気粒子と媒体とを組合せて、シリカ磁気粒子と生物学的目標物質との複合体を形成し、外部磁場を適用して、媒体から複合体を除去し、生物学的目標物質を溶出させる事によって、複合体から生物学的目標物質を分離して、単離された生物学的目標物質を得る事を含む方法である。更なる観点では、本発明は、シリカ磁気粒子の１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する事の出来るシリカ磁気粒子を使用して、媒体中で、その他の物質から対象の生物学的目標物質を単離し、且つそれに結合した生物学的目標物質の少なくとも６０％を放出する為の方法である。本発明方法の好ましい実施では、シリカ磁気粒子の１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも約４μｇがそれらに結合し、且つシリカ磁気粒子に接着した生物学的目標物質の少なくとも約７５％が順次溶出した。本発明の方法により単離される生物学的目標物質は、好ましくは核酸である。本発明方法の好ましい実施は、次の工程から成る。第１に、媒体とシリカ磁気粒子から成る混合物が形成される。第２に、生物学的目標物質が、混合物中で、シリカ磁気粒子に接着される。第３に、シリカ磁気粒子が外部力、最も好ましくは磁力を使用して混合物から除去される。第４に、シリカ磁気粒子に接着した生物学的目標物質の少なくとも６０％が、粒子と溶出溶液とを接触させる事によって溶出される。その他の観点では、本発明は、シリカ磁気粒子、即ち、シリカ質酸化物被覆磁気粒子の好ましい形態を使用して、媒体中でその他の物質からプラスミドＤＮＡを単離する方法であって、好ましい粒子は、粒子の１ｍｇ当たりプラスミドＤＮＡ物質の少なくとも２μｇを結合する事が出来、それに結合したプラスミドＤＮＡの少なくとも６０％を放出する事が出来る。本発明のこの観点の方法の好ましい実施は、次の工程から成る。第１に、プラスミドＤＮＡ、シリカ質酸化物被覆磁気粒子、及びカロトロピック塩を含有する媒体から成る混合物が形成される。第２に、このプラスミドＤＮＡが混合物中でシリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着される。第３に、シルカ質酸化物被覆磁気粒子が、外部力、最も好ましくは磁場を使用して混合物から除去される。第４に、シリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着したプラスミドＤＮＡの少なくとも６０％が、粒子と溶出溶液とを接触させる事によって溶出される。更なる観点では、本発明は、生物学的目標物質を含有する媒体から生物学的目標物質を単離する為のキットであり、このキットは、第１の容器の水溶液中に懸濁されたシリカ質酸化物被覆磁気粒子のアリコットを含み、粒子は、粒子の１ｍｇ当たり生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を有する。任意に、キットは、本発明方法により、生物学的目標物質を含有する媒体から、生物学的目標物質を単離するのに必要とされるその他の成分を含んでも良い。ここで使用される「磁気粒子」とは、磁場を持たないが、磁場に曝された時に磁気双極子を形成する物質、即ち、磁場の存在で磁気化される事の出来る物質であるが、その様な磁場が存在しなければそれ自身磁気のない物質を意味する。この文脈で使用される「磁気」と言う言葉は、常磁性又は超常磁性物質である物質を含む。又、ここで使用される「磁気」と言う言葉は、例えば、キューリー温度で強磁性又はフェリ磁性物質の様な一時的磁性物質を包含し、その様な一時的磁性物質は、その様な物質を含有するシリカ磁気粒子が、生物学的物質を単離する為に本発明方法で使用される温度範囲で常磁性を示す。「シリカ磁気粒子」とは、シリカゲル、シリカ質酸化物、ガラス又は珪藻土の様な固体シリカ、又は前述の２つ以上の混合物形態のシリカから成る磁気粒子を意味する。ここで使用される「シリカゲル」とは、普通に多くの販売元から市販されている物質である、クロマトグラフィー用シリカゲルを意味する。シリカゲルは、珪酸塩、例えば、ナトリウムシリケートを含有する溶液を、１０又は１１より低いｐＨまで酸性化し、次いで、酸性化溶液をゲル化させる事によって極一般的に製造される。例えば、Kurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technolog y，Vol．6，4th ed.，Mary Howe-Grant，ed.，John Wiley & Sons，pub.，1993 ，pp．773-775のシリカ調製の項参照。ここで使用される「シリカ磁気粒子」は、シリカ磁気粒子の１ｍｇ当たり生物学的目標物質の少なくとも２μｇを結合する能力を有し、且つ、独立的に、本発明方法の溶出工程において、それらに結合した生物学的目標物質の少なくとも６０％を放出する能力を有する、上述の性質を持った粒子を、好ましくは意味する。本発明で使用されるシリカ磁気粒子は、シリカゲルマトリックス中に導入された強磁性物質から成るのが更に好ましい。本発明の単離方法の溶出工程は、金属、金属化合物（例えば、鉄又は鉄化合物）又は、シリカ磁気粒子に起因するその他の異物質による核酸物質の実質的な汚染無しに遂行されるのが好ましい。ここで使用される「ガラス粒子」とは、結晶シリカは非晶質ではないから、正しくは「ガラス」ではないが、結晶シリカ（例えば、α−石英、石英ガラス）又は主にシリカから造られたガラス粒子を意味する。「シリカ質酸化物被覆磁気粒子」又は「ＳＯＣＭ粒子」とは、本発明の方法及びキットで使用されるシリカ磁気粒子の最も好ましい形態を意味する為にここでは使用される。ＳＯＣＭ粒子は、超常磁性又は常磁性物質の少なくとも１つの粒子の芯を被覆しているシリカ質酸化物から成る。本発明の方法及びキットで使用されるＳＯＣＭ粒子は、又、含水シリカ質酸化物の吸着性表面、即ち、その上にシラノール基を有する事を特徴とする表面を有する。ＤＮＡ又はＲＮＡの様な目標核酸物質は、粒子の吸着性表面に接着する一方、その他の物質、特に、エキソヌクレアーゼの様な有害物質は、接着しないか、又は、核酸物質と一緒に粒子から共溶出する。ＳＯＣＭ粒子の物性及びその様な粒子の製造方法は、同時出願の、発明の名称が「磁気基体上のシリカ吸着剤」の米国特許出願第号明細書に開示されており、ここに参照として導入される。本発明は、様々な異なる媒体から、対象の生物学的目標物質を単離する為の簡便且つ効率的手段を提供するものである。媒体から粒子を除去するのに磁力が使用される、上で簡単に述べた本発明方法の好ましい観点は、生物学的目標物質が他のシリカ物質に可逆的に結合する従来の単離方法よりも顕著な利点を提供する。特に、本発明方法の磁気除去工程は、従来のシリカ結合及び溶出単離方法で必要とされる真空濾過又は遠心分離工程に代わるものである。従って、特に自動化され易い。小さな実験室又は個々の研究者は、例えば、真空濾過の為の真空マニホールド及び真空、或いは遠心分離法の為のマイクロ遠心分離機といった方法を実施する為の特殊な、且つ高価な装置を購入しなければならない。反対に、本発明の磁気分離は、強力且つ簡単に利用できる磁石から発生される様な集中磁場だけを必要とするに過ぎない。又、分子生物学研究関係での使用に特に適合した安価な装置、例えば、MagneSphere Technology Magnetic Separation Strand又は、PolyATract Series 9600 Multi-Magnet（共に、Promega Corporation，Madiso n，Wisconsin，USAから市販）が市販されている。本発明の単離方法を使用して単離された生物学的目標物質は、標準分子生物学的方法を使用する更なる処理又は分析用として十分に汚染物質の無いものである。様々な異なる媒体から様々な異なる生物学的目標物質を単離する為の本発明方法の適用は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、磁性の、孔径調整ガラス（ＣＰＧ）粒子又はシリカ磁気粒子に添加されたプラスミドＤＮＡのμｇ当たりに結合したプラスミドＤＮＡのμｇ数のプロットである。図２は、磁気ＣＰＧ又はシリカ磁気粒子から溶出したプラスミドＤＮＡのμｇ数対溶出前に粒子に添加されたプラスミドＤＮＡのμｇ数のプロットである。図３は、図１に示された結合データ及び磁気ＣＰＧ及びシリカ磁気粒子から得られた図２に示した溶出データのプロットである。図４は、ゲル電気泳動を使用して、ゲル上のＤＮＡフラグメントを画分化した後、蛍光染料で染色したアガロースゲルの蛍光像である。ＤＮＡフラグメントは、λＤＮＡをHind IIIで消化し、結合し、フラグメントをシリカ磁気粒子から溶出する事によって製造された。図５は、ゲル電気泳動を使用して、ゲル上のＤＮＡフラグメントを画分化した後、蛍光染料で染色したアガロースゲルの蛍光像である。ＤＮＡフラグメントは、ΦＸ１７４ＤＮＡをHae IIIで消化し、結合し、フラグメントをシリカ磁気粒子から溶出する事によって製造された。図６は、シリカ磁気粒子に適用され、結合され、そしてそれから放出された、³² P-ラベル化ＲＮＡの１００万当たりのカウント（ＣＰＭ）のヒストグラムプロットである。発明の詳細な説明本発明方法を使用して単離される生物学的目標物質は、核酸又はタンパク質が好ましく、より好ましくはＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの様な核酸物質である。本発明方法を使用して単離される生物学的目標物質が核酸である場合は、プラスミドＤＮＡ、制限酵素消化から造られるＤＮＡフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様な増幅反応によって造られる増幅ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はトータルＲＮＡを含み、これらに限定されないＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい。本発明方法によって単離される核酸物質は、プラスミドＤＮＡ又はトータルＤＮＡが尚一層好ましい。核酸は、本発明方法を使用して単離される最も好ましい生物学的目標物質であるから、以下の本発明の詳細な説明の大部分は、本発明のこの好ましい観点に就いて述べる。然しながら、本発明のこの特定の観点についての詳細な説明は、本発明の範囲を限定する為のものではない。ここに開示の説明は、当業者に、核酸物質、例えば、タンパク質又は抗体以外の生物学的目標物質を単離する為の本発明方法を使用できる様にする為の十分な方向付けを提供するものである。生物学的目標物質を単離する為の本発明方法は、任意のシリカ磁気粒子を使用して実施する事が出来るが、ＳＯＣＭ形態のシリカ磁気粒子を使用して実施するのが好ましい。又、本発明方法は、以下の物性を持つシリカ磁気粒子を使用して実施する事が好ましい。本発明方法で使用されるシリカ磁気粒子は、多数の異なるサイズのものであっても良い。小さなシリカ磁気粒子は、吸着に対しては広い表面積（重量単位基準当たり）を用意するが、小さな粒子は、大きな粒子に比べて、その様な粒子中に導入する事の出来る磁性物質の量が制限される。本発明で使用されるシリカ磁気粒子の平均粒径は、約１〜１５μｍが好ましく、より好ましくは約３〜１０μｍ、最も好ましくは約４〜７μｍである。又、粒径分布は、変化しても良い。然しながら、比較的狭い単一粒径分布（monodal particle size distribution）が好ましい。単一粒径分布は、粒径の約８０重量％が、平均粒径で１０μｍの範囲以内、より好ましくは８μｍの範囲以内、最も好ましくは６μｍの範囲以内であるのが好ましい。本発明で使用される好ましいシリカ磁気粒子は、粒子の外部から近づく事の出来る孔を有する。この孔は、生物学的目標物質、例えば、核酸を粒子の内部へ収容でき、大部分のその様な孔の内側表面上のシリカゲル物質に結合させるのに十分大きく調整されているサイズ範囲である事が好ましい。シリカ磁気粒子の最も好ましい形態の孔は、生物学的目標物質、特に、核酸物質を結合する事の出来る大きな表面積のシリカゲル物質となる様に設計される。シリカ磁気粒子の全細孔容積は、窒素ＢＥＴ法で測定して、粒子質量の少なくとも約０．２ｍｌ／ｇが好ましい。窒素ＢＥＴ法で測定した全細孔容積の、少なくと約５０％の細孔容積が、６００Å以上の直径を有する孔に含まれる事が好ましい。シリカ磁気粒子は、その様な物質で実質的に汚染された単離された生物学的目標物質の単一性に逆に影響を及ぼす、例えば、遷移金属或いは揮発性有機物の様な物質を含むかも知れない。特に、その様な混入物は、下流の処理、分析及び／又はその様な物質の使用、例えば、酵素活性の抑制又は目標物質それ自身のニッキング又は分解の為の使用に影響を及ぼし得る。本発明で使用されるシリカ磁気粒子中に存在するその様な物質は、粒子の外に及び本発明方法により製造された単離生物学的目標物質中に簡単に浸出しない形態で存在する。鉄は、特に、生物学的目標物質が核酸である場合に、望ましくない混入物の１つである。鉄は、マグネタイトの形態で、本発明のシリカ磁気粒子の特に好ましい形態、即ち、ＳＯＣＭ粒子の芯に存在する。鉄は、２６０と２７０ｎｍの間に広い吸収ピークを持つ。核酸は、約２６０ｎｍにピーク吸収を有するので、核酸試料中の鉄混入は、その様な試料の定量分光光度分析の結果の精度に、逆に影響を及ぼす。本発明を使用して、核酸を単離する為に使用されるシルカ磁気粒子中に含まれる鉄は、２６０ｎｍ付近での物質の分光光度分析を邪魔する、その鉄に対して鉄で十分に汚染された単離核酸物質を製造しない。本発明方法で使用される最も好ましいシリカ磁気粒子、即ち、ＳＯＣＭ粒子は、次の様な分析を行った場合に、５０ｐｐｍより多く、より好ましくは１０ｐｐｍより多く、最も好ましくは５ｐｐｍより多くの遷移金属を浸出しない。特に、０．３３ｇの粒子（１１０℃でオーブン乾燥した）を、２０ｍｌの１ＮＨＣｌ水溶液（脱イオン水を使用）に混合し、次いで、この混合物を、粒子を分散する為だけの目的で攪拌し、全接触時間で約１５分後に、次いで、混合物の液体部分の金属含有量が分析される。得られる液体中の遷移金属の量を定量する為には、通常の元素分析方法を使用しても良いが、誘導結合プラズマ分光分析（ＩＣＰ）が好ましい。同時出願の特許出願番号、発明の名称「磁気基体上のシリカ吸着剤」（ここに参照として導入される）は、本発明方法及びキットで使用するのに適したＳＯＣＭ粒子の製造方法を開示する。本発明での使用の為のＳＯＣＭ粒子を製造する為の最も好ましい方法は、次の工程を含む：（１）ＦｅＣｌ₂及びＦｅＣｌ₃の混合物の水性沈殿によって磁気コア粒子を調整する工程、（２）粒子のスラリーを、ＳｉＯ₂及びＮａ₂Ｏの混合物に、少なくとも４５分間、少なくとも６０℃の温度で暴露する事に依って磁気コア粒子上にシリカ質酸化物被膜を沈着させ、次いで、酸溶液を混合物に添加して、ｐＨを９未満のｐＨまで下げる工程、（３）得られたスラリーを、少なくとも約１５分間、好ましくはスラリーの攪拌を続けながら熟成する工程、及び（４）粒子を洗浄する工程。上述の好ましい粒子製造方法の沈着及び熟成工程は、磁気コア上に多層のシリカ質酸化物被膜を造る為に繰返し行う事が出来、これによって、周囲の環境へのコアからの浸出に対して追加的保証を用意する事が出来る。上述の方法で製造されたＳＯＣＭ粒子は、コアからの更なる浸出を抑制する為に、穏やかな酸化工程に掛ける事によって処理されるのが最も好ましい。本発明方法を使用して単離される生物学的目標物質は、培養中の真核細胞又は原核細胞から、或いは、組織、動物及び植物を含む多細胞有機体から得られる細胞；血液、リンパ液、尿、便又は精液の様な体液；胚嚢又は胎児；食品；化粧品；或いは、その他の細胞源から得る事が出来る。或種のＤＮＡ又はＲＮＡの様な生物学的目標物質は、オルガネラ、ウイルス、ファージ、プラスミド、細胞感染ウイロイド等のＤＮＡ又はＲＮＡから、本発明方法によって単離される。細胞は、溶解され、溶解産物は、当業者にとって周知の様々な方法で普通に処理され、ＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液を得、これに本発明の分離又は単離方法が適用される。その様な溶液中のＤＮＡ又はＲＮＡは、一般には、その他の成分、例えば、タンパク質、（ＤＮＡ分離の場合には）ＲＮＡ、（ＲＮＡ分離の場合には）ＤＮＡ又はその他のタイプの成分と共に存在する。その様な物質源の性質に拘わりなく、本発明方法で単離される生物学的目標物質は、生物学的目標物質及びその他の種類から成る媒体で提供される。生物学的目標物質は、本発明方法の第１工程で、シリカ磁気粒子に接着する事の出来る形態で媒体中に存在しなければならない。核酸物質が、細胞内部に含まれる時は、細胞壁又は細胞膜は、その物質を粒子に接着出来ない様にする。その様な細胞が溶解されたとしても、或いは、そこに含まれる核酸物質を周りの溶液中に放出する為に十分に分裂されたとしても、溶液中の細胞片は、シリカ磁気粒子への核酸物質の接着を妨害する。従って、本発明方法を使用して単離される核酸物質が、細胞内に含まれる場合は、細胞は、先ず初めに、溶解産物を造る為に細胞を溶解又は分裂処理する事が好ましく、更に、本発明方法の媒体として用意される場合に、核酸物質のシリカ磁気粒子への接着を多分妨害するであろう細胞片の溶解産物を清浄処理する（例えば、遠心分離又は真空濾過によって）事が、より好ましい。そこに含まれる核酸物質を放出する為に、溶解又は分裂させる為の多くの異なる公知の方法はどれでも、本発明での使用の為に細胞からの媒体の製造に使用するのに適する。細胞から核酸物質を放出するのに選ばれる方法は、その物質を含有する細胞の性質に依存する。例えば、比較的硬い細胞壁を有する細胞、例えば、真菌細胞又は植物細胞からそこに含まれる核酸物質を放出させる為には、強力なプロテアーゼ及び、ホモジナイザーでの機械的剪断或いは超音波処理器を使用する音波での分裂の様な厳しい処理を必要とするかも知れない。対照的に、核酸物質は、水溶液中に細胞を懸濁して、その溶液に界面活性剤を添加するだけで、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアの様な脂質２層膜を持つ細胞又は動物の血液細胞から簡単に放出する事が出来る。上述の様に、核酸物質が溶解又は分裂細胞から放出されると、シリカ磁気粒子への核酸の接着を妨害する細胞片は、多くの異なる公知の方法又は方法の組合わせを使用して除去する事が出来る。溶解又は分裂された細胞の溶液は、遠心分離にかけて粒状細胞片を除去する事が好ましい。次いで、上澄液は、追加のその他の物質の沈殿物を形成させる為にその上澄液に第二溶液を添加し、次いで、得られる溶液から沈殿物を遠心分離によって除去する為に更に処理される事が好ましい。本発明の特に好ましい観点では、本発明方法によって単離される対象の核酸物質は、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリア細胞中に最初に含まれるプラスミドＤＮＡである。この核酸物質は、溶解産物を形成する為にアルカリ溶液、例えば、水酸化ナトリウム溶液の添加によって、バクテリアから放出されるのが最も好ましい。この溶解産物は、次いで、細胞片を除去する為に、遠心分離で更に処理される事が好ましい。中和溶液、例えば、酸性緩衝液を、追加の強力な妨害物質の沈殿物を形成する為に、得られる上澄液に添加する事が好ましい。この様にして形成された沈殿物は、遠心分離によって除去されるのが好ましい。清澄な溶解産物の残留上澄液は、本発明方法のこの特に好ましい観点の第１工程で用意される媒体である。本発明方法の第１工程で用意される媒体は、細胞から直接放出される核酸物質を含む必要が無い。核酸物質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して製造される増幅ＤＮＡの様な増幅反応の生成物である事が出来る。又、核酸物質は、制限酵素でＤＮＡを消化する事によって産生されるＤＮＡのフラグメントの形態である事も出来る。又、媒体は、溶融又は酵素的に消化された電気泳動ゲルと核酸物質との混合物の形態である事も出来る。本発明方法の第２工程で用意されるシリカ磁気粒子は、粒子１ｍｇ当たり、核酸物質の少なくとも２μｇを可逆的に結合する事によって、媒体中で核酸物質と複合体を形成する能力を有する事が好ましい。本発明での使用の為に用意される粒子は、粒子１ｍｇ当たり、核酸物質を少なくとも４μｇ、より好ましくは少なくとも８μｇを可逆的に結合する能力を有する事が更に好ましい。シリカ磁気粒子は、好ましくは、それらに接着した核酸物質の少なくとも６０％を放出する能力を有さなければならない。粒子は、それらに接着した核酸物質の少なくとも７０％、最も好ましくは、少なくとも９０％を放出する能力を有する事が更に好ましい。本発明方法の第１工程で用意されるシリカ磁気粒子は、ＳＯＣＭ粒子が最も好ましい。シリカ磁気粒子と生物学的目標物質との複合体は、第３工程で、好ましくは、粒子を、複合体の形成を促進する様に設計された条件下で、目標物質を含有する媒体に暴露する事によって形成される。複合体は、シリカ磁気粒子と媒体とカオトロピック塩の混合物で形成されるのが更に好ましい。カオトロピック塩は、カオトロピックイオンの塩である。その様な塩は、水溶液に良く溶ける。その様な塩で用意されたカオトロピックイオンは、タンパク質又は核酸の水溶液中で十分に高濃度であれば、タンパク質を展開し、核酸の第２構造を失わせ、或いは、二本鎖核酸の場合には、溶融（即ち、鎖−分離）させる。カオトロピックイオンは、それらが、液体の水に存在する水素結合ネットワークを分裂させて、それらの、正確に組合され又は構造化された対応物よりも熱力学的により安定な変性タンパク質及び核酸とするので、その様な効果を有するものと考えられる。カオトロピックイオンとしては、グアニジニウム、ヨウ化物、過塩素酸化物及びトリクロロアセテートが挙げられ、本発明では、グアニジニウムイオンが好ましい。カオトロピック塩としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン（これは、時に、イソチオシアン酸グアニジンとも称される）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びナトリウムトリクロロアセテートが挙げられ、グアニジニウム塩が好ましく、特に、塩酸グアニジンが好ましい。本発明方法のこの実施で形成される混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、約０．１Ｍ〜７Ｍの間が好ましいが、約０．５Ｍ〜５Ｍの間がなお好ましい。混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、混合物中で生物学的目標物質をシリカ磁気粒子に接着させる程度に十分高くなければならないが、劣化する程に実質的に変性させたり、或いは、目標物質を混合物の外に沈殿させる程に高くする必要はない。タンパク質及び、染色体ＤＮＡの様な二本鎖ＤＮＡの大きな分子は、約０．５〜２モルの間のカオトロピック塩濃度では安定であるが、約２モル以上のカオトロピック塩濃度では溶液の外に沈殿する事が知られている。例えば、米国特許第５，３４６，９９４号明細書の第２欄、５６〜６３行参照。逆に、ＲＮＡ及び、プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡの制限又はＰＣＲフラグメント、又は一本鎖ＤＮＡは、２〜５モルの間のカオトロピック塩濃度で、劣化せずに溶液で残る。本発明で使用されるカオトロピック塩は、塩の濃度を、本発明を実施するに当って、塩が使用される溶液のいずれの溶液に於いても、本発明を実施するに当って、溶液が置かれる全ての条件下で、溶液中の塩の溶解度以下に止める事が望ましい。本発明方法の実施においては、上述の様に形成される混合物は、核酸物質の少なくとも幾つかがシリカ磁気粒子に接着して複合体を形成するまで培養される。この培養工程は、少なくとも０℃、好ましくは少なくとも４℃、尚好ましくは少なくとも２０℃で行われ、培養温度は６７℃未満である。培養工程は、シリカ磁気粒子が、核酸物質へ可逆的に結合するその能力を失い始める温度以下の温度で行われなければならない。培養工程は、約室温（即ち、約２５℃で）で行うのが最も好ましい。複合体は、磁場を使用して、混合物から除去される。又、磁場に加えて、その他の形態の外部力も、初期除去工程後に、本発明方法により生物学的目標物質を単離する為に使用する事が出来る。外部力の適当な追加形態としては、重力濾過、真空濾過及び遠心分離が挙げられるがこれらに限定されるものではない。媒体から複合体を除去する為に使用される外部磁場は、多数の異なる公知の方法を使用して、媒体中で適宜発生させる事が出来る。例えば、粒子を含有する溶液の容器の外側面に磁石を置き、溶液を介して粒子を移動させ、磁石に隣接する容器の内側面に集める事が出来る。次いで、磁石を、容器の外側面の位置に保持して、粒子を、磁石によって発生した磁場によって容器中に保持しながら、溶液は、容器の外にデカントして、棄てる事も出来る。次いで、第二溶液を容器に加え、磁石を除去して、粒子を第二溶液中に移動させる事も出来る。或いは又、磁化性プルーブを溶液中に挿入してプルーブを磁化して、粒子を、溶液に浸漬したプルーブの末端に沈着させる事も出来る。次いで、磁化したままで、プルーブを溶液から除去し、第二溶液に浸漬し、粒子を第二溶液に移動させる為に磁場を中断させる事も出来る。上記の一般的用語で述べられた磁気除去並びに移動技術の２つのタイプで使用される様に設計された磁石は、市販品として存在する。例えば、MagneSphere Technology Magnetic Separation Stand or the PolyATract S eries 9600 Multi-Magnet，共にPromega Corp．から市販されている；Magnetigh t Separation Stand(Novagen，Madison，WI); or Dynal Magnetic Particle Con centrator（Dynal，Oslo，Norway）参照。本発明方法の好ましい観点では、第３工程で媒体から除去される複合体は、洗浄溶液でリンスされる事によって、少なくとも一度は洗浄される。この方法の好ましい追加工程で使用される洗浄溶液は、好ましくは、シリカ磁気粒子からの混入物を除去する事の出来る溶液から成る。洗浄溶液は、好ましくは、塩及び溶媒、好ましくはアルコールから成る。洗浄溶液のこの最後の好ましい形態でのアルコールの濃度は、少なくとも３０容量％、より好ましくは少なくとも４０容量％、最も好ましくは少なくとも５０容量％である。その様に使用されるアルコールは、エタノール又はイソプロパノールが好ましく、より好ましくはエタノールである。塩は、緩衝液の形態であるのが好ましく、アセテートバッファーの形態が最も好ましい。洗浄溶液中の塩の濃度は、核酸物質が、洗浄工程中にシリカ磁気粒子から溶出しない程度に十分に高いものである。複合体は、洗浄溶液中に複合体を再懸濁して媒体から除去された後に洗浄するのが好ましい。複合体は、最初の洗浄後に洗浄溶液から除去されるのが好ましく、各洗浄工程毎に新鮮な洗浄溶液を使用して、少なくとも一回以上、最も好ましくは三回以上洗浄される。第４に、そして最後に、核酸物質は、溶出溶液に複合体を暴露する事によってシリカ磁気粒子から溶出される。溶出溶液は、低イオン強度の水溶液が好ましく、より好ましくは、水又は、核酸物質が安定で且つ実質的に損なわれないｐＨ付近の低イオン強度バッファーである。ＴＥバッファー（即ち、１０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ，１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０）以下のイオン強度の水溶液であれば、本発明方法の溶出工程での使用に適するが、溶出溶液は、約６．５〜８．５のｐＨまで、より好ましくは、約７．０〜８．０のｐＨまで緩衝されるのが好ましい。ＴＥバッファー及び蒸留された或いは脱イオン化された水は、本発明での使用の為の溶出溶液として特に好ましい。上記の溶出溶液の好ましい形態の低イオン強度は、核酸物質が粒子から放出されるのを確実にする。本発明方法での使用に適するその他の溶出溶液は、当業者にとっては、容易に明らかである。本発明方法の溶出工程で複合体から溶出した核酸物質は、例えば、遠心分離又は磁場の様な外部力によって、より好ましくは遠心分離を使用して、溶出混合物中に残存するシリカ磁気粒子及び複合体から分離されるのが好ましい。遠心分離は、小さ過ぎるか、或いは、磁場を使用して除去される為に十分に磁気的に応答性のない粒子又は粒子セグメントを除去する事が出来るので好ましい。本発明方法を使用して溶出される核酸物質は、更に単離する事無しに、分子生物学的方法による分析又は更なる処理に適するものである。溶出された核酸は、例えば、配列、制限分析、又は核酸プルーブハイブリダイゼーションによって分析出来る。この様に、本発明方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分析を基礎とした、例えば、病気診断；病原体の同定；食品、化粧品、血液又は血液製品、又は病原体による汚染に対するその他の製品検査；父性検査；及び胎児又は胚嚢の性鑑別方法の一部として適用出来る。本発明方法によって用意される溶出ＤＮＡ又はＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡそれぞれとの反応を触媒する様々なエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼで処理する事が出来、ＤＮＡの場合には、ＤＮＡ中に存在する制限部位を切断する制限酵素で消化する事が出来る。溶出ＤＮＡ由来の制限フラグメントは、ベクター中に結合する事が出来、クローニング又は発現の為の適当な宿主中に形質転換する事が出来る。溶出ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントは、目標の核酸セグメントを増幅する為に、当該技術分野において公知の様々な方法で増幅する事が出来る。溶出ＤＮＡが、プラスミド又は、他のタイプの自己複製ＤＮＡであれば、形質転換された宿主中で発現する事の出来るＤＮＡ上の遺伝子のクローニング又は発現の為に適当な宿主中に形質転換する事が出来る。本発明方法で単離されたプラスミドＤＮＡは、この出願の本発明方法のシリカゲルに代えて、珪藻土が使用される従来法によって単離されたものよりも、真核細胞中により効率的に形質転換される事が分かった。以下の非限定的実施例は、本発明の種々の実施態様を教示するものである。実施例及び明細書及びクレームにおいて、容量及び濃度は、特段の指示なき場合は、室温におけるものである。最も好ましい形態のシリカ磁気粒子、即ち、ＳＯＣＭ粒子のみが、以下のそれぞれの実施例での使用で使用された。然しながら、当業者は、本発明の教示の方法を、その使用が、以下の実施例で証明される本発明方法の観点で例示されるＳＯＣＭ粒子以外のシリカ磁気粒子の形態の選択及び使用の為に使用する事が出来るものと考える。以下の実施例１及び６で示される分析結果を造り出す為に、同じバッチのＳＯＣＭ粒子が使用され、一方で、ＳＯＣＭ粒子の第二バッチが、実施例２〜４及び７で示される結果を出す為に使用された。然しながら、ＳＯＣＭ粒子の両バッチ共、以下に開示のテストを行った場合には、受入れ可能な結果を出す事が分かった。ＳＯＣＭ粒子の第一のバッチ、即ち、実施例１及び６で使用された粒子は、次の物性を有する事が分った：表面積が５５ｍ²／ｇ、＜６００Åの粒径の細孔容積が０．１８１ｍｌ／ｇ、＞６００Åの粒径の細孔容積が０．１６３ｍｌ／ｇ、平均粒径サイズが５．３μｍ、及び、上記のＩＣＰの使用で開示された様に分析された場合の鉄浸出が２．８ｐｐｍ。以下の実施例で使用されたＳＯＣＭのその他のバッチは、次の物性を有する事が分った：表面積が４９ｍ²／ｇ（＜６００Åの粒径）の細孔容積が０．１６０ｍｌ／ｇ（＞６００Åの粒径）の細孔容積が０．１６３ｍｌ／ｇ、平均粒径サイズが５．５μｍ、及び鉄浸出が２．０ｐｐｍ。実施例１−プラスミドＤＮＡに対するシリカ磁気粒子の結合能力及び溶出効率の分析シリカ磁気粒子及び磁気調整細孔ガラス（ＣＰＧ）粒子のＳＯＣＭ形態の結合能力は、最終６００μｌ容量の４．１６Ｍ塩酸グアニジン（ＧＨＣｌ）中で、粒子の一定量に対するプラスミドの増加量を滴定する事によって決定した。使用した磁気ＣＰＧ粒子は、５００Åの平均細孔径を持つ５μＭ磁気ガラス粒子であり、CPG Inc.，Lincoln Park，N.J.，U.S.A.，Part Number MCPG0510から入手した。この実施例では、１４０ｍｇの磁気シリカを１０ｍｌの脱イオン水(ＤＩＨ₂Ｏ ) に懸濁し、次いで、同じ溶液で最終濃度１４ｍｇ／ｍｌで懸濁する前に、１０ｍｌの５ＭＧＨＣｌで３回洗浄した。ＤＮＡの５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０ μｇ、６０μｇ及び８０μｇに相当する、ＤＩＨ₂Ｏ中のPromega Corp．のｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）プラスミドＤＮＡ（カタログ番号Ｐ２２７１）の増加量を、μ ｌ当たり１．０μｇの濃度で、５００μｌの粒子に添加して結合混合物を形成し、ＤＩＨ₂Ｏを添加して最終容量を６００μｌとした。次いで、このプラスミド／粒子結合混合物を、２〜３分間、室温で培養した。磁気シリカに結合したプラスミドの量は、各サンプルで、粒子に添加された全プラスミドの量から、溶液中に残ったプラスミドＤＮＡの量を差し引いて、次の様にして決定した。分析混合物の液体画分は、２０秒間の１４，０００ｘｇの遠心分離によって、磁気シリカから分離された。上澄液中に残ったプラスミドＤＮＡの量は、２６０ｎｍでの溶液の吸光度を観察する事によって決定した。２６０ｎｍでの１吸光度単位は、５０μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ濃度に等しい。結合混合物中に残ったシリカ磁気粒子は、次いで、混合物から分離されて、次の様にして洗浄した。混合物中のシリカ磁気粒子を、磁石に最も近い容器の側に沈着させる為に、結合混合物を入れた容器の外側の、容器の一側面に近い位置に磁石を置いた。次いで、磁石を、容器のその側面上のその位置に維持しながら、容器中の実質的に全てのシリカ磁気粒子を残して、混合物を容器の外にデカントした。次いで、各洗浄工程中に容器の側面から磁石を取除いて、各洗浄工程に引き続いて洗浄溶液をデカントしながら、粒子が容器中に残るのを確実にする為に、磁石を、再度、容器の側面に置き直して、残留シリカ磁気粒子を、８０ｍＭＫＯＡｃ及び５５％のエタノールを含む１０μＭＥＤＴＡの洗浄溶液の１ｍｌで４回洗浄した。次いで、最後の洗浄工程後に容器に残った粒子を、３〜５分間、空気乾燥した。最後に、プラスミドＤＮＡを、室温で、ＤＩ水の１ｍｌを添加してシリカ磁気粒子から溶出した。粒子は、得られた単離プラスミドＤＮＡ溶液から遠心分離によって除去された。次いで、溶出したプラスミドＤＮＡの量を、２６０ｎｍでの溶液の吸光度を測定して決定した。プラスミド単離方法の全体効率は、粒子と一緒に培養されたＤＮＡの量に対する最終溶出液中に回収されたＤＮＡの割合で決定した。結合能力は、全体効率が、９０％に低下した時点で決定した。上述の結合分析の結果は、図１で、図３の溶出結果と一緒に示される。磁気シリカ（△）及び磁気ＣＰＧ（＋）粒子で得られたＤＮＡ結合能力の結果は、図１で、別々に示される。この結果は、シリカ磁気粒子に添加されたプラスミドＤＮＡの量が増加するにつれて、粒子は、ＤＮＡの増加量を結合し続けて、添加されたプラスミドの１３０μｇ当たり９０μｇを結合する事を示している。反対に、磁気ＣＰＧ粒子は、１３０μｇのプラスミドＤＮＡが添加された場合でも、プラスミドＤＮＡの４０μｇより多くを結合する事はない。シリカ磁気粒子の全結合能力は、粒子１ｍｇ当たりプラスミド８μｇであった。これは、磁気ＣＰＧ粒子の結合能力よりも著しく高く、Promega Corp．のWizard Plus Plasmid DNA Puri fication Systemで使用される１０μＭシリカビーズの結合能力の少なくとも４倍高い。上述の溶出分析の結果は、図２で、図３の溶出結果と一緒に示される。この結果は、この実施例のシリカ磁気粒子に結合したプラスミドＤＮＡの９０％より多くが、粒子から溶出され、一方、ＣＰＧ粒子に結合したプラスミドＤＮＡの６０％未満が、それらから溶出された事を示す。図１〜３で示される結果は、ここで分析されたシリカ磁気粒子は、優れた結合並びに溶出特性を示す事を明確に証明した。実施例２−ＤＮＡフラグメントに対するシリカ磁気粒子の結合能力及び溶出効率の分析 Promega Corp．からの精製した自然のλＤＮＡを、自然のλＤＮＡを、２３，０００ｂｐ〜１２５ｂｐの範囲の８つのセグメントに切断する酵素である、Hind III制限酵素で消化した。このHind IIIで消化されたλＤＮＡは、以後、「λ H ind III消化物」と称する。磁気シリカは、前述の様にして調製され、１４ｍｇ／ｍｌの濃度で、５ＭＧＨＣｌ中に懸濁された。１ｍｌの懸濁粒子溶液を、室温で、２〜３分間、８０μｌの「λ Hind III消化物」で培養した。磁気シリカに結合したＤＮＡの量は、２０秒間の１４，０００ｘｇの遠心分離で液体及び固体相を分離した後に粒子に添加された全ＤＮＡ量から、溶液中に残るＤＮＡを差し引いて決定した。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定で決定した。２６０ｎｍでの１吸光度単位は、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度に等しい。結合混合物中に残ったシリカ磁気粒子は、次いで、混合物から分離して、次の様にして洗浄した。混合物中のシリカ磁気粒子を、磁石に最も近い容器の側に沈着させる為に、結合混合物を入れた容器の外側の、容器の一側面に近い位置に磁石を置いた。次いで、磁石を、容器のその側面上のその位置に維持しながら、容器中に実質的に全てのシリカ磁気粒子を残して、混合物を容器の外にデカントした。次いで、各洗浄工程中に容器の側面から磁石を取除いて、各洗浄工程に引き続いて洗浄溶液をデカントしながら、粒子が容器中に残るのを確実にする為に、磁石を、再度、容器の側面に置き直して、残留シリカ磁気粒子を、８０ｍＭＫＯＡｃ及び５５％のエタノールを含む１０μＭＥＤＴＡの洗浄溶液の１ｍｌで４回洗浄した。次いで、最後の洗浄工程後に容器に残った粒子を、３〜５分間、空気乾燥した。最後に、「λ Hind III消化物」を、室温で、ＤＩ水の２００μｌを添加して溶出した。粒子は、得られた単離「λ Hind III消化物」溶液から遠心分離によって除去された。次いで、溶出した「λ Hind III消化物」の量を、２６０ｎｍでの溶液の吸光度を測定して決定した。同様のシリカ磁気粒子結合並びに溶出分析を、１３５３ｂｐ〜７２ｂｐサイズの範囲の１０のＤＮＡセグメントを産生する消化反応である、Hae III制限酵素で消化されるΦＸ１７４ＤＮＡを使用して行った。これらの実験のデータは、以下の表１に纏められる。 ^*第一溶出工程後に、２００ｍｌのＤＩ水がシリカ磁気粒子に添加された第二溶出工程は、結合ＤＮＡの＞９７％を達成した。 ^**導入ＤＮＡの量を基準とする。実施例３−シリカ磁気粒子から溶出後のＤＮＡフラグメントの電気泳動シリカ磁気粒子が、異なる量で、異なる分子量のＤＮＡフラグメントを結合又は放出するのかを決定する為に、実施例２において、シリカ磁気粒子に結合し、それから放出されたＤＮＡフラグメントを、次の様に、電気泳動を使用して分析した。シリカ磁気粒子の２つの異なるサンプルから溶出されたλHind III消化物のサンプルを使用して、未処理ＤＮＡ消化物の対照サンプルと一緒にアガロースゲル上に分画した。又、結合し溶出されたΦＸ１７４Hae III消化物のサンプルを、未処理ＤＮＡ消化物の対照サンプルと一緒にアガロースゲル上に分画した。次いで、画分化ＤＮＡの得られたゲルを、ＤＮＡを染色する事の出来る蛍光染料で染色し、この染色ゲルを、分子動力学的蛍光画像機(Molecular Dynamics Fluo roimager)を使用して分析した。制限酵素ダイゲストのそれぞれからの溶出ＤＮＡフラグメントの蛍光強度は、磁気シリカ上で捕獲、及び溶出する前の対照消化物に匹敵するものである。図４及び５は、上述の様に造られた、画分化され、捕獲、及び溶出されたＤＮＡフラグメントの蛍光染色アガロースゲルからの、蛍光光度計で発生した可視像を示す。図４は、１％アガロースゲル上で電気泳動された２μｇのλHind I II消化物を示す。図５は、３％アガロースゲル上で電気泳動された５μｇのΦＸ１７４Hae III消化物を示す。両パネル上で、サンプル１は、未処理ＤＮＡ消化物の対照であり、一方、サンプル２及び３は、２つの異なるシリカ磁気粒子のサンプルに結合し、それから溶出したＤＮＡ消化物のサンプルを示す。対照及び、ここで分析された消化物サンプルのいずれかのセットからのサンプルの間には、相対バンド強度又はバックグランドにおいて実質的な相違は認められず、ここで分析されたシリカ磁気粒子は、分子量によりＤＮＡフラグメントを選択的に結合又は放出しない事を示している。実施例４−シリカ磁気粒子及び磁力を使用して、バクテリア培養からプラスミドＤＮＡの単離プラスミドＤＮＡのいずれかの形態で形質転換された、ＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉバクテリアの培養からのｐＧＥＭ−３ｚｆ（＋）プラスミドＤＮＡを単離する為に、実施例１で調製された再懸濁シリカ磁気粒子を使用した。次の溶液を単離方法において使用した。１．細胞再懸濁溶液：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５１０ｍＭＥＤＴＡ１００μｇ／ｍｌＤＮアーゼ−フリーリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡ）２．カラム洗浄溶液：２００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、又は、１９０ｍＭＫＡｃ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５から成る水性緩衝液を造り、この緩衝液を、９５％エタノールで１：１．４に希釈して調製した。３．ＴＥバッファー：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５１ｍＭＥＤＴＡ４．中和溶液：１．３２ＭＫＯＡｃ（酢酸カリウム）、ｐＨ４．８５．細胞溶解溶液：０．２ＭＮａＯＨ１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）以下に簡単に述べられる工程に従って、清澄な溶解産物を造る為に、バクテリア培養を処理した。１．培養を、マイクロ遠心分離機でトップスピードで１〜２分間、遠心分離に掛けて、１〜３ｍｌのバクテリア培養から細胞を収集した。収集した細胞を２００ｍｌの細胞再懸濁溶液に再懸濁し、マイクロ遠心分離管に移した。得られた再懸濁細胞溶液は濁っていた。２．次いで、２００ｍｌの細胞溶解溶液を、再懸濁細胞溶液に添加し、溶液が、比較的清澄になって、再懸濁細胞が溶解された事を示すまで、反転混合した。３．２００ｍｌの中和溶液をこの可溶化溶液に添加し、反転混合した。この溶解産物は、中和溶液が添加された後に混濁した。４．次いで、溶解産物を清澄にする為に、溶液を５分間、トップスピードでマイクロ遠心分離機で回転させた。５．得られた清澄な溶解産物の上澄液を、新たなマイクロ遠心分離管に移した。次いで、実施例１で調製した塩酸グアニジンの溶液に再懸濁したシリカ磁気粒子を使用して、清澄な溶解産物からプラスミドＤＮＡを単離した。実施例２で開示したプラスミド結合分析で使用されたものと本質的に同じ方法を、粒子及び磁力を使用して、プラスミドＤＮＡの単離に使用した。然しながら、この単離方法は、５００μｌの懸濁粒子を、精製プラスミドＤＮＡの５〜８０μｇに添加する方法から始めるのではなしに、１ｍｌの懸濁シリカ磁気粒子を、直前の工程５から造られた清澄な溶解産物に添加する事によって開始された。後に続くこの単離方法の各後工程でのシリカ磁気粒子に添加される各溶液の容量は、大量のスタート容量を考慮して、それに釣り合う様に調整した。得られた単離プラスミドＤＮＡを、ゲル電気泳動を使用し、且つ分光光度計を使用して、定量的に分析した。ゲル分析結果は、元の多重螺旋プラスミドＤＮＡの高い割合を示した。光学濃度測定は、ＤＮＡの期待範囲での吸光度比（例えば、２６０／２５０ｎｍ及び２６０／２８０ｎｍ）で証明される様に、ＤＮＡ生成を示した。実施例５−シリカ磁気粒子及び真空濾過を使用して、バクテリア培養からプラスミドＤＮＡの単離実施例４で使用した、清澄な溶解産物製造方法と同じ方法を、プラスミドＤＮＡで形質転換したＥ．ｃｏｌｉバクテリアの培養の清澄な溶解産物を造るのに使用した。次いで、プラスミドを、実施例１のシリカ磁気粒子の懸濁液を使用して、一度プラスミドＤＮＡが粒子に結合した結合混合物から粒子を分離する為に、磁力ではなくて真空濾過を使用して、得られた清澄な溶解産物からプラスミドを単離した。又、真空濾過は、単離方法の洗浄工程で、粒子から洗浄溶液を除去するのにも使用される。実施例６−ＲＮＡの結合の例示４Ｍチオシアン酸グアニジン中の１４ｍｇ／ｍｌの磁気シリカを使用して、実施例１と同様にして調製された再懸濁シリカ磁気粒子の７００μｌを、容器中で、³²Ｐでラベル化された、Promega RNA Markers,カタログ番号１５５０の３０μ ｌと、１ｍｇ／ｍｌ溶液のコールド（即ち、未ラベル化）Promega RNA Markersp art #G3191 の５μｌに添加した。得られた混合物を、５分間、室温で培養した。その後で、上澄液を第二容器にデカントしながら、粒子を容器の一側面に引付ける為の磁力を使用して、粒子を捕獲した。第二容器に集められた上澄液は貯えられ、数えられた。次いで、第一容器の捕獲粒子を、カラム洗浄溶液で３回洗浄し、実施例４に開示の様に調製した。粒子は、各洗浄工程後に捕獲され、洗浄液はデカントされた。各デカント洗浄液は貯蔵されて、数えられた。上澄液のカウントの合計及び洗浄のくぼみカウントは、全ての未結合ＣＰＭを決定するのに使用された。第三洗浄工程後に、３７℃に加熱したナノ純水(Nanopure water)の２５０ｍｌ中に粒子を再懸濁し、次いで、溶出液をデカントして、収集しながら、粒子を容器の側面上に保つ為に磁力を使用して、ＲＮＡが、捕獲され、洗浄された粒子から溶出された。次いで、１００μｌの溶出液をカウントした。残留粒子を５００μｌのナノ純水に再懸濁し、次いで、残留している未溶出ＣＰＭの量を決める為にカウントした。上記分析を二度にわたって行った。図６に示される結果は、二度の各セットに対する平均カウント及び各実験で集められたカウントを示す。図６は、この分析のシリカ磁気粒子に暴露されたＲＮＡの２００，０００ＣＰＭの内、平均１２５，０００ＣＰＭが粒子に結合した事になり、粒子に結合したＣＰＭの約１００，０００が放出されて、最終溶出工程で粒子から溶出した事を示す。これらのＲＮＡ結合並びに溶出分析結果は、実施例２に開示のＤＮＡ結合並びに溶出結果に匹敵し得るものである。この分析は、ＲＮＡを単離する為の、本発明方法によるシリカ磁気粒子の可能な適用を示す。実施例７−シリカ磁気粒子からの鉄浸出の分析上記実施例で使用された様なシリカ磁気粒子を、核酸物質の定量分析を妨害すると思われる鉄又はその他の物質を浸出させるそれらの傾向について、粒子に暴露された溶液が分光光度計で分析される場合に、２６０ｎｍ付近でピークを作り出す事によってスクリーンした。シリカ磁気粒子は、次の様にして分析された。１４０ｍｇのシリカ磁気粒子を、１０ｍｌのＤＩ水に再懸濁し、簡単に掻き混ぜた。粒子／水混合物を保つ容器の外側に対して磁石を置き、粒子を磁場に１分間暴露した。混合物中の粒子は、磁石表面に最も近い容器の側に集められ、上澄液を容器の外にデカントしながら、磁石によって容器の側に保たれた。次いで、磁石を取除き、容器に残っている粒子を、別の１０ｍｌのＤＩ水に再懸濁した。この収集、デカント及び再懸濁工程を、三度繰返した。第三のその様な工程の後に、再懸濁粒子を、それぞれ、１０ｍｌの７Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ５．９で二度、１０ｍｌのＤＩ水で二度、そして１０ｍｌの５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で二度洗浄した。それらの洗浄のそれぞれからの上澄液を、それぞれの対照溶液をブランクとして、Hewlett Packard Diode配列分光光度計を使用して、２３０ｎｍ〜３００ｎｍを走査した。上記実施例で使用したシリカ磁気粒子を分析して得られた洗浄溶液のいすれにおいても、２６０ｎｍでのバックグランド以上の吸光度は観察されなかった。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１２月１日【補正内容】請求の範囲１．媒体中で他の物質から生物学的目標物質を単離する方法であって、ａ．生物学的目標物質を含有する媒体を用意し、ｂ．生物学的目標物質と可逆的に結合する事の出来るシリカ磁気粒子を用意し、ｃ．シリカ磁気粒子と媒体とを組合せて、シリカ磁気粒子と生物学的目標物質との複合体を形成し、ｄ．外部磁場を適用して媒体から複合体を除去し、及び、ｅ．生物学的目標物質を溶出させる事によって、複合体から生物学的目標物質を分離して、単離された生物学的目標物質を得る、事を特徴とする方法。２．該方法によって単離される生物学的目標物質が、核酸から成る、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。３．工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する事が出来る、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。４．工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子である、請求項３に記載の生物学的目標物質を単離する方法。５．複合体中の生物学的目標物質の少なくとも６０％が、工程（ｅ）で粒子から溶出される、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。６．工程（ｅ）において、複合体から溶出される生物学目標物質が、５０ｐｐｍ以下の遷移金属混入物を含む、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。７．媒体中で他の物質から生物学的目標物質を単離する方法であって、ａ）生物学的目標物質を含有する媒体を用意する工程、ｂ）粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を持つシリカ磁気粒子を用意する工程、ｃ）媒体とシリカ磁気粒子とから成る混合物を形成する工程、ｄ）混合物中で、生物学的目標物質をシリカ磁気粒子に接着させる工程、ｅ）外部磁場を適用して、混合物から、シリカ磁気粒子と共に、粒子に接着した生物学的目標物質を除去する工程、及び、ｆ）溶出溶液に粒子を暴露する事によって、シリカ磁気粒子から、少なくとも６０％の生物学的目標物質を溶出させる工程、を含む事を特徴とする方法。８．該方法により単離される生物学的目標物質が、核酸物質から成る、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。９．該方法により単離される核酸生物学的目標物質が、プラスミドＤＮＡ物質から成る、請求項８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 10．単離される核酸生物学的目標物質が、ＤＮＡフラグメント物質から成る、請求項８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 11．該方法の工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子である、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 12．工程（ｃ）で形成される混合物が、媒体、シリカ磁気粒子及びカオトロピック塩を含み、カオトロピック塩濃度が、工程（ｄ）において、生物学的目標物質をシリカ磁気粒子に接着させるのに十分に高い、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 13．工程（ｃ）で形成される混合物中のカオトロピック塩が、塩酸グアニジン又はチオシアン酸グアニジンから成る、グアニジニウムカオトロピック塩から成る、請求項１２に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 14．工程（ｃ）で形成される混合物中のカオトロピック塩の濃度が、少なくとも２モルである、請求項１２に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 15．生物学的目標物質が、混合物をインキュベートする事によって、工程（ｄ）においてシリカ磁気粒子に接着する、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 16．生物学的目標物質が、混合物を室温で少なくとも３０秒間インキュベートする事によって、工程（ｄ）においてシリカ磁気粒子に接着する、請求項１５に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 17．シリカ磁気粒子を媒体から除去した後であって、該粒子から生物学的目標物質を溶出する前に、シリカ磁気粒子を洗浄する工程を更に含む、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 18．洗浄工程が、アルコールと塩とから成る洗浄溶液を使用して行われる、請求項１７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 19．洗浄工程が、少なくとも３０容量％のアルコールと緩衝液とから成る洗浄溶液を使用して行われる、請求項１８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 20．生物学的目標物質が、水又は低イオン強度の溶出溶液を使用して、工程（ｆ）で、シリカ磁気粒子から溶出される、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 21．工程（ｆ）で、シリカ磁気粒子から溶出される生物学的目標物質が、高分子又は金属混入物を実質的に含まない、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 22．媒体中で、他の物質からプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法であって、ａ）プラスミドＤＮＡを含有する媒体を用意する工程、ｂ）粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を持つシリカ質酸化物被覆磁気粒子を用意する工程、ｃ）媒体、シリカ質酸化物被覆磁気粒子及びカオトロピック塩を含む混合物を形成する工程であって、混合物中のカオトロピック塩濃度が、プラスミドＤＮＡを粒子に接着させるのに十分に高い工程、ｄ）少なくとも或程度の生物学的目標物質が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着するまで、混合物をおよそ室温でインキュベートする工程、ｅ）外部磁場を使用して、混合物からシリカ質酸化物被覆磁気粒子を除去する工程、及び、ｆ）粒子を溶出溶液に暴露する事によって、シリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着したプラスミドＤＮＡの少なくとも６０％を溶出させる工程、を含む事を特徴とする方法。 23．工程（ｃ）で形成された混合物中のカオトロピック塩が、塩酸グアニジン又はチオシアン酸グアニジンから成るグアニジニウムカオトロピック塩である、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 24．工程（ｃ）で形成された混合物中のカオトロピック塩の濃度が、約０．１Ｍ〜７Ｍである、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 25．シリカ質酸化物被覆磁気粒子を媒体から除去した後であって、該粒子からプラスミドＤＮＡ物質を溶出する前に、シリカ質酸化物被覆磁気粒子を洗浄する工程を更に含む、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 26．洗浄工程が、アルコールと塩とを含む洗浄溶液を使用して行われる、請求項２５に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 27．洗浄工程が、少なくとも３０容量％のアルコールと緩衝液とを含む洗浄溶液を使用して行われる、請求項２５に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 28．工程（ｆ）でシリカ質酸化物被覆磁気粒子から溶出されるプラスミドＤＮＡが、更なる処理又は分析を妨害する様な高分子又は金属混入物を実質的に含まない、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 29．媒体から生物学的目標物質を単離する為のキットであって、第一容器の水溶液中に懸濁されたシリカ質酸化物被覆磁気粒子のアリコットを含む、粒子が、粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を有するキット。 30．第二容器にカオトロピック塩を、及び第三容器に洗浄溶液を更に含む、請求項２９に記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．媒体中で他の物質から生物学的目標物質を単離する方法であって、ａ．生物学的目標物質を含有する媒体を用意し、生物学的目標物質と可逆的に結合する事の出来るシリカ磁気粒子を用意し、ｂ．シリカ磁気粒子と媒体とを組合せて、シリカ磁気粒子と生物学的目標物質との複合体を形成し、ｃ．外部磁場を適用して媒体から複合体を除去し、及び、ｄ．生物学的目標物質を溶出させる事によって、複合体から生物学的目標物質を分離して、単離された生物学的目標物質を得る、事を特徴とする方法。２．該方法によって単離される生物学的目標物質が、核酸から成る、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。３．工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する事が出来る、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。４．工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子である、請求項３に記載の生物学的目標物質を単離する方法。５．複合体中の生物学的目標物質の少なくとも６０％が、工程（ｄ）で粒子から溶出される、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。６．工程（ｄ）において、複合体から溶出される生物学目標物質が、５０ｐｐｍ以下の遷移金属混入物を含む、請求項１に記載の生物学的目標物質を単離する方法。７．媒体中で他の物質から生物学的目標物質を単離する方法であって、ａ）生物学的目標物質を含有する媒体を用意する工程、ｂ）粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を持つシリカ磁気粒子を用意する工程、ｃ）媒体とシリカ磁気粒子とから成る混合物を形成する工程、ｄ）混合物中で、生物学的目標物質をシリカ磁気粒子に接着させる工程、ｅ）外部磁場を適用して、混合物から、シリカ磁気粒子と共に、粒子に接着した生物学的目標物質を除去する工程、及び、ｆ）溶出溶液に粒子を暴露する事によって、シリカ磁気粒子から、少なくとも６０％の生物学的目標物質を溶出させる工程、を含む事を特徴とする方法。８．該方法により単離される生物学的目標物質が、核酸物質から成る、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。９．該方法により単離される核酸生物学的目標物質が、プラスミドＤＮＡ物質から成る、請求項８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 10．単離される核酸生物学的目標物質が、ＤＮＡフラグメント物質から成る、請求項８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 11．該方法の工程（ｂ）で用意されるシリカ磁気粒子が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子である、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 12．工程（ｃ）で形成される混合物が、媒体、シリカ磁気粒子及びカオトロピック塩を含み、カオトロピック塩濃度が、工程（ｄ）において、生物学的目標物質をシリカ磁気粒子に接着させるのに十分に高い、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 13．工程（ｃ）で形成される混合物中のカオトロピック塩が、塩酸グアニジン又はチオシアン酸グアニジンから成る、グアニジニウムカオトロピック塩から成る、請求項１２に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 14．工程（ｃ）で形成される混合物中のカオトロピック塩の濃度が、少なくとも２モルである、請求項１２に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 15．生物学的目標物質が、混合物をインキュベートする事によって、工程（ｄ）においてシリカ磁気粒子に接着する、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 16．生物学的目標物質が、混合物を室温で少なくとも３０秒間インキュベートする事によって、工程（ｄ）においてシリカ磁気粒子に接着する、請求項１５に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 17．シリカ磁気粒子を媒体から除去した後であって、該粒子から生物学的目標物質を溶出する前に、シリカ磁気粒子を洗浄する工程を更に含む、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 18．洗浄工程が、アルコールと塩とから成る洗浄溶液を使用して行われる、請求項１７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 19．洗浄工程が、少なくとも３０容量％のアルコールと緩衝液とから成る洗浄溶液を使用して行われる、請求項１８に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 20．生物学的目標物質が、水又は低イオン強度の溶出溶液を使用して、工程（ｆ）で、シリカ磁気粒子から溶出される、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 21．工程（ｆ）で、シリカ磁気粒子から溶出される生物学的目標物質が、高分子又は金属混入物を実質的に含まない、請求項７に記載の生物学的目標物質を単離する方法。 22．媒体中で、他の物質からプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法であって、ａ）プラスミドＤＮＡを含有する媒体を用意する工程、ｂ）粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を持つシリカ質酸化物被覆磁気粒子を用意する工程、ｃ）媒体、シリカ質酸化物被覆磁気粒子及びカオトロピック塩を含む混合物を形成する工程であって、混合物中のカオトロピック塩濃度が、プラスミドＤＮＡを粒子に接着させるのに十分に高い工程、ｄ）少なくとも或程度の生物学的目標物質が、シリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着するまで、混合物をおよそ室温でインキュベートする工程、ｅ）外部磁場を使用して、混合物からシリカ質酸化物被覆磁気粒子を除去する工程、及び、ｆ）粒子を溶出溶液に暴露する事によって、シリカ質酸化物被覆磁気粒子に接着したプラスミドＤＮＡの少なくとも６０％を溶出させる工程、を含む事を特徴とする方法。 23．工程（ｃ）で形成された混合物中のカオトロピック塩が、塩酸グアニジン又はチオシアン酸グアニジンから成るグアニジニウムカオトロピック塩である、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 24．工程（ｃ）で形成された混合物中のカオトロピック塩の濃度が、約０．１Ｍ〜７Ｍである、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 25．シリカ質酸化物被覆磁気粒子を媒体から除去した後であって、該粒子からプラスミドＤＮＡ物質を溶出する前に、シリカ質酸化物被覆磁気粒子を洗浄する工程を更に含む、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 26．洗浄工程が、アルコールと塩とを含む洗浄溶液を使用して行われる、請求項２５に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 27．洗浄工程が、少なくとも３０容量％のアルコールと緩衝液とを含む洗浄溶液を使用して行われる、請求項２５に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 28．工程（ｆ）でシリカ質酸化物被覆磁気粒子から溶出されるプラスミドＤＮＡが、更なる処理又は分析を妨害する様な高分子又は金属混入物を実質的に含まない、請求項２２に記載のプラスミドＤＮＡ物質を単離する方法。 29．媒体から生物学的目標物質を単離する為のキットであって、第一容器の水溶液中に懸濁されたシリカ質酸化物被覆磁気粒子のアリコットを含む、粒子が、粒子１ｍｇ当たり、生物学的目標物質の少なくとも２μｇと可逆的に結合する能力を有するキット。 30．第二容器にカオトロピック塩を、及び第三容器に洗浄溶液を更に含む、請求項２９に記載のキット。