JPH11510364A

JPH11510364A - ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップの特異的カップリングの方法、およびｍＲＮＡおよび完全なｃＤＮＡの調製

Info

Publication number: JPH11510364A
Application number: JP8533070A
Authority: JP
Inventors: ニコラエウナメレンコーワ，イレーナ; エドワールデュマ，ミルヌ
Original assignee: ジェンセット
Priority date: 1995-05-02
Filing date: 1996-04-29
Publication date: 1999-09-14
Also published as: CA2220045A1; ATE227346T1; PT824598E; FR2733762A1; FR2733762B1; DE69624695T2; AU5982996A; CA2220045C; ES2186778T3; US6022715A; DE69624695D1; DK0824598T3; EP0824598A2; WO1996034981A2; EP0824598B1; AU719217B2; WO1996034981A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、アミン官能基によって官能化した分子により真核性ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップを特異的にカップリングする方法に関する。本発明は、ｍＲＮＡ５′末端を単離する方法、およびｍＲＮＡの５′末端に相補性の一本鎖ｃＤＮＡ末端およびｍＲＮＡ５′末端に相当する二本鎖ｃＤＮＡの製造法も提供する。本発明は、完全なｍＲＮＡに相当する全長ｃＤＮＡの単離法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップの特異的カップリングの方法、およびｍＲＮＡおよび完全なｃＤＮＡの調製本発明は、真核メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）の５′末端のキャップの特異的カップリングの方法に関する。本発明は、５′末端にキャップを含んでなる真核細胞からｍＲＮＡを単離する方法にも関する。また、本発明は、ｍＲＮＡの５′末端に相補性の一本鎖（ｓｓ）ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ並びに完全なｃＤＮＡの５′末端に相当する二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡの製造法に関する。更に、本発明は、上記方法を行うための試薬キットを含んでなる。本発明は、メッセンジャーＲＮＡを認識するタンパク質を捕捉する方法にも関する。最後に、本発明は、５′キャップによって分子に特異的にカップリングしたｍＲＮＡ断片にも関する。遺伝子の活性は、転写の開始部位の上流に位置した核酸ドメイン(nucleic dom aines)によって支配される。転写の開始部位の最初の５００ヌクレオチド上流以内に位置したゲノムＤＮＡの領域が基端プロモーター(proximal promoter)を構成していることが一般に認められている。後者は、転写の制御に必要な情報の大部分を含んでいる。遺伝子の転写を促進するまたは阻害する幾つかの配列は、実際には基端プロモーターの上流（５′側）または下流（３′側）に位置している。遺伝子の活性を制御する配列の知識は、遺伝子の発現の機構を理解し、長期間では改変する上で極めて重要である。これらの制御ドメインの決定は、メッセンジャーの５′末端の単離および特性決定によって著しく促進される。上記末端は、実際に通常の分子生物学の手法による続いてプロモーターを単離し、あるいは遺伝子の同定およびゲノムＤＮＡ配列のコンピューター解析（相同配列）によるプロモーターの位置決定のためのヒトゲノムにおける足場として用いることができる。ｍＲＮＡの５′末端の配列は極めて重要であるが、特異的なｍＲＮＡを特性決定して単離するのに用いられる通常の手法は、相当するｃＤＮＡクローンの単離を伴っている。次に、構築したならば、これらのクローンを多少ｍＲＮＡの５′ 末端に相当する部分に切り詰める。５′末端の単離および特性決定において、最近明確な改良がなされた。Frohman et al．(1)およびDelort et al．(2)は、ｍＲＮＡの５′末端に相当するｃＤＮＡの３′末端の、それらの末端にホモポリマーを付加してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した後に完全なｃＤＮＡのクローニングを促進することによる単離を記載している。しかしながら、これらの方法で提供される応用例は、比較的多量のメッセンジャーＲＮＡにしか適用されない。Delort et al．(2)は、この方法は、発現が弱い分子種には適用が困難であることを示した。この方法の無効性は、ｃＤＮＡの３′末端への末端トランスフェラーゼの活性によるホモポリマー配列の付加による。実際に、この場合には、第二の鎖の合成を開始し、場合によっては次のＰＣＲを行うのに用いられるプライマー（リターンプライマーと呼ばれる）は、必然的にその３′末端にホモポリマー性テイルを含んでいる。ｃＤＮＡの３′末端に加えられる配列に対して抗補体性の配列のこのホモポリマー性テイルが、内部のホモポリマー性配列とハイブリッドして、予想した断片より短いＤＮＡ断片の発生に寄与することができる。この方法の感受性を制限する第二の因子を、非特異的プライミングによって合成されたｃＤＮＡ断片の増幅にリンクさせる。総てのこれらのｃＤＮＡ断片は、それらがハイブリダイゼーションに好ましいホモポリマー性配列を有するならばリターンプライマーの可能な標的である。ホモポリマー性テイルの付加に関連した不都合を解決するため、Dumas Milne Edwards et al．(3)は、ｃＤＮＡの３′末端に、Ｔ₄ファージＲＮＡリガーゼの作用により官能化オリゴヌクレオチド（タグ）を連結した。ヌクレオチドの官能化は、タグの自己連結を防止するためであった。そのため、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル官能基を持たない５′Ｐ末端および３′末端を有していなければならなかった。一本鎖ｃＤＮＡのタグ形成はホモポリマー性テイルの付加より優れているが、画定配列がｃＤＮＡ分子に付加するからである。更に、３′末端にホモポリマー配列を有するプライマーを用いることに関連した問題点も、完全に除かれる。これにより、ｃＤＮＡ３′末端の単離がかなり改良された。上記の方法はいずれも、ｃＤＮＡ、すなわちトランススクリプターゼの活性の生成物で出発するという限界を有している。この酵素は、高い、例えば二次構造における幾つかの領域においてメッセンジャーＲＮＡの鎖の複製が困難なことがあることが知られている。この問題点を回避するため、ｍＲＮＡを直接タグ形成することが提案された(4 -7)。この第二の方法は、ｍＲＮＡの５′末端を標識し、クローニング操作の固定配列を提供することを完全にまたは部分的に可能にするリボヌクレオチド配列をｍＲＮＡの５′末端に付加することに基づいている。真核ｍＲＮＡの５′末端は、特別な化学構造、すなわちキャップ（５′−三リン酸結合によってメッセンジャーＲＮＡの５′末端に連結した７−メチルグアノシン）によって保護されている。現在の知識の状態では、リボヌクレオチド配列をｍＲＮＡキャップに直接付加することができる生物学的手段はない。更に、この方法を用いてＲＮＡを単離するには、最初にｍＲＮＡからキャップを除いた後、選択されたリボヌクレオチド配列を付加する必要がある。この方法は、第二のｃＤＮＡ鎖を合成し、場合によってはＰＣＲを行うのに用いることができる特異的なプライマーの標的として用いることができる既知配列によって５′末端にＲＮＡを特異的に標識するという利点を有する。しかしながら、ＲＮＡについて行った操作、特に行われる酵素反応の数により、多量のｍＲＮＡに対してこの方法を用いることができる使用が限定される。この方法は多数の酵素段階を必要とする不都合があり、これにより限定されることがあり、酵素がＲＮＡアーゼで汚染されることがあり、それぞれの段階の間で核酸を精製することができる操作は原料が高価であるからである。最後に、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡヘテロ二本鎖の選択の後、ｍＲＮＡの５′末端のキャップを認識して、結合する特定のタンパク質の特性を用いるｍＲＮＡの精製法(8)が記載されている。この方法は、実際にｍＲＮＡ−ｃＤＮＡヘテロ二本鎖を予め形成させることを伴い、従って線状配置または予め変性したｍＲＮＡにしか適用することができない。しかしながら、ＲＮＡ分子を直線化してキャップの付着を容易にするのに必要な変性条件下では、この過程で記載された上記タンパク質も変性し、その認識および親和性特性を喪失する。従って、これまで報告された方法は、いずれも完全なメッセンジャーＲＮＡを単離することはできない。従って、本発明の一つの目的は、上記の不利益のない完全なメッセンジャーＲＮＡおよび特にその５′末端を単離できる方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、ｍＲＮＡの５′末端に相補性の一本鎖ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡおよび特に完全なｃＤＮＡの５′末端に相当する二本鎖ｃＤＮＡの３′末端の製造法を提供することである。これを行うため、本発明は、最初に、アミン官能基によって官能化した分子によってＲＮＡ断片、特に真核ｍＲＮＡの５′末端のキャップを特異的にカップリングする方法であって、 a) 上記ｍＲＮＡ断片の３′末端を特異的に改変して、最後のヌクレオチドが２′および３′位にＯＨ基を最早含まないようにし、 b) ジオールのジアルデヒドへの特異的酸化を、上記ｍＲＮＡ断片の５′末端のメチルグアノシンの２′，３′−シス−ジオール官能基で行い、 c) 段階b)で得た２′，３′−ジアルデヒドを、上記の生物学的分子の上記アミン官能基とカップリングさせる段階を含んでなる方法を提供する。「アミン官能基によって官能化された分子」とは、本発明では、アミン官能基を天然で含むことがある分子またはアミン官能基を付加した分子を意味するものと理解される。「アミン官能基」とは、アミン基それ自体、またはヒドラジド、カルバジド、チオカルバジドまたはセミカルバジドのような反応性アミン基を含む官能基を意味するものと理解される。メッセンジャーＲＮＡの５′末端は、特定の構造、すなわちキャップによって保護されている。キャップは、７位がメチル化されたグアノシンから形成され、５′，５′−三リン酸結合によってＲＮＡの第一塩基の５′末端に結合されている。場合によっては、グアノシンは２および７位がメチル化されている。最後に、微量メッセンジャーおよび多数の核内低分子ＲＮＡに対しては、グアノシンは２、７および７位(9)でトリメチル化されている。この特異的ヌクレオシドの糖（リボース）は、２′，３′−シス−ジオール官能基を有する。ｍＲＮＡ分子では、２つの末端（キャップを有する５′および最後の糖２′，３′−ＯＨを有する３′）だけがこれらのジオールを有する。従って、本発明によれば、アミン官能基を含む生物学的分子を５′末端に特異的に向けるため、上記ＲＮＡ分子の３ ′末端を特異的に改変する。本発明によれば、この場合には、５′にジオールが１個だけ残っており、当業者に周知の特異的な酸化条件下で２′，３′−ジアルデヒドに酸化される(10,11)。次に、得られたジアルデヒドを、特にアミン官能基を含む分子を含む多数の試薬と反応させることができる。光活性化可能な分子のカップリング(10)、タンパク質(12)、オリゴヌクレオチド(11)のビオチン化は、ジアルデヒドをビオチン−ヒドラジンと反応させることによって既に記載されている。ヒドラジン含有合成オリゴヌクレオチドの末端にタンパク質が付着することが記載されている(13)。しかしながら、核酸の場合には、キャップ上に付着は起こらない。段階a)において、「３′末端の改変」は最後の塩基の上記ＯＨ基の置換、転化または脱離、または１個以上のヌクレオチドの上記ｍＲＮＡ断片の３′末端に対する脱離または付加を意味し、３′末端の最後のヌクレオチドはグリコシド環の２′および／または３′位にＯＨ基を最早含まないものと理解される。段階a)の目的は、３′末端から２′，３′−ジオール官能基を除去し、ジオール官能基の特異的酸化が３′末端では起こらないが、５′末端だけで起こるようにすることである。段階a)は、幾つかのＲＮＡ断片がその３′端の最後の塩基の２′および３′位にジオールを含まない限り、任意である。一つの態様では、段階a)の改変は、上記ｍＲＮＡ断片の３′末端にヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであってその３′末端が２′，３′−ジオール官能基を含まないものの付加によって行われる。添加されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、その３′末端に、例えば保護基によってブロックされた２′および３′に少なくとも１個のＯＨ基を有することがある。ｍＲＮＡ断片の３′末端とヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとの結合は、当業者に知られている方法によってヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５′末端との５′−３′ヌクレオチド間結合によって得ることができる。特定の態様では、ヌクレオシド二リン酸は、３′および５′（ｐＮｐ）において、酵素、特にＲＮＡリガーゼ、更に具体的にはＴ４ファージＲＮＡリガーゼを用いて、特にｐＣｐの付加によって連結される(14-15)。ｍＲＮＡ断片が、段階a)において２′，３′−ジオール官能基を有する３′で終わるポリＡ３′末端を含むときには、上記ｍＲＮＡ断片の３′末端の特異的改変は制御されたアルカリ加水分解の後に、アルカリ加水分解によって生成したポリＡ３′末端における断片を分離する段階によって行う。実際に、アルカリ加水分解は、３′末端で特異的に起こる。これは、５′にキャップを含む第一の断片を包含する幾つかの断片を生成し、他のものは５′ＯＨを有し、その３′末端は、初期のｍＲＮＡ断片の３′末端を含む断片であって、従って除去すべきであるものを除き、３′−リン酸、２′−リン酸または（２′ ，３′）−シクロリン酸型である。この除去は、任意の既知の適当な手段によって行うことができる。ｍＲＮＡ断片は、ポリＡ断片からなる３′末端を含んでいることが極めて多い。この場合には、特にオリゴ−ｄＴｓが付着する固相を含むクロマトグラフィカラムを用いて特にオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドに付着することによって上記第二の断片を除去することができる。制御されたアルカリ加水分解は、０．１ＭＮａＯＨの存在下にて、４℃にて４０〜６０分間行うのが有利である。過ヨウ素酸（ＨＩＯ₄）または四酢酸鉛によるα−グリコール型ジオールの酸化は、取り分け２個のヒドロキシル官能基の間のＣ−Ｃ結合の開裂を引き起こし、ジアルデヒドを形成する。段階b)の特定の態様では、ジオールをジアルデヒドに特異的に酸化する上記試薬は、過ヨウ素酸塩、特に過ヨウ素酸ナトリウムである。段階c)の一態様では、酸化によって形成したジアルデヒド基は、酸性ｐＨ条件下、特に４〜６のｐＨで主としてアミン官能基と反応する。次に、この結合をＮａＢＨ₄のようなホウ水素化物、好ましくはＮａＢＨ₃ＣＮのようなシアノホウ水素化物で還元し、ヒドラゾン官能基を安定化した後、ヒドラジドに転換することによって安定化する。適当な方法では、上記の官能化分子は、生物学的分子である。生物学的分子としては、特にアビジンまたは抗体のようなタンパク質、ビタミンまたはリガンド／レセプター相互作用に用いられるリガンド分子、あるいはオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明は、真核ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップの特異的標識法であって、本発明によるカップリング法であって、上記分子が標識分子であることを特徴とする方法も提供する。「標識分子」は、本発明では、直接または間接的に、すなわち別の分子および／または固相と共有カップリングまたは相互作用によって結合した後に検出することができる分子を意味するものと理解される。「直接検出」とは、特に、上記分子自身が放射性原子のような検出可能な元素を含み、または上記分子を発色基剤によって検出することができる酵素とカップリングさせ、または上記分子を蛍光分子にカップリングさせる場合を意味するものと理解される。「間接的検出」とは、特に、上記分子が、放射性原子、酵素または蛍光分子のような直接検出可能な元素を含む別の分子自身と物理化学的にまたは共有カップリングによって反応することができる場合を意味するものと理解される。本発明の主題は、生物学的試料から真核ｍＲＮＡの５′末端を単離する方法であり、本発明によるカップリング法を用いて、上記分子が、カップリングを行うｍＲＮＡ断片を単離できる分子であることを特徴とする方法でもある。「ｍＲＮＡ断片の５′末端」とは、５′にメチルグアノシンキャップを含む任意の断片を意味するものと理解される。「単離できる分子」とは、カップリングを行うｍＲＮＡ断片を直接または間接的に単離できる分子を意味するものと理解される。「直接単離」とは、タンパク質の場合における沈澱の場合が挙げられる。「間接的単離」とは、上記分子が、固相または固相に付着した第二の分子と反応することができる場合が挙げられる。本発明の目的は、本発明によるカップリング、標識または単離法を行うのに有用な試薬キットであり、上記ｍＲＮＡの３′末端における改変のための試薬、５′末端における２′，３′−ジオール官能基を酸化してジアルデヒドとする試薬、およびジアルデヒドと上記分子の上記アミン官能基との間の共有カップリングの試薬を含んでなる試薬キットでもある。詳細には、上記酸化試薬は過ヨウ素酸ナトリウムである。一の態様によれば、上記アミン官能基とカップリングする上記試薬は、ｐＨが４〜６の酸性緩衝液とホウ水素化物からなる還元試薬とを含んでいる。有利な別形によれば、上記３′末端を改質する上記試薬は、上記ｍＲＮＡの３ ′末端を、３′末端に２′，３′−ジオール官能基を含まないオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドの５′末端とカップリングすることができる試薬である。詳細には、上記ｍＲＮＡの３′末端を改質するための上記試薬は、ヌクレオチド３′，５′−二リン酸ｐＮｐおよび連結酵素ＲＮＡリガーゼ、特にＴ４ＲＮＡリガーゼからなっている。本発明では、５′末端の化学的反応性およびこれを特に５′末端について化学的に改変し、分子、特にビオチンのような生物学的分子をこれに付着させることができることを利用することによって、ｍＲＮＡおよび特に完全なｍＲＮＡの５ ′末端を単離することもできる。続いて、このようにして標識したＲＮＡを、例えばビオチン化ＲＮＡの場合にストレプトアビジンにカップリングした磁性ビーズを用いて選択することができる通常の手法によって選択することができる。この場合には、本発明は、キャッピングしたアビジンまたはストレプトアビジンビーズ、従って完全なメッセンジャーまたは完全なメッセンジャーの５′末端で捕捉することによって精製することができる。更に精確には、本発明の目的は、生物学的試料から５′末端において完全なｍＲＮＡを単離する方法であって、 1) ｍＲＮＡの５′末端のキャップの特異的標識を、本発明のカップリング法に記載の第一の分子Ｐ１で行って、結合体Ｐ１−ｍＲＮＡを得て、 2) 上記の第一の生物学的分子で標識した上記ｍＲＮＡ（Ｐ１−ｍＲＮＡ）を、上記の第一の分子に共有的または非共有的に結合している第二の分子Ｐ２に暴露して、結合体またはそれぞれ複合体（Ｐ２／Ｐ１−ｍＲＮＡ）を形成し、 3) 上記結合体または上記複合体Ｐ２／Ｐ１−ｍＲＮＡを試料から分離し、 4) Ｐ２およびＰ１の間の共有結合の開裂または脱複合体形成を場合によって行い、標識したｍＲＮＡＰ１−ｍＲＮＡを回収することを特徴とする、方法である。適当な方法では、段階2)において、上記の第二の分子を固相に付着させ、段階 3)において、上記結合体または上記複合体でコーティングした固相を試料から分離する。しかしながら、上記の分子Ｐ１およびＰ２がタンパク質であるときには、複合体Ｐ２／Ｐ１を例えば沈殿によって回収することができ、この場合には固相を使用する必要はない。一の態様では、第一（Ｐ１）および第二の分子（Ｐ２）として、非共有形結合によって互いに相互作用している生物学的分子を用いる。このような対は、周知である。特に、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）／抗−ジゴキシゲニン抗体（抗−ＤＩＧ）のような抗原／抗体の対、またはビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン型の生物学的分子の間の相互作用、あるいは相補性核酸の間のハイブリダイゼーション反応が挙げられる。Ｐ２の固相への付着は、当業者に知られている方法によって共有的または非共有的であることがある。特定の態様では、Ｐ１はビオチンヒドラジドであり、Ｐ２はアビジンまたはストレプトアビジンである。この場合には、アビジンまたはストレプトアビジンは、単に２％ＳＤＳ中で約９５℃まで加熱することによってビオチン−ｍＲＮＡ結合体から分離することができる。固相は、生物学的試料が存在する容器の内面または上記の容器に導入されるビーズのような成分からなることができる。本発明によるｍＲＮＡの単離法は、Ｐ１と上記ｍＲＮＡとの間の開裂の追加段階であって、上記の第一の生物学的分子Ｐ１を分離して、カップリングしていないｍＲＮＡを回収する段階を含むことができる。本発明の目的は、本発明によるｍＲＮＡ５′末端を単離する方法を行うのに有用な単離試薬キットであって、５′においてキャップを本発明による上記の第一の生物学的分子Ｐ１とカップリングする特定のｍＲＮＡの試薬キットの成分と、上記第二の分子の溶液、または上記の第二の生物学的分子Ｐ２が共有的または非共有的に付着する固相を含むことを特徴とする試薬キットでもある。本発明の目的は、一本鎖ｃＤＮＡ３′末端、特に完全なｃＤＮＡの製造法であって、下記の段階 a) 本発明によるｍＲＮＡ５′末端の単離法によって得たｍＲＮＡ５′末端、および特に完全なｍＲＮＡの逆転写を行い、 b) 一本鎖ＲＮＡおよび非ハイブリッドＲＮＡ断片を除去して、ｍＲＮＡが、５′キャップが上記第一の分子によって特異的にカップリングしている完全なｍＲＮＡであるｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ二本鎖の個体群を得て、 c) 上記ヘテロ二本鎖を、上記第二の生物学的分子でコーティングした固相によって捕捉し、 d) ヘテロ二本鎖の脱ハイブリダイゼーションを行って、３′末端を含んでなる一本鎖ｃＤＮＡ断片、特に完全な一本鎖ｃＤＮＡを回収するを含んでなる方法でもある。有利なことには、段階b)において、一本鎖ＲＮＡまたは非ハイブリッドＲＮＡ断片の除去を、一本鎖または非ハイブリッドＲＮＡを分解し、完全なＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を残す酵素を用いて酵素処理によって行う。特に、ｃＤＮＡの合成の後に、ＲＮＡ分子または遊離のＲＮＡ断片のＴ１ＲＮアーゼまたはＳ１ヌクレアーゼによる除去により、キャップしたｍＲＮＡ分子を含むヘテロ二本鎖の個体群が産生される。ＲＮＡ分子のカップリング、特にビオチン化により、上記方法により分子を捕捉し、ｃＤＮＡ３′末端、特に完全なｃＤＮＡの分子を精製することができる。本発明は、化学的経路により、二本鎖ｃＤＮＡの製造のための真核メッセンジャーＲＮＡのキャップに「タグ」を連結することもでき、上記タグ配列は第二のｃＤＮＡ鎖を合成するのに用いられるプライマーの標的として働く。「タグ」とは、本発明では、この配列を得ることができるようにした方法とは無関係に所定の核酸配列（デオキシリボ、リボヌクレオチドなど）を意味するものと理解される。従って、これは、これらを得るのに用いた化学とは無関係に天然または合成配列をカバーする。本発明によるタグ作成法は、ｍＲＮＡの５′末端のタグ作成を行う酵素の使用に関連した問題点を除くことができる。キャップを予め除去することを伴うｍＲＮＡのタグ形成の酵素的経路では、連結反応は１個の３′−ＯＨ末端を５′−Ｐ末端に結合する酵素（Ｔ４ＲＮＡリガーゼ）によって触媒される。このため、ｍＲＮＡの「脱キャッピング(uncapping)」の前には、キャッピングされていないＲＮＡの５′−Ｐ末端を不活性化し、従って酵素的段階（細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）のようなホスファターゼによって触媒される）を加える必要がある。使用した方法はキャップの反応性に基づいているので、ＲＮＡの複雑な個体群では、キャッピングされたメッセンジャーＲＮＡだけがタグ形成される。従って、本発明の目的は、ｍＲＮＡ５′末端に相当する真核性の二本鎖ｃＤＮＡおよび特に完全なｃＤＮＡの製造法であって、下記の a) 真核ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップのカップリングを本発明の方法に従って行い、上記官能化分子が３′末端にアミン官能基を含むオリゴヌクレオチドタグであり、ｍＲＮＡの３′末端の改変の第一段階が任意であり、 b) 段階a)で得た連結ｍＲＮＡの逆転写を行い、 c) 段階b)で得たヘテロ二本鎖を変性し、一本鎖ＲＮＡを除去して、第一のｃＤＮＡ鎖を得た後、 d) 第二の合成を、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーであって、その配列が上記オリゴヌクレオチドタグ配列の全体または一部に対して抗補体性であるものを用いて行う段階を行うことを特徴とする、方法でもある。キャップを介して逆転写を行うことが可能であることは、実際に本発明によって見出だされた。この可能性は、本発明以前には全く例示されていなかったものである。この方法により、ｍＲＮＡの５′末端に相当する末端を含む二本鎖ｃＤＮＡ、および特に完全なメッセンジャーＲＮＡに相当する完全なｃＤＮＡを得ることができる。段階a)の化学的連結法はジオールの反応性を用いているので、キャッピングしたＲＮＡ分子では、ｍＲＮＡ断片の２つの末端が反応することができる。キャップだけの水準での反応が可能であり、そのためには３′−ＯＨ官能基を除去することによるキャップしたＲＮＡの３′末端をブロックする必要がある。しかしながら、タグのｍＲＮＡの３′末端への連結は、第３図の略図から明らかなように本発明の使用を全く限定しない。実際に、この場合には３′−３′連結が関与しており、いずれにしても、逆転写を開始するのに用いたプライマーは加えたヌクレアーゼ配列の上流に位置している。収率を一層良好にするには、タグを上記ＲＮＡの５′末端に特異的に連結する目的でのｍＲＮＡの３′末端の改質の段階が好ましいことがある。本発明による二本鎖ｃＤＮＡの製造法の段階a)において、化学的に合成したオリゴヌクレオチドタグが連結に用いるのに好ましい。このオリゴヌクレオチドタグの合成は、プライマー伸張の生成物に相補性でないオリゴヌクレオチドを用い、異種ＤＮＡの増幅を回避するのに重要であることを考慮して行う。本発明に用いたオリゴヌクレオチドタグの長さは、ＤＮＡポリメラーゼによって用いられるプライマーのハイブリダイゼーションを行うのに十分なものであるべきである。少なくとも１０ヌクレオチドに等しい長さのオリゴヌクレオチドを用いるのが好ましい。本発明を更に良好に実施するには、増幅の追加段階を行うのに十分な長さを有するオリゴヌクレオチドタグを用いるのが好ましいことがある。これらの条件下では、オリゴヌクレオチドタグの長さは１０〜４０ヌクレオチドであるのが有利である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグのアミン官能基は、その３′末端におけるヒドラジド基である。本発明のもう一つの目的は、上記の二本鎖ｃＤＮＡの製造法を行うキットであり、特に場合によってはその３′末端にアミン官能基を含むオリゴヌクレオチドタグと、ｍＲＮＡの５′末端に連結させる試薬とを含んでなるキットからなっている。本発明の特別な態様によれば、キットは、初期のＲＮＡ鋳型をｓｓ−ｃＤＮＡに逆転写するプライマーおよび酵素、および第二の鎖を合成するプライマーおよび酵素も含んでいる。本発明のもう一つの特別な別形によれば、キットは、クローニングした二本鎖核酸の増幅を行うプライマーおよび酵素も含んでいる。本発明の目的は、ｍＲＮＡを認識するタンパク質Ｐｏを捕捉する方法であって、本発明による単離法によって得たｍＲＮＡを用いて、これを上記タンパク質に暴露した後、複合体（タンパク質／完全なｍＲＮＡ）を回収し、脱複合体形成を行って上記タンパク質を回収することを特徴とする方法でもある。使用した上記ｍＲＮＡを上記Ｐ１分子にカップリングすることができ、またはそれから分離することができる。同様に、上記ｍＲＮＡまたはＰ１−ｍＲＮＡ結合体を、固相に付着させることができる。特に、Ｐ１−ｍＲＮＡ結合体は、それ自身が上記固相に付着している上記Ｐ２分子との相互作用によって固相に付着させることができる。この捕捉法は、特に少なくとも２つの生物学的に重要な状況翻訳の制御およびメッセンジャーＲＮＡの安定性に関与しているタンパク質の単離、ｍＲＮＡがプレメッセンジャーＲＮＡであるときには、スプライシングに関与するタンパク質または複合体（ＳＮＵＲＰＳ）を捕捉するのに用いることができるに適用することができる。本発明の他の利点および特徴は、下記の詳細な例示のための態様を考慮すれば明らかになるであろう。これらの例は、第１図によって示されており、放射性³² ＰｐＣｐの連結によって標識したキャップされていないオリゴヌクレオチド（レーンＡおよびＢ）およびキャップしたオリゴヌクレオチド（レーンＣおよびＤ）のポリアクリルアミドゲル電気泳動であって、実施例１に記載のキャップビオチン化工程を施したもの（レーンＢおよびＤ）およびこの工程を施さなかったもの（レーンＡおよびＣ）を表している。第２図は、ビオチン化して、磁性のストレプトアビジンビーズによって捕捉されたオリゴヌクレオチドの回収の際に得られた結果を示している。第３図は、核酸をｍＲＮＡの５′末端に化学的に連結するための略図を表している。オリゴ−ｄＴクロマトグラフィによってｍＲＮＡを精製した後、３′−ＯＨ末端が場合によってはブロックされているＲＮＡを過ヨウ素酸の存在下にて酸化する（第１段階）。次に、ヒドラジン含有ヌクレオチドタグを、酸化したＲＮＡに連結する（第２段階）。逆転写（第３段階）を、ランダム配列を有するヘキサマーのオリゴ−ｄＴ、あるいは特異配列を有するプライマーによって開始する（プライマー）。逆転写酵素がキャップを交差すると、タグ（ＲＴタグ）を複製することができる。ＲＮＡの除去の後（第４段階）、逆転写したタグ（ＲＴタグ）の配列とハイブリダイゼーションするように選択したプライマーで開始したｃＤＮＡの第二の鎖の合成（第５段階）により、ｍＲＮＡの少なくとも５′末端を含む二本鎖ｃＤＮＡが産生される。第４図は、ｐＣｐを標識し、キャッピングし（レーンＣおよびＤ）またはキャッピングしていない（レーンＡおよびＢ）、タグと連結した（レーンＢおよびＤ）または連結していない（レーンＡおよびＣ）２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの８％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動図のオートラジオグラフを表す。第５図は、ｐＣｐを標識し、キャッピングし（レーンＣ、ＤおよびＥ）またはキャッピングしていない（レーンＡおよびＢ）、タグと連結した（レーンＢ、ＤおよびＥ）または連結していない（レーンＡおよびＣ）４６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの１２％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動図のオートラジオグラフを表す。第６図は、逆転写前（Ａ、Ｃ）または後（Ｂ、Ｄ）のタグを連結した（Ｃ、Ｄ）または連結していない（Ａ、Ｂ）ＲＮＡの１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動図のオートラジオグラフを表す。第７図は、³²ｐＣｐを連結することによって３′において放射能標識した２００ｎｔのオリゴヌクレオチドの８％ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを表す。レーンＡ：キャッピングしていない、酸化し、ヒドラジン含有タグと連結した２００ｎｔのオリゴヌクレオチド。レーンＢ：キャッピングし、酸化し、ヒドラジン含有タグと連結した２００ｎｔのオリゴヌクレオチド。第８図は、タグの配列とは抗補体性の配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドに相当する（キネーション、リン酸化反応による）放射能標識プローブのハイブリダイゼーションの後にタグ形成したＲＮＡおよびコントロールを付着させたナイロン膜のオートラジオグラフを表す。総てのスポットは２個ずつである。レーンＡ〜Ｄ：タグ０．５、５、２５および５０ｆｍｏｌ。レーンＥ：タグ形成したｍＲＮＡの１／１０を、２回付着で付着させた。第９図は、配列がタグと同一である５′末端のリン酸化によって放射能標識したオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションしたのちに一本鎖ｃＤＮＡおよびコントロールを付着したナイロン膜のオートラジオグラフを示す。レーンＡ〜Ｅは、連結したタグと同一の配列のコントロールオリゴデオキシリボヌクレオチドの様々な濃度（１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌおよび１ｆｍｏｌ）を表す。レーンＦ：タグ形成した一本鎖ｃＤＮＡの付着。第１０図は、逆転写のＰＣＲ生成物の臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの写真を表す（逆転写の生成物の１／２０を、それぞれのＰＣＲ反応に用いた）。レーンＡおよびＢ：分子量マーカー（記載）。レーンＣおよびＤ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＣ）または非存在下（レーンＤ）でのグロブリンプライマーによるＰＣＲ。レーンＥおよびＦ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＥ）または非存在下（レーンＦ）でのデヒドロゲナーゼプライマーによるＰＣＲ。レーンＧおよびＨ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＧ）または非存在下（レーンＨ）でのｐｐ１５プライマーによるＰＣＲ。レーンＩおよびＪ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＩ）または非存在下（レーンＪ）でのＥＩＥ４プライマーによるＰＣＲ。レーンＣ、Ｅ、ＧおよびＩでは、予想した大きさのバンドの存在により、ｃＤＮＡ個体群における相当する配列の存在を示差する。第１１図は、臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの写真を表す。第１０図と同じ説明であるが、ＰＣＲは、プライマーのそれぞれの対のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および配列が連結したタグの配列に相当するオリゴヌクレオチドで行った。レーンＣおよびＥの増幅生成物は、逆転写によりＲＮＡ分子および連結したオリゴデオキシリボヌクレオチドタグが複製したことを示している。実施例１ｍＲＮＡ５′キャップの特異的標識形成１．ヌクレオシド二リン酸ｐＣｐのメッセンジャーＲＮＡの３′末端への連結ＲＮＡ１μｇを、 a) 製造業者(Gribco-BRL)によって供給された緩衝液中でＴ₄ファージＲＮＡリガーゼ５Ｕ、および b) ＲＮアーゼ阻害剤、すなわちPromega 社から発売されているＲＮアシン、および c) ³²ｐＣｐ Amersham #PB 10208 ２μｌの存在下で１０μｌの最終反応媒質中でインキュベーションする。インキュベーションは、３７℃で２時間または７〜８℃で一晩行うことができる。２．キャッピングおよび非キャッピング形態のＲＮＡの生成ＲＮＡを、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有する二本鎖ＤＮＡ鋳型で出発するイン・ビトロでの転写によって得る。２．１．二本鎖ＤＮＡ鋳型の生成二本鎖ＤＮＡ鋳型は、下記の方法でＰＣＲによって得られる。配列 5′CT TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAT CCT ACT CCC ATC CAA TTC CAC CCT AAC TCC TCC CAT CTC CAC 3′ （Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列はイタリック体である）を、配列5′CT TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAT C 3′の5′プライマーおよび配列 5′GTG GAG ATG GGA GTT AGG GTG 3′の３′プライマーを用いて増幅する。それぞれの反応は、容積１００μｌ中で行い、２ｍＭＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰをそれぞれ２００μＭ、プライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、一本鎖ＤＮＡ鋳型１ｎｇ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を含んでいる。増幅条件は下記の通りである。９４℃で３分、５３℃で３０秒および７２℃で３０秒からなる１サイクル、９４℃で１分、５３℃で３０秒および７２℃で３０秒からなる２５サイクル、９４℃で１分、５３℃で３０秒および７２℃で５分からなる１サイクル。次に、増幅生成物を１０％不変性アクリルアミドゲル上で電気泳動によって分離した後、ＵＶシャドウイングによって可視化する。次に、二本鎖ＤＮＡ鋳型をゲルから溶出し、フェノール抽出を施した後、アルコール沈殿によって回収する。２．２．キャッピングおよび非キャッピングＲＮＡの合成ＲＮＡを、転写キット「AmpliScribe T7」(Epicentre Technologies)を用いて二本鎖ＤＮＡ鋳型のイン・ビトロでの転写によって得る。反応媒質が４ＮＴＰを含むときには、生成したＲＮＡはキャップを持たない（これは、また5′ppGpNpN ...型の５′末端を備えている）。キャッピングしたＲＮＡを得るため、ＧＴＰをキャップの類似体m7G(5′)ppp(5′)G で置換する。ポリメラーゼに認識されるこの化合物を、転写の開始段階において新生転写体の５′末端に組み込む。しかしながら、これは、伸張段階では組み込むことができない。従って、ＲＮＡの合成の鋳型として働くＤＮＡは、コード鎖が＋１位にチロシン１個しか持たないように定義した。３．５′におけるキャップの酸化ＲＮＡ０．１ＯＤ単位を溶解する。キャッピングした（＋Ｃａｐ、４７ヌクレオチド）および他方はキャッピングしていない（−Ｃａｐ、４６ヌクレオチド）を含む４７および４６ヌクレオチドの２種類のオリゴリボヌクレオチドを用いた。 +Cap: -m7GpppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC -Cap: pppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC 酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）９μｌ中、および新たに調製した０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液３μｌ。混合物を、暗所で１時間インキュベーションする。次に、１０％エチレングリコール４μｌを加えて反応を停止する。生成物をエタノール沈澱させ、水に対して透析する。４．ジアルデヒドのビオチンによるカップリング前段階で得た酸化生成物を、ｐＨ５〜５．２の酢酸ナトリウム５０μｌ、および式のビオチンヒドラジドをメトキシエタノール／水混合物（１：１）に溶解した新たに調製した０．０２Ｍ溶液５０μｌに溶解する。スペーサーをｎ＝５のビオチンヒドラジドで用いる。他の市販のヒドラジドでが０〜５のものを極めて良好に用いることができる。次に、混合物を３７℃で２時間インキュベーションする。これをエタノールで沈澱させ、蒸留水に対して透析する。実施例２磁性ビーズによる標識したｍＲＮＡの捕捉１．ストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズを、製造御者の指示に従って調製する(CPG Inc．、米国）。ＲＮＡをハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ５〜６）に加える。次に、３０分間インキュベーションした後、未結合のビオチン化していない材料を除く。ビーズを、１％ＳＤＳを含む水で数回線状する。２．ｍＲＮＡの回収得られたビーズを、２％ＳＤＳを含む水中で９５℃で１５分間インキュベーションする。３．実験結果第１図および第２図のいずれの場合にも、示された実験結果は、ＴＢＥ緩衝液中での０．４ｍｍの厚さの１２％アクリルアミドゲルのオートラジオグラムに相当する。第１図は、ヌクレオチド配列が上記配列（実施例１）に相当する４７ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドで得られた結果を示している。レーンＡおよびＢ：キャッピングがない、放射性ｐＣｐ（実施例１、１．）で標識し、実施例１、３節および４節に記載の手続きを施した（Ｂ）または施さない（Ｂ）４６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。レーンＣおよびＤ：放射性ｐＣｐで標識したキャップを有し、実施例１（１節〜４節）に記載の手続きを施した（Ｄ）または施さない（Ｃ）４７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。レーンＡおよびＣに観察された移動の差は、レーンＣにおいて移動するオリゴヌクレオチドにキャップが存在することによるものである。レーンＣおよびＤの間で見られる移動の差は、オリゴヌクレオチドのキャップのビオチン化によるものである。これは、キャップのビオチン化の特異性を示している。第２図は、ビオチン化し、磁性ストレプトアビジンによって捕捉されたオリゴヌクレオチドの回収中に得られた結果を示す。オリゴヌクレオチドを３′で放射性ｐＣｐで標識した後、実施例１．１に記載の手続きを施した。次いで、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを実施例２に記載の磁性ビーズで補足した後、２％ＳＤＳの存在下にて９５℃で５分（レーンＡ）、１５分（レーンＢ）、および３０分間（レーンＣ）インキュベーションした。反応の生成物を、変性条件（７Ｍ尿素）下で１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分析した。ゲルをオートラジオグラフィにかけた。この操作の際に、ヒドラゾン結合は還元されなかった。最上部のバンド（矢印ｓ）は、ビオチンおよびオリゴリボヌクレオチドのリンカーを結合するヒドラゾン結合を有するビオチン化ＲＮＡに相当する。下部のバンド（矢印ｉ）は、酸化した分子（オリゴリボヌクレオチド）に相当する。ヒドラゾン結合が加熱の際に安定しなければ、開裂することがあり、オリゴリボヌクレオチドはジアルデヒド型に戻る。レーンＤは、実施例１．１に記載のｐＣｐで標識したオリゴリボヌクレオチドを示す。実施例３完全なｃＤＮＡの製造法。キャッピング下またはキャッピングしていない合成ＲＮＡの研究この方法は、下記の段階を含んでいる。Ａ）タグによるＲＮＡの５′末端の標識形成Ａ．１）７−メチルグアノシンのジオールのジアルデヒドへの酸化Ａ．２）ＮＨ₂基を有するタグの３′末端の官能化Ａ．３）官能化したタグのキャップへの化学的連結Ｂ）タグ形成したＲＮＡの逆転写逆転写は、オリゴ−ｄＴプライマー、ランダムプライマーあるいはプライマー伸張反応と同様な特異的なプライマーを用いることからなる通常の経路の一つに従って開始する。１）方法１．１連結するオリゴヌクレオチドタグの官能化３′がリン酸化した核酸を、約１〜３Ｍのヒドラジンまたは式Ｈ₂Ｎ（Ｒ１）ＮＨ₂のジヒドラジドの水溶液を用いて、ｐＨ４．５で、水に可溶性のカルボジイミド型薬剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの最終濃度が０．３Ｍの存在下にて、８℃の温度で一晩処理することによって３′のヒドラジドに転換する。次に、オリゴヌクレオチドを他の薬剤および生成物から、オリゴヌクレオチドを単離する標準的手法によって分離する。１．２タグを収容するｍＲＮＡ分子の調製ａ）３′−ＯＨ官能基の除去３′−ＯＨのない配列の酵素的連結、例えば(14)に記載のｐＣｐの連結による下記の手続きによるＲＮＡのアルカリ加水分解であって、アルカリ加水分解を０．１Ｎ水酸化ナトリウム中ｍＲＮＡ１．５μｇの存在下にて最終容積１００μｌで４０〜６０分間４℃で行い、次に溶液を酢酸で中和し、エタノール中で沈澱させるアルカリ加水分解による。ｂ）ジオール官能基の酸化ＲＮＡを、１０Ｄ単位までを緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６〜７、または水）９μｌ、よび新たに調製した０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液３μｌに溶解する。暗所で１時間インキュベーションする。１０％エチレングリコール４μｌを加えて反応を停止する。室温で１５分間インキュベーションする。生成物のエタノール沈澱を行い、水に対して透析する。１．３化学的連結ＲＮＡを、酸性媒質、酢酸ナトリウム、ｐＨ４〜６、５０μｌ、および官能化したタグの溶液５０μｌに溶解した後、これをホウ水素化物で還元して、ＲＮＡ：タグの比率が１：２０となるようにする。３７℃で２時間または１０℃で一晩（１４時間）インキュベーションする。エタノールで沈澱し、蒸留水に対して透析し、アクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣのような分析を行う。１．４逆転写ａ）第一のｃＤＮＡ鎖の合成材料および試薬水槽（９０℃、および４０℃）ドライアイスアセチル化ウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ(Biolab)）ＲＮａｓｉｎ（５Ｕ／μｌ、Promega Biotech)。ＲＮアシンを４０Ｕ／ μｌの濃度で供給し、これをＲＴ緩衝液中で５Ｕ／μｌまで希釈する。 β−メルカプトエタノール（３５０ｍＭ、Sigma）。市販のβ−メルカプトエタノールを１４．４Ｍの濃度で供給し、３５０ｍＭの溶液を得て、５０μ ｌを蒸留水１９５０μｌと混合する。１０×ＲＴ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３（４２℃）８０ｍＭＫＣｌ、１６ｍＭＭｇＣｌ₂）それぞれｄＮＴＰ(PharmaciaまたはBoehringer)の１００ｍＭ溶液１ｍＭｄＣＴＰ２０ｍＭピロリン酸ナトリウム［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ４００Ｃｉ／ミリモル(Amersham) 蒸留水中での溶液状の逆転写酵素（１００ｎｇ／μｌ蒸留水）を開始するのに用いたオリゴヌクレオチドオリゴ−ｄＴ（１５〜１７(Boehringer) ランダム配列を有するプライマー特異的プライマー方法ＲＮＡを９５℃で５分間加熱した水１８μｌで希釈した後、１．２に記載した溶液を加える。下記の成分を微量遠沈管で混合する。１０×ＲＴ緩衝液２．５μｌＢＳＡ（５リットル〜μｌ／μｌ〜）１μｌＲＮａｓｉｎ（５Ｕ／μｌ）１μｌｄＡＴＰ（１００ｍＭ）２μｌｄＴＴＰ（１００ｍＭ）０．５μｌｄＧＴＰ（１００ｍＭ）０．５μｌｄＣＴＰ（１ｍＭ）２．５μｌピロリン酸ナトリウム（２００ｍＭ）１μｌ水２４μｌとする。これを、ハイブリダイゼーションしたプライマーを有するＲＮＡ溶液と混合し、４２℃で４５分間インキュベーションし、混合物を使用するときまで−２０℃ で保管する。２）実験結果２．１オリゴデオキシリボヌクレオチドの２００マーおよび４６マーＲＮＡへの連結Ａ）４６または２００ｎｔのオリゴリボヌクレオチドをイン・ビトロで製造する。その合成に用いた試薬によって、これらのオリゴリボヌクレオチドをキャッピングし、またはキャッピングしない（それぞれ、２００＋、４６＋および２００−、４６−）。４６＋および４６−オリゴヌクレオチドの配列を、実施例１３節に示す。２００マーについては、配列は下記の通りである。それらの合成の後、オリゴヌクレオチドを１．２．ａ（ｐＣｐへの連結）基記載の手続きを施し、３′−ＯＨ末端をブロックした後、１．２．ｂに記載の手続きを施してキャッピングしたオリゴヌクレオチドを酸化する。Ｂ）３′ＯＨ末端が３′−Ｐに改変されている１７ｎｔ（ＧＴＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＣＴ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドを１．１に記載の手続きを施して、その３′にヒドラジド官能基を付加する。Ｃ）次に、２．１．Ｂで生成したオリゴデオキシリボヌクレオチドおよび２．１．Ａで生成したオリゴヌクレオチドを、１．３に記載の方法で連結させる。第４図：レーンＡおよびＢには、ヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドと連結した（レーンＢ）または連結していない（レーンＡ）２００ｎｔのキャッピングしていないオリゴリボヌクレオチドを付着させる結果が示されている。レーンＣおよびＤには、ヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドと連結した（レーンＤ）または連結していない（レーンＣ）２００ｎｔのキャッピングしたオリゴリボヌクレオチドが付着している。この実施例は、キャッピングしたＲＮＡのタグ形成反応の特異性を示している。用いた実験条件下では、キャッピングしたオリゴリボヌクレオチドの３０％がタグに連結する。第５図：レーンＡおよびＢには、ヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドと連結した（レーンＢ）または連結していない（レーンＡ）４６ｎｔのキャッピングしていないオリゴリボヌクレオチドを付着させる結果が示されている。レーンＣ、ＤおよびＥには、ヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドと連結したキャッピングしたオリゴリボヌクレオチドが付着している結果が示されている。レーンＣは、未酸化で未連結のキャッピングしたオリゴリボヌクレオチドを表している。レーンＤおよびＥにおいて、矢印ａの水準のバンドは、未連結で酸化した４６ｎｔのオリゴリボヌクレオチドが表され、矢印ｂの水準のバンドは連結生成物を表している。この実施例は、別のＲＮＡ分子種とキャッピングしたＲＮＡのタグ形成反応の特異性を示している。２．２連結生成物の逆転写イン・ビトロでキャッピングしたまたはしていない４６ｎｔのオリゴリボヌクレオチドを製造する。次に、これを１．３に記載の方法でタグに連結する工程を施して、これを１７ｎｔのヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドに連結する。連結したオリゴリボヌクレオチド（第５図のレーンＤおよびＥのバンドｂに相当する）および未連結オリゴリボヌクレオチド（第５図のレーンＤおよびＥのバンドａに相当する）をゲル精製した。第６図において、レーンＡおよびＢは、逆転写した（レーンＢ）またはしていない（レーンＡ）未連結オリゴリボヌクレオチドを表す。レーンＣおよびＤは、逆転写した（レーンＤ）またはしていない（レーンＣ）連結したオリゴリボヌクレオチドを表す。いずれの場合にも、生成物は放射能標識されており、４６マー生成物は３′において放射性ｐＣｐでブロックされるからであることが分かる。しかしながら、同量のオリゴヌクレオチドをレーンＡ、Ｂ、ＣおよびＤに付着させた。レーンＢおよびＤにおけるシグナルが一層強くなり、余分なバンドが存在することは、逆転写が起こっていることを示している。レーンＤにおけるシグナルは、逆転写がキャップを介して行われたことを示している。実施例４完全なｃＤＮＡの製造法（II：胎盤ｍＲＮＡでの研究）この方法は、実施例３と同じ段階を有する。本発明者らは、この方法の実施においてほとんど改変を行わなかった。１）方法１．１連結する標識したオリゴヌクレオチドの官能化配列ＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡ（５′−ＯＨおよび３′−Ｐ末端）のオリゴデオキシリボヌクレオチドの３ＯＤ単位を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド２μｇを含むジメチルホルムアミド／水（７５：２５）中で調製した１．５Ｍヒドロキシルベンゾトリアゾール溶液７０μｌに溶解する。２２℃で２時間３０分間インキュベーションを行う。ＬｉＣｌＯ₄／アセトン中で２回沈澱を行う。ペレットを、０．２５Ｍヒドラジン２００μｌに再懸濁する。８℃で３〜１４時間インキュベーションする。ＬｉＣｌＯ₄／アセトン中で２回沈澱を行う。１．２タグを収容する分子の調製ａ）実施例３、１．２節に記載の方法による胎盤ｍＲＮＡの調製１．３化学連結は、実施例３、１．３節に記載の方法で、下記の改変を行って実施した。沈澱段階を排除クロマトグラフィ段階に代え、未連結のヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを除去する。行った手続きは、下記の通りである。ａ）カラムの調製ＡｃＡ３４(BioSepra#230151)ゲル１０ｍｌを、緩衝液（緩衝液：１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ）５０ｍｌ中で平衡にした。混合物を沈降させる。上清を除く。ゲルを、緩衝液５０ｍｌに再懸濁する。この段階を２または３回繰り返す。ガラスビーズ（直径３ｍｍ）を、２ｍｌ使い捨てピペット（長さ２５ｃｍ）に導入する。ピペットにゲル懸濁液を満たし、ゲルの高さをピペットの最上部から１ｃｍで安定化させる。次に、カラムを、平衡化緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭＮａＣｌ）２０ｍｌで平衡にする。ｂ）クロマトグラフィ試料（タグ形成したＲＮＡ）１０μｌを、１０ｍＭ尿素３９μｌおよびブルー・グリセロール緩衝液（ブロモフェノールブルー５ｍｇを６０％グリセロール（ｖ／ｖ）に溶解し、直径０．４５μｍのフィルターで濾過）２μｌに混合する。カラムに装填する。試料が浸透したならば、平衡化緩衝液を加える。１００μｌ画分を回収する。４６ｎｔのタグは、画分１６以後に現れる。画分３〜１５を保存した後、エタノールと合わせて沈澱させる。１．４逆転写逆転写はGibco-BRL 製の逆転写酵素Superscript IIを用いて、製造御者の指示に従って行う。反応を開始するため、ランダム配列を有するノナマー５０ｐｍｏｌを用いる。１．５ＲＮＡおよびｃＤＮＡのブロッティングｃＤＮＡおよびＲＮＡのブロッティング（ＲＮＡおよびｃＤＮＡブロット）は、通常に用いられる方法に従って正に帯電したナイロン膜上で行った。ｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖にアルカリ加水分解を施してＲＮＡを除去した後、ｃＤＮＡを膜上に付着させた。連結したオリゴヌクレオチドに抗補体性の配列（ＴＡＡＴＧＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドを、その５′末端で³²Ｐで標識し、ＲＮＡブロットでハイブリダイゼーションをおこなった。連結したオリゴヌクレオチドの配列と同一の配列のオリゴヌクレオチドを、その５ ′末端で³²Ｐで標識し、ｃＤＮＡブロットでハイブリダイゼーションをおこなった。１．６ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅逆転写の後に得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。２種類の反応を行う。ａ）特異配列を検出するための増幅（グロブリン、デヒドロゲナーゼ、ｐｐ１５および伸張因子Ｅ４）下記のオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを用いた。 α−グロブリン GLO_S: CCG ACA AGA CCA ACG TCA AGG CCG C GLO_As: TCA CCA GCA GGC AGT GGC TTA GGA G 3′ デヒドロゲナーゼ 3 DH_S: AGT GAT TCC TGC TAC TTT GGA TGG C 3 DH_As: GCT TGG TCT TGT TCT GGA GTT TAG A ｐｐ１５ PP15_S: TCC AGA ATG GGA GAC AAG CCA ATT T PP15_As: AGG GAG GAG GAA ACA GCG TGA GTC C 伸張因子Ｅ４ EFA1_S: ATG GGA AAG GAA AAG ACT CAT ATC A EF1A_As: AGC AGC AAC AAT CAG GAC AGC ACA G ｂ）上記対のアンチセンス（＿Ａｓ）オリゴデオキシヌクレオチドおよび連結したオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡ）の配列から選択されたプライマーを用いて行った増幅２）実験結果２．１化学連結の効率実施例４、１．１に記載の２５ｎｔのオリゴヌクレオチドをこの節に記載の方法で改変し、実施例３に記載のキャッピングしたまたはしていない２００ｎｔのオリゴリボヌクレオチドに連結した。第７図：レーンＡ：キャッピングしていない、酸化され、タグに連結した２００ｎｔのオリゴリボヌクレオチド（３′末端を³²ｐＣｐで放射能標識した）。レーンＢ：キャッピングして、酸化し、ヒドラジン含有タグに連結した２００ｎｔのオリゴリボヌクレオチド（３′末端を³²ｐＣｐで放射能標識した）。このレーンでは、最下部のバンド(i)は未連結の２００マーに相当し、最上部のバンド（ｓ）は連結した２００マーに相当する。タグの調製および連結の条件下で、キャッピングしたオリゴヌクレオチドの８０％を連結した。２．２タグとポリＡ＋ＲＮＡとの連結胎盤メッセンジャーＲＮＡ（７μｇ）を実施例３に記載の条件下で酸化した後、実施例４に記載の条件下でヒドラジン含有オリゴデオキシリボヌクレオチドに連結する。未連結オリゴヌクレオチドを、実施例４の１．３節に記載の方法で排除クロマトグラフィによって除去する。連結したタグの存在は、プローブを実施例４の１．５節に記載の方法ナイロン膜上のタグ形成したＲＮＡスポットとハイブリダイゼーションすることによって明らかにされる。第８図は、プローブのハイブリダイゼーションの後の膜のオートラジオグラフを表す。総てのスポットは、２回スポットした。レーンＡ〜Ｄ：タグ０．５、５、２５および５０ｆｍｏｌ。レーンＥ：タグ形成したｍＲＮＡの１／１０を２個のスポットに付着した。２．３キャップによる逆転写実施例４の２．２節で得たタグ形成したＲＮＡの９／１０を、実施例４の１．４に記載の方法で逆転写した後、膜上に付着し、実施例４の１．６に記載の方法で分析し、または１．６．ａ）およびｂ）に記載の方法でＰＣＲ反応の鋳型として用いる。第９図は、１．６に記載の放射能標識したプローブでハイブリダイゼーションを行った後の膜のオートラジオグラフを示す。レーンＡ〜Ｅは、連結したタグと同一の配列を有するコントロールオリゴデオキシリボヌクレオチドの様々な濃度（１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌおよび１ｆｍｏｌ）を表す。レーンＦ：タグ形成した一本鎖ｃＤＮＡの付着。約１５ｆｍｏｌのタグが含まれる。これらの結果は、逆転写は、キャップを介して行うことができ、特に逆転写は真核性メッセンジャーＲＮＡのキャップの５′−Ｐ−Ｐ−Ｐ−５′結合と交差することを示している。第１０図は、逆転写のＰＣＲ生成物の臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの写真を表している（逆転写の生成物の１／２０を、それぞれのＰＣＲ反応に用いた）。レーンＡおよびＢ：分子量マーカー（記載）。レーンＣおよびＤ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＣ）または非存在下での（レーンＤ）グロブリンプライマーを用いるＰＣＲ。レーンＥおよびＦ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＥ）または非存在下での（レーンＦ）デヒドロゲナーゼプライマーを用いるＰＣＲ。レーンＧおよびＨ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＧ）または非存在下での（レーンＨ）ｐｐ１５プライマーを用いるＰＣＲ。レーンＩおよびＪ：ｃＤＮＡの存在下（レーンＩ）または非存在下での（レーンＪ）ＥＩＥ４プライマーを用いるＰＣＲ。レーンＣ、Ｅ、ＧおよびＩにおいて、予想される大きさのバンドが存在することにより、ｃＤＮＡ個体群における相当する配列が存在することを示唆している。第１１図は、臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの写真を表す。第１０図と同じ説明であるが、ＰＣＲは、プライマーのそれぞれの対のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および配列が連結したタグの配列に相当するオリゴヌクレオチドを用いて行った。レーンＣおよびＥの増幅生成物は、逆転写はＲＮＡ分子および連結したオリゴデオキシリボヌクレオチドタグを複製したことを示している。レーンＣに得られたパターンは、用いたプライマーの対について最適でないＰＣＲ条件によるものと思われる。参考文献１． Frohman et al．(1988)，PNAS 85，8998-9002; ２． Delort et al．(1989)，NAR 17，6439-6448; ３． Dumas Milne Edwards et al．(1991)，NAR 19，5227- 5232; ４． Frohman-Racine(1993)，NAR 21，1683-1684; ５． Maruyama et Sugano(1993)，Gene 138，171-174; ６． Dumas Milne Edwards(1993): Doctorate thesis， paris VI，75-90; ７． Kato and Sekine(1993)，EPO-Application: #93921061.3; ８． sonenberg and Altman(1989)，EPO-Applcation: #89313030.2; ９． Reddy et al．(1992): Pharmac Ther．Vol．54，pp．249ー 267; 10． Zamecnik et al．(1960)，PNAS 46，811; 11． Agrawal et al．(1986)，NAP 14，6227-6245; 12． O′Shannessy D.J．et al．(1987)，Anal．Biochem．163， 204-209; 13． Ghosh F.，EPO-Application No．89309532.3; 14． Uhlenbeck O.C.，Gumport R.J．(1982)，T4 RNA Ligase， The Enzymes，V．15B（P.D．Boyer ed）pp．31-60． Academic Press; 15． Current Protocol in Molecular Biology．N.Y．3.15.1. （1994）Ed．John Wiley and Sons，Inc．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．アミン官能基によって官能化した分子によって真核ｍＲＮＡ断片の５′ 末端のキャップを特異的にカップリングする方法であって、下記の段階 a) 上記ＲＮＡ断片、特にｍＲＮＡ断片、の３′末端を特異的に改変して、最後のヌクレオチドが２′および３′位にＯＨ基を最早含まないようにし、 b) ジオールのジアルデヒドへの特異的酸化を、上記ｍＲＮＡ断片の５′末端のメチルグアノシンの２′，３′−シス−ジオール官能基において行い、 c) 段階b)で得た２′，３′−ジアルデヒドを、上記分子のアミン官能基とカップリングさせるを行う、方法。２．段階a)の改変を、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、その３′末端が２′、３′−ジオール官能基を含まないものを上記ｍＲＮＡ断片の３′末端に付加することによって行う、請求の範囲第１項に記載の方法。３．段階a)において、上記ｍＲＮＡ断片の３′末端の特異的改変を、酵素、特にＲＮＡリガーゼを用いてヌクレオシド３′，５′−二リン酸（ｐＮｐ）の連結によって行う、請求の範囲第２項に記載の方法。４．ｍＲＮＡ断片が、段階a)において２′，３′−ジオール官能基とともに３′で終わるポリＡ３′末端を含むとき、上記ｍＲＮＡ断片の３′末端の特異的改変を、制御されたアルカリ加水分解およびその後のアルカリ加水分解によって生成したポリＡ３′末端の断片を分離する段階によって行う、請求の範囲第１項に記載の方法。５．段階b)のジオール官能基のジアルデヒド官能基への特異的酸化を、過ヨウ素酸塩で行う、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の方法。６．段階c)において、ジアルデヒドの上記アミン官能基によるカップリングを酸性媒質中で行った後、ホウ水素化物で還元する、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。７．上記官能化分子が生物学的分子である、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。８．真核ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップを特異的に標識する方法であって、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載のカップリング法を用い、前記分子が標識分子である、方法。９．生物学的試料から真核ｍＲＮＡの５′末端を単離する方法であって、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載のカップリング法を用い、前記分子が、カップリングするｍＲＮＡ断片を単離することができる分子である、方法。１０．請求の範囲第１〜９項のいずれか一項に記載の方法を行うのに有用な試薬キットであって、ｍＲＮＡ２′，３′−ジオールの３′末端の特異的改変のための試薬、５′末端の２′，３′−ジオール官能基をジアルデヒドに酸化するための試薬、およびジアルデヒドと前記分子のアミン官能基との間で共有カップリングを行うための試薬を含んでなる、試薬キット。１１．上記酸化試薬が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求の範囲第１０項に記載の試薬キット。１２．上記アミン官能基によるカップリングのための上記試薬が、ｐＨ４〜６の酸性緩衝液とホウ水素化物からなる還元試薬とを含んでなる、請求の範囲第１０項または１１項に記載の試薬キット。１３．上記末端を改変する上記試薬が、上記ｍＲＮＡの３′末端を、オリゴヌレオチドまたはヌクレオチドであって、その３′末端に２′，３′−ジオール官能基を含まないものの５′末端でカップリングできる試薬である、請求の範囲第１０〜１２項のいずれか１項に記載の試薬キット。１４．上記ｍＲＮＡの３′末端を改変するための上記試薬が、ヌクレオチド３′，５′−二リン酸ｐＮｐと連結酵素Ｔ４ＲＮＡリガーゼとからなる、請求の範囲第１３項に記載の試薬キット。１５．請求の範囲第９項に記載の生物学的試料から真核ｍＲＮＡの５′末端を単離する方法であって、 1) ｍＲＮＡの５′末端のキャップの特異的カップリングを、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の第一の分子Ｐ１で行って、結合体Ｐ１−ｍＲＮＡを得て、 2) 上記の第一の生物学的分子で標識した上記ｍＲＮＡ（Ｐ１−ｍＲＮＡ）を、上記の第一の分子に共有的または非共有的に結合している第二の分子Ｐ２に暴露して、結合体またはそれぞれ複合体（Ｐ２／Ｐ１−ｍＲＮＡ）を形成し、 3) 上記結合体または上記複合体Ｐ２／Ｐ１−ｍＲＮＡを試料から分離し、 4) Ｐ２およびＰ１の間の共有結合の開裂または脱複合体形成を場合によって行い、カップリングしたｍＲＮＡＰ１−ｍＲＮＡを回収することを特徴とする、方法。１６． a) 段階2)において、上記の第二の分子を固相に付着させ、 b) 段階3)において、上記結合体または上記複合体でコーティングした固相を試料から分離する、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．Ｐ１およびＰ２が、非共有的に相互作用し、複合体を形成する、請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。１８．Ｐ１がビオチンヒドラジドであり、Ｐ２がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求の範囲第１５〜１７項のいずれか一項に記載の方法。１９．固相が、生物学的試料が存在し、または上記容器に導入されるビーズのような成分である容器の内面からなる、請求の範囲第１６〜１８項のいずれか一項に記載の方法。２０．完全なｍＲＮＡを単離する、請求の範囲第１５〜１９項のいずれか一項に記載の方法。２１．Ｐ１と上記ｍＲＮＡとの間の開裂の追加段階を含み、カップリングしていないｍＲＮＡを回収する、請求の範囲第１５〜２０項のいずれか一項に記載の方法。２２．請求の範囲第１５〜２１項のいずれか一項に記載の方法を行うのに有用な試薬キットであって、ｍＲＮＡ５′キャップと請求の範囲第１０〜１４項のいずれか一項に記載の上記第一の分子とを特異的にカップリングするための試薬キットの成分、および上記第二の分子の溶液、または第二の分子が付着する固相を含んでなる、試薬キット。２３．ｃＤＮＡ３′末端、特に完全な一本鎖ｃＤＮＡの製造法であって、下記の a) 請求の範囲第９項または１５〜２１項のいずれか一項に記載の単離法よって得たｍＲＮＡの逆転写を行い、 b) 一本鎖ＲＮＡおよび非ハイブリッドＲＮＡ断片を除去して、ｍＲＮＡが、５′キャップが上記第一の分子によって特異的にカップリングしているｍＲＮＡであるｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ二本鎖の個体群のみを保存し、 c) 上記ヘテロ二本鎖を、上記第二の分子でコーティングした固相によって捕捉し、 d) ヘテロ二本鎖の脱ハイブリダイゼーションを行って一本鎖ｃＤＮＡを回収する段階を行うことを特徴とする、方法。２４．段階b)において、一本鎖ＲＮＡまたは非ハイブリッドＲＮＡ断片の除去を、一本鎖または非ハイブリッドＲＮＡを分解し、かつ完全なＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を残す酵素による酵素処理によって行う、請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．段階b)において、酵素ＴＩＲＮアーゼまたはＳ１ヌクレアーゼを用いる、請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．ｍＲＮＡ５′末端に相当する真核性の二本鎖ｃＤＮＡおよび特に完全なｃＤＮＡの製造法であって、下記の a) 真核ｍＲＮＡ断片の５′末端のキャップのカップリングを請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法に従って行い、上記官能化分子が３′末端にアミン官能基を含むオリゴヌクレオチドタグであり、ｍＲＮＡの３′末端の改変の第一段階が任意であり、 b) 段階a)で得た連結ｍＲＮＡの逆転写を行い、 c) 段階b)で得たヘテロ二本鎖を変性し、一本鎖ＲＮＡ断片を除去して、第一のｃＤＮＡ鎖を得て、 d) 第二の鎖の合成を、ＤＮＡポリメラーゼ酵素およびプライマーであって、その配列が上記オリゴヌクレオチドタグの配列の全体または一部に対して抗補体性であるものを用いて行う段階を行うことを特徴とする、方法。２７．請求項１〜９項、または１５〜２０項のいずれか一項に記載の方法によって得られる、上記分子に対して５′末端のキャップによって特異的にカップリングしたｍＲＮＡ。２８．ｍＲＮＡを認識するタンパク質Ｐｏを捕捉する方法であって、上記タンパク質を、請求項１５〜２１項のいずれか一項に記載の単離法によって得たｍＲＮＡに暴露した後、複合体（Ｐｏ／完全なｍＲＮＡ）を回収し、脱複合体形成を行って上記タンパク質Ｐｏを回収することを特徴とする、方法。