JPH11510596A

JPH11510596A - ヒト急性期血清アミロイドａタンパク質、組換えタンパク質、特異的抗体の定量的測定法

Info

Publication number: JPH11510596A
Application number: JP9506508A
Authority: JP
Inventors: ドイル，ジョン・マーティン; ホブソン，ヘイゼル・オードリー; ホワイトヘッド，アレグザンダー・スティーヴン
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 1999-09-14
Also published as: BR9609771A; EP0842434B1; WO1997004317A1; US6194163B1; EP0842434A1; DE69607176D1; ATE190728T1; CA2227537A1; AU711163B2; AU6667096A; DE69607176T2

Abstract

(57)【要約】ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）の定量的な測定方法には、抗体との接触の前あるいは同時に有機溶媒と反応させた生物学的液体（fluid）の試料をＡ−ＳＡＡに特異的な抗体と接触させることを含む。有機溶媒はC₁-C₄アルコールが適していて、また抗体は固相上で、そして酵素免疫測定法（enzame linked immunosorbent assay）の検出系の構成成分として用いることができる。本法は、急性炎症状態、慢性炎症状態の両方の診断と臨床管理に用いることができる、感度のよい、信頼性のあるＡ−ＳＡＡおよび炎症状態の測定法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質、組換えタンパク質、特異的抗体の定量的測定法技術分野本発明は、Ａ−ＳＡＡと構成的な型のＳＡＡ（Ｃ−ＳＡＡ）とを識別するヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）の定量的測定法に関する。背景となる技術ほ乳類の急性期反応は、感染、外傷、心筋梗塞、腫瘍(neoplasms)、及び外科手術のような刺激によって引き出される全身的な防御の第一線である。それは、サイトカイン類、グルココルチコステロイド類及びアナフィラトキシン類を含む大量の前炎症性媒介物質によって開始され、また維持され、そして肝臓で合成された急性期反応物質（ＡＰＲｓ）の循環血中濃度を高くすることを含む広範囲の複雑な生理的変化と関連する。ヒトにおいては、この後者のクラスは「メジャー」ＡＰＲｓ、すなわち血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）及びＣ−反応性タンパク質 (ＣＲＰ)を含む(Steel,D.M.and Whitehead,A.S.,(1994)Immunol.Today,(England )15,81)により総説されている)。ヒトＳＡＡ遺伝子ファミリーは４つの既知の遺伝子を含んでおり、それらは染色体11p15.1短腕に位置が決定されている。ＳＡＡ１とＳＡＡ２遺伝子はおのおの２つの急性期ＳＡＡタンパク質であるＡ−ＳＡＡ１とＡ−ＳＡＡ２を規定していて、それらは共に104アミノ酸、12.5kDaのタンパク質であり、93％のアミノ酸配列の相同性を有している。対立遺伝形質の数は血漿より単離したＡ−ＳＡＡのアミノ酸配列の解析により同定された。Ａ−ＳＡＡ１タンパク質は３つの対立遺伝形質を持つのに対し、Ａ−ＳＡＡ２は２つを持っている。ＳＡＡ１及びＳＡＡ２と71％のヌクレオチドの相同性を示す第３の遺伝子ＳＡＡ３は偽遺伝子(pse udogene)である。構成的ＳＡＡ（Ｃ−ＳＡＡ）は第３の発現ＳＡＡファミリーのメンバーであり、ＳＡＡ４遺伝子の産物である。Ｃ−ＳＡＡのレベルは特徴として、炎症の結果としては上昇せず、また血清中に80-140mg/Lの濃度範囲で存在している(Yamada,T.et al,(1994)Int.J.Exp.Clin.Invest,1,114)。Ｃ−ＳＡＡはペプチド長においてＡ−ＳＡＡと異なっていて、８アミノ酸長く、そしてＡ− ＳＡＡとわずか55％の相同性しか有さない。加えて、Ｃ−ＳＡＡは単一部位のグリコシル化による翻訳後修飾を受けうる。Ａ−ＳＡＡ類と同様に、Ｃ−ＳＡＡは循環血中に放出されたとき高密度リポタンパク質（ＨＤＬ３）と速やかに結合する。Ａ−ＳＡＡの循環血中濃度は急性刺激の24-48時間以内に1000mg/Lまで上昇する場合があり(Marhaug,G.,(1983)Scand.J.Immunol.,18,329)、これらのタンパク質の重要な保護的役割を示すが、Ａ−ＳＡＡタンパク質の明確な機能は証明されていない。最近の研究は、Ａ−ＳＡＡが化学誘因活性をもち、脂質代謝と免疫抑制の役割を果たす可能性があり、そして好中球での酸化的破裂（burst）を阻害する可能性があることを様々に示唆している。慢性炎症の間、Ａ−ＳＡＡのレベルは継続した根底にある病理学的炎症過程の持続を反映して有意に高いままであり、長期的な組織障害の一因となる可能性がある。慢性炎症の時折の結果は反応性の二次アミロイドーシスで、Ａ−ＳＡＡの切断産物であるアミロイドＡタンパク質（ＡＡ）が主要な臓器に蓄積する不溶性繊維質沈着物の主要な構成要素である進行性の致死状態である。慢性炎症状態においてＡ−ＳＡＡが持続的に上昇していることから、Ａ−ＳＡＡが疾患の状態の重要な指標であることが示唆される。しかしながら、一部的にはヒトＡ−ＳＡＡに対する特異的抗血清が生じる際の困難さのために、通常の臨床診断や臨床管理には用いられなかった(Pepys,M.B.ct al.,(1984)British Medical Journal,28 8,859)。しかしながら、ＳＡＡのレベルを測定するいくつかの方法が報告された。これらは(i)ラジオイムノアッセイと単一放射免疫拡散法の手順(Chambers,R.E.and Whicher,J.T.,(1983)J.Immunol.Methods.59,95:Marhaug,G.,(1983)上記;Taktak ,Y.S.and Lee,M.A.,(1991)J.Immunol.Methods,136,11)，(ii)ＥＬＩＳＡを基礎としたアッセイ(Zuckerman,S.H.and Suprenant.Y.M..(1986)J.Immunol.Methods, 92,37-43;Duhois,D.Y.and Malmendier,C.L.,(1988)J.Immunol.Methods,112,71-7 5;Sipe, J.D.et al.,(1989)J.Immunol.Methods,125,125.135;Yamada,T.et al.,(1989)Cli n.Chim.Acta,179,169-176;Tino-Casl,M.and Grubb,A.,(1993)Arm.Clin.Biochem. ,30,278-286)；(iii)比濁分析法(Vermeer,H.ct al.,(1990)Clin.Chcm,36,1192;Y amada,T.et al.,(1993)Ann.Clin.Biochem.,30,72-76)；(iv)電気泳動の手順(God enir,N.L.et al.,(1985)J.Immunol.Methods,83,217)；（v）免疫化学発光の手順（Hachem,H.et al.,(1991)Clin.Biochem,24,143-147）；（vi）モノクローナル −ポリクローナル抗体固相エンザイムイムノアッセイを基礎とした自動化された方法(Wilkins,J.W.et al.,(1994)Clin.Chem,40(7),1284-1290);そして(vii)時間分解的蛍光イムノアッセイ（Malle,E.et al.,(1995)J.Immunol.Methods,182,131 ）を含む。血清中でＳＡＡはＨＤＬ３分子に結合したアポリポタンパク質の一つとして存在するため、これらの方法の多くはアッセイを実行する前に（ＳＡＡの正確な定量において問題となることが以前に観察された、マスキング（遮蔽）効果を消去するための作用において）血清試料の変性を必要とする。以前に報告された多くのアッセイでは、全ＳＡＡを測定していたかあるいは全ＳＡＡに対して生じた抗血清に基づいており、そしてＡ−ＳＡＡとＣ−ＳＡＡタンパク質とを識別できるものとしては報告していなかった。さらに、これらのアッセイの多くは一晩のインキュベートを必要とする。可溶性の精製天然Ａ−ＳＡＡを得るのに問題が見出される。すなわち、大量の血液からのＡ−ＳＡＡタンパク質の精製は収量が乏しいこと(Godenir,N.L.et al.,(1985)上記)、溶解性が限られること(Bausserman.LL,et al..(1983)J Biol Chem.,258,10681)、そして不均質の性質のＡ−ＳＡＡが回収されることで特徴づけられる。加えて、血清から精製されたＡ−ＳＡＡは追跡量（trace amount）の別の血清成分を含んでいる可能性があり、それによって感度のよいバイオアッセイを伴うＡ−ＳＡＡ機能の研究を潜在的に危うくする。急性炎症状態と慢性炎症状態の両者の診断と臨床管理に用いることのできる感度がよくかつ信頼性のあるＡ−ＳＡＡと炎症状態の測定を提供する方法に対しては需要がある。発明の開示本発明は、抗体との接触の前もしくは同時に有機溶媒と反応させられている生物学的液体（biological fluid）の試料を、Ａ−ＳＡＡに特異的な抗体と接触させることを含む、ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）の定量的測定の方法を提供する。本明細書中で、生物学的液体とは血漿、血清、滑液、尿、そして胆汁などの体液を意味し、さらに具体的には血漿と血清、還流液(perfusate)、すなわち組織保持培地または細胞／組織培養培地である。生物学的液体は希釈することができる。好ましくは、抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原は組換えＡ−ＳＡＡである。組換えタンパク質技術は、信頼でき、継続でき、均質なＡ−ＳＡＡの源を生産する手段を提供する。最も好ましくは、抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原は組換えＡ− ＳＡＡ２である。組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗体を利用する他のイムノアッセイは報告されていない。 pGEX発現系を用いたGST融合タンパク質としてのE．coli中での組換えヒトＡ −ＳＡＡ２の産生は実施例１に記載する(Smith,D.B.and Johnson,K.S.,(1988)Ge ne，67，447)。この系でのＡ−ＳＡＡ２の発現は本明細書中で後述する穏やかな非イオン性界面活性剤の存在下で用いられたときに、融合タンパク質のトロンビン切断の後に可溶性組換えＡ−ＳＡＡ２タンパク質を回収することができる。好ましくは、有機溶媒は極性有機溶媒である。さらに具体的には、有機溶媒はC₁-C₄アルコールである。有機溶媒はある量のC₁-C₄エーテルを含みうる。好ましくは、有機溶媒は10-50％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる。最も好ましくは、有機溶媒は20-30％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる。好ましい一態様において、抗体は固相上で、そして酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の検出系の構成成分として用いられる。本明細書中で後述するように、組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗体はＡ −ＳＡＡに特異的であることが見出され、また血清中のＡ−ＳＡＡレベルを定量するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを開発するために用いられた。本明細書中に記載されたＥＬＩＳＡは感度が高く、ヒト血清と組織培養培地中の５μg/Lの濃度のＡ−ＳＡＡを検出できる。本発明はまた本発明による方法を実行するための検査キットあるいはパックを提供する。本発明はまた実質的に純粋な組換えΛ−ＳＡＡ２を提供する。さらに本発明はＡ−ＳＡＡ１及びＡ−ＳＡＡ２に特異的な抗体を、さらに具体的にはIgGクラス抗体を、最も具体的にはポリクローナルIgGを提供する。本発明は、構成的に発現したＳＡＡ、すなわちＣ−ＳＡＡあるいは他の急性期タンパク質と交差反応性を示さない、急性期ＳＡＡ類であるＡ−ＳＡＡ１及びＡ−ＳＡＡ２に特異的な抗体を提供する。図面の簡単な説明図１は実施例２に記載の、pGEXにより発現した組換えＡ−ＳＡＡ２の分析の後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。図２は実施例２に記載の、抽出された組換えＧＳＴ−（Ａ−ＳＡＡ２）融合タンパク質の分析の後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。図３は実施例３に記載の、組換えと天然Ａ−ＳＡＡに対する反応性、及びＣ −ＳＡＡに対する潜在的交差活性を試験した場合の、組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗血清の、分析の後のイムノブロットの写真である。図４は実施例４に記載したアッセイのＡ−ＳＡＡの標準曲線である。図５は実施例５に記載の、２つの試料に対する時間（時(hours)）対ＳＡＡ濃度（μg/L）のグラフである。図６は実施例６に記載の、試料希釈緩衝液中の有機溶媒の種々の濃度に対するＡ−ＳＡＡ濃度（μg/L）対450nmの吸光度のグラフである。図７は実施例９に記載の、種々の試料の希釈系列対450nmでの光学密度（吸光度）のグラフであり、そして図８は実施例１０に記載の、リューマチ性関節炎の患者血清中のＡ−ＳＡＡ濃度を示す棒グラフである。本発明を行う方法本発明は以下の実施例により、さらに説明されるであろう。実施例１Ａ−ＳＡＡ２タンパク質発現ベクターの構築５’末端に付加的なグリシン残基及びＢａｍＨＩ制限酵素部位(オリゴヌクレオチドプライマー配列５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣ−３’(ＳＥＱＩＤＮＯ．１))、および３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位（オリゴヌクレオチドプライマー配列５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣ−３’(ＳＥＱＩＤＮＯ．２)）を規定する配列の付随した導入を含む、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、Ａ−ＳＡＡ２コード領域を、Ａ−ＳＡＡ２のｃＤＮＡクローンより増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ゲルにて精製、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ(Pharm acia Fine Chemicals,Milton Keynes.U.K.)にライゲーションした。Ａ−ＳＡＡ２コード領域は、Ａ−ＳＡＡ２発現がイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃプロモーターと、ＧＳＴリボゾーム結合部位の調節下にある構築物をつくるために、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターにインフレームで挿入した。結果としてできたｐＧＥＸ−（Ａ−ＳＡＡ２）のＤＮＡ配列分析は、これが、ＰＣＲプロセスによる組換えのないＧＳＴコード領域の下流に位置する完全なの非修飾Ａ−ＳＡＡ２コード領域をもつことを明らかにした。実施例２組換えＡ−ＳＡＡ２タンパク質の高レベル発現のためのE.coli培養の誘導プラスミドｐＧＥＸ−（Ａ−ＳＡＡ２）をE．coli発現系統ＮＭ５５４へトランスフォームした。トランスフォーム種を単離し、３７℃にて一晩培養した。この一晩培養物を100μg/mlアンピシリン（Boehringer Mannheim,East Sussex,U .K.）を含むルリアブロス（Luria broth）によって１／１００希釈し、ＯＤ６００値が１．０になるまで増殖させた。０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ：Sigma,Dorset,U.K.）とともに３７℃、５時間培養し、組換え融合タンパク質の発現を誘導した。この培養物を５０００×ｇにて４ ℃で１０分間遠心した。上記誘導で、全細胞タンパク質のおよそ５％を構成する、３８．５ｋＤａのＧＳＴ−（Ａ−ＳＡＡ２）融合タンパク質がつくられた(図１、レーン４)。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析したｐＧＥＸ（Ａ−ＳＡＡ２）からの組換えＡ−ＳＡＡ２タンパク質発現を示す。図１の要点レーン１：タンパク質分子量マーカー55.6，39.2，26.6，12.5，6.5ｋＤａレーン２：ｐＧＥＸ（Ａ−ＳＡＡ２）非誘導レーン３：ＩＰＴＧにより誘導されたｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクターレーン４：ＩＰＴＧにより誘導されたｐＧＥＸ（Ａ−ＳＡＡ２）レーン５：トロンビン切断した成熟Ａ−ＳＡＡ２産物レーン６：イオン交換クロマトグラフィーにて精製した組換えＡ−ＳＡＡ２細胞ペレットを溶解緩衝液［０．２mg/mlリゾチーム（Sigma）を含むＰＢＳ（ｐＨ７.３）（Gibco/BRL,Paisley.U.K.）；５mM ＥＤＴＡ（BDH,Merck,Dors ct,England）；０．１％（V/V）Triton X-100（BDH）；５０mMベンズアミジン（ Sigma）；０．１mM ＰＭＳＦ（Sigma）；および０．５mg/mlヨードアセタミド(S igma)］により、当初容量の１／５０液量にて再懸濁し、室温にて１時間インキュベートした。溶解したE．coli細胞ペレットからのＧＳＴ−（Ａ−ＳＡＡ２）の可溶化は０．１％（V/V）Triton X-100の存在が必要である（図２）。組換えＧＳＴ−（Ａ−ＳＡＡ２）融合タンパク質を非イオン性界面活性剤である０．１％（V/V）Triton X-100の存在下、非存在下での可溶性を試験し、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。結果を図２に示す。図２の要点レーン１：タンパク質分子量マーカー 55.6，39.2，26.6，12.5ｋＤａレーン２：0.1％（V/V）Triton X-100非存在下での細胞溶解後の不溶性画分レーン３：0.1％（V/V）Triton X-100非存在下での可溶性画分レーン４：0.1％（V/V）Triton X-100存在下での細胞溶解後の不溶性画分レーン５：0.1％（V/V）Triton X-100存在下での可溶性画分完全に溶解させるために、この溶解物を氷上で超音波処理し(３×２０秒間破砕(Bursts))、10000×ｇで４℃１０分間遠心し、微粒子物質を取り除くため、０．４５μ M Millipore（Milliporeは商標）フィルターを通して濾過した。不純物を除去した超音波処理物を、ＧＳＴ−（Λ一ＳＡＡ２）融合タンパク質が結合するグルタチオンセファロース４Ｂカラム（Pharmacia）に通した。混在しているE．coliタンパク質は、カラムの１０倍量のＰＢＳ（ｐＨ７．３）による洗浄で取り除き、組換えＡ−ＳＡＡ２タンパク質はＰＢＳ（ｐＨ７．３）０．１％（V/V）Triton X-100中のトロンビン（Sigma）（５U/mgタンパク質結合）を用い、室温にて６時間処理することで、直接的にグルタチオンセファロース４Ｂカラム上でＧＳＴ部分を切断した。０．１％（V/V）Triton X-100存在下でのトロンビンによる切断で、１２．５kDa［成熟Ａ−ＳＡＡ２の予想される大きさ］の可溶性Ａ−ＳＡＡ２産物が得られた(図１（切断）及び図２(非切断)、レーン５)。組換えＡ−ＳＡＡ２を含んでいるカラム溶出液を回収し、４℃で保存した。組換えＡ−ＳＡＡ２試料はさらに、高性能セファロースＱカラム(Pharmacia)を用い、０．１％（V/V）Triton X-100、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０）にて平衡化し、０．１％（V/V）Triton X-100、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ１０．０)、０．１ＭＮａＣｌにて溶出するイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した。組換えＡ−ＳＡＡ２のさらなる精製をイオン交換クロマトグラフィーを用いて行い、結果として得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドとして分離することができた(図１、レーン６)。１２．５kDa産物のＮ末端アミノ酸配列はGly-Ser-Gly-Arg-Ser-Phe-Phe-Ser-Phe-Leu-Gly-Glu-Ala-Phe-Asp-Gly-Al a-Arg-Asp（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）であり、融合タンパク質からもたらされる、アミノ末端Gly-Ser-Gly伸長をもつＡ−ＳＡＡ２としてこの独自性が確認されている。組換えＡ−ＳＡＡ２のＮ末端配列決定は、組換えＡ−ＳＡＡ２をＰｒｏＢｌｏｔｔ（ProBlottは商標）膜上にエレクトロブロッティングし、アミドブラックで染色し、その後バイオシステムズモデル４７３Ａ(Biosystcms model 47 3A)タンパク質シーケンサー上でのＮ末端アミノ酸配列決定を行った。バクテリア培養１リットルにつき、おおよそ３mgの組換えＡ−ＳＡＡ２を得た。アフィニティーカラムによって精製した画分もイムノブロッティングにて解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングのために、抗（Ａ−ＳＡＡ）抗血清（実施例３を参照）を、二次抗体としてのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma）とともに使用した。画分のタンパク質の含有量は、結晶性ウシ血清アルブミン（Sigma）を標準として、ビシンコニン酸溶液（Sigma）を用いて測定した。組換えＡ−ＳＡＡ２は、緩衝液Ａ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．４)、１５０mM ＮａＣｌ、及び０．１％（V/V）Triton X-100）中で４℃にて保存した。実施例３Ａ−ＳＡＡ２に対する抗体ウサギを、実施例２で調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより精製した組換えＡ −ＳＡＡ２で以下に示す方法（Hager,D.A.and Burgress,R.R.et al.(1980),Anal .Biochem．109，76）に従って筋肉注射にて免疫した。すなわち１日目に、Freun ds完全アジュバント（Sigma）中の１mg/ml組換えＡ−ＳＡＡ２を１ml；１４日目及び２１日目に、Freunds不完全アジュバント（Sigma）中１mg/ml組換えＡ−ＳＡＡ２を１ml投与する。血液を２８日目に採取した。ＩｇＧ−抗（Ａ−ＳＡＡ）を固定化プロテインＡ（Pharmacia）上のアフィニティークロマトグラフィーにて単離した。得られた抗血清をイムノブロット解析により、他のヒトＳＡＡタンパク質ファミリーメンバー及び血清構成成分との交差反応性を試験した（図３）。図３の要点レーン１：組換えＡ−ＳＡＡ２レーン２：急性期患者の血清レーン３：非急性期血清レーン４：ＮＩＢＳＣ（National Instiute of Biological Standards and Cont rols）Ａ−ＳＡＡレーン５：組換えＣ−ＳＡＡレーン６：組換えＡ−ＳＡＡ１レーン７：非急性期血清に打ち込んだ組換えＡ−ＳＡＡ２抗血清は(i)精製組換えＡ−ＳＡＡ２(図３、レーン１)、(ii)炎症を起こしている患者の血清中に存在するＡ−ＳＡＡ（ただし他の分子種ではない）(図３、レーン２)、及びＮＩＢＳＣから入手したＡ−ＳＡＡ(図３、レーン４)、(iii) 非急性期血清に打ち込んだ組換えＡ−ＳＡＡ２(図３、レーン７)、(iv)［Ａ−ＳＡＡ２に対応して発現し、精製した］組換えＡ−ＳＡＡ１（図３、レーン６）と反応させた。組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗体は、イムノブロットにおいて組換えＡ−ＳＡＡ１及び組換えＡ−ＳＡＡ２両方に等しいシグナルを生じ(図３、レーン１及び６を比較)、これは、それぞれのアイソホーム（isoform）の結合力は本質的に等しいことを示している。加えて、組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗体は［Ａ−ＳＡＡ２に対応して発現及び精製した］精製Ｃ−ＳＡＡ(図３、レーン５)、もしくは非急性期血清（図３、レーン３）のいずれかの構成成分と交差反応はしなかった。実施例４発明に従うＥＬＩＳＡ手順は、実施例３で示したようにして入手した精製ＩｇＧ［抗Ａ−ＳＡＡ］にてマイクロタイタープレートをコーティングすること、そしてアッセイ手順を行うことを含む。１、マイクロタイタープレートのコーティングマイクロタイター・マキシソープ・プレート（Nunc，Denmark）を親和性精製ＩｇＧ［抗ＳＡＡ２］(０．１Ｍ炭酸塩緩衝液(ｐＨ９．６)中で１.０μg/ml) にて４℃、一晩でコートした。プレートはＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて２回洗浄し、ＢＳＡ含有ブロッキング緩衝液をウェルに加えた。マイクロタイタープレートを３７℃、１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除き、プレートを３７℃にで一晩乾燥させた。マイクロタイタープレートを密閉し、４℃にて使用するまで保存した。２、アッセイ手順（ａ）血清試料及びアッセイ測定物（組換えＡ−ＳＡＡ）を以下の試料希釈緩衝液にて希釈した。２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）１５０ mM ＮａＣｌ２５％（V/V）プロパン−２−オールそして、それぞれの希釈物１００μｌをマイクロウェルに一対にして（duplic ate）加えた。室温（２０〜２５℃）で６０分間等速振動しながらインキュベートした後、ウェルをプレート洗浄器を用いて３５０μｌのＰＢＳＴにて４回洗浄した。（ｂ）酵素結合物（ＩｇＧ［抗ＳＡＡ２］−ＨＲＰ）を結合希釈緩衝液（５０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１５０mM ＮａＣｌ、１％（W/V）ＢＳＡ）にて希釈し、１００μｌ等量をウェルに加えた。酵素結合物は本質的にDuncan ,R.J.S.ら（(1983);Anal.Biochcm.132,68）によって記載されているように作製した。ＨＲＰは、Biozyme Ltd.,U.K.より入手した。マイクロタイタープレートを室温（２０〜２５℃）でさらに６０分間等速振動しながらインキュベートした。ウェルを３５０μｌのＰＢＳＴにて４回洗浄した。（ｃ）１００μｌの安定化テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ）基質をそれぞれのウェルにマルチチャンネルピペットを用いて加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。発色は１００μｌＩＮＨ₂ＳＯ₄を用いて停止させ、プレートをすぐにプレートリーダーにてＯ．Ｄ．４５０nmで測定した。（ｄ）Ａ−ＳＡＡのための標準曲線：National Institute of Biological Sta ndards and Controls（ＮＩＢＳＣ，ＵＫ）から入手した天然ＳＡＡ、及び組換えＳＡＡ２タンパク質双方を標準曲線をつくるために使用した。結果は両方の場合において同一であった。５〜７５０μg/Lの範囲のＡ−ＳＡＡ標準曲線は、上述したように試料希釈緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１５０mM ＮａＣｌ、２５％（V/V）プロパン−２−オール）中で調製した。温度、時間及び濃度の特定のパラメータのそれぞれを、実質上この手順の有用性に影響しないように標準の研究室の慣習に従って変更してもよい。ＳＡＡ標準物を用いて得られた標準曲線は、試験する試料中のＳＡＡ濃度を測定するために使用した( 図４)。実施例５試料希釈緩衝液中でのプロパン−２−オールの使用について、日常的に使用する試薬としての安定性について試験した。試料はプロパン−２−オール希釈液で希釈し、室温にて２４時間放置した。試料を有機試料希釈緩衝液中においておいたときに免疫反応において何らかの変化が起こるかどうかを調べるために、試料を異なる時間点において、すなわち希釈した直後、およびその後およそ０．５時間、１時間、３時間、６時間、２４時間においてアッセイした。異なる血清試料にたいして、何のシグナル回帰の変異性も観察されなかったことから、Ａ−ＳＡＡエピトープの変性は全くないこと、そしてプロパン−２−オール希釈緩衝液は臨床研究において日常的に使用できることを示す。結果は図５に示す。実施例６マスキング（遮蔽）効果いずれかの血清タンパク質がＡ−ＳＡＡの定量を干渉するかどうかを調査するために打ち込み実験を行った。これらの実験において、我々は、組換えＡ−ＳＡＡの既知量を非急性期血清へ打ち込んだ後に、Ａ−ＳＡＡの同一量を回収できるか調査した。表１に示したように組換えＡ−ＳＡＡを試料希釈緩衝液中に打ち込んだときに１００％の検出が観察された一方、組換えＳＡＡ２を非急性期血清に打ち込んだときには２６％の検出しか得られなかった。これは、ある血清構成成分がＳＡＡシグナルをマスクする事を示している。 Tino-Casl & Grubb(1993)もＳＡＡシグナルのマスキングを観察しており、ＩｇＧ及びＨＤＬがマスキング画分中の主要タンパク質であることを観察した。彼らは、試料を分析前に１：５００に前希釈し、最終濃度が０．２％（V/V）通常血清がそれらの希釈緩衝液中で存在するときには、それらのＥＬＩＳＡ法において抗原シグナルの測定可能なマスキングがないことを提唱した。しかしながら、彼らのその研究の中で、初期のもしくは残りのマスキングの絶対的なレベルを調べる打ち込み試験は報告されていない。我々のアッセイ系では、希釈緩衝液中での０．２％血清はどんな大きな程度へのマスキング効果も減少させなかった(データは示していない。)。Ｔｗｅｅｎ２０、Triton X-100、ＮｏｎｉｄｅｔＰ− ４０、ＳＤＳ、尿素のような様々な試薬を含む様々な緩衝液は、表２で示すように、ＳＡＡシグナルに対するマスキング効果を減少もしくは除去しなかった。表３及び図５に示すように、濃度２５％（V/V）のプロパン−２−オールの存在は、試料希釈緩衝液中の他のアルコール／有機溶媒と同様に、組換えＡ−ＳＡＡによる非急性期血清への打ち込んだ後の、Ａ−ＳＡＡシグナルの完全な量的回収を導くことが観察された。図５：図５は、試料希釈緩衝液中のプロパン−２−オールの様々な濃度の非マスキング能力の調査の結果を表す。組換えＡ−ＳＡＡを非急性期血清に打ち込み、プロパン−２−オールを含まない希釈緩衝液中でアッセイした。図５の要点：（Ａ）組換えＡ−ＳＡＡ２を緩衝液Ａに打ち込み、プロパン−２−オールを含まない希釈緩衝液中でアッセイした。（Ｂ）組換えＡ−ＳＡＡ２を非急性期血清中に打ち込み、以下を希釈緩衝液中でアッセイした。（Ｃ）１０％プロパン−２−オール（Ｄ）２０％プロパン−２−オール（Ｅ）２５％プロパン−２−オール、そして（Ｆ）４０％プロパン−２−オール天然ＳＡＡスタンダード（ＮＩＢＳＣ）を調製したときの希釈緩衝液中の２５％（V/V）プロパン−２−オールの存在により、得られるシグナルを増加させることも観察されており、よって、実施例７で示すように、血清に打ち込んだ精製された天然ＳＡＡもまた血清構成成分によるマスキングの対象であることを示している。実施例７比較データ組換えＳＡＡ２と同一量の急性期ＳＡＡを含む血清試料の比較は、ＩｇＧ[ 抗ＳＡＡ２（組換え体）]が同じ様式で両方のタイプを認識することを保証するために本質的である。表４から示されるように、これは実際に組換えＳＡＡ２に対して生じたＩｇＧがヒト血清より精製した急性期ＳＡＡに同様に反応するケースである。実施例８臨床有用性血清中急性期ＳＡＡについての通常の上限は、１０mg/Lより少ないと知られている。実施例４で示したイムノアッセイを用いると、検出できない量の急性期ＳＡＡが多くの正常ヒト血清試料中で検出でき、１０mg/Lより少ない量のＳＡＡが、それぞれ酵素イムノアッセイを用いて測定したように、リウマチ様関節炎及び急性膵炎の両方の場合で上昇していることが検出できた。実施例９患者血清中のＡ−ＳＡＡを測定するための方法のいくつかの以前の報告は、血清構成成分によるＡ−ＳＡＡシグナルを消滅させることと関連する問題を明らかにした(Casl ct al.,1993)。この発行物を扱うために、我々は精製組換えＡ− ＳＡＡ２を血清に添加して(打ち込んで)、血清構成成分によって引き起こされる干渉を定量する実験を行った。既知濃度の組換えＡ−ＳＡＡ２を（i）緩衝液Ａ、及び（ii）非急性期血清に打ち込み、２５％（V/V）プロパン−２−オールを含まない試料希釈緩衝液を用いてアッセイした。表１に示したように、非急性期血清への組換えＡ−ＳＡＡ２の打ち込み後、２６％のシグナルの回収しか観察されなかった。上記の打ち込み実験を２５％（V/V）プロパン−２−オールを含む試料希釈緩衝液を用いて繰り返した。有機溶媒の存在下で、非急性期血清中に組換えＡ− ＳＡＡ２を打ち込んだ後、ほとんど完全にシグナル回収が観察された（図６）。発明の理論上の説明によっては結合することは希望していないが、プロパン −２−オール試料希釈緩衝液はほとんど疎水性アポリポタンパク質複合体を乱し、それによってそうでなければ隠れているＡ−ＳＡＡエピトープへの抗体の接近を促進することでシグナルの回収を達していることがもっとも可能性がある。我々の研究から、緩衝液Ａ中の精製組換えＡ−ＳＡＡ２、急性期血清へ打ち込んだＡ−ＳＡＡ２、リウマチ様関節炎患者からの血清中天然Ａ−ＳＡＡ２はすべて、我々の試料希釈緩衝液で希釈したときに同様な希釈系列曲線(profile)を示す(図７)。試料希釈緩衝液中のプロパン−２−オールの存在は、固相上に固定化する前の血清試料中のＡ−ＳＡＡの非マスク化するために用いた先の方法にかわる簡単で迅速な方法を提供する。実施例１０血清試料実施例８の臨床データのさらなる例証として、正常血清試料を１８〜６５歳の血液提供者から入手した。リウマチ様関節炎血清試料はダブリンのＳｔＪａｍｅｓ病院のリウマチ病病棟において日常的に検査を受けている患者より入手した。試料は使用するまで−２０℃で保存した。Ａ−ＳＡＡサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、血清試料は通常１／２００希釈で実験した。低範囲の標準曲線の上限及び下限はそれぞれ、５μg/L及び１００μg/Lであった。高範囲標準曲線の上限及び下限はそれぞれ、５０μg/L及び７５０μg/Lであり（図４）、試料のＡ−ＳＡＡレベルがこの曲線の範囲に収まるように、この範囲より上にある試料は適当に希釈した。アッセイ確認のため、試料希釈の線形性は連続希釈を行うことで解析し、結果のデータは、アッセイの対応性がＥＬＩＳＡで観察されたことを示している。ＥＬＩＳＡ法の再現性は、アッセイ内、アッセイ間の変異性により解析した。３つのＡ−ＳＡＡ血清試料（Ａ −ＳＡＡ濃度５、１３０及び２４４mg/L）の２０回反復アッセイからのアッセイ内の変異率はそれぞれ、４．８、５．０及び６．７％であった。同じ血清サンプルの１０回反復アッセイでのアッセイ間の変異率はそれぞれ、８．０、６．２、６．０％であった。Ａ−ＳＡＡの通常範囲は５０の健康なヒトからの血清サンプルを用いて解析し、標準方程式を用い、０．４mg/L±０．５mg/L（：平均±２ＳＤ）であることを決定した。リウマチ様関節炎患者の３０血清試料中のＡ−ＳＡＡ濃度は、実施例４のＥＬＩＳＡの方法を用いて解析し、リウマチ様関節炎患者の９５％がＡ− ＳＡＡのレベルが高いことを示した（図８）。Ａ−ＳＡＡタンパク質は単離、精製、可溶化が困難である。可溶化のための Triton X-100の使用と組み合わせて、ＧＳＴ−（Ａ−ＳＡＡ２）融合タンパク質をトロンビン切断することでＡ−ＳＡＡ２を産生することにより、大量の同質のＡ−ＳＡＡを生成する方法を提供する。この方法による可溶性Ａ−ＳＡＡ２の回収はきつい界面活性剤を用いることなく可能であることから、結果として得られる物質は、特にその後のＡ−ＳＡＡの構造及び生物学的機能の研究に適している可能性がある。組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生成した抗体は、Ａ−ＳＡＡ類に特異性を持つことを示し、本明細書で先に例証したように、患者血清中のＡ−ＳＡＡの定量のためのＥＬＩＳＡを開発するために使用した。急性期タンパク質レベルをモニターすることは炎症疾患活性及び治療への反応の評価においてかなりの臨床的重要性を持ち、本明細書に報告するＥＬＩＳＡは、このようなモニターのための簡単で、迅速な、そして再現性を持つ方法を提供する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月２２日【補正内容】『急性炎症状態と慢性炎症状態の両者の診断と臨床管理に用いることのできる感度がよくかつ信頼性のあるＡ−ＳＡＡと炎症状態の測定を提供する方法に対しては需要がある。ＷＯ 91/05874は主として固相（例えば塩化ポリビニルのマイクロタイタープレート）への全血漿タンパク質の固定化とその後に適切な抗血清を用いた前記血漿タンパク質（例えばＳＡＡ）の検出に関する。筆者らは固体支持体への血漿タンパク質の付着を促進する目的で無機塩と高い温度を用いている。参考文献は検体の脱脂質化の後に、抗原捕捉ＥＬＩＳＡを行うが、この技術は血清アミロイドＡの検出を正確にかつ再現性良く容易にすることはないことがわかった。抗原捕捉ＥＬＩＳＡは臨床的に適切なＳＡＡの測定に求められる感度を提供しないことが述べられる。 JP-A-63044895は血清アミロイドＡタンパク質の特定の領域に対するモノクローナル抗体を合成ペプチドを用いて生産することについて言及していて、それは二次アミロイドーシスの診断において潜在的な有用性をもつことを提案している。 Biochemistry,(1972)11,2934-2938は霊長類（Macaca mulatta）のアミロイドＡタンパク質の一次配列を記載していて、そしでアミロイドーシスにおけるアミロイドΛの推定上の役割に関する。そのタンパク質に対する抗血清の生成についての参考文献はない。ヒト活性化型血清アミロイドＡにおいて相当に高度の配列の相同性が観察されているが、２つの異なる種（Homo sapicnsとMacaca mulat ta)において同じin vivoでの役割を両者のタンパク質が果たすかは明らかではない。 Chemical Abstracts,Vol.125,No.15はヒト血清より精製したタンパク質に対して生じた抗血清を用いる血清アミロイドＡの検出に関する。血清より精製されたタンパク質画分は、構成的な形態が存在しないことを保証できず、またそのために結果としてのＥＬＩＳＡ試験のいずれかにおける交差反応性は明らかな（dist inct）可能性である。発明の開示本発明は、抗体の接触の前もしくは同時に有機溶媒と反応させる生物学的液体（biological fluid）の試料をＡ−ＳＡＡに特異的な抗体（抗Ａ−ＳＡＡを生ずるために使用する抗原は組換えＡ−ＳＡＡである）と接触させることを含む、ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）の定量的測定の方法を提供する。本明細書中で、生物学的液体とは血漿、血清、滑液、尿、そして胆汁などの体液を意味し、さらに具体的には血漿と血清、還流液(perfusate)、すなわち組織保持培地または細胞／組織培養培地である。生物学的液体は希釈することができる。好ましくは、抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原は組換えＡ−ＳＡＡである。組換えタンパク質技術は、信頼でき、継続でき、均質なＡ−ＳＡＡの源を生産する手段を提供する。最も好ましくは、抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原は組換えＡ− ＳＡＡ２である。組換えＡ−ＳＡＡ２に対して生じた抗体を利用する他のイムノアッセイは報告されていない。 pGEX発現系を用いたGST融合タンパク質としてのE．coli中での組換えヒトＡ −ＳＡＡ２の産生は実施例１に記載する(Smith,D.B.and Johnson,K.S.,(1988)Gc ne，67，447)。この系でのＡ−ＳＡＡ２の発現は本明細書中で後述する穏やかな非イオン性界面活性剤の存在下で用いられたときに、融合タンパク質のトロンビン切断の後に可溶性組換えＡ−ＳＡＡ２タンバク質を回収することができる。』『１．抗体との接触の前あるいは同時に有機溶媒と反応させた生物学的液体 (fluid)の試料を、ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）に対して特異的な抗体と接触させることを含み、前記抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために使用した抗原が組換えＡ−ＳＡΛである、Ａ−ＳＡＡの定量的測定方法。２．生物学的液体が血漿あるいは血清である、請求項１に記載の方法。３．抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原が組換えＡ−ＳＡＡ２である、請求項１または２に記載の方法。４．有機溶媒が極性有機溶媒である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。５．有機溶媒がC₁-C₄アルコールである、請求項４に記載の方法。６．有機溶媒がある量のC₁-C₄エーテルを含む、請求項５に記載の方法。７．有機溶媒が10-50％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。８．有機溶媒が20-30％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる、請求項７に記載の方法。９．抗体が固相上でそして酵素免疫測定法（enzyme Iinked immunosorben t assay）の検出系の構成成分として用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１０．請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を実行するための、試験キットあるいはパック。１１．実質的に純粋な組換えＡ−ＳＡＡ２。１２．Ａ−ＳＡＡ１及びＡ−ＳＡＡ２に対して特異的な抗体。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホブソン，ヘイゼル・オードリーアイルランド国カウンティ・ウィックロー，アークロー，アヴォーカ，キルマギグ・ハウス (72)発明者ホワイトヘッド，アレグザンダー・スティーヴンアイルランド国カウンティ・ウィックロー，デルガニー，ベルビュー・ヒル，アンバーリー

Claims

【特許請求の範囲】１．抗体との接触の前あるいは同時に有機溶媒と反応させた生物学的液体 (fluid)の試料を、ヒト急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）に対して特異的な抗体と接触させることを含む、Ａ−ＳＡＡの定量的測定方法。２．生物学的液体が血漿あるいは血清である、請求項１に記載の方法。３．抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原が組換えＡ−ＳＡＡである、請求項１または２に記載の方法。４．抗Ａ−ＳＡＡを生じさせるために用いる抗原が組換えＡ−ＳＡＡ２である、請求項３に記載の方法。５．有機溶媒が極性有機溶媒である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。６．有機溶媒がC₁-C₄アルコールである、請求項５に記載の方法。７．有機溶媒がある量のC₁-C₄エーテルを含む、請求項６に記載の方法。８．有機溶媒が10-50％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。９．有機溶媒が20-30％ v/vの量で試料希釈剤として用いられる、請求項８に記載の方法。１０．抗体が固相上でそして酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorb ent assay）の検出系の構成成分として用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実行するための、試験キットあるいはパック。１２．実質的に純粋な組換えＡ−ＳＡＡ２。１３．Ａ−ＳＡＡ１及びＡ−ＳＡＡ２に対して特異的な抗体。