JPH11511112A - 外因性化合物の送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、病原性因子の生物学的膜を横切って、ターゲットする外因性化合物を受容体仲介移送するための方法と物質とを開示する。本発明はまた、ヒト型結核菌（Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ）を包含する病原性因子による感染症を治療するための方法と物質をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 外因性化合物の送達 発明の分野 本発明は病原体の膜を横切っての種々な外因性化合物の送達(delivery)を開示 する。本発明は病原体の研究と、病原体感染症の検出及び治療とを可能にする。 本発明は特に、１種以上の慣用的化学療法剤に対して耐性を有する、例えばヒト 型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような 細菌によって惹起される感染症の治療に用いることができる。 発明の背景 病原性因子(pathogenic agent)による多重薬物耐性（multidrug resistance） の獲得は既存の薬物及び診断試薬を病原体感染症の治療に無効にしている。同様 に、新たに発見された又は合成された治療薬は病原体中への浸透から除外される か、又は多重薬物耐性酵素によって認識される分子構造への治療薬の類似性のた めに、代謝されて無害な生成物になることがある。 病原性微生物は、既存遺伝子の突然変異又は他の微生物からの新しい遺伝子の 導入を包含する、幾つかの機構によって、多種多様の薬物に対する耐性を獲得す ることができる。薬物耐性の獲得は細胞分裂抑制性（cytostatic）又は殺細胞性 (cytocidal)化合物に長期間さらされるとしばしば生じる。新しい遺伝子の獲得 は、例えばバクテリオファージ感染による外因性ＤＮＡの転移による細菌接合中 のプラスミドの転移によって生ずる可能性がある。 一般に薬物耐性細菌、特に薬物耐性結核症の発生は米国及び世界中で急激に重 大な公衆健康問題になりつつある（論説．抗生物質は奇跡を起こすか？ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ２６４：３６０〜３６５，１９９４）。薬物耐性結核症のための新規な 治療法(treatment modalities)の発見の緊急性は、最近発表された２つの分子的 及び慣用的な疫学的研究によって強調されている（Ａｌｌａｎｄ，Ｄ．等，「ニ ューヨーク市における結核の伝染．ＤＮＡフィンガープリンティングと慣用的な 疫学的方法とによる分析」，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１７１０ 〜１７１６，１９９４）。ニューヨーク及びサンフランシスコにおける新たに診 断されたＴＢ症例の１／３以上が潜伏感染症の活性化によるよりも、最近のヒト からヒトへの伝染の結果であることのみでなく、ニューヨークにおける最近伝染 した感染症の患者からの単離物のほぼ半分が薬物耐性のヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）であることも、ＤＮＡフィンガープリンティングの利用 によって実証された。これらの薬物耐性単離物のうち、半分が多種多様の薬物に 耐性であった。薬物耐性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、長期間感染状態を 生じる可能性があるため、最近のヒトからヒトへの伝染において特に活性である 。 結核は最も一般的なヒト伝染性疾患であり、世界保健機構によると、世界的に ７５０万症例の活性感染の年間新症例数と、２５０万の結核による年間死亡数と を有する（論説．「結核の大きな変化」，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４４：２７ ７〜２７９，１９９４）。 結核の近代的な化学療法は１９５２年にイソニアジド（イソニコチン酸ヒドラ ジド）の開発によって開始され、イソニアジドはリファムピン（rifampin）（又 はリファムピシン（rifampicin））と共に依然として結核の治療の主流である。 １９５２年前に結核の治療に有効であると判明していたストレプトマイシンは、 ストレプトマイシンに対する耐性の迅速な発生のために、しばしば治療失敗を生 じている。次に、ストレプトマイシンと、アミノサリチル酸及びイソニアジドと の組合せは結核患者において高い治癒度を生じている。現在臨床的に用いられて いる抗結核薬は、最重要の経口薬としてのイソニアジド、リファムピン、ピラジ ンアミド及びエタムブトール；注射可能な薬物としてのストレプトマイシン、ア ミカシン、カナマイシン及びカプロマイシン；二次的(second-line)経口薬とし てのオフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸及 びＤ−シクロセリンである（Ｉｓｅｍａｎ，「多重薬物耐性の結核のＭ．Ｄ．治 療」，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３ ２９：７８４〜７９１，１９９３； Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌ．とＳａｎｄｅ， Ｍ．Ａ．，「結核とハンセン病の化学療法に用いられる抗菌剤、薬物」，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓ，Ｇｉｌｍａｎ Ａ．Ｇ．等編集；Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０ ，１１４６〜１１６４頁）。 結核における薬物耐性と多重薬物耐性とは、結核菌において予測可能な速度で 生ずる自然突然変異で始まる。突然変異は連鎖性ではなく、薬物治療の結果又は まだ確立されず若しくは理解されていない他の新規な機構ではなく、これらの予 め存在する突然変異の結果である（Ｈｅｙｍ，Ｂ．等，「結核のショートコース 化学療法の今後と多重薬物耐性の関係」，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，３４４：２９ ３〜２９８，１９９４）。したがって、薬物耐性の発生は、ランダムな以前から 存在する突然変異の残存と、有効な薬物による薬物感受性微生物の殺滅による突 然変異含有微生物の選択との直接の結果である。結核菌の薬物耐性は、他の薬物 耐性菌及び例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａ ｒｕｍ ）のような寄生生物の場合のような、多重薬物耐性（ＭＤＲ）チャンネル を通して増加した薬物流出の存在に関連した機構を含まない。 ｍＲＮＡ上に存在する特定の配列に相補的な塩基配列を含有するオリゴヌクレ オチドは、この数年間中に、ターゲットされるｍＲＮＡによってコードされる特 異的タンパク質の合成を阻害することが判明した。アンチセンスとして知られる 、これらのオリゴヌクレオチドは新規な種類の治療剤を含み、インビボ若しくは インビトロスクリーニング系における、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）並びに 他のウイルス又は細胞タンパク質の複製及び発現を阻害することが実証されてい る。ターゲットｍＲＮＡに対するその塩基配列特異的ハイブリダイゼーションに 対して重大な影響を与えることなく修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 を高めるために、オリゴデオキシヌクレオチドのインターヌクレオシド（intern ucleoside）ホスフェート基を例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート 又はホスホロアミデートに化学的に修飾することができる。このような修飾は５ ０％阻止濃度（ＩＣ₅₀）を１０^-7Ｍ範囲に低下させることができる。 ＧｏｏｄｃｈｉｌｄとＺａｍｅｃｎｉｋへの「外因性オリゴヌクレオチドによ るＨＴＬＶ−ＩＩＩの阻害」なる名称の米国特許第４，８０６，４６３号は、現 在ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれるＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスの複製 と遺伝子発現とを阻害するための、内部ホスフェート基上で修飾されたオリゴヌ クレオチドである、オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートを包含する 修飾オリゴヌクレオチドの使用を初めて開示した。Ｃｏｈｅｎ等への「レトロウ イルスの複製と癌遺伝子産物の発現との阻害剤」なる名称の米国特許第５，２７ ６，０１９号も、宿主におけるウイルス複製を阻害し、特にヒト免疫不全ウイル ス複製を阻害するための修飾オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートの 使用を開示する。これらの２特許の開示は本明細書に援用される。 オリゴヌクレオチド薬物は３つの可能な機構によって特定遺伝子の発現を阻害 する。ＲＮＡターゲットに関して、少なくとも２つの阻害機構を思い浮かべるこ とができる。相補的なＲＮＡ配列とのオリゴデオキシヌクレオチドハイブリダイ ゼーションは必要なｍＲＮＡ配列への機能的な機構のアクセスをブロックするこ とによって、ｍＲＮＡのプロセシング、核輸出(nuclear export)又は翻訳を阻害 することができる。或いは、オリゴデオキシヌクレオチドハイブリダイゼーショ ンは試験される全ての細胞中に存在するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド依存性リボ ヌクレアーゼである、ＲＮアーゼＨ活性を用いてＲＮＡ切断を生じることができ る。ＲＮアーゼＨ依存性及び独立性作用機序の両方の根拠は、無細胞系における 相補的オリゴデオキシヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳阻害に関して与えられて いる。オリゴヌクレオチドはそれらが特定遺伝子（抗原又はトリプレックス方法 ）の転写を阻害するＤＮＡ二重ヘリックスの特定配列をもターゲットとすること ができる。オリゴヌクレオチドの開発と、治療剤としてのそれらの修飾とは合成 オリゴヌクレオチド化学の最近の進歩によって促進されている。 発明の概要 本発明は、外因性化合物を特定種類のターゲッティング分子（targeting mole cule）、例えばＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンに結合させ、病原性因子 の膜を横切って輸送させることができるという発見に関する。ターゲッティング 分子は病原性因子上の受容体と結合して、ターゲッティング分子が細胞膜を横切 って輸送されるときに、外因性化合物のキャリヤーとして作用する。本発明は、 ターゲッティング分子の受容体を有する任意の病原性因子への外因性化合物の送 達に有効である。例えばＤ−シクロセリンやＤ−グルコサミンのようなターゲッ ティング分子は、哺乳動物の細胞がこれらのターゲッティング分子の受容体を含 有しないので、哺乳動物の治療に特に適する。したがって、本発明は、病原性因 子がそのための受容体を有し、哺乳動物細胞がそのための受容体を有さないター ゲッティング分子を含む組成物によって哺乳動物を治療することを含む。 本発明の１つの態様によると、病原性因子の分子を横切っての外因性化合物の 輸送を強化する方法を提供する。病原性因子をインビトロ又はインビボでターゲ ッティング分子と外因性化合物とのコンジュゲート(conjugate)と、膜を横切っ てのコンジュゲートの輸送を可能にするほどの充分な時間接触させる。ターゲッ ティング分子はＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンのいずれかである。好ま しい実施態様では、外因性化合物は病原性因子の成長、複製又は残存を低下させ る細胞機能調節剤(cell function modifier)である。特に好ましい実施態様では 、細胞機能調節剤はアンチセンス核酸、抗生物質、病原性因子プロテアーゼの阻 害剤、核酸結合ペプチド若しくはタンパク質、及び病原性因子の宿主免疫系認識 のエンハンサー(enhancer)から成る群から選択される。他の実施態様では、外因 性化合物を、病原性因子中の加水分解に耐性な結合によってターゲッティング分 子に結合させる。さらに、上記コンジュゲートの取り込みを強化する又は病原性 因子の膜を不安定にさせる(labelize)作用剤を送達して、外因性化合物の輸送を 強化することができる。特に好ましい実施態様では、ターゲッティング分子がＤ −グルコサミンであり、コンジュゲートを膜不安定化剤(labelizing agent)であ るエタンブトール（ethambutol）と共に送達する。本明細書に述べる方法は、特 に細菌が多重薬物耐性である場合に、細菌の膜を横切る外因性分子の輸送を強化 するために特に有用である。 本発明の他の態様によると、組成物を提供する。この組成物はＤ−シクロセリ ンとＤ−グルコサミンから成る群から選択されるターゲッティング分子と、この ターゲッティング分子に結合した外因性化合物とのコンジュゲートを包含する。 好ましい外因性化合物とターゲッティング分子とは上述した通りである。好まし い実施態様では、外因性化合物はポリペプチド又はオリゴヌクレオチドである。 ターゲッティング分子は、病原性因子中の加水分解に耐性な結合によって外因性 化合物に結合することができる。組成物は製薬的に受容されるキャリヤーを包含 することもできる。 本発明のさらに他の態様では、病原性因子の感染の治療方法を提供する。この 方法はこのような治療を必要とする対象に上記組成物を送達することを含む。こ の組成物の好ましい態様は上記に認められる。 本発明はまた、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ ）によって惹起されるような感染症を包含する細菌感染症がアンチセ ンステクノロジーを用いて治療可能であるという発見をも含む。アンチセンステ クノロジーが細菌感染症の治療に拡張可能であることを確立するための実験的証 拠は、発明者の知る限りでは、今までに存在していない。さらに、ヒト型結核菌 （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における薬物耐性 の機構が外因的に導入されたオリゴヌクレオチドを排除するように作用するかど うかは、まだ知られていない。最後に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、外 因的に導入された場合に、非耐性菌株に関しても細菌細胞壁を通ってアクセスす ることができるかどうか不明であった。本発明は、細菌増殖を阻害するため、し たがって細菌感染症を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を 開示する。細菌感染症は今までは安価で、有効かつ容易に入手可能な種類の抗菌 剤によって治療されていたので、本発明の重要な態様は、慣用的な治療剤の１種 類以上に耐性な細菌の増殖がそれにも拘わらずアンチセンスオリゴヌクレオチド によって容易に阻害されうるという開示である。本発明は、薬物耐性菌を生じる 通常の機構がオリゴヌクレオチドを排除するように作用しないこと、通常のアン チセンスオリゴヌクレオチドが細菌膜を通って侵入しないこと、及びアンチセン スオリゴヌクレオチドが細菌における薬物耐性を阻止することができることを実 証する。 本発明の１態様によると、細菌によって生じる感染症の治療方法を提供する。 この方法はこのような治療を必要とする対象（subject；好ましくはヒト）に、 細菌の増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を送達すること を含む。有用なオリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシ リボヌクレオチド及びこれらの修飾形（modified versions）を包含する。修飾 形は例えばホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合及びホスホロアミ デート結合のような修飾インターヌクレオシド結合を有するものを包含する。ホ スホロチオエートが好ましい。オリゴヌクレオチドを一端部又は両端部において 化学的に修飾して、ヌクレオリティック(nucleolytic)分解を阻止することもで きる。オリゴヌクレオチドが生理的条件下で加水分解して、その発現が細菌の代 謝及び増殖にとって重要であるような細菌遺伝子になるように、オリゴヌクレオ チドを構成し、配置する。本発明は代謝及び増殖に限定されない。本発明は特定 の細菌感染症の治療に限定されないが、細菌の薬物耐性菌株による感染症の治療 が好ましい。 本発明のオリゴヌクレオチドを有効量で送達するための種々な方法が提案され ている。本発明の１つの態様では、細胞壁を不安定化して、オリゴヌクレオチド の細菌中への送達を促進する、例えばエタンブトールのような化合物によって、 対象を同時に治療する。本発明の他の態様では、オリゴヌクレオチドを、細菌壁 通過を強化する分子に結合させることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチ ドを細菌上の受容体に対するリガンドに共有結合させることが可能である。リガ ンドの例はＤ−シクロセリンとＤ−グルコサミンを包含する。 本発明の他の態様によると、製品が考えられる。例えば、不安定化剤と本発明 のオリゴヌクレオチドとを包含する抗菌性カクテルを製造することができる。他 の例としては、本発明は、細菌の細胞壁を横切るオリゴヌクレオチドの輸送を強 化する分子に共有結合した、本発明のオリゴヌクレオチドである抗菌剤を提供す る。このような分子は細菌上の受容体に対するリガンドでありうる。特定の例は 、Ｄ−シクロセリン及びＤ−グルコサミンに共有結合したアンチセンスオリゴヌ クレオチドを包含する。 本発明の上記その他の態様は以下でさらに詳しく説明する。 発明の詳細な説明 本発明は、外因性分子をＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンとの結合によ る細胞仲介エンドサイトーシス（endocytosis）によって細胞に送達することが できるという発見に関する。このようにして、病原性因子によって排除されるか 又はあまり取り込まれない分子をこの病原性因子に効果的に送達することができ る。本発明は、例えば、Ｄ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンに対する受容体 を有する病原性因子の膜を横切る外因性分子の移送を強化することが望ましい場 合に常に有用である。したがって、本発明はこのような膜を横切って治療剤又は 診断薬を、特に、特定の外因性分子に対する効果的な取り込み機構を有さない病 原性因子に、又はその取り込み機構が多重薬物耐性によって変化した病原性因子 に送達するために用いることができる。 本発明は１態様において外因性分子とターゲッティング分子、Ｄ−シクロセリ ン又はＤ−グルコサミンとのコンジュゲーション(conjugation)を含む。外因性 分子は受容体仲介エンドサイトーシス機構によって有効に移送されると考えられ る。本発明はまた、治療剤及び／又は診断薬を含めた、１種以上のこのような分 子に結合したターゲッティング分子を包含する組成物にも関する。 本発明の“コンジュゲート”は多様な形式で相互に結合する。分子が相互に結 合する場合には、ターゲッティング分子は外因性化合物に、ターゲッティング分 子のターゲッティング特異性を維持するように共有結合又は非共有結合する。 本明細書で用いるかぎり、“結合した”又は“結合”は、２つの実体(entity) が任意の物理化学的手段によって相互に結合することを意味する。結合が、外因 性化合物の有効性又はターゲッティング分子の結合特異性を実質的に損なわない ような性質であることが重要である。これらのパラメーターに留意しながら、当 業者に知られた任意の結合、共有又は非共有を用いることができる。結合のこの ような手段と方法は当業者に周知である。 本発明による結合は直接の結合である必要がない。本発明の組成物の成分はそ れらの結合を容易にするための官能基(functionalized group)を備えることがで きる、及び／又はこれらの組成物の成分の間にリンカー基を挿入して、それらの 結合を容易にすることができる。さらに、本発明の組成物の成分は単一プロセス で合成することもでき、それによって成分を１つの同じ実体と見なすことができ る。例えば、細胞外受容体に特異的なターゲッティング分子を外因性化合物と共 に合成することができる。これらの変更等は本発明によって含まれることになる 。 共有結合の特定の例は、二官能性クロスリンカー分子が用いられる結合を包含 する。クロスリンカー分子は、コンジュゲートされる分子の性質に依存して、ホ モ二官能性又はヘテロ二官能性であることができる。ホモ二官能性クロスリンカ ーは２個の同じ反応基を有する。ヘテロ二官能性クロスリンカーは２個の異なる 反応基を有して、これらの基が逐次コンジュゲーション反応を可能にする。種々 な種類の商業的に入手可能なクロスリンカーが次の基：第１級アミン、第２級ア ミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル及び炭水化物に１つ以上に反 応性である。アミン特異性クロスリンカーの例はビス（スルホスクシンイミジル ）スベレート、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニル）エチル］スルホ ン、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタルトレート(disucci nimidyl tartarate)、ジメチル−アジピメート(dimethyl-adipimate)・２ＨＣｌ 、ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ、ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ、及 びエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］］である。 スルフヒドリル基と反応性のクロスリンカーはビスマレイミドヘキサン、１，４ −ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ブタン、１− ［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、及びＮ− ［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ ］プロピオンアミドを包含する。炭水化物と選択的に反応するクロスリンカーは 、アジドベンゾイルヒドラジドを包含する。カルボキシル基と選択的に反応する クロスリンカーは４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンを包含する。 アミン及びスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性クロスリンカーは、Ｎ−ス クシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、スクシンイミジ ル ［４−ヨードアセチル］アミ ノベンゾエート、スクシンイミジル ４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキ サン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル、スルホスクシンイミジル ６−［３−［２−ピリジルジチ オ］プロピオンアミド］ヘキサノエート、及びスルホスクシンイミジル ４−［ Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレートを包含する。カ ルボキシル基及びアミン基と反応するヘテロ二官能性クロスリンカーは、１−エ チル ３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミドヒドロクロリドを 包含する。炭水化物及びスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性クロスリンカ ーは、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジ ド・ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、及 び３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドを包含する。クロスリン カーは非選択的であることもできる。非選択的クロスリンカーの例はビス−［β −（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド及びグルタルアルデヒド である。外因性分子が合成核酸である場合には、二官能性クロスリンカー分子の ための結合点を与えるように合成核酸の任意のヌクレオチドにアミン又はチオー ル基を加えることができる。核酸を合成して、例えばＵｎｉ−ＬｉｎｋＡｍｉｎ ｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、３’−ＤＭＴ−Ｃ６−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ、Ａｍｉ ｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ ＩＩ、Ｎ−ＴＦＡ−Ｃ６−ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ 、Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｐｈｏｓｐ ｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ及びＣ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ＣＰＧ（Ｃｌｏｎｔｈｅ ｃｈ，カリフォルニア州，パロアルト）のようなコンジュゲーション−コンペテ ント(conjugation-competent)試薬を組み入れることができる。 コンジュゲーションの非共有方法を用いて、ターゲッティング分子と外因性分 子とを接合させることもできる。非共有コンジュゲーションは、疎水性相互作用 、イオン相互作用、インターカレーション、核酸のメジャー若しくはマイナー溝 への結合、正荷電分子と負荷電分子とのイオン相互作用及び他のアフィニティ相 互作用を包含する直接又は間接手段によって、達成することができる。 共有結合は生理的環境において切断不能でも、例えばジスルフィド含有リンカ ーのように、生理的環境において切断可能でもよい。場合によっては、好ましい 結合は、組成物が病原性因子の壁を通って移送された後に初めて、加水分解を受 ける。例えば、組成物はペニシリナーゼ酵素によって加水分解されることができ る結合によって接合されることができる。このような組成物は宿主中で安定であ るが、病原性因子中に移送されるや否や解離する。ターゲッティング分子が病原 性因子中で外因性分子に結合した状態で留まるように、病原性因子によって加水 分解されない他の結合を用いることができる。このような分子は分解に耐えるこ とができる及び／又は種々な分子内移送機構を受けることができる。当業者は結 合されるべき分子の化学的性質と結合の好ましい特徴とに基づいて、ターゲッテ ィング分子と外因性化合物とを結合させるための好ましい結合を、過度の実験な しに、確認することができる。他の共有結合は当業者に周知であるので、これ以 上記載しない。 本発明の１つの方法は細胞膜上に発現されるＤ−グルコサミン又はＤ−シクロ セリン受容体のいずれかを有する細胞に有効である。このような膜は細胞の境界 を形成し、例えばオルガネラのような細胞内スペースの境界を形成することがで きる。細菌はこのような受容体を有する。本発明の方法と組成物とを用いて、イ ンビトロで（即ち、細胞培養において）又はインビボで、細胞が個々の細胞とし て若しくは病原性多細胞生物の一部として存在しうる場合に、細胞の細胞機能を 変更することができる。病原性生物は感染した宿主から培養するか又は寄託され た培養物から増殖させて、本発明の方法を受けさせることができる。同様に、哺 乳動物の宿主を本発明の組成物によって処置することができる；哺乳動物の細胞 はＤ−グルコサミン又はＤ−シクロセリンに対する受容体を有さないので、組成 物を適当な受容体を有する宿主中の病原性因子に選択的にターゲットさせること ができる。病原性因子を含む細胞は宿主の細胞外スペースに存在する、即ち、血 液若しくはリンパ液中に懸濁して存在するか、又は細胞内病原体であることがで きる。 本明細書で用いる限り、“受容体仲介エンドサイトーシス”とは、そのコグネ ート（cognate）受容体によるリガンドの結合によって仲介される、分子の細胞 中への選択的取り込み（selective uptake）を意味する。このことはエネルギー 依存性及びエネルギー独立性の移送イベント、例えば分子の濃度勾配に伴う又は 反する、このような分子の移送を、この移送が膜結合受容体へのリガンドの結合 に依存する限り包括する。 本明細書で用いる限り、“取り込み増強剤(uptake enhancing agent)”なる用 語は、病原性因子を処置するために用いられる外因性化合物の取り込み量又は取 り込み速度を高める化合物を意味するように意図される。取り込み強化剤はそれ 自身の資質で抗菌剤であることができる。取り込み強化剤は特に単一の抗菌性化 合物、構造的若しくは機能的同等物を共有するある種類の化合物、又は異質であ る化合物類の取り込みを明確に高めることができる。取り込み強化剤は特異的な 取り込み経路を刺激することができる、又は一般に病原性因子中への分子の移送 を高めることができる。取り込み強化剤は特定の病原性因子に対して特異的であ りうるが、特異的である必要はない。 取り込み強化剤の特異性度は、取り込み強化剤が相互作用する病原性因子の膜 成分から推論される。例えば、病原体の外側膜又は細胞壁成分の合成若しくは形 成を妨害する作用剤(agent)が、本発明の方法による外因性化合物の移送を増強 することができる。このような作用剤の特定の例は、β−ラクタム抗生物質の種 類に属する分子：ペニシリン、セファロスポリン等である。このような作用剤は 濃度勾配の溶解(dissolution)を促進することによって多くの化合物の取り込み を増強することができる。他の例は本発明の方法において外因性化合物の受容体 仲介移送に有用な特異的受容体の発現を増強することによって取り込みを高める 、例えばエタンブトールのような、作用剤である。受容体の発現を誘導する他の 分子は当業者に知られている。増殖培地からの例えば特定の栄養素のような分子 の削除は、本発明の方法のインビトロ適用で省略されたような分子の受容体を誘 導する有効な方法であると考えられる。同様な効果が食餌(diet)の変化又は問題 の受容体と結合した分子を封鎖するか若しくは不活化する作用剤の同時送達によ ってインビボで達成されることができる。このような作用剤（この１例はエタン ブトールである）による処置の結果は、問題の受容体の発現の増加である。エタ ン ブトールの場合には、細胞壁の単糖先駆体の受容体が調節される。 本明細書で用いる限り、“膜不安定化剤”は外因性化合物の排除に関する生物 学的膜の不安定性を生じる作用剤を意味する。これに関して、膜不安定化剤は物 理的、化学的又は生物学的性質でありうる。例えば、膜不安定化剤は例えば電気 回路パルス、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、低浸透性ショック(h ypoosmotic shock)、高速度ミクロプロジェクティル(microprojectile)等のよう な、細胞中にＤＮＡを非特異的に導入するために用いられる作用剤であることも できる。開口又は孔が膜中に形成されるように、不安定化剤を膜成分の間に挿入 することもできる。この種類の不安定化剤の例はアンホテリシンＢと細菌ポーリ ンタンパク質を包含する。他の膜不安定化剤は当業者に周知であろう。特定の外 因性分子の移送を増強するための膜不安定化剤は、ほんのルーチンの実験で選択 することができる。 本発明のターゲッティング分子によって送達可能な化合物は、例えば当該技術 分野で標準の抗生物質と、宿主の感染の軽減に有効であると知られる又は考えら れる他の作用剤のような、ターゲットにされる微生物(microbe)の増殖又は生残 のために必要な細胞機能を中断又は調節する作用剤を包含する。上記ターゲッテ ィング化合物によって送達されることができる化合物の１種類はアンチセンスオ リゴヌクレオチドであり、これは配列特異的にターゲット核酸とハイブリダイズ することによって、細菌細胞の生残又は増殖に重要である特定タンパク質の合成 を阻害する。 本明細書で用いる限り、“細胞機能調節剤”とは病原性因子の増殖、複製又は 生残のために必要な機能を変える化合物を意味する。例えば、細胞毒性又は細胞 分裂抑制性である全ての薬物が細胞機能調節剤である。さらに詳しくは、タンパ ク質合成、核酸合成、核酸複製、例えば有力な代謝産物の合成のような細胞代謝 プロセス、脂質合成、グリコシル化、ホスホリル化、及び他の細胞プロセスに干 渉する化合物が細胞機能調節剤である。他の細胞機能調節剤は、例えばビルレン スファクターに干渉する分子又は病原体−特異的遺伝子の発現をブロックする分 子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのように、病原性生物に特異的であ ると考えられる。ビルレンスファクターは病原性因子の病原性効果（例えば、侵 襲性又は毒性）の明示に重要である、病原性因子によって産生されるファクター を意味すると定義される。侵襲性ファクターは病原性因子が宿主防御機構による 捕捉又は消化を免れるのを助けることができる。例えば、特にＳ．ｐｎｅｕｍｏ ｎｉａｅ 、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｔｓ及びＹ．ｐｅｓ ｔｉｓ の莢膜多糖は宿主食細胞の付着を阻害し、それによって侵襲性を強化する 。細胞壁成分は細胞壁の消化を防止することによって侵襲性を強化し、それ故、 病原性因子の破壊を防止する。例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅのＭ−タンパク質とＭ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のマイコール酸(mycolic acid)のような成分が食細 胞による消化を阻害する。この種の病原性ファクターは宿主細胞の細胞内侵入を 可能にする。病原性生物に関連して、細胞機能調節剤は病原性トキシン分子の阻 害剤でもあることができる。 本発明の方法と組成物は例えば抗菌剤、抗菌性化合物強化剤(antimicrobial c ompound potentiating agent)、免疫系認識エンハンサー、診断性分子等のよう な外因性分子の病原体への送達に有用である。一般に、送達されるべき分子は、 非限定的に、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質及び糖タンパク質、これら の全ては天然及び非天然の種類のアミノ酸と結合とを含有することができる；ア ミノ酸と修飾アミノ酸、脂質、リン脂質及びリポソーム；抗体；トキシン；天然 及び非天然の構造及び組成のリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド；生 物学的活性を保有する天然及び非天然の類似体と誘導体と含めた、オリゴヌクレ オチドとポリヌクレオチド；ポリヌクレオチド又はタンパク質の発現を導く、プ ラスミドと他の核酸ベクター；バクテリオファージ誘導核酸又はタンパク質；ア ンチセンス核酸等を包含することができる。特定の状態の治療のために有用であ り、共有又は非共有リガンドを含めた技術上標準的な方法によってＤ−シクロセ リン又はＤ−グルコサミンにコンジュゲートすることができる任意の化合物を、 以下に述べる方法及び組成物に用いることができる。 病原体感染を軽減するか又は解消するような、抗菌物質として有用な分子を本 発明の方法及び組成物によって送達することができる。抗菌剤は細菌の複製を阻 害することによって又は感染性生物の生残のために必要な細菌成分の合成を阻害 することによって殺菌性又は細菌発育阻止性であることができる。抗生物質は合 成的に又は微生物によって製造されることができる。抗生物質の例は、アモキシ シリン、アンピシリン、カルベニシリン二ナトリウム(carbenicillin disodium) 、クロキサシリンＮａ、ナフシリンＮａ、ペニシリンＧＮａ、ピペリシリン及び シクラシリン(cyclacillin)を包含するペニシリン類；セファクロル、セフォタ キシムＮａ、セフタジジム及びセフトリアキソンを包含するセファロスポリン； アズトレオナムとイミペニムを包含する、カルバペニム類とモノバクタム類；ク ラブラネートカリウムとスルバクタムＮａとを包含するβ−ラクタマーゼ阻害剤 類；硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ネオマイシン、硫酸ストレプト マイシン及びトブラマイシンを包含するアミノグリコシド類；エリスロマイシン と誘導体を包含するマクロライド類(macrolides)；バシトラシン、硫酸ポリミキ シンＢ、硫酸カプレオマイシン、コロスチメタンＮａ及びダプトマイシンを包含 するポリペプチド類；テトラサイクリン類；クラムフェニコールと誘導体；シク ロセリン；スペクチノマイシンＨＣｌ；バンコマイシンＨＣｌ；フルオロキノロ ン類等を包含する。 抗菌剤は、特定の遺伝子産物の合成を低下又は増加させる核酸であることがで きる。例えば、抗菌剤は細菌細胞に有害であるタンパク質の合成を導くプラスミ ドであることができる。このようなトキシンはトキシンによってターゲットにさ れる細菌細胞に感染した宿主に影響しないことが好ましい。他の例として、抗菌 物質はアンチセンスオリゴヌクレオチド又は、リボザイムを包含する触媒的核酸 であることができる。このような核酸抗菌性化合物の有効量は、例えば細胞壁、 細胞膜、栄養素輸送若しくは合成系、タンパク質合成装置、核酸合成装置等の成 分のような、細菌細胞の増殖又は生残に重要な遺伝子産物の発現を低下させるた めに充分な量であると考えられる。特定の例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ ｍｕｔａｎｓ のグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸にハイ ブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、このような細菌に本発明の 方法と組成物によって送達されることができる。スクロースをデキストランに転 化させ、このようにしてＳ．ｍｕｔａｎｓを歯の表面に付着させることができる グルコシルトランスフェラーゼ酵素の減少は、宿主中に存在する細菌感染の程度 を減少させる。 本発明の組成物によって送達可能な他の化合物は、医学的分野で標準的な抗生 物質の効果を強化することによって抗菌剤として有効でありうる。このような増 強性化合物は単独で送達されたときに抗菌剤として有効でありうる。増強剤の例 は、抗生物質の受容体の発現因子(inducer)、抗生物質の細菌細胞中への移送を 増加させる又は抗生物質の細菌細胞からの移送を減少させる作用因子、抗生物質 を代謝させる細菌酵素の阻害剤等を包含する。 送達される化合物は、宿主を感染させる病原性因子の、宿主の免疫系による認 識を増強させるような化合物をも包含する。このような免疫認識強化性化合物は 、免疫認識に対する病原体の防御機構(defense)を妨害する又は破壊する任意の 化合物を包含する。これに関して、減少させるべき莢膜で囲まれた細菌細胞の莢 膜の合成を低下させるか又は莢膜の分解を増強させる、アンチセンスオリゴヌク レオチド、リボザイム又はプラスミドを抗菌剤と見なすことができる。例えば、 ヒアルロニダーゼの合成を導くプラスミドの送達は細菌莢膜の分解を増強させ、 処置した細菌細胞への食細胞の付着を強化する。同様に、グラム陽性菌における ペプチドグリカン合成の阻害剤は、処置した細胞の細胞膜中に宿主の溶菌補助タ ンパク質(lytic complement protein)が挿入される可能性を強化すると考えられ る。他の例は、腸内寄生虫のミクロフィラリア表面膜を変化させて、これらに宿 主防御性破壊(host defense destruction)をより受けやすくさせるジエチルカル バモジンと、宿主防御機構が活性化される程度に腸内寄生虫の空胞形成とビジキ ュレーション(vsiculation)を生じるプラジクアンテル(praziquantel)である。 本発明の組成物によって送達可能な化合物の他の例は、特定のプロテアーゼ又は ペプチダーゼを阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムであ る。このような化合物は、補体(complement)ペプチドを分解させる酵素、又は免 疫認識と溶菌との他のエフェクターの量を減少させることができる。このような プロテアーゼの例は、補体タンパク質Ｃ３ａとＣ５ａを不活化するＰｓｅｕｄｏ ｍｏ ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ のエラスターゼである。感染性細菌中に存在する プロテアーゼ活性の低下に有効な化合物は、感染を減ずる免疫監視の強化にも有 効である。細菌感染の減少に関して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、鼻咽頭の髄膜炎 菌、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ中に存在する細菌 プロテアーゼの種類（これらのプロテアーゼはＩｇＡ₁ダイマーを消化する）の 上記方法による阻害は、ＩｇＡ₁ダイマー結合を増加させ、細菌細胞が宿主の粘 膜に付着する可能性を低下させる。プロテアーゼの発現、分泌又は機能の低下は 病原体の侵襲を中止させる有効な治療手段である。 本発明の方法及び組成物による、上述した抗菌性化合物及び他の化合物の送達 は、先行技術方法よりも特異的かつ選択的である。ターゲットを定めた本発明の 送達は、先行技術の抗菌物質送達よりも宿主組織が耐える暴露が軽度であるため に、今までに可能であったよりも大きな毒性の抗菌性化合物を医師(practitione r)が用いることを可能にする。抗菌性化合物は感染性細菌及び他の病原体に特異 的に送達されるので、Ｄ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンにコンジュゲート した抗菌性化合物の等量の送達は、抗菌性化合物単独による治療に比べて少量の 抗菌性化合物を必要とすることになる。感染性病原体への抗菌物質の送達は、本 発明の組成物によって送達される抗菌物質が受容体仲介エンドサイトーシス機構 によって取り込まれるので、先行技術方法によるよりも効果的でもある。他の方 法に比べたこれらの改良は、少量の抗菌剤の使用によって宿主の病原体感染を軽 減させることを可能にする。本発明の組成物の使用は、感染症の治療の結果とし て、先行技術方法よりも少ない厳しさ(severity)と期間での軽度な副作用を生じ る。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細菌の核酸配列に相補的な塩基 配列から成る短いオリゴヌクレオチド（約１２〜３６ヌクレオチド長さ）である 。オリゴヌクレオチドの５’若しくは３’末端、インターヌクレオシドホスフェ ート若しくは任意の他の合成インターヌクレオシド部分、糖部分又は塩基自体に おいて、オリゴヌクレオチドの化学修飾を生成することができる。外因的に施用 される場合に、これらのオリゴマーはターゲット細胞に侵入した後にそれらがタ ー ゲットｍＲＮＡ配列に配列特異的にハイブリダイズするために、ターゲットにさ れたタンパク質の合成を阻害することができる。 本発明を実証するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓ に非常に密接に関連し、薬物がインビトロスクリーニング系で有効である と判明した後に臨床結果に関して予測可能である細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ を、我々は用いた。薬物耐性結核に対する治療法(the rapeutic modality)を開発するための一般的な許容されるモデルとしてＭ．ｓｍ ｅｇｍａｔｉｓ を用いることの正当化は、下記の周知の要因による： Ｉ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと重要な遺伝的配 列を共有する。開発したアンチセンス薬物は、増殖のために重要なタンパク質の 発現を阻害するためのマイコバクテリウム菌遺伝機構とのハイブリダイゼーショ ンに基づく； ＩＩ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに比べた、そ の迅速な増殖速度のために抗結核薬の開発のための初期マイコバクテリウム菌モ デルとして今までに用いられている；及び ＩＩＩ．ヒトにおける非病原体であるＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、薬物耐性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ においてターゲットを定めた薬物開発の研究のための 好ましい選択である。これらの研究のための多重薬物耐性（ＭＤＲ）Ｍ．ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ の使用は、許容されない危険性を生じ、初期研究の非常に長 い期間を要する、広範囲な微生物学的かつ生化学的操作を必要とするために不可 能であると考えられる。 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、一般に抗マイコバクテ リウム菌薬、特に抗結核薬の開発に関連した、生化学的研究と効力スクリーニン グのためのモデルとして一般に用いられている。 多くの条件下でオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートが細菌に侵入 しないことが発見されている。細菌細胞中へのオリゴヌクレオチドの侵入を可能 にするために２つの対策が用いられて成功している。１つの対策は非常に低レベ ルのエタンブトールの存在を用いるものであり、他方はＤ−シクロセリン又はＤ −グルコサミン分子に共有結合したオリゴマーの使用を含み、これによって受容 体仲介プロセスによって細菌細胞中への侵入を達成している。マイコバクテリウ ムアスパルトキナーゼ（ａｓｋ）遺伝子の特定領域に対して配列において相補的 な修飾オリゴヌクレオチドによって、エタンブトールと組合わせて（エタンブト ール単独に比べて）用いた場合に又は他の細胞毒性若しくは細胞分裂抑制性作用 剤の存在なしにＤ−シクロセリン共有結合アダクツ(covalent adduct)として用 いた場合に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの明確な配列特異的増殖阻害が得られた。 Ｄ−グルコサミン分子が共有結合した配列特異的なオリゴデオキシヌクレオチド ホスホロチオエートは、エタンブトールの存在下でＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓによ って同じ条件下の非修飾オリゴマーに比べて非常に大きい速度で取り込まれ、か なり増大した増殖阻害を生じ、細胞壁の炭水化物先駆体の合成のエタンブトール による阻害のためのヘキソース取り込みのアップレギュレーションを実証する。 したがって、我々はここで、修飾オリゴヌクレオチドが細菌の増殖阻害に使用 可能であることと、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのイソニアジド耐性、リファムピシ ン耐性かつストレプトマイシン耐性な菌株の増殖が同じ細菌の薬物感受性菌株と 同じ程度に阻害されうることとを実証する。それ故、本発明は、修飾オリゴヌク レオチドが、特にＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンのようなターゲッティ ング分子にコンジュゲートした場合に、細菌における薬物耐性を克服できること を実証する。病原性因子における薬物耐性を克服するために他の外因性分子を本 発明の方法と組成物とによって送達することもできる。組成物の個々の成分は、 特定の病原性因子が薬物耐性を示す機構を克服するように選択することができる 。例えば、上記ターゲッティング分子は特定薬物の取り込みを低下させた病原性 因子における薬物耐性を克服するために、病原性因子中へのこのような薬物の受 容体仲介移送を誘導することによって有効である。病原性因子の他の薬物耐性形 態、即ち、多重薬物耐性の輸送タンパク質(transport protein)の発現又は抗菌 剤分解の増強は、本発明の組成物の他の特徴によって克服することができる。例 えば、外因性化合物へのターゲッティング分子の共有結合は、選択した薬物の立 体的特性(steric properties)を多重薬物耐性のタンパク質によって輸送されな いよう に変えることができる。薬物へのターゲッティング分子のコンジュゲーションは 薬物の特定部位を微生物の分解酵素から遮蔽することにも効果的であると考えら れる。 我々は、液体培地中で増殖させたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａ ｔｉｓ を用いて実験をおこなった（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊｒ．，Ｗ．Ｒ．Ｋａｌｐａ ｎａ，Ｇ．Ｖ．，Ｃｉｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｐａｓｃｏｐｅｌｌａ，Ｌ．，Ｓ ｎａｐｐｅｒ，Ｓ．Ｂ．，Ｕｄａｎｉ，Ｒ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｗ．，Ｂａｒｌ ｅｔｔａ，Ｒ．Ｇ．及びＢｌｏｏｍ，Ｂ．Ｒ．「マイコバクテリウム菌の遺伝子 系」Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４：５３７〜５５５，１ ９９１）、これは、これらの細菌細胞が細菌細胞膜を横切って、細胞内コンパー トメント中へのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート類の侵入を許さ ないことを示す。通常の条件下では、２５μＭまでの広範囲なオリゴデオキシヌ クレオチドホスホロチオエート類によって、有意な増殖阻害活性は観察されなか った。マイコバクテリウム細胞エンベロープ構造、特に外膜層（ＯＬ）は親水性 薬物のマイコバクテリウム細胞中への侵入を阻止し、外膜層の脂質部分中で容易 に可溶化される親油性薬物の侵入を助成することが以前から知られている（Ｒａ ｓｔｏｇｉ，Ｎ．，Ｇｏｈ，Ｋ．Ｓ．及びＤａｖｉｄ，Ｈ．Ｌ．「細胞エンベロ ープ合成の阻害剤によるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍの薬物感受性 の増強」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：７ ５９〜７６４，１９９０）。１９６６年以来、結核と他のマイコバクテリウムに よって生じる感染症との治療に臨床的に用いられている薬物である（Ｈｅｉｆｅ ｔｓ，Ｌ．Ｂ．，Ｉｓｅｍａｎ，Ｍ．Ｄ．及びＬｉｎｄｈｏｌｍ−Ｌｅｖｙ，Ｐ ．Ｊ．「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘとＭｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとに対するエタンブトールＭＩ ＣとＭＢＣ」 Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３ ０：９２７〜９３２，１９８６と、これに記載された参考文献）エタンブトール は、細胞エンベロープ合成を阻害することによって、マイコバクテリウムの薬物 感受性の増強に有効であると報告された（Ｈｏｆｆｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｋａｅｌ ｌｅ ｎｉｕｓ，Ｇ．，Ｂｅｅｚｅｒ．Ａ．Ｅ．及びＳｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．「Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅに対するエタンブトール と他の抗菌剤との相乗効果の機構に関する研究」 Ａｃｔａ Ｌｅｐｒｏｌｏｇ ｉｃａ（Ｇｅｎｅｖａ）７（Ｓｕｐｐｌ．１）：１９５〜１９９，１９８９）。 マイコバクテリウムの細胞壁合成の中断におけるエタンブトール活性の機構は確 認されている。これらの機構は細胞壁中へのマイコール酸移送の阻害（Ｔａｋａ ｙａｍａ，Ｋ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｕｎｕｇｉ，Ｋ．Ａ．及び Ｋｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｏ．「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ の細胞壁中へのマイコール酸移送のエタンブトールによる阻害」 Ａｎｔｉｍｉ ｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１６：２４０〜２４２，１９７ ９）と、細胞壁オリゴ糖と多糖類の合成に用いられる単糖類のグルコースからの 生合成の阻害（Ｔａｋａｙａｍａ，Ｋ．とＫｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｏ．「Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ におけるエタンブトールによるアラビ ノガラクタン合成の阻害」 Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏ ｔｈｅｒ．３３：１４９３〜１４９９，１９８９）とを包含する。エタンブトー ルのこれらの初期効果の後に、細胞壁アラビノガラクタン蓄積のエタンブトール によって促進される阻害の最終結果である、マイコバクテリウム細胞壁中へのマ イコール酸移送の低下が生じる（Ｓｉｌｖｅ，Ｇ．，Ｖａｌｅｒｏ−Ｇｕｉｌｌ ｅｎ，Ｐ．，Ｑｕｅｍａｒｄ，Ａ．ＤｕＰｏｎｔ，Ｍ．Ａ．，Ｄａｆｆｅ，Ｍ． 及びＬａｎｅｅｌｌｅ，Ｇ．「マイコバクテリウムにおけるグルコース代謝のエ タンブトール阻害：薬物の可能なターゲット」 Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ ｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：１５３６〜１５３８，１９９３）。本発明 において、エタンブトールがアンチセンスオリゴヌクレオチドの細菌による吸収 を促進することができることが発見された。 実施例１ 液体培地中でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓの増殖の測定 をおこなった（Ｊａｃｏｂｓ，Ｊｒ．，Ｗ．Ｒ．等，「マイコバクテリウムの遺 伝子系」，上記文献）、細胞計数は細菌粒子の計数に適当なプローブを用いる電 子Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ｚによっておこなった。 この細胞計数方法は、我々が連続希釈後の寒天上でのプレーティング(plating )とコロニーカウントによるその同等性(equivalency)によって実証したように、 非常に正確であった。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１０寒天中でのコロニー増殖 による増殖の評価も同様に用いられた。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの増殖は実際の 細胞カウントと、細菌細胞の少なくとも９９％の増殖を阻害するために必要な阻 害剤の最小濃度（ＭＩＣ）と細菌集団の少なくとも９９％を殺すために必要な阻 害剤の最小濃度（ＭＢＣ）である、ＭＩＣ（最小阻止濃度）とＭＢＣ（最小殺菌 濃度）の測定とによって評価した。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの野生型菌株はｍｃ² １５５（Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｊｒ．の好意により提供）（Ｊａｃｏｂｓ， Ｊｒ．，Ｗ．Ｒ．等，「マイコバクテリウムの遺伝子系」，上記文献）と、我々 自身によって単離したＡＴＣＣ（Ａｍｅｒ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）菌株６０７からの他の単独コロニー単離物であった。イソ ニアジド、リファムピン又はストレプトマイシンに耐性な菌株は我々の実験室に おいて、１０^-6〜１０^-7の突然変異頻度で単独薬物に対する耐性を生じる自然Ｍ ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ突然変異の存在に基づく発表された方法によって単離した （Ｈｅｙｍ，Ｂ．とＣｏｌｅ，Ｓ．Ｔ．「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅ ｇｍａｔｉｓ とＭ．ａｕｒｕｍとのイソニアジド耐性突然変異体の単離及び特徴 づけ」Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：７２１〜７３０，１９９２）。オ リゴデオキシヌクレオチドの合成と修飾及びそれらの変更のための全ての方法論 は発表された方法に従う（Ｃａｒｄｕｌｌｏ，Ｒ．Ａ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ． ，Ｆｌｏｒｅｓ，Ｃ．，Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．及びＷｏｌｆ，Ｄ．Ｅ．「 非放射性蛍光共鳴エネルギー転移による核酸ハイブリダイゼーションの検出」， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０〜８７９４， １９８８；Ａｇｒａｗａｌ，ＳとＴａｎｇ，Ｊ．Ｙ．「Ｈ−ホスホネート アプ ローチを用いるオリゴリボヌクレオチドとそのホスホロチオエート類似体との効 果的な合成」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：７５４１〜７ ５ ４４，１９９０；Ｍｅｔｅｌｅｖ，Ｖ．とＡｇｒａｗａｌ，Ｓ．「オリゴヌクレ オチドホスホロチオエート類のイオン交換高性能液体クロマトグラフィー分析」 ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：３４２〜３４６，１９９２）。 エタンブトールをヒトにおいて達せられる血漿レベルよりも５〜１０倍低い、 ０５〜１．０μｇ／ｍｌのレベルで液体培地中に用いて（Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｇ． Ｌ．とＳａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．「抗菌剤」，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，Ｇｉｌｌｍａｎ，Ａ．Ｇ ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｉｅｓ，Ａ．Ｓ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｐ．編集，１ １５２〜１１５３頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、Ｍ．ｓｍｅ ｇｍａｔｉｓ を、特異的遺伝子ターゲットに向けられるオリゴデオキシヌクレオ チドホスホロチオエートによって、エタンブトール処置のみに比べて、侵入及び 増殖阻害を受けやすくした。発表されたマイコバクテリウム遺伝子ヌクレオチド 配列のコーディング領域と非コーディング領域との幾つかのセンス配列に相補的 な数種類の異なるオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートを合成した。 マイコバクテリウムアスパルトキナーゼ遺伝子（ａｓｋ）の保存領域に相補手き なアンチセンスオリゴマーは、液体培地スクリーニング系においてＭ．ｓｍｅｇ ｍａｔｉｓ の増殖阻害に非常に効果的であると判明した（表１）。オペロンの上 流及びオペロン中でアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ） 遺伝子によって同定されたアスパルトキナーゼ（ａｓｋ）遺伝子は、重要な生合 成経路を触媒するタンパク質をコードする（Ｃｉｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｗｅｉ ｓｂｒｏｄ，Ｔ．Ｒ．，Ｐａｓｃｏｐｅｌｌａ，Ｌ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｂ．Ｒ．及 びＪａｃｏｂｓ，Ｊｒ．，Ｗ．Ｒ．「マイコバクテリウムからのアスパルトキナ ーゼと、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ オペロンとの単離及 び特徴づけ」，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＩＩ．６９２〜６３９，１９９４ ）。 ａ データは２つの独立した実験の平均値を表す。 ｂ 全てのインキュベーションは１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ培養物でおこなった。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ の他の野生型菌株並びにＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのイソ ニアジド耐性、ストレプトマイシン耐性及びリファムピシン耐性菌株に関する結 果は定量的に同じであった。 ｃ．６２０ｘ１０⁶細胞／ｍｌはこれらの条件下での液体培養物中のＭ．ｓｍｅ ｇｍａｔｉｓ 細胞の飽和密度を表す。 ｄ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ａｓｋ−ａｓｄオペロンのヌクレオチド配列１５ ３３〜１５５３に相補的な２１マー（２１ヌクレオチド長さ）オリゴデオキシヌ クレオチドホスホロチオエート。 ｅ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ａｓｋ−ａｓｄオペロンのヌクレオチド配列１５ ２７〜１５５３に相補的な２７マー（２７ヌクレオチド長さ）オリゴデオキシヌ クレオチドホスホロチオエート。 ｆ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ａｓｋ−ａｓｄオペロンのヌクレオチド配列１５ １８〜１５５３に相補的な３６マー（３６ヌクレオチド長さ）オリゴデオキシヌ クレオチドホスホロチオエート。 実施例２ ａｓｋ遺伝子の５’末端に単一転写始点を含有するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの ａｓｋ−ａｓｄオペロンの読み枠内のヌクレオチド配列１４９９〜１５５３の領 域は、最良の遺伝的ターゲットであると実証された（表１）。この領域はマイコ バクテリウム及び他の細菌種における高度保存(highly conserved)領域をコード し、アスパルトキナーゼタンパク質の活性部位をもコードすることが示されてい る（Ｃｉｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｄ．等，「マイコバクテリウムからのアスパルトキナ ーゼと、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ オペロンとの単離及 び特徴づけ」，上記文献）。ａｓｋ遺伝子のこの特定の領域に対して向けられる 相補的配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの細菌増殖阻害効力は、ａ ｓｄ遺伝子発現のその予想される付加的増殖阻害を考慮するならばさらに理解さ れる。ＡｓｋとＡｓｄの両タンパク質はマイコバクテリウム細胞壁結合性(integ rity)に影響する生合成反応を触媒する。この領域の種々なセグメントに相補的 な、幾つかの２１マー及び２７マーオリゴヌクレオチドは、エタンブトールと組 合せての効力を実証した。 Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの増殖の阻害におけるオリゴデオキシヌクレオチドホ スホロチオエート類の感受性の分析を、低レベルのエタンブトール（０．５〜５ ．０μｇ／ｍｌ）の存在下の液体培地中でおこなったところ、効果的なオリゴマ ーは２．５μＭ濃度において、同じレベルのエタンブトールのみの存在下での増 殖に比べて、９０％までの増殖阻害を生じた（表ＩＩ）。親菌株と、親菌株のＡ ＴＣＣ６０７コロニーから我々の実験室において選択した後に、発表された一般 的方法に従って薬物耐性突然変異体を単離した、イソニアジド、リファムピシン 及びストレプトマイシンに耐性なＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌株（Ｈｅｙｍ，Ｂ． とＣｏｌｅ，Ｓ．Ｔ．「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳｍｅｇｍａｔｉＳとＭ ．ａｕｒｕｍとのイソニアジド耐性突然変異体の単離及び特徴づけ」，上記文献 ）は、アンチセンスオリゴヌクレオチド仲介増殖阻害に対して同じ感受性を生じ て、個々の薬物耐性の回避を実証した。 ａ データは２つの独立した実験の平均値を表す。 ｂ 全てのインキュベーションは１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ培養物でおこなった。 イソニアジド耐性、ストレプトマイシン耐性及びリファムピシン耐性菌株に関す る結果は定量的に同じであった。 ｃ．ＭＩＣははブロス培養物中で２週間中に細胞増殖の少なくとも９９％を阻害 したエタンブトールの最小濃度として測定した。 ｄ．表１の脚注に記載。 実施例３ エタンブトールは細胞壁単糖先駆体の細胞内枯渇を生じ、エタンブトールによ るＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの増殖阻害はＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、 Ｄ−マンノース又はＤ−アラビノースの添加によって逆転されるが、Ｄ−グルコ ース又はＤ−フルクトースの添加によっては逆転されないので（Ｓｉｌｖｅ，Ｇ ．等，「マイコバクテリウムにおけるグルコース代謝のエタンブトール阻害：薬 物の可能なターゲット」，上記文献）、エタンブトールの存在下でのＭ．ｓｍｅ ｇｍａｔｉｓ による単糖先駆体吸収の可能なアップレギュレーションを利用した 。エタンブトールの存在下でのＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ増殖の阻害に有効であっ たオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド３’末端において、前述した精製 及び分析と共にＨ−ホスホレート化学を含む確立された化学的方法を用いて、ホ スフェートリンカーを介してＤ−グルコサミンに共有結合させた。オリゴデオキ シヌクレオチドホスホロチオエートに対するＤ−グルコサミンの共有結合アダク ツは、エタンブトールの存在下でのオリゴヌクレオチドの増殖阻害活性を顕著に 増強させた（表ＩＩＩ）。 ａ データは２つの独立した実験の平均値を表す。 ｂ 全てのインキュベーションは１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ培養物でおこなった。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ の他の野生型菌株並びにＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのイソ ニアジド耐性、ストレプトマイシン耐性及びリファムピシン耐性菌株に関する結 果は定量的に同じであった。６５０ｘ１０⁶細胞／ｍｌはこれらの条件下でのブ ロス培養物中のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの飽和密度を表す。 ｃ．オリゴヌクレオチドＯＤＳ−ＤＡは、Ｄ−アラニン分子によるその３’末端 における共有結合修飾(covalent modification)以外には、そのヌクレオチド配 列においてＯＤＳ８に同じである。 ｄ．オリゴヌクレオチドＯＤＳ−ＤＳは、Ｄ−シクロセリン分子によるその３’ 末端における共有結合修飾以外には、そのヌクレオチド配列においてＯＤＳ８に 同じである。 ｅ．オリゴヌクレオチドＯＤＳ−ＬＳは、Ｌ−シクロセリン分子によるその３’ 末端における共有結合修飾以外には、そのヌクレオチド配列においてＯＤＳ８に 同じである。 ｆ．オリゴヌクレオチドＯＤＳ−ＤＧは、Ｄ−グルコサミン分子によるその３’ 末端における共有結合修飾以外には、そのヌクレオチド配列においてＯＤＳ８に 同じである。 実施例４ Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ中へのアンチセンスオリゴヌクレオチド吸収の強化の ための共有結合リガンドの利用におけるこの最初の成功後に、エタンブトールの 存在なしにオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートのＭ．ｓｍｅｇｍａ ｔｉｓ 中への吸収と、オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートによるそ の後のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ増殖阻害とを可能にするリガンドを探すことに着 手した。合成して、試験した幾つかのリガンドのなかで、ポジティブな結果を生 じた唯一のリガンドはＤ−シクロセリンであった。Ｄ−シクロセリンは、抗結核 療法(regimen)の一部として用いられている広範囲スペクトル抗生物質である（ Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌ．とＳａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．「抗菌剤」，Ｔｈｅ Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，Ｇ ｉｌｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｉｅｓ，Ａ．Ｓ．及びＴａｙ ｌｏｒ，Ｐ．編集，１１５６頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。 Ｄ−シクロセリンの細菌における阻害活性は細菌細胞壁合成にＤ−アラニンが関 与する反応に関係するので、Ｄ−シクロセリンはＤ−アラニンに用いられる吸収 系によって吸収されると一般的に考えられる。Ｄ−グルコサミン修飾オリゴマー の合成と同様な方法で、３’末端ホスフェートリンカーを用いて、エタンブトー ルの存在下でＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ増殖を阻害するオリゴデオキシヌクレオチ ドホスホロチオエートを、Ｄ−シクロセリンに共有結合させた。Ｄ−シクロセリ ンに共有結合した、ａｓｋ遺伝子の上記領域に相補的な塩基配列を有する２１マ ーのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートは、５μＭの濃度において 液体培地中のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの６０〜７０％阻害を典型的に生じた（表 ＩＩＩ）。Ｄ−シクロセリンリガンドを有さない同じオリゴヌクレオチド、又は Ｌ−シクロセリン、Ｄ−若しくはＬ−アラニン、Ｌ−アザセリン及び多様な他の リガンドに共有結合した場合の同じオリゴヌクレオチドは、同じ条件下でＭ．ｓ ｍｅｇｍａｔｉｓ の増殖に全く効果を及ぼさなかった（表ＩＩＩ）。遊離のＤ− シクロセリン自体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの共有結合部分として存 在するレベルと等しいレベル（１．０μｇ／ｍｌ）において液体培地中で、増殖 の最小阻害を生じた（表ＩＶ）。このレベルの１０〜３０倍過剰なＤ−シクロセ リンは、液体培地中に存在する場合に（１０〜３０μｇ／ｍｌ）、Ｍ．ｓｍｅｇ ｍａｔｉｓ の増殖の有意な阻害を生じた。さらに重要なことには、このレベルの 遊離Ｄ−シクロセリンは、５μＭ濃度のＤ−シクロセリン修飾アンチセンスオリ ゴヌクレオチドと共に存在する場合には、この修飾オリゴヌクレオチドの阻害活 性を助成しなかったばかりか、遊離Ｄ−シクロセリンによって得られる大体のレ ベルにまで阻害レベルを実際に低下させた（表ＩＶ）。これらのデータは、遊離 Ｄ−シクロセリンがＤ−シクロセリン修飾オリゴヌクレオチドの細胞吸収に関係 する同じ受容体に関して競合して、Ｄ−シクロセリン修飾オリゴヌクレオチドの 吸収をブロックして、その結果、このＤ−シクロセリン修飾オリゴヌクレオチド の増殖阻害活性を上首尾にブロックすることを実証する。 ａ データは２つの独立した実験の平均値を表す。 ｂ 全てのインキュベーションは１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ培養物でおこなった。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ の他の野生型菌株並びにＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのイソ ニアジド耐性、ストレプトマイシン耐性及びリファムピシン耐性菌株に関して得 られた結果は定量的に同じであった。６３２ｘ１０⁶細胞／ｍｌはこれらの条件 下でのブロス培養物中のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの飽和密度を表す。 ｃ．表ＩＩＩの脚注に記載したとおり。 結論として、本発明は特に薬物耐性結核菌の、一般的には薬物耐性細菌の科学 的に許容されるモデルとしての薬物耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇ ｍａｔｉｓ を用いて、下記のことを実証する： 細菌細胞の増殖又は代謝に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子の配列 の相補的な（“アンチセンス”）ヌクレオチド配列を有する、オリゴデオキシヌ クレオチド類とそれらのホスホロチオエート誘導体（オリゴデオキシヌクレオチ ドホスホロチオエート）を、種々な薬物に対する耐性を回避するやり方で病原菌 細胞増殖を阻害するために用いることができる。しかし、オリゴヌクレオチドは 多くの場合に病原菌細胞膜を横切る細胞中への侵入を、下記２方法のいずれかに よって得られる方法によって、強化されなければならない： Ｉ． オリゴヌクレオチドのマイコバクテリウム細胞中への侵入を可能にし、そ の結果増殖を有意に阻害する、例えばエタンブトールのような、膜不安定化剤の マイコバクテリウムへの使用。 ＩＩ．細胞受容体のリガンドであるＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミンに共 有結合したオリゴヌクレオチドの使用、これは膜不安定化剤の存在なしに、病原 菌細胞中への修飾オリゴヌクレオチドの侵入の強化を可能にする。これらの化合 物の細菌細胞中への迅速な侵入は、共有結合したリガンドとその受容体との相互 作用による。共有結合したリガンドは細胞内でのオリゴヌクレオチドの増殖阻害 活性に影響を与えない。 オリゴヌクレオチドの化学的修飾はこれらのオリゴヌクレオチドをヌクレアー ゼ作用による生物学的分解から保護し、Ｈ−ホスホレート化学を含む確立された 化学的方法（ａｒｄｕｌｌｏ，Ｒ．Ａ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，Ｆｌｏｒｅｓ ，Ｃ．，Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．及びＷｏｌｆ，Ｄ．Ｅ．「非放射性蛍光共 鳴エネルギー転移による核酸ハイブリダイゼーションの検出」，Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０〜８７９４，１９８８；Ａｇ ｒａｗａｌ，ＳとＴａｎｇ，Ｊ．Ｙ．「Ｈ−ホスホネート アプローチを用いる オリゴリボヌクレオチドとそのホスホロチオエート類似体との効果的な合成」， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：７５４１〜７５４４，１９９ ０）を、既述された精製及び分析（Ｍｅｔｅｌｅｖ，Ｖ．とＡｇｒａｗａｌ，Ｓ ．「オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類のイオン交換高性能液体クロマト グラフィー分析」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：３４２〜３４６，１９ ９２）と共に用いて、本発明に開示するＤ−シクロセリン又はＤ−グルコサミン のような、小さいリガンド分子によるオリゴヌクレオチドの共有結合修飾を可能 にする。 上記実施例はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓと、これと密 接な環系によって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと に関する方法と製品とを説明するが、本発明はこれらに限定されない。本発明は 細菌、一般に病原性因子の耐性菌株と非耐性菌株の両方に適用可能である。 薬物耐性は、周知のように、緊急の重大な公衆健康問題であり、慣用的な効果 的で安価な抗生物質への耐性は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ 以外にも非常に多様な微生物の菌株に認められている。したがって、 本発明はこのような菌株の処置に特に重要である。主要な抗生物質に対して耐性 を発生した細菌菌株の例は、疾患を誘発する細菌の中でも特に、Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ 、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅ 、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ 及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを 包含する（Ｓａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｐｕｓｎｉｋ−Ｕｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．及び Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌ．，「微生物疾患の化学療法」，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，Ｇｉｌｍ ａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｉｅｓ，Ａ．Ｓ．及びＴａｙｌｏｒ， Ｐ．編集，１０１８〜１０４６頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０） 。本発明で開示する方法論を用いて、広範囲スペクトルの細菌種の増殖を阻害す ることができる。他の特定の例として、実際にＤ−シクロセリンを吸収するＥ． ｃｏｌｉ において（Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌ．ｔｏＳａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．「抗菌 剤」，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒ ａｐｅｕｔｉｃｓ ，Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｉｅｓ， Ａ．Ｓ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｐ．編集，１１５６頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅ ｓｓ，１９９０）、遺伝子エンコーディングアスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＳＫ タンパク質）が配列決定されている（Ｃａｓｓａｎ，Ｍ．，Ｐａｒｓｏｔ，Ｃ． ，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｎ．及びＰａｔｔｅ，Ｊ．Ｃ．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のリシン感受性アスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓ Ｃ遺伝 子のヌクレオチド配列」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０５２〜１０５ ７，１９８６）、それ故、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｓｋ遺伝子の匹敵する配列に相補的 な塩基配列を有するＤ−シクロセリン修飾オリゴデオキシヌクレオチドホスホロ チオエートは、本明細書に開示する機構によって細菌の増殖を阻害すると予想さ れる。本発明はまた、抗菌剤への耐性を発生させた、原生動物及び後生動物(met azoan)感染症のような、寄生虫感染症の治療にも使用可能である（Ｗｅｂｓｔｅ ｒ，Ｌ．Ｔ．Ｊｒ．「寄生虫感染症の化学療法」，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，Ｇｉｌｍａｎ， Ａ．Ｇ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｉｅｓ，Ａ．Ｓ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｐ．編 集，９５４頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。 実施例は、大きい親水性分子の移送を、細菌細胞の受容体へのリガンドにこの ような分子を結合させることによって強化する可能性を実証する。本発明が細菌 細胞膜を横切るオリゴヌクレオチドの受容体仲介移送に限定されないことは、当 業者に明らかであろう。むしろ、本発明はＤ−グルコサミン又はＤ−シクロセリ ンの受容体を含む受容体仲介プロセスによって生物学的膜を通して外因性分子を 投与するための組成物と方法とに包括する。このように投与される外因性分子が オリゴヌクレオチドに限定されないことが意図される。本発明によって投与され る分子は大きくても小さくてもよく、荷電していても無荷電であってもよく、極 性でも無極性でもよい。分子コンジュゲーション分野の進歩は、当業者が上述し たような多くの種類の分子を本発明に有用なリガンドに結合させることを可能に する。上述したこのような分子結合の化学は当業者に周知であろう。同様に、熟 練した技術者は、本発明の方法と組成物がＤ−グルコサミン又はＤ−シクロセリ ン又はこれらの生物学的に機能的な(biologically functional)同等物の受容体 を包含する実際に任意の生物学的膜に分子を投与するために有用であることを理 解するであろう。本発明によってターゲットされる膜は、病原性微生物を包む天 然生成膜、合成膜及び、例えば、生物学的、化学的若しくは物理的手段による、 膜融合、受容体エンコーディング核酸のウイルス トランスダクション(transdu ction)又はトランスセクション(transsection)によって適当な受容体が導入され た膜を包含する。 当業者は、ほんのルーチンの実験によって、病原性因子の代謝及び増殖に重要 である遺伝子及びこのような遺伝子の、アンチセンスターゲットとして有効であ る領域を知ることができるであろう。典型的には、このような領域は高度に保存 された領域である。投与する場合に、本発明の組成物は製薬的に受容される製剤 として施用される。このような製剤はルーチンに、製薬的に受容される濃度の塩 、緩衝剤、保存剤、相容性キャリヤー及び任意の他の治療的成分を含有する。 本発明のコンジュゲートはそのままで（ニートで）又は製薬的に受容される塩 の形状で投与されうる。薬剤に用いる場合には、製薬的に受容されるものである べきであるが、製薬的に受容されない塩もその製薬的に受容される塩の製造に好 都合に用いることができるので、本発明の範囲から除外されない。このような薬 理的及び製薬的に受容される塩は、非限定的に、下記の酸：塩酸、臭化水素酸、 硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸 、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、琥珀酸、ナフタレン −２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸から製造される塩を包含する。また、カ ルボン酸基の例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム塩のような、アルカリ 金属塩又はアルカリ土類金属塩としても、製薬的に受容される塩を製造すること ができる。 適当な緩衝剤は、酢酸と塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸と塩（１〜３％ｗ／ ｖ）；ホウ酸と塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；及びリン酸と塩（０．８〜２％ ｗ／ｖ）を包含する。適当な保存剤はベンザルコニウムクロリド（０．００３〜 ０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン 類（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメロザール（０．００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）を包含する。 本発明の製剤は、製薬的に受容されるキャリヤー中に任意に包含された有効量 の本発明のコンジュゲートを有する薬剤組成物であることができる。本明細書で 用いる限り、“製薬的に受容されるキャリヤー”なる用語は、ヒト又は他の動物 への投与に適した、１種以上の相容性固体若しくは液体フィラー、希釈剤又はカ プセル形成物質(encapsulating substance)を意味する。経口薬製剤の成分は希 釈剤、バインダー、滑沢剤、グライダント(glidant)、崩壊剤、着色剤及びフレ ーバー剤を包含する。エーロゾル製剤の成分は可溶化有効成分、酸化防止剤、溶 媒ブレンド及び溶液製剤のための噴射剤、微粒状の懸濁した有効成分、分散剤及 びサスペンジョン製剤のための噴射剤を包含する。腸溶性被覆経口製剤の製造の ためのカプセル形成物質は、フタル酸酢酸セルロース、ポリビニルアセテートフ タレート(polyvinyl acetate phthalate)、ヒドロキシプロピルメチルセルロー スフタレート、及びメタクリル酸エステルコポリマーを包含する。 多様な投与経路が利用可能である。選択される特定の形式(mode)は、当然、選 択された特定のコンジュゲート、治療されるべき特定の状態、及び治療効果に必 要な投与量に依存する。本発明の方法は、一般的にいうと、本発明のコンジュゲ ートの血流への投与を含む。好ましい投与形式は静脈内及び局部(locoregional) 投与、即ち、腹腔内、動脈内、腫瘍内(intratumoral)、小胞内(intravessicle) 、包膜内(intrathecal)投与を包含する非経口注入によるものである。 非経口投与に適した組成物は便宜的に、レシピエントの血液と等張性でありう る多糖の無菌水溶液を含む。受容されるビヒクルと使用可能である溶剤には、水 、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が 溶媒又は懸濁媒質として慣用的に用いられる。このために、合成モノ−又はジ− グリセリドを包含する、任意のブランドの不揮発性油が使用可能である。さらに 、例えばオレイン酸のような、脂肪酸が注射可能薬物の製造に用いられる。皮下 、筋肉内、静脈内等の投与に適したキャリヤー製剤(carrier formulation)はＲ ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍ ａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルバニア州，イースト ンに見い出される。 組成物は便宜的に、単位投与量形(unit dosage form)として提供され、製薬分 野で周知の任意の方法で製造されることができる。全ての方法はコンジュゲート を、１種以上の補助成分を含む(constitute)キャリヤーと一緒にする工程を含む 。一般に、コンジュゲートを液体キャリヤー又は微粉状固体キャリヤー又は両方 と 均質にかつ完全に混合し、必要に応じて、生成物を成形することによって組成物 が調製される。 他の態様では本発明は徐放性薬物投与系を含む。本発明のこの態様は身体のあ る一定の局在化領域への薬剤のターゲッティングと、その後の周囲組織への放出 とを可能にする。本発明のこの態様はターゲッティング分子と外因性分子とのコ ンジュゲートを、他の点では慣用的な持続放出投与系の成分として組み入れるこ とを可能にする。例えば、コンジュゲートを拡散系及び拡散／侵食系に含めるこ とができる。このような系は、例えば乳酸のポリマー、グリコール酸のポリマー 、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリエステル、セルロース、コラーゲンの ような、天然及び合成ポリマーから形成されたポリマーに基づく系；並びに例え ばポリヒアルロン酸、ゼラチン、ポリメタクリレート等から形成された系のよう なポリマーヒドロゲル系を包含する。非常に多くの持続放出系が当業者に周知で ある。このような系は本発明のコンジュゲートの反復投与を避けることができ、 患者(subject)と医師とに対して便利さを高める。 本発明のコンジュゲートは治療有効量で投与される。治療有効量は以下に述べ るパラメーターによって決定されるが、いずれにせよ、コンジュゲートを投与す る目的である状態を有効に治療する量である。１ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋ ｇまでの範囲の投与量が投与形式に依存して有効であると考えられる。好ましい 範囲は約５００ｎｇ〜５００μｇ／ｋｇであると考えられ、最も好ましい範囲は １μｇ〜１００μｇ／ｋｇであると考えられる。絶対量は、投与が単回量又は複 数回量のいずれであるか、病原菌感染の程度を包含する種々なファクター、並び に年齢、肉体的条件、大きさ及び体重を含めた個々の患者のパラメーターに依存 する。これらのファクターは当業者に周知であり、ほんのルーチンの実験によっ て対処することができる。最大用量を用いる、即ち、論理的な(sound)医学的判 断による最高安全量を用いることが一般に好ましい。本発明をこのように説明し てきたが、新規であり、特許権によって保証されることが望ましいとして、我々 が特許請求することは、請求の範囲に述べる通りである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月２５日 【補正内容】 ２０．ターゲッティング分子がＤ−グルコサミンである、請求項１４〜１８ のいずれかに記載の組成物。 ２１．外因性化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４ 〜２０のいずれかに記載の組成物。 ２２．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その発現が病原性因子の代謝又 は増殖に不可欠である遺伝子に生理学的条件下でハイブリダイズする、請求項２ １記載の組成物。 ２３．病原性因子の感染症の治療方法であって、このような治療を必要とす る対象に請求項１４〜２１のいずれかに記載の組成物を投与することを含む方法 。 ２４．病原性因子が多重薬物耐性である、請求項２３記載の方法。 ２５．病原性因子が細菌である、請求項２３記載の方法。 ２６．病原性因子がヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ ｒｃｕｌｏｓｉｓ ）である、請求項２３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 37/02 (72)発明者 ザメクニク，ポール・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01545, シュルーズベリ，ルボー・ドライブ 29

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．病原性因子の膜を横切っての外因性化合物の移送を強化する方法であっ て、 Ｄ−シクロセリン及びＤ−グルコサミンから成る群から選択されたターゲッテ ィング分子に結合した外因性化合物と病原性因子を、病原性因子の膜を横切って の組成物の移送を可能にするほど充分な時間、接触させることを含む方法。 ２．外因性化合物が病原性因子の増殖、複製又は残存を低下させる細胞機能 調節剤である、請求項１記載の方法。 ３．細胞機能調節剤がアンチセンス核酸、抗生物質、病原性因子プロテアー ゼの阻害剤、及び宿主免疫系の病原性因子認識のエンハンサーから成る群から選 択される、請求項２記載の方法。 ４．ターゲッティング分子を病原性因子内での加水分解に耐性な結合によっ て外因性化合物に結合させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５．ターゲッティング分子に対する受容体の発現をアップレギュレートする 取り込み増強剤に、病原性因子を接触させることをさらに含む、請求項１〜３の いずれかに記載の方法。 ６．病原性因子を膜不安定化剤と接触させることをさらに含む、請求項１〜 ３のいずれかに記載の方法。 ７．膜不安定化剤がエタンブトールである、請求項６記載の方法。 ８．ターゲッティング分子がＤ−グルコサミンである、請求項１〜７のいず れかに記載の方法。 ９．ターゲッティング分子がＤ−シクロセリンである、請求項１〜７のいず れかに記載の方法。 １０．病原性因子が細菌である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 １１．細菌が多重薬物耐性である、請求項１０記載の方法。 １２．細菌がヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ ）である、請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法。 １３．外因性化合物が、その発現が病原性因子の代謝又は増殖に不可欠であ る遺伝子に生理学的条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチ ドである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。 １４．受容体仲介エンドサイトーシスによって外因性化合物を病原性因子に 送達するための組成物であって、 Ｄ−シクロセリン及びＤ−グルコサミンから成る群から選択されたターゲッテ ィング分子と、 該ターゲッティング分子に結合した外因性化合物と を含む組成物。 １５．外因性化合物が、病原性因子の増殖、複製又は残存を低下させる細胞 機能調節剤である、請求項１４記載の組成物。 １６．細胞機能調節剤がアンチセンス核酸、抗生物質、病原性因子プロテア ーゼの阻害剤、核酸に結合するペプチドまたは蛋白質、及び宿主免疫系の病原性 因子認識のエンハンサーから成る群から選択される、請求項１５記載の組成物。 １７．ターゲッティング分子を病原性因子内での加水分解に耐性な結合によ って外因性化合物に結合させる、請求項１４〜１６のいずれかに記載の組成物。 １８．薬剤学的に許容されるキャリヤーをさらに含む、請求項１４〜１７の いずれかに記載の組成物。 １９．ターゲッティング分子がＤ−シクロセリンである、請求項１４〜１８ のいずれかに記載の組成物。 ２０．ターゲッティング分子がＤ−グルコサミンである、請求項１４〜１８ のいずれかに記載の組成物。 ２１．外因性化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４ 〜２０のいずれかに記載の組成物。 ２２．アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理的条件下で加水分解されて、 その発現が病原性因子の代謝又は増殖に不可欠である遺伝子に生理学的条件下で ハイブリダイズする、請求項２１記載の組成物。 ２３．病原性因子が多重薬物耐性である、請求項１４〜２２のいずれかに記 載の組成物。 ２４．病原性因子が細菌である、請求項１４〜２３のいずれかに記載の組成 物。 ２５．病原性因子がヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ ｒｃｕｌｏｓｉｓ ）である、請求項１４〜２３のいずれかに記載の組成物。 ２６．病原性因子の感染症の治療方法であって、このような治療を必要とす る対象に請求項１４〜２１のいずれかに記載の組成物を投与することを含む治療 方法。