JPH11512092A - 化粧品生成物における突然変異型サブチリシンプロテアーゼの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分子の基質結合領域内の正電荷を減少させるまたは負電荷を増大させる少なくとも1つの突然変異をアミノ酸配列中に有するサブチリシン型突然変異型プロテアーゼを、化粧品生成物中に使用する。そのようなプロテアーゼは、皮膚および粘膜刺激性が非常に低い。

Description

【発明の詳細な説明】 化粧品生成物における突然変異型サブチリシンプロテアーゼの使用 本発明は、皮膚刺激性の低い突然変異型タンパク質分解酵素（すなわち突然変 異型サブチリシンプロテアーゼ）の化粧品生成物（より具体的にはボディクレン ジングおよびボディケア製剤ならびに口腔衛生用製剤）における使用に関する。 洗剤およびクリーナーには、本質的にその洗浄および清浄能力を補助するため に、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼなどの酵素が使用さ れてきた。これらの酵素のうちプロテアーゼは最も重要な位置を占めている。 プロテアーゼは、タンパク質およびペプチド基質中のペプチド結合の加水分解 ならびに特定の末端エステルのエステル結合の加水分解を触媒する酵素である。 サブチリシンは約20,000〜45,000の分子量を持つ細菌性細胞外プロテアーゼファ ミリーであり、例えばバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amylo-l iquefaciens）などの土壌菌から得ることができる。サブチリシンは、活性部位 のセリン残基によってペプチド（エステル）結合に対する求核攻撃を開始するセ リンプロテアーゼのグループに属する。これらは物理的化学的によく特徴づけら れた酵素である。X線回折図によって、いくつかのサブチリシンの三次元構造が 詳細に解明された（C．Betzel，G.P．Pal および W．Saenger,（1998）Eur．J． Biochem．178，155-171; R．Bott，M．Ultsch，A．Kossiakoff，T．Graycar，B. Kartzおよび S．Power,(1988)J．Biol．Chem．263，7895-7906; D.W．Goddette, C．Paech，S.S．Yang，J.R．Mielenz，C．Bystroff，M．Wilke および R.J.Flet terick,（1992）J．Mol．Biol．228，580-595; D.W．Heinz，J.P．Priestle, -371; J．Kraut（1977）Ann．Rev．Biochem．46，331-358; D.J．Neidhart およ び G.A．Petsko（1988）Protein Eng．2，271-276; A.V．Teplyakov，I.P. よび K.S．Wilson（1990）J．Mol．Biol．214，261-279）。 サブチリシンは、例えば洗濯用洗剤、食器洗浄剤およびコンタクトレンズ洗剤 などの市販製品に広く使用されており、また合成有機化学でも（とりわけ研究用 に）広く使用されている。サブチリシンファミリーの一員、すなわち界面活性剤 含有製剤に使用できる高アルカリ性プロテアーゼは、国際特許出願WO 91/02792 に記述されている。バチルス・レンタス（Bacillus lentus）由来のこのアルカリ 性プロテアーゼ（バチルス・レンタス-アルカリ性プロテアーゼ；BLAP）は、バチ ルス・リヘニホルミス（Bacillus licheniformis）ATCC 53926株（バチルス・リヘ ニホルミスATCC 53926株のアルカリ性プロテアーゼのプロモーターの支配下にBL AP遺伝子を発現させる発現プラスミドを保持しているもの）から、工業的に有用 な量で得ることができる。BLAPの結晶構造は決定されており（D.W．Goddetteら （1992）J．Mol．Biol．228，580-595; WO 92/21760）、その座標はBrookhaven Protein Data Bankに寄託されている。BLAP（269アミノ酸）の配列をサブチリシ ンBPN'（275アミノ酸）の配列と相同性が最適となるように並べると、次のパタ ーンが得られる：BLAPの位置1〜35、36〜54、55〜160および161〜269は、それぞ れサブチリシンBPN'中の位置1〜35、37〜55、57〜162および167〜275に対応する 。特に明記しない限り、本明細書で使用するアミノ酸番号は、BLAPのアミノ酸番 号に相当する。 本発明で使用するプロテアーゼ変種を記述する際には、次の命名法を使用する :［元のアミノ酸；成熟酵素（ripe enzyme）のN末端の位置；置換アミノ酸］。 例えば、BLAPの4番目をバリンからイソロイシンに置換した場合は、これをV4Iと 呼ぶ。典型的なアミノ酸に関する標準的な略号を表1に挙げる。 同じタンパク質分子内で数個の突然変異が起こる場合は、これを、例えばS3T ＋V4I＋A188P＋V193M＋V199Iというように、個々の突然変異の和で表わす。 工業的および商業的な適用のために新しいプロテアーゼを開発する場合は、熱 的失活および化学的失活からの保護、洗浄・清浄能力の改善および皮膚科学的適 合性の改善が主な目的である。サブチリシン型プロテアーゼを含む複数種類の酵 素が、ランダム突然変異誘発法または部位特異的突然変異誘発法によって開発さ れている。これらは、どうすれば熱的安定性および化学的安定性の改善を合理的 に達成することができるかという点について、いくつかの指標を与える（D.A.Es tell，T.P．Graycar および J.A．Wells（1985）J．Biol．Chem．260，6518-652 1; M．Matsumura，W.J．Becktel，M．Levitt および B.W．Matthews（1989）Pro c．Natl．Sci．US 86，6562-6566; M.W．Pantoliano，M．Whitlow，J.F．Wood， M.L．Rollence，B.C．Finzel，G.L．Gilliland，T.L．Poulos および P.N.Bryan （1988）Biochemistry 27，8311-8317; A.J．Russell および A.R．Fersht（198 7）Nature 328，496-500; R.J．Siezen，W.M．De Vos，J.A.M．Leunissen およ び B.W．Dijkstra（1991）Protein Eng．4，719-737; J.H．van Ee（1991） Chimicaoggi(7/8)，31-35; J.A．Wells および D.A．Estell（1988）Trends Bio chem．Sci．13，291-287）。これに対し、酵素活性の改良、特に特定の基質に対 する活性速度の改善もしくは最適化は、はるかに複雑な問題である。EP 0 260 1 05には、触媒三つ組残基の15Å以内にある特定のアミノ酸残基を修飾することに よる、加水分解速度に対するエステル交換速度の比と求核特異性とが変化したサ ブチリシン-BPN'-突然変異体の生産が開示されている。A.J．Russell および A. R．Fersht（1987）J．Mol．Biol 193，803-813には、活性中心から14〜15Åの距 離にある表面電荷が変化したサブチリシン-BPN'−突然変異体（DO99S）の単離が 記述されている。この置換はサブチリシンの触媒反応のpH依存性に影響を与える 。これらの刊行物はいずれも、アミノ酸に対するそれらの修飾が当該酵素の皮膚 科学的適合性に変化をもたらすかどうかについては教示していない。EP 0130 75 6、EP 0 247 647およびUS 4,760,025には、サブチリシンBPN'のアミノ酸残基（B PN'位置番号）Asp32、Asn155、Tyr104、Met222、Gly166、His64、Ser221、Gly16 9、Glu156、Ser33、Phe189、Tyr217及び/又はAla152に少なくとも一つの突然変 異を挿入する飽和突然変異法が開示されている。この方法を用いることにより、 改善された酸化安定性、変化した基質特異性及び/又は変化したpH活性を示す突 然変異型プロテアーゼが得られる。これらの文書は、当該プロテアーゼの活性中 心近傍における突然変異が活性に対して最も強い影響を持つことをも教示してい る。しかし、これらの文書はいずれも、アミノ酸配列中の変化がプロテアーゼの 皮膚科学的適合性を向上させるか否か、またアミノ酸配列中のどの変化がプロテ アーゼの皮膚科学的適合性を向上させるかという予測を可能にする方法を開示し てはいない。 サブチリシンの触媒活性に関する情報のほとんどは、小さくて明確なペプチド 基質の加水分解に関する研究に集中している。大きなタンパク質基質との相互作 用については、まだほとんど何もわかっていない。このことは、プロテアーゼの 洗浄能力に関する情報に特に当てはまる（プロテアーゼを洗浄において使用する 場合、プロテアーゼ基質は繊維製品表面に結合していて、触媒作用は当該酵素と 相互作用する漂白剤、界面活性剤およびビルダーなどの物質の存在下に起こらな くてはならない）。また、スキンケアおよびヘアケア製品ならびに口腔衛生用製 品中に通常存在する物質とプロテーゼとの相互作用については何もわかっていな い。 EP 0 328 229には、洗浄試験の結果から考えて洗剤中で使用した場合の特性が 向上しているPB92サブチリシン突然変異体の単離と特徴づけが開示されている。 この文書は、洗浄に関する酵素能力を予測するには、生化学的特性が信頼できる パラメータでないことを教示している。この文書に記述されている突然変異選択 法は、同じカテゴリー（極性、非極性、芳香族性、荷電、脂肪族性および中性） に属する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換、荷電アミノ酸による極性アミノ酸 （例えばアスパラギンやグルタミン）の置換、および活性中心に属さない突然変 異部位における当該プロテアーゼの陰イオン性の増大からなる。どの特定のアミ ノ酸を修飾すべきかを同定する方法については何も記述されていない。 洗剤中でのサブチリシン酵素の作用様式を改善するためのサブチリシン酵素の 修飾については、例えばWO 91/00345やWO 92/11357など、いくつかの特許出願に 記述されている。 欧州特許出願EP 0 571 049には、ある種の突然変異型タンパク質分解酵素が開 示されている。これらの酵素はPB92セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と少なく とも70%相同であり、PB92セリンプロテアーゼとは99、102、116、126、127、128 、130、160、203、211および/または212番目にあるアミノ酸の少なくとも１つが 異なるとされている。この突然変異型プロテアーゼは、所望の突然変異型プロテ アーゼをコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主株を生育 することによって生産される。 国際特許出願WO 95/23221（現時点では未公開）には、洗剤およびクリーナー に加えた時にその効力を改善する突然変異型プロテアーゼが記述されている。 本発明の課題は、元のプロテアーゼと比較して改善された皮膚科学的適合性を 示し、化粧品生成物（特にボディクリーニング用およびボディケア用製剤ならび に口腔衛生用製剤）中での使用に適した突然変異型プロテアーゼを提供すること であった。 驚くべきことに、WO 95/23221に記載の突然変異型プロテアーゼがこの条件を 特に満たすことがわかった。 本発明は、化粧品生成物における突然変異型サブチリシンプロテアーゼの使用 であって、その突然変異型サブチリシンプロテアーゼが、基質に結合する分子領 域（「基質結合領域」）近傍の正電荷を減少させるまたは負電荷を増大させる少 なくとも1つの突然変異をそのアミノ酸配列内に有することを特徴とする使用に 関する。 本発明に従って突然変異型プロテアーゼを使用しうる化粧品生成物には、特に ボディクリーニング用およびボディケア用製剤ならびに口腔衛生用製剤、例えば 固形または液状石鹸、ピーリング（剥皮）クリーム、スキンクリーム、ソフトク リーム、栄養クリーム、日焼け防止用クリーム、ナイトクリーム、スキンオイル 、スキンケアローション、ボディエアゾール、デオドラント、シェービングクリ ーム、シェービングフォーム、ヘアシャンプー、ヘアリンス、発泡浴剤、含嗽剤 および練り歯磨きが含まれる。 驚くべきことに、本発明に従って使用される突然変異型プロテアーゼは、皮膚 及び粘膜に対する刺激性が低く、したがって上述の生成物中での使用に極めて適 している。 また本発明は、スキンケア、ヘアケア及びボディケア製剤を生産するための上 記プロテアーゼの使用にも関する。これらの製剤を生産するには、個々の成分を 既知の方法で混合する。特に親油性物質を含有する場合、これらの製剤は「水中 油型」および「油中水型」エマルジョンのいずれの形態でも存在することができ 、他の一般的な助剤および添加剤を含有してもよい。 本発明に従って必須成分として使用されるプロテアーゼの他に、これらの製剤 は特に、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性 界面活性剤および/または双性イオン界面活性剤などの界面活性剤を含んでもよ い。 適当な助剤および添加剤は、例えば、乳化剤、油成分、脂肪および蝋、増粘剤 、過脂肪剤、生体由来物質、フィルム形成剤、香料、色素、真珠光沢剤、保存剤 、 およびｐＨ調節剤である。 適当な油成分は、例えば、パラフィン油、植物性油、脂肪酸エステル、シリコ ーン油、ジアルキルエーテル、脂肪アルコールおよびゲルベアルコール、スクア ランおよび２−オクチルドデカノールであり、適当な脂肪および蝋は、例えば、 鯨蝋、蜜蝋、モンタン蝋、パラフィンおよびセトステアリルアルコールである。 適当な乳化剤は、例えば、ソルビタンエステル、モノグリセリド、ポリソルベ ート、ポリエチレングリコールモノ／ジ脂肪酸エステル、高エトキシル化脂肪酸 エステル、および高分子量シリコーン化合物（例えば平均分子量１００００〜５ ００００のジメチルポリシロキサン）である。 過脂肪剤は、例えばポリエトキシル化ラノリン誘導体、レシチン誘導体、およ び脂肪酸アルカノールアミドのような物質を包含する。脂肪酸アルカノールアミ ドは、泡安定剤としても作用する。 適当な増粘剤は、例えば、多糖、とりわけキサンタンガム、グアー、寒天、ア ルギネート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシ エチルセルロース、比較的高分子量の脂肪酸ポリエチレングリコールモノエステ ルおよびジエステル、ポリアクリレート、ポリビニルアルコールおよびポリビニ ルピロリドン、並びに電解質（例えば塩化ナトリウムおよび塩化アンモニウム） である。 本発明において、生体由来物質は、例えば植物抽出物、タンパク質加水分解物 、およびビタミン複合体である。 適当なフィルム形成剤は、例えば、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン ／酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸系ポリマー、第四級セルロース誘導体およ び同様の化合物である。 適当な保存剤は、例えば、ホルムアルデヒド溶液、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ま たはソルビン酸である。 真珠光沢剤は、例えば、エチレングリコールジステアレートのようなグリコー ルジステアリン酸エステル、および脂肪酸モノグリコールエステルから選択し得 る。 der Ｄeutschen Ｆorschungsgemeinschaft、Ｖerlag Ｃhemie（ヴァインハイ ム）、１９８４に挙げられているような、化粧品に適当で承認された物質である 。そのような色素は通例、混合物全体に対して０.００１〜０.１重量％の濃度で 使用する。 クリームは特に、場合により既述の添加剤に加えて、抗酸化剤、例えばブチル ヒドロキシトルエンやトコフェロールなど、保湿剤、例えばグリセロール、ソル ビトール、2-ピロリジン-5-カルボキシレート、フタル酸ジブチル、ゼラチン、 平均分子量200〜600のポリグリコールなど、pH緩衝剤、例えば乳酸/トリエタノ ールアミン系または乳酸/NaOH系など、穏やかな界面活性剤、例えばアルキルオ リゴグルコシド、脂肪アルコールエーテルスルフェート、脂肪酸イセチオネート 、タウリドおよびサルコシネート、エーテルカルボン酸、スルホスクシネート、 蛋白加水分解物及び脂肪酸縮合物、スルホトリグリセライド、短鎖グルカミド、 リン脂質、植物抽出物、例えばアロエベラの抽出物など、太陽光線保護剤、例え ば超微細二酸化チタン、またはp-アミノ安息香酸およびそのエステル、エチルヘ キシルp-メトキシ桂皮酸エステル、2-エトキシエチルp-メトキシ桂皮酸エステル 、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびその混合物などの有機物質、および いわゆる活性物質促進剤、より具体的には例えばユーカリ油やメントールなどの 精油を含んでもよい。 上述のタイプの製剤中でプロテアーゼの使用が可能であるためには、それらが 皮膚および粘膜を（たとえ刺激するとしても）ごく僅かにしか刺激しないべきで ある。 本発明に従って使用される突然変異型プロテアーゼの元となるプロテアーゼの 種類は、DSM5483株から得られる、分子量26,823ダルトン、pK標準値から計算さ れる等電点9.7の269アミノ酸単位からなる上記アルカリ性バチルス・レンタス-プ ロテアーゼ（BLAP）であることが好ましい。BLAP遺伝子は、バチルス・レンタスD SM5483株から染色体DNAを単離し、バチルス・レンタス-プロテアーゼをコードす る領域のDNA配列に対して相同性を持つDNAサンプルを調製し、単離した染色体DN Aからゲノムライブラリーを作成し、上記サンプルのハイブリダイゼーションに よって目的の遺伝子のライブラリーを選択することにより、既知の方法で得るこ とができる。熱及び界面活性剤に対する安定性が改善された上記BLAPの突然変異 体は、国際特許出願WO 94/21760に記述されている。 今回、酵素の基質結合領域内で負電荷を増大させるアミノ酸修飾を行なうこと により、皮膚および粘膜刺激性を減少させうることがわかった。本発明によれば 、例えば半径7Å以内にある基質結合領域中の負に荷電したアミノ酸残基を増や すかもしくは正に荷電したアミノ酸残基を減らすことにより、これを行なうこと ができる。基質結合領域は、例えばAAPFなどの結合基質分子を使ってその位置を 確認することができる。具体的に述べると、WO 94/21760により公表されたバチ ルス・レンタスのBLAP変種M130およびM131中の位置99、154および211におけるア ミノ酸修飾は、皮膚および粘膜刺激性の減少をもたらす。突然変異体M130は元の BLAPと比較して4つのアミノ酸修飾S3T、A188P、V193MおよびV199Iを有する。突 然変異体M131は元のBLAPと比較して5つのアミノ酸修飾S3T、V4I、A188P、V193M およびV199Iを有する。プロテアーゼM130またはM131のアミノ酸配列は国際特許 出願WO 94/21760のSEQ ID No.2またはSEQ ID No.1に記載されている。M130とM13 1は刺激性が減少したプロテアーゼを得るためのさらなるアミノ酸修飾の基礎と なりうる。本発明の使用に好ましいプロテアーゼ突然変異体は、99番目のアルギ ニン、154番目のセリンおよび211番目のロイシンからなる群より選択される、プ ロテアーゼM130またはM131のアミノ酸の少なくとも1つを置換して得られるもの である。これらの突然変異体とそれらの生産は国際特許出願WO 95/21221に開示 されており、そこではF11（S3T＋R99S＋A188P＋V193M＋V199I）、F43（S3T＋V4I ＋R99G＋A188P＋V193M＋V199I）、F44（S3T＋V4I＋R99A＋A188P＋V193M＋V199I ）、F45（S3T＋V4I＋R99S＋A188P＋V193M＋V199I）、F46（S3T＋V4I＋S154E＋A1 88P＋V193M＋V199I）、F47（S3T＋V4I＋S154D＋A188P＋V193M＋V199I）、F49（S 3T＋V4I＋A188P＋V193M＋V199I＋L211D）、F54（S3T＋V4I＋R99G＋A188P＋V193M ＋V199I＋L211D）およびF55（S3T＋V4I＋S154D＋A188P＋V193M＋V199I＋L211D） と呼ばれている。タンパク質分解活性はTenside 7（1970）125に記載の方法を用 い て、すなわちカゼインを基質とする不連続測定法により、以下のように測定する ことができる。基質溶液の濃度は、硬度15°dH（ドイツ硬度）の合成水道水（0. 029%（重量/v）CaCl₂・2H₂O、0.014%（重量/v）MgCl₂・6H₂Oおよび0.021%（重量/v ）NaHCO₃の水溶液）中、12mg/mlのカゼイン（Hammarstenに従って調製；供給者 ：Merck（ダルムシュタット）No．2242）および30mMトリスである。基質溶液を7 0℃に加熱し、0.1N NaOHを用いて、そのpHを50℃で8.5に調節する。合成水道水 中に2%（重量/v）の無水トリポリリン酸五ナトリウムを含むプロテアーゼ溶液を 調製し、そのpHを塩酸で8.5に調節する。その酵素溶液200μlをカゼイン基質溶 液600μlに加える。その混合物を50℃で15分間保温する。3%（V/V）酢酸中の0.4 4Mトリクロロ酢酸（TCA）および0.22M酢酸ナトリウム600μlの添加により、反応 を停止する。15分間氷冷した後、TCA不溶性タンパク質を遠心分離によって除去 し、その900μlを2N NaOH 300μlと混合し、TCA可溶性ペプチドを含む得られた 混合物の吸光度を290nmで測定する。対照値は、カゼイン溶液600μlにTCA 600μ lを加えた後、酵素溶液200μlを加えることによって得る。定義として、この試 験条件下に290nmで0.550 ODの吸光度変化をもたらすプロテアーゼ溶液は、10PU/ mlの活性を持つ。 実施例 実施例１： 刺激性の測定 F49と比較用のBLAPとを例として用いて、本発明に従って使用されるプロテア ーゼの刺激性を調べた。これは、用量測定用のBuehler試験に従ってモルモット で試験した（E.V．Buehler，Arch．Dermatol．1965，91，171-177）。そのため に、プロテアーゼの10%溶液を剃毛した皮膚に局所投与し、帯布（Scotchpak(R)N on-Woven Patch，Minnesota Mining and Manufacturing Company製）を用いて6 時間固定した。帯布を除去した24、48および72時間後に、問題の皮膚領域を評価 した。 これらの試験を4匹のモルモット（系統：「Pirbright white」）に対して行い 、各動物につき少なくとも2ヶ所に溶液を適用した。その結果を紅斑および浮腫 形 成の平均値として下記表2および3に示す。これらの結果は、本発明に従って使用 される突然変異型プロテアーゼが修飾されていないプロテアーゼBLAPよりもはる かに低い刺激性を持つことを示している。 表中の数字0、1および2は、皮膚炎症が観察された動物上の皮膚領域数を表わ し、sは処置した皮膚領域の縁における軽微な痂皮形成を表わし、aは腫脹を表わ す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｎ 9/54 15/09 15/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分子の基質結合領域内の正電荷を減少させるまたは負電荷を増大させる少 なくとも1つの突然変異をアミノ酸配列中に有するサブチリシン型突然変異型プ ロテアーゼの、化粧品生成物中での使用。 ２．突然変異型プロテアーゼがアルカリ性バチルス・レンタス-プロテアーゼ に由来する請求項1に記載の使用。 ３．突然変異型プロテアーゼが突然変異型アルカリ性プロテアーゼM131（S3T ＋V4I＋A188P＋V193M＋V199I）または突然変異型アルカリ性プロテアーゼM130（ S3T＋A188P＋V193M＋V199I）である請求項2に記載の使用。 ４．プロテアーゼがそのアミノ酸配列中に位置99、154および211から選択され る位置において少なくとも1つの突然変異を持つ請求項2または3に記載の使用。 ５．アミノ酸残基99（アルギニン）がグリシン、アラニンまたはセリン残基で 置換されている請求項2ないし4のいずれかに記載の使用。 ６．アミノ酸残基154（セリン）がグルタミン酸またはアスパラギン酸残基で 置換されている請求項2ないし5のいずれかに記載の使用。 ７．アミノ酸残基211（ロイシン）がグルタミン酸またはアスパラギン酸残基 で置換されている請求項2ないし6のいずれかに記載の使用。 ８．突然変異型プロテアーゼが突然変異R99G、R99S、R99A、L211D、L211E、S1 54D、S154Eの1またはそれ以上を持つ請求項1ないし7のいずれかに記載の使用。 ９．化粧品生成物が固形および液状石鹸、スキンクリーム、ソフトクリーム、 栄養クリーム、日焼け防止用クリーム、ナイトクリーム、スキンオイル、スキン ケアローション、ボディエアゾール、デオドラント、シェービングクリーム、シ ェービングフォーム、ピーリングクリーム、ヘアシャンプー、ヘアリンス、発泡 浴剤、含嗽剤および練り歯磨きから選択される請求項1ないし8のいずれかに記載 の使用。 10．分子の基質結合領域内の正電荷を減少させるまたは負電荷を増大させる少 なくとも1つの突然変異をアミノ酸配列中に有するサブチリシン型突然変異型プ ロテアーゼを化粧品生成物の他の成分と混合することを含んで成る化粧品生成 物の製造法。 11．陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界 面活性剤または双性イオン界面活性剤、乳化剤、油成分、脂肪および蝋、増粘剤 、過脂肪剤、生体由来物質、フィルム形成剤、香料、色素、真珠光沢剤、保存剤 および/またはpH調節剤をさらなる成分として使用する請求項10に記載の方法。