PL209952B1

PL209952B1 - Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, plazmid, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowania neurotroficznego czynnika wzrostu, kompozycje faramaceutyczne, przeciwciało oraz sposób wykrywania neurotroficznego czynnika wzrostu

Info

Publication number: PL209952B1
Application number: PL348431A
Authority: PL
Inventors: Hugo Alfonso Geerts; Stefan Leo Jozef Masure; Theo Frans Meert; Miroslav Cik; Donck Luc August Laurentius Ver
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2011-11-30
Also published as: HU226073B1; CA2333910C; ATE343594T1; JP4624476B2; SI1640381T1; HRP20010036A2; BRPI9912819B8; KR20010083108A; HUP0102821A2; DE69933771T2; EP1640381A2; HK1092477A1; PL348431A1; HK1045528B; IL140877A0; EP1640381A3; EP1097167A2; NO20010212L; ES2479067T3; CA2333910A1

Description

Przedmiotem wynalazku są wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu określony jako enowina, wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, plazmid, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowania neurotroficznego czynnika wzrostu, kompozycje farmaceutyczne, przeciwciało oraz sposób wykrywania neurotroficznego czynnika wzrostu.

Niniejszy wynalazek dotyczy neurotroficznego czynnika wzrostu, a w szczególności klonowania i ekspresji nowego członka z rodziny czynników neurotroficznych GDNF, określonego tu jako enowina (EVN).

Wprowadzenie

Czynniki neurotroficzne zaangażowane są w różnicowanie, rozwój i utrzymywanie neuronów. Białka te mogą zapobiegać degeneracji i umożliwiać przeżycie różnych typów komórek neuronowych, są zatem, potencjalnymi czynnikami terapeutycznymi w chorobach neurodegeneracyjnych. Neurotroficzny czynnik pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) był pierwszym członkiem rosnącej nadrodziny czynników neurotroficznych różniących się strukturalnie od neurotrofin. GDNF jest członkiem nadrodziny czynników wzrostu transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) cechujących się specyficznym wzorem silnie konserwowanych siedmiu reszt cysteiny w sekwencji aminokwasowej (Kingsley, 1994). GDNF został pierwotnie oczyszczony przy użyciu testu opartego na zdolności do utrzymywania życia i funkcji neuronów dopaminergicznych embrionalnego śródmózgowia brzusznego in vitro (Lin et al., 1993). Inne typy komórek neuronowych ośrodkowego (CNS) i obwodowego (PNS) układu nerwowego także reagują na działanie GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF wytwarzany jest przez komórki w formie nieaktywnej, która jest cięta specyficznie w miejscu RXXR rozpoznawanym przez furynę, w wyniku czego powstaje aktywny (dojrzały) GDNF (Lin et al., 1993). Egzogenne podawanie GDNF działa neuroochronnie w zwierzęcych modelach choroby Parkinson'a, powszechnego zaburzenia neurodegeneracyjnego cechującego się utratą do 70% komórek dopaminergicznych w istocie czarnej pnia mózgu (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).

Ostatnio odkryto kolejne czynniki neurotroficzne z rodziny GDNF. Neurturynę (NTN) czyszczono z kondycjonowanej pożywki z komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), przy użyciu testu opartego na jej zdolności do utrzymywania przy życiu neuronów współczulnych w hodowli (Kotzbauer et al.,

1996) . Dojrzałe białko NTN jest w 57% podobne do dojrzałego GDNF. Persefinę (PSP) odkryto poprzez klonowanie z użyciem PCR ze zdegenerowanymi starterami oraz genomowym DNA jako matrycą. Dojrzała PSP, tak jak dojrzały GDNF, odpowiada za przeżycie w hodowli neuronów dopaminergicznych śródmózgowia brzusznego oraz neuronów ruchowych (Mildbrandt et al., 1998). Podobieństwo dojrzałego białka PSP z dojrzałymi GDNF i NTN wynosi = 50%.

Arteminę (ARTN) odkryto poprzez przeszukiwanie bazy danych DNA. Jest ona czynnikiem umożliwiającym przeżycie w hodowli neuronów czuciowych i współczulnych (Baloh et al., 1998, Neuron (12); 1291-1302). Inny odkryty neurotroficzny czynnik wzrostu to neublastyna (WO 00/01815).

GDNF, NTN, PSP oraz ARTN wymagają dla przeprowadzenia wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału utworzenia heterodimerowego kompleksu receptora. GDNF wiąże się z podjednostką receptora alfa 1 rodziny GDNF (GFRa-1; GFRa Nomenclature Committee, 1997), fosfatydylo-inozytolowym (glikozylo-PtIns) błonowym białkiem kotwiczącym (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al.,

1997) . Kompleks GDNF/GFRa-1 wiąże się i aktywuje protoonkogen cRET, kinazę tyrozynową związaną z błoną (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996) w wyniku czego następuje fosforylacja reszt tyrozyny w cRET i dalsza aktywacja położonych niżej dróg transdukcji sygnału (Worby et al., 1996). Scharakteryzowano kilka innych członków rodziny receptorów wiążących ligand GFRa (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFRa-2 oraz GFRa-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) zostały zidentyfikowane przez wiele różnych grup. GFRa-1 i GFRa-2 ulegają ekspresji w prawie wszystkich tkankach i ekspresja ta może być regulowana podczas rozwoju (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).

GFRa-3 nie ulega ekspresji w rozwijającym się lub dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym, lecz ulega wysokiej ekspresji w kilku rozwijających się i dorosłych zwojach czuciowych oraz współczulnych obwodowego układu nerwowego (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Czwarty członek rodziny, GFRa-4 został sklonowany z cDNA kurczaka (ThompPL 209 952 B1 son et al., 1998). GFRa-1 jest preferowanym receptorem dla GDNF, podczas gdy GFRa-2 preferencyjnie wiąże się z NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). GFRa-4 kurczaka tworzy funkcjonalny kompleks recepcora dla PSP w połączeniu z cRET (Enokido et al.,

1998). Pokazano, że komórki, w których ekspresji ulega zarówno GFRa-3 jak i cRET nie odpowiadają na GDNF, NTN czy PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Ostatnio wykazano, że ART przekazuje sygnał poprzez cRET przy użyciu GFRa-3 jako preferowanego receptora wiążącego ligand (Baloh et al., 1998b). Komunikacja krzyżowa pomiędzy czynnikami neurotroficznymi a receptorami GRFa jest możliwa in vitro, ponieważ GDNF w obecności cRET może wiązać się z GRFa-2 lub GRFa-3 (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998), a NTN może z niskim powinowactwem wiązać się z GRFa-1 (Klein et al., 1997). Podsumowując, GDNF, NTN, PSP oraz ART stanowią część systemu przekazywania sygnału neurotroficznego, gdzie różne podjednostki wiążące ligand (GRFa-1 do 4) mogą oddziaływać z tą samą podjednostką kinazy tyrozynowej (cRET). Ostatnio, w doświadczeniach ze znokautowanym genem, (artykuł przeglądowy Rosenthal, 1999) pokazano, że GDNF oddziałuje z GRFa-1 in vivo, podczas gdy NTN jest preferowanym ligandem dla GRFa-2, co jest fizjologicznym potwierdzeniem wyników badań in vitro.

Twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali, sklonowali, uzyskali ekspresję, zlokalizowali na chromosomie i scharakteryzowali enowinę (EVN), będącą czwartym członkiem rodziny GDNF. Wiedza na temat dojrzałego białka EVN została poszerzona dzięki odkryciu różnych funkcjonalnych i niefunkcjonalnych wariantów splicingu mRNA. Ponadto, twórcy niniejszego wynalazku przedstawili wyniki ekspresji, wiązania EVN z GRFa-3 oraz wpływ EVN in vitro na wydłużanie neurytów oraz ochronę przed neurotoksycznością indukowaną taksolem w hodowlach ludzkich komórek nerwiaka niedojrzałego, SH-SY5Y, różnicowanych za pomocą staurosporyny.

Podsumowanie wynalazku

W niniejszym zgłoszeniu dostarczana jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca nowy ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, enowinę, wektor ekspresyjny obejmujący taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza stransformowana tym wektorem, neurotroficzny czynnik wzrostu kodowany przez tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, wyizolowana enowina oraz kompozycje farmaceutyczne zawierające kwas nukleinowy lub białko enowiny.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że koduje ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu określony jako enowina i posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

Korzystnie cząsteczka ta stanowi cząsteczkę DNA.

Korzystnie cząsteczka ta stanowi cząsteczkę cDNA.

Korzystnie cząsteczka ta posiada sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą sekwencji jednego z wariantów produktów splicingu przedstawionej na sekwencjach oznaczonych SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 albo 15.

Korzystnie cząsteczka ta posiada sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 2.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, charakteryzujący się tymi, że kodowany jest przez jedną z cząsteczek kwasu nukleinowego określonych powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, charakteryzujący się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową od pozycji 27 do 139 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na sekwencji oznaczonej SSQ ID NO: 4.

Korzystnie obejmuje on sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, charakteryzujący się tym, że obejmuje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto plazmid EVNmat/ pRSETB zdeponowany w LMBP pod numerem dostępu LMBP 3931.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że obejmuje jedną z cząsteczek DNA określonych powyżej.

Korzystnie wektor ten ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę reporterową.

PL 209 952 B1

Przedmiotem wynalazku jest też komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że jest transformowana lub transfekowana wektorem określonym powyżej.

Korzystnie Komorka ta stanowi komórkę eukariotyczną albo komórkę bakteryjną.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej sekwencję wykazującą co najmniej 70% homologii aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego określona powyżej do zastosowania jako lek.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie neurotroficznego czynnika wzrostu wykazującego co najmniej 70% homologii aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub oś rodkową komponentą neurogenną.

Przedmiotem wynalazku jest również neurotroficzny czynnik wzrostu określony powyżej do zastosowania jako lek.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie neurotroficznego czynnika wzrostu określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że obejmuje czynnik wzrostu określony powyżej wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało, charakteryzujące się tym, że jest zdolne do wiązania czynnika wzrostu określonego powyżej, lub jego epitopu.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że obejmuje przeciwciało określone powyżej wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania w próbce obecności czynnika wzrostu określonego powyżej, polegający na tym, że przeprowadza się reakcję przeciwciała określonego powyżej z próbką i wykrywa się wiązanie przeciwciała z tym czynnikiem wzrostu.

Korzystnie w sposobie tym stosuje się przeciwciało sprzężone z cząsteczką reporterową.

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodnie z pierwszym aspektem według niniejszego wynalazku dostarczana jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, określony jako enowina, posiadająca sekwencję aminokwasową przedstawioną na Fig. 21 (SEQ ID NO: 4) lub kodująca funkcjonalny odpowiednik, pochodną lub prekursor biologiczny omawianego czynnika wzrostu, w szczególności wariant długi (Fig. 23, SEQ ID NO: 9) i wariant krótki (Fig. 24, SEQ ID NO: 10) oraz inne warianty splicingu zilustrowane na Fig. 21 (SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 albo 15). Omawiana cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie jest cząsteczką DNA, a korzystniej cząsteczką cDNA.

Kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję od pozycji 81 do 419 z sekwencji przedstawionej na Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), korzystniej od pozycji 81 do 422 a jeszcze bardziej korzystnie całą sekwencję przedstawioną na Fig. 1.

Uważa się, że cząsteczka kwasu nukleinowego od pozycji 81 do 419 koduje sekwencję dojrzałej enowiny po przekształceniu proformy białka dzięki obróbce miejsca RXXR obecnego w stabilnej proformie omawianej enowiny.

Opisano tu także cząsteczkę antysensowną zdolną do hybrydyzacji z dowolną sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku, w warunkach o wysokiej sile, dobrze znanych specjalistom w dziedzinie.

Użyta tu siła hybrydyzacji odnosi się do warunków, w których kwasy polinukleinowe są stabilne. Stabilność hybryd odzwierciedlona jest temperaturą topnienia (Tm) hybryd. Tm można obliczyć na podstawie wzoru:

PL 209 952 B1

81,5°C-16,6 (log10 [Na⁺]+0,41 (%G&C)-600/l), gdzie l odpowiada długości hybryd w nukleotydach. Tm maleje około o 1-1,5°C na każdy 1% spadku homologii sekwencji.

Cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku można korzystnie zastosować do uzyskania ekspresji ludzkiego neurotroficznego czynnika wzrostu według wynalazku, w komórce gospodarza lub temu podobnej stosując odpowiedni wektor ekspresyjny.

Wektor ekspresyjny według wynalazku obejmuje wektory zdolne do ekspresji DNA funkcjonalnie połączonego z sekwencjami regulatorowymi, takimi jak regiony promotorowe, które są zdolne do wpływania na ekspresję takich fragmentów DNA.

Elementy regulacyjne wymagane do ekspresji obejmują sekwencje promotorowe wiążące polimerazę RNA oraz sekwencje inicjujące translacji wiążące rybosomy. Przykładowo, bakteryjny wektor ekspresyjny może zawierać promotor, taki jak promiotor lac, a także sekwencje Shine-Dalgarno do inicjacji translacji oraz kodon start AUG. Podobnie, eukariotyczny wektor ekspresyjny może zawierać heterologiczny lub homologiczny promotor dla polimerazy RNA II, położone poniżej miejsce poliadenylacji, kodon start AUG oraz kodon terminacyjny dla odpadnięcia rybosomu. Wektory takie są komercyjnie dostępne, ale można je także złożyć z opisanych sekwencji metodami dobrze znanymi specjalistom.

Zatem, wektor ekspresyjny odnosi się do rekombinowanych konstruktów DNA lub RNA, takich jak plazmid, fag, zrekomibinowany wirus lub inny wektor, które po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza dają ekspresję fragmentów DNA lub RNA. Odpowiednie wektory ekspresyjne są dobrze znane specjalistom i obejmują te, które ulegają replikacji w komórkach eukariotycznych i/lub komórkach prokariotycznych oraz te, które pozostają w formie episomu lub takie, które integrują do genomu komórki gospodarza.

Cząsteczkę antysensowną zdolną do hybrydyzacji z kwasem nukleinowym, według wynalazku można stosować jako sondę, lek czy kompozycję farmaceutyczną.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można wstawiać do wektorów opisanych powyżej w orientacji antysensownej w celu wytwarzania antysensownego RNA.

Antysensowny RNA lub inne antysensowne kwasy nukleinowe można wytwarzać metodami syntezy.

Dalszy aspekt według wynalazku obejmuje komórkę gospodarza transformowaną, transfekowaną lub zainfekowaną wektorem ekspresyjnym, według wynalazku, którą korzystnie jest komórka eukariotyczna, a korzystniej komórka ssacza.

Wprowadzenie sklonowanego DNA do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, transformacja omówionej komórki, a następnie selekcja stransformowanych komórek są dobrze znane specjalistom i podane w Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Opisano tu również cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą co najmniej 15 nukleotydów z czą steczki kwasu nukieinowego wedł ug wynalazku, a dogodnie od 15 do 50 nukleotydów.

Sekwencje te można dogodnie użyć jako sondy czy startery do inicjowania replikacji lub podobnych procesów. Cząsteczki kwasu nukleinowego można wytwarzać zgodnie z technikami dobrze znanymi specjalistom, takimi jak sposoby rekombinacji oraz syntezy. Cząsteczki te można także użyć w zestawach diagnostycznych lub podobnych urzą dzeniach w celu wykrywania obecnoś ci kwasu nukleinowego według wynalazku. Testy takie zasadniczo obejmują kontaktowanie się sondy z próbką w warunkach hybrydyzacji i wykrywanie obecności dowolnej formy dupleksu pomiędzy sondą a dowolnym kwasem nukleinowym z próbki.

Sondy te można zakotwiczyć na stałym nośniku. Dogodnie tworzą one macierz w taki sposób, że wiele sond może jednocześnie hybrydyzować z jedną próbką biologiczną. Sondy można nakraplać na macierz lub syntetyzować in situ na macierzy. (Patrz Lockhart et al. Nature Biotechnology, vol. 14, Grudzień 1996, Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays. Pojedyncza macierz może zawierać ponad 100, 500 czy nawet 1000 różnych sond w oddzielnych miejscach.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można także wytwarzać stosując sposoby rekombinacji lub syntezy, takie jak przykładowo z użyciem technik klonowania przez PCR, które ogólnie wymagają wytworzenia pary starterów, które mogą być z regionu w przybliżeniu 10 do 50 nukleotydów od regionu genu, który ma być sklonowany, umożliwienia starterom kontaktu z mRNA, cDNA

PL 209 952 B1 lub genomowym DNA z ludzkiej komórki, przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy w warunkach umożliwiających amplifikację pożądanego regionu, izolacji zamplifikowanego regionu czy fragmentu i odzyskania zamplifikowanego DNA. Zasadniczo, techniki tu zdefiniowane są dobrze znane specjalistom, a opisano je w Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory manual,1989).

Kwasy nukleinowe według wynalazku lub opisane tu oligonukleotydy mogą posiadać wykrywalny znacznik. Odpowiednie znaczniki obejmują radioizotopy, takie jak ³²P czy ³⁵S, znaczniki enzymatyczne lub inne znaczniki białkowe, takie jak biotyna czy markery fluorescencyjne. Znaczniki takie można podłączyć do kwasów nukleinowych lub oligonukleotydów i można je wykrywać dobrze znanymi per se technikami.

Ludzkie warianty alleliczne lub polimorfizmy cząsteczki DNA według wynalazku można dogodnie identyfikować poprzez, przykładowo, przeszukiwanie bibliotek cDNA lub genomowych z szeregu osobników, na przykład z różnych populacji. Ponadto, kwasy nukleinowe i sondy tu opisane można użyć do sekwencjonowania DNA genomowego pacjentów przy użyciu technik dobrze znanych specjalistom, takich jak metoda Sangera terminacji łańcucha z wykorzystaniem dideoksynukleotydów, która dogodnie może potwierdzić predyspozycję pacjenta do pewnych zaburzeń związanych z czynnikiem wzrostu według wynalazku.

Opisano tu ponadto komórkę transgeniczną, tkankę czy organizm nie-człowieka obejmujący transgen zdolny do ekspresji enowiny, ludzkiego czynnika neurotroficznego według wynalazku.

Użyty tu termin transgen zdolny do ekspresji oznacza dowolną odpowiednią sekwencję kwasu nukleinowego, która prowadzi do ekspresji czynnika neurotroficznego posiadającego tę samą funkcję i/lub aktywność jak czynnik neurotroficzny według wynalazku. Transgen może obejmować, przykładowo, genomowy kwas nukleinowy wyizolowany z komórek ludzkich lub syntetyczny kwas nukleinowy obejmujący cDNA, zintegrowany z chromosomem lub w postaci pozachromosomowej.

Korzystnie transgen obejmuje wektor według wynalazku, który to wektor obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą omawiany czynnik neurotroficzny lub funkcjonalny fragment omawianej cząsteczki kwasu nukleinowego. Funkcjonalny fragment omawianego kwasu nukleinowego powinien odpowiadać fragmentowi genu lub cDNA kodującego czynnik neurotroficzny lub jego funkcjonalny odpowiednik, który to fragment może ulegać ekspresji co pozwala na wytworzenie funkcjonalnego neurotroficznego czynnika wzrostu według wynalazku. Zatem, przykładowo, fragmenty neurotroficznego czynnika wzrostu według wynalazku, które odpowiadają specyficznym resztom aminokwasowym oddziałującym z odpowiednim receptorem także tworzą część niniejszego wynalazku i fragmenty te mogą służyć jako agoniści aktywujący odpowiedni receptor czynnika wzrostu według wynalazku tak, że wpływają na jego właściwości umożliwiające wzrost i utrzymanie przy życiu komórki. Ten aspekt wynalazku obejmuje także izoformy powstałe w wyniku alternatywnego splicingu oraz różnych miejsc startu transkrypcji kwasów nukleinowych według wynalazku.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zdefiniowany kwas nukleinowy obejmuje nie tylko identyczny kwas nukleinowy, ale także taki, który posiada niewielkie zmiany zasad, w tym w szczególności podstawienia zasad, które prowadzą do powstania kodonów synonimicznych (inny kodon, który określa tę samą resztę aminokwasową) zgodnie z degeneracją kodu w konserwatywnych podstawieniach aminokwasowych. Termin cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje także sekwencję komplementarną do dowolnej sekwencji jednoniciowej z wariantami zasad.

Zgodnie z dalszym aspektem wynalazek dostarcza wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak tu zdefiniowano. Korzystnie, czynnik wzrostu obejmuje sekwencję aminokwasową od pozycji 27 do 139 sekwencji aminokwasowej z Fig. 1.

Określenie funkcjonalny odpowiednik należy rozumieć jako czynnik wzrostu wykazujący wszystkie cechy wzrostowe i funkcjonalne jakie posiada czynnik wzrostu jakim jest enowina. Określenie pochodna enowiny definiowana jest tu tak, że ma obejmować polipeptyd, w którym pewne aminokwasy zostały zmienione, usunięte lub zamienione na inne aminokwasy oraz który to polipeptyd zachowuje aktywność biologiczną enowiny i/lub może oddziaływać jako wywołujący antygen z przeciwciałami przeciwko enowinie według wynalazku.

Zakresem niniejszego wynalazku objęte są także hybrydowe oraz zmodyfikowane formy enowiny, włączając białka fuzyjne oraz fragmenty. Hybrydowe oraz zmodyfikowane formy obejmują takie przypadki, przykładowo, gdzie pewne aminokwasy są poddane pewnym modyfikacjom lub wymianie, przykładowo, mutacja punktowa, ale modyfikacje te, wciąż pozwalają na powstawanie białka, które ma aktywność biologiczną enowiny według wynalazku. Specyficzne sekwencje kwasów nukleinowych

PL 209 952 B1 mogą być zmienione przez specjalistów w celu wytworzenia czynnika wzrostu wykazującego te same lub zasadniczo takie same cechy jak enowina.

Jak dobrze wiadomo specjalistom, wiele białek wytwarzanych jest in vivo z (pre) sekwencją sygnałową na końcu N białka. Ponadto, białka takie mogą obejmować dodatkowo pro sekwencję, dzięki której istnieje stabilny prekursor białka dojrzałego. Takie sekwencje pre i pro nie są zasadniczo konieczne dla aktywności biologicznej. Cząsteczka enowiny według wynalazku obejmuje nie tylko pełnej długości sekwencję przedstawioną na Fig. 21, lecz także sekwencję od pozycji 27 do 139, za miejscem dla obróbki proteolitycznej RXXR obecnym w tego typu czynnikach wzrostu i którą uważa się za sekwencję stanowiącą dojrzałą sekwencję enowiny.

Określone białko, peptyd czy sekwencja aminokwasowa według wynalazku obejmuje nie tylko identyczną sekwencję aminokwasową, lecz także jej izomery, z niewielkimi różnicami aminokwasowymi w stosunku do naturalnej sekwencji aminokwasowej, włączając konserwatywne wymiany aminokwasowe (wymiana przez aminokwas o pokrewnym łańcuchu bocznym). Objęte są także sekwencje aminokwasowe, które różnią się od naturalnej sekwencji aminokwasowej, lecz które skutkują powstaniem polipeptydu, który jest immunologicznie identyczny lub podobny do peptydu kodowanego przez sekwencję występującą naturalnie.

Białka lub polipeptydy według wynalazku obejmują ponadto warianty takich sekwencji, w tym naturalnie występujące warianty alleliczne, które są zasadniczo homologiczne do omawianych białek lub polipeptydów. W tym kontekście, za zasadniczo homologiczną sekwencję uważa się taką sekwencję, która wykazuje co najmniej 70%, a korzystnie 80%, 90% i 95% homologii aminokwasowej z białkami lub polipeptydami kodowanymi przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Neurotroficzne czynniki wzrostu wytwarzane w komórce gospodarza według wynalazku także są objęte niniejszym wynalazkiem.

Ze względu na podobieństwo sekwencji pomiędzy czynnikiem wzrostu tu opisanym a wcześniej zidentyfikowanymi czynnikami wzrostu rodziny GDNF, uważa się, że enowina jest także w stanie umożliwić przeżycie i wzrost oraz leczyć zaburzenia powstałe na skutek defektów funkcjonowania czy ekspresji czynnika neurotroficznego,

Zatem cząsteczki kwasu nukleinowego czy czynnik wzrostu według wynalazku mogą, korzystnie, być stosowane w leczeniu i profilaktyce zaburzeń układu nerwowego u osobnika przez podawanie temu osobnikowi cząsteczki kwasu nukleinowego lub czynnika wzrostu według wynalazku w ilości i stężeniu wystarczają cym dla zredukowania objawów zaburzenia. Czą steczki kwasu nukleinowego można zatem, stosować do podtrzymania lub utrzymania przy życiu neuronów i do leczenia zaburzeń układu nerwowego lub stanów neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinson'a, Alzheimer'a, neuropatii obwodowej, stwardnienia zanikowego bocznego, urazu ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, czy uszkodzenia i ekspozycji na neurotoksyny.

Zaobserwowano, że neurotroficzny czynnik wzrostu według wynalazku wywiera korzystny wpływ neurotroficzny lub neuroprotekcyjny na komórki lub populacje komórek układu nerwowego, szczególnie na te komórki lub populacje komórek układu nerwowego, które zostały zaindukowane do przejścia apoptozy. Zgodnie z tym, kwas nukleinowy lub sam czynnik wzrostu jakim jest enowina według wynalazku może ponadto być zastosowany jako lek.

Dodatkowo, co jest dokładniej opisane w przykładach poniżej, pokazano, że enowina przyspiesza regenerację zaindukowanych braków czucia, co typuje enowinę jako kandydata do leczenia lub łagodzenia zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną, chorób reumatyczno/zapalnych, jak również do leczenia zaburzenia przewodnictwa, poprzez podawanie jej potrzebującemu pacjentowi w stężeniu wystarczającym do zredukowania lub profilaktyki występowania objawów tych zaburzeń.

Alternatywny sposób leczenia zaburzeń układu nerwowego opisanych powyżej obejmuje wszczepianie gospodarzowi komórek, które eksprymują ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu według wynalazku, takich jak opisana tu komórka transgeniczna.

Cząsteczki kwasu nukleinowego i neurotroficzny czynnik wzrostu według wynalazku mogą także być włączone do kompozycji farmaceutycznej wraz z farmaceutycznie dopuszczanym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Przeciwciała przeciwko neurotroficznemu czynnikowi według niniejszego wynalazku można, dogodnie, wytworzyć technikami dobrze znanymi specjalistom. Przykładowo, przeciwciała poliklonalne można wytworzyć poprzez wstrzyknięcie do organizmu zwierzęcego, takiego jak mysz, czynnika wzrostu lub jego epitopu i odzyskanie surowicy odpornościowej. Przeciwciała monoklonalne można

PL 209 952 B1 wytwarzać zgodnie ze znanymi technikami jak opisano w Kohler R. i Milstein C, Nature (1975) 256, 495-497.

Przeciwciała według wynalazku można, korzystnie, stosować w sposobie wykrywania obecności czynnika wzrostu według wynalazku, który to sposób obejmuje przeprowadzenie reakcji przeciwciała z próbką oraz identyfikowanie dowolnego biał ka zwią zanego z tym przeciwciał em. Opisano tu takż e zestaw do przeprowadzania takiego testu, który obejmuje przeciwciała według wynalazku oraz środki do przeprowadzenia reakcji tego przeciwciała z omawianą próbką.

Opisano tu także zestaw lub urządzenie do wykrywania w próbce obecności neurotroficznego czynnika wzrostu według wynalazku, obejmujący przeciwciało opisane powyżej oraz środki do przeprowadzenia reakcji przeciwciała z omawianą próbką.

Białka oddziałujące z czynnikiem, neurotroficznym według wynalazku, takie jak przykładowo, odpowiadający mu receptor komórkowy można zidentyfikować poprzez badanie oddziaływań białko-białko przy użyciu dwuhybrydowego systemu wektorów dobrze znanego biologom molekularnym (Fields i Song, Nature 340:245, 1939). Technika ta oparta jest na funkcjonalnej rekonstrukcji in vivo czynnika transkrypcyjnego, który aktywuje gen reporterowy. Bardziej szczegółowo technika obejmuje dostarczenie odpowiedniej komórki gospodarza z konstruktem DNA obejmującym gen reporterowy pod kontrolą promotora regulowanego czynnikiem transkrypcyjnym posiadającym, domenę wiążącą DNA oraz domenę aktywującą, poddanie ekspresji w komórce gospodarza pierwszej sekwencji hybrydowego DNA kodującej pierwszą fuzję fragmentu lub całej sekwencji nukleotydowej według wynalazku ze wspomnianą domeną wiążącą DNA albo domeną aktywującą czynnika transkrypcyjnego, poddanie ekspresji w komórce gospodarza co najmniej jednej drugiej sekwencji hybrydowego DNA, takiej jak biblioteka lub jej podobnej, kodującej przypuszczalne białka wiążące, które mają być badane, wraz z domieną wiążącą lub domeną aktywującą czynnika transkrypcyjnego, która nie jest wprowadzona do pierwszej fuzji; wykrywanie dowolnego wiązania białek, które mają być badane, z białkiem według wynalazku poprzez wykrycie obecności produktu dowolnego genu reporterowego w komórce gospodarza; ewentualnie wyizolowanie sekwencji drugiego hybrydowego DNA kodujących białko wiążące.

Przykładową tego rodzaju techniką jest technika wykorzystująca białko GAL4 w drożdżach. GAL4 jest aktywatorem transkrypcyjnym metabolizmu galaktozy w drożdżach i posiada oddzielną domenę wiążącą do aktywatorów położonych przed genami metabolizmu galaktozy oraz domenę wiążącą białko. Można konstruować wektory nukleotydowe, z których jeden obejmuje reszty nukleotydowe kodujące domenę wiążącą DNA z GAL4. Te reszty domeny wiążącej mogą być w fuzji z sekwencją kodującą znane białko, taką jak przykładowo kwasy nukleinowe według wynalazku. Drugi wektor obejmuje reszty kodujące domenę wiążącą białko z GAL4. Reszty te są w fuzji z resztami kodującymi testowane białko, korzystnie ze szklaku transdukcji sygnału z kręgowca, o którym mowa. Jakiekolwiek oddziaływanie pomiędzy czynnikiem neurotroficznym kodowanym przez kwas nukleinowy według wynalazku i testowanym białkiem prowadzi do aktywacji transkrypcji cząsteczki reporterowej w komórce drożdży z wadliwą transkrypcją GAL4, do której wprowadzono wektory. Korzystnie, cząsteczka reporterowa, taka jak β-galaktozydaza, aktywowana jest dzięki przywróceniu transkrypcji genów metabolizmu galaktozy u drożdży.

Receptor enowiny zidentyfikowany został przez twórców niniejszego wynalazku jako GFRa3. Można zatem stworzyć testy do identyfikowania agonistów i antagonistów enowiny. Test taki można także użyć w połączeniu z innymi neurotroficznymi czynnikami wzrostu i odpowiadającymi im receptorami. Zidentyfikowane związki można zastosować do leczenia lub profilaktyki zaburzeń, takich jak choroba Parkinson'a, choroba Alzheimer'a, zaburzenia neuronów związane z ekspansją sekwencji poliglutaminowych, takie jak choroba Huntington'a, neuropatii obwodowej, ostrego uszkodzenia mózgu, nowotworów układu nerwowego, stwardnienia rozsianego, stwardnienia zanikowego bocznego, urazu obwodowego układu nerwowego, ekspozycji na neurotoksyny w wyniku uszkodzenia, licznych nowotworów układu gruczołów hormonalnych, rodzinnej choroby Hirschsprung'a, chorób związanych z prionami, choroby Creutzfeld'a-Jacob'a, udary, zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną, chorób reumatyczno/zapalnych, jak również zaburzeń przewodnictwa, poprzez podawanie osobnikowi porcji omawianego agonisty lub antagonisty w stężeniu wystarczającym dla profilaktyki lub leczenia przytoczonych zaburzeń układu nerwowego. Związki takie można także włączyć do kompozycji farmaceutycznych wraz z farmaceutycznie akceptowanymi nośnikiem, rozcieńczalnikiem czy zaróbką.

W jednym wykonaniu agonistów czy antagonistów czynnika wzrostu (takiego jak na przykład enowina) można identyfikować poprzez kontaktowanie komórki, tkanki lub organizmu nie-człowieka

PL 209 952 B1 wytwarzających odpowiedni receptor i cRET, ze wskazanym składnikiem w obecności czynnika wzrostu i porównanie poziomów aktywności RET w omawianej komórce, tkance lub organizmie nie-człowieka z kontrolą, której nie kontaktowano ze wskazanym związkiem.

Opisano tu także sposób identyfikowania agonistów lub antagonistów neurotroficznego czynnika wzrostu, który obejmuje kontaktowanie komórki, tkanki lub organizmu nie-człowieka, wytwarzających odpowiedni receptor i cRET, ze wskazanym składnikiem w obecności czynnika wzrostu, pomiar poziomu aktywacji kinazy sygnałowej z drogi transdukcji sygnału, której składnikiem jest odpowiedni receptor po dodaniu przeciwciała swoistego dla kinazy sygnałowej sprzężonej z cząsteczką reportera w porównaniu z komórką, tkanką lub organizmem nie-człowieka, których nie kontaktowano ze wskazanym składnikiem.

Jak to będzie widoczne dokładniej w przykładach poniżej, enowina jest z powodzeniem stosowana do zmniejszenia braków czucia wywołanych taksolem. Enowina może zatem odgrywać rolę w zespołach bólowych z zasadniczo obwodową lub oś rodkową komponentą neurogenną , chorobach reumatycznych, jak również w zaburzeniach przewodnictwa. Może ona także odgrywać rolę modulacyjną w procesach czuciowych po podaniu przezskórnym, domiejscowym, lokalnym, ośrodkowym (jak nadtwardówkowe, dooponowe, ICV, dosplotowe, doneuronowe), doustnym, doodbytniczym, oraz układowym. Zatem, w ten sam sposób jak opisano tu dla innych stanów wywołanych za pośrednictwem enowiny, stany te można łagodzić, lub nawet im zapobiegać poprzez podawanie cząsteczki antysensownej, kwasu nukleinowego, enowiny w postaci białka, kompozycji farmaceutycznej lub związku zidentyfikowanego jako agonista lub antagonista, stosownie, według wynalazku w stężeniach wystarczających do złagodzenia lub zapobiegnięcia objawom omawianego zaburzenia (zaburzeń).

Kompozycje terapeutyczne lub farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można podawać dowolnymi, odpowiednimi, drogami dobrze znanymi specjalistom, przykładowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, przezskórnie, dooponowo lub wewnątrzmózgowo lub podawać do komórek według protokołów ex vivo. Podawanie może mieć postać szybkiego wstrzyknięcia lub może odbywać się przez pewien okres czasu, na przykład poprzez powolną infuzję lub podawanie preparatu o powolnym uwalnianiu. Przy leczeniu tkanek ośrodkowego układu nerwowego, podawanie może odbywać się poprzez wstrzyknięcie lub infuzję do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

Enowina może być także połączona lub sprzężona z czynnikami dostarczającymi pożądane właściwości farmaceutyczne lub farmakodynamiczne. Przykładowo, może być sprzężona z dowolną znaną specjalistom substancją ułatwiającą penetrację lub transport przez barierę krew-mózg, taką jak przeciwciało dla receptora transferryny, i podawana poprzez wstrzyknięcie dożylne.

Enowinę, cząsteczki antysensowne lub właściwie związki zidentyfikowane jako agoniści lub antagoniści jak tu opisano można zastosować w postaci kompozycji farmaceutycznej, którą wytwarza się według procedur dobrze znanych specjalistom. Zalecane kompozycje obejmują farmaceutycznie akceptowany nośnik lub rozcieńczalnik czy zaróbkę, jak przykładowo roztwór soli. Mogą być także użyte inne farmaceutycznie akceptowalne nośniki obejmujące inne nietoksyczne sole, sterylną wodę lub temu podobne. Obecny może także być odpowiedni bufor pozwalający na to, aby kompozycje mogły być liofilizowane i przechowywane w sterylnych warunkach przed rekonstytucją poprzez dodanie sterylnej wody przed podaniem. Enowinę można wprowadzić na stałe lub pół-stałe biologicznie zgodne podłoże, które można wszczepić do tkanek wymagających leczenia.

Nośnik może także zawierać inne farmaceutycznie akceptowalne zaróbki celem modyfikowania właściwości, takich jak pH, osmotyczność, lepkość, sterylność, lipofilność, rozpuszczalność i im podobnych. Dodane mogą być także farmaceutycznie akceptowalne zaróbki, które pozwalają na przedłużone lub opóźnione uwalnianie po podaniu.

Enowinę w postaci białka lub cząsteczki kwasu nukleinowego czy związku według wynalazku można podawać doustnie. W tym wykonaniu mogą mieć one postać kapsułki lub mogą być połączone z odpowiednimi noś nikami w dawkach o formie stał ej, dobrze znanych specjalistom.

Jak jest to dobrze znane specjalistom, stosowny tryb dawkowania jest określany na podstawie wielkości powierzchni ciała pacjenta lub objętości zajętej przestrzeni, zależnie od zastosowania określonej drogi podawania. Ilość kompozycji faktycznie podawanej będzie, jednakże, ustalana przez lekarza w oparciu o warunki leczonego zaburzenia takie jak siła objawów, kompozycja, która ma być zastosowana, wiek, masa, odpowiedź indywidualnego pacjenta oraz wybór drogi podawania.

Niniejszy wynalazek będzie lepiej zrozumiały dzięki następującym przykładom, które są wyłącznie przykładowe oraz dzięki odniesieniom do towarzyszących rysunków.

PL 209 952 B1

Figura 1: jest częściową sekwencją cDNA czynnika neurotroficznego według wynalazku, określonego jako enowina. Sekwencję konsensusową otrzymano poprzez amplifikację PCR ze starterami PNHsp3 i PNHap1 na różnych cząsteczkach cDNA i genomowym DNA, a następnie klonowanie i analizę sekwencji oraz porównanie otrzymanych sekwencji. Przewidywaną sekwencję aminokwasową w postaci jednoliterowego kodu przedstawiono powyżej sekwencji DNA. Numerację reszt nukleotydowych umieszczono po prawej stronie sekwencji DNA, podczas gdy numerację reszt aminokwasowych umieszczono po prawej stronie sekwencji przepisanej na białko. Przypuszczalne miejsce cięcia RXXR prodomeny zaznaczono pogrubioną i podkreśloną czcionką.

Przypuszczalne miejsce startu dojrzałego białka zaznaczono strzałką. Siedem konserwatywnych reszt cysteiny, charakterystycznych dla wszystkich członków rodziny TGF-β, zaznaczono pogrubioną czcionką. Potencjalne miejsce N-glikozylacji podkreślono podwójną linią.

Figura 2: jest przyrównaniem sekwencji przewidywanych ludzkich dojrzałych białek GDNF, NTN, PSP oraz EVN. Sekwencje są przyrównane przy użyciu programu ClustalW. Konserwatywne reszty aminokwasowe pomiędzy wszystkimi trzema białkami znajdują się w czarnych obszarach. Reszty konserwatywne pomiędzy dwiema lub trzema sekwencjami są zacieniowane na szaro. 7 konserwatywnych reszt cysteiny, charakterystycznych dla członków rodziny TGF-β zaznaczono gwiazdkami powyżej sekwencji. Numerację reszt aminokwasowych umieszczono po prawej stronie. Linie przerywane oznaczają przerwy wprowadzone do sekwencji dla zoptymalizowania przyrównania.

Figura 3: jest częściową sekwencją cDNA enowiny. Sekwencję konsensusową otrzymano poprzez amplifikację PCR (najpierw ze starterami PNHsp1 i PNHap1, a zakotwiczony PCR ze starterami PNHsp2 i PNHap2) na różnych cząsteczkach cDNA, a następnie klonowanie i analizę sekwencji oraz porównanie otrzymanych sekwencji. Sekwencję aminokwasową, po translacji nukleotydów od 30 do 284 (ramka odczytu A), w postaci jednoliterowego kodu przedstawiono powyżej sekwencji DNA, a numerację umieszczono po stronie prawej (A1 do A85). Ta ramka odczytu zawiera przypuszczalne miejsce startu translacji ATG. Sekwencję aminokwasową, po translacji nukleotydów od 334 do 810 (ramka odczytu B), w postaci jednoliterowego kodu przedstawiono powyżej sekwencji DNA, a numerację umieszczono po stronie prawej (B1 do B159). Ta otwarta ramka odczytu zawiera region homologii z GDNF, NTN oraz PSP. Numerację reszt nukleotydowych umieszczono po prawej stronie sekwencji DNA. Przypuszczalne miejsce cięcia RXXR prodomeny zaznaczono pogrubioną i podkreśloną czcionką. Przypuszczalne miejsce startu dojrzałego białka zaznaczono strzałką. Siedem konserwowanych reszt cysteiny, charakterystycznych dla wszystkich członków rodziny TGF-β, zaznaczono pogrubioną czcionką. Potencjalne miejsce N-glikozylacji podkreślono podwójną linią.

Figura 4: jest ilustracją chromosomowej lokalizacji ludzkiej enowiny. (A) Diagram wyników mapowania enowiny techniką FISH. Każda kropla odpowiada podwójnym sygnałom FISH wykrytym na ludzkim chromosomie 1, w regionie p31.3-p32. (B) Przykład mapowania enowiny techniką FISH. Lewy panel przedstawia sygnały FISH na chromosomie 1. Prawy panel przedstawia tę samą figurę mitotyczną barwioną 4',6-diamido-2-fenyloindolem w celu zidentyfikowania chromosomu 1.

Figura 5: jest ilustracją ekspresji enowiny w różnych ludzkich tkankach. (A), (B), (C) analiza typu Northern tkanek wytwarzających enowinę. Wytwarzanie mRNA enowiny w różnych tkankach ludzkich szacowano używając sondy odpowiadającej części regionu kodującego enowiny (włączając region kodujący dojrzałe białko enowiny) do analizy filtrów z bogatym w poli (A) ludzkim RNA. (A) Northern dla różnych tkanek (MTN, ang. Multiple Tissue Northern); (B) MTN II; (C) MTN II z płodu. Panel (D) przedstawia autoradiogram matrycowego filtru z ludzkim RNA analizowanego przy użyciu tego samego fragmentu cDNA enowiny jako sondy. Panel (E) pokazuje położenie próbek mRNA ludzkich tkanek na matrycowym filtrze z ludzkim RNA z (D).

Figura 6: jest graficzną ilustracją całkowitej przeżywalności komórek SH-SY5Y po 72 godz. od podania 10-6 M taksolu oraz wpływ na tę przeżywalność wzrastających dawek enowiny, normalizowaną w stosunku do warunków z rozpuszczalnikiem. Komórki SH-SY5Y różnicowano przez 5 dni w 25 nM staurosporynie przed podaniem taksolu. Wyniki pochodzą z dwóch niezależnych eksperymentów w sześciorynienkowych płytkach. Pokazano uśrednione wyniki oraz odchylenie standardowe.

Figura 7: jest graficznym przedstawieniem wpływu wzrastających stężeń enowiny przez 48 godz. na wydłużanie neurytów w różnicowanych za pomocą staurosporyny komórkach SH-SY5Y, normalizowanego w stosunku do warunków z rozpuszczalnikiem. Komórki SK-SY5Y różnicowano przez 5 dni w 25 nM staurosporynie przed rozpoczęciem 48 godz. eksperymentu. Jako kontrola pozytywna, pokazany jest wpływ 25 nM staurosporyny na różnicowanie. Długość neurytu określano dla co

PL 209 952 B1 najmniej 5000 komórek. Wyniki pochodzą z dwóch eksperymentów. Pokazano uśrednione wyniki oraz odchylenie standardowe.

Figury 8 do 18: są graficznym przedstawieniem wpływu enowiny na proliferację różnych typów komórek.

Figura 19: jest graficznym przedstawieniem wpływu enowiny na braki czucia zaindukowane taksolem przy użyciu testu kłucia igłą. Podane są średnie (± 1 SEM) łączne wyniki, dla szczurów traktowanych dwiema różnymi dawkami enowiny (23 lub 130 μg/ml; n = 10 szczurów/grupę) albo nośnikiem/roztworem soli fizjologicznej (n = 20 szczurów), w czasie po podaniu taksolu. Enowinę lub roztwór soli fizjologicznej/nośnik wstrzykiwano w objętości 75 μl pod podeszwę prawej tylnej łapy.

Figura 20: jest graficznym przedstawieniem wpływu enowiny na braki czucia zaindukowane taksolem przy użyciu testu kłucia igłą. Podane są średnie (± 1 SEM) łączne wyniki dla szczurów traktowanych dwiema różnymi dawkami enowiny (23 lub 130 μg/ml; n = 10 szczurów/grupę) albo nośnikiem/roztworem soli fizjologicznej (n = 20 szczurów), w czasie po podaniu taksolu. Enowinę lub roztwór soli/nośnik wstrzykiwano w objętości 75 μl pod podeszwę stopy prawej tylnej łapy.

Figura 21: jest sekwencją DNA enowiny. Sekwencję konsensusową otrzymano poprzez amplifikację PCR ze starterami PNHsp5 i PNHap1 na matrycy cDNA z ludzkiej kory czołowej i genomowym DNA, a następnie klonowanie i analizę sekwencji oraz porównanie otrzymanych sekwencji. Przewidywaną sekwencję aminokwasową przedstawiono powyżej sekwencji DNA tylko dla wariantu splicingu dającego funkcjonalne białko enowiny po translacji. Numerację reszt nukleotydowych umieszczono po lewej stronie sekwencji DNA, podczas gdy numerację reszt aminokwasowych umieszczono po prawej stronie sekwencji przepisanej na białko. Miejsca 5' i 3' dla splicingu wykryte na podstawie porównania zsekwencjonowanych fragmentów cDNA z sekwencją genomową zaznaczono pionowymi liniami wygiętymi odpowiednio w lewo lub prawo, i kolejno ponumerowanymi. Przypuszczalne miejsce cięcia RXXR prodomeny przez furynę zaznaczono pogrubioną i podkreśloną czcionką. Przypuszczalne miejsce startu dojrzałego białka zaznaczono strzałką. Siedem konserwowanych reszt cysteiny, charakterystycznych dla wszystkich członków rodziny TGF-β, zaznaczono pogrubioną czcionką. Potencjalne miejsce N-glikozylacji podkreślono podwójną linią. Miejsca 5' i 3' dla splicingu są ponumerowane w elipsach.

Figura 22: jest ilustracją ekspresji enowiny dla różnych wariantów splicingu w tkankach ludzkich. (A) schematyczny rysunek wariantów splicingu enowiny zidentyfikowanych na podstawie eksperymentów RT-PCR ze starterami specyficznymi dla enowiny przy użyciu RNA pochodzącym z różnych tkanek ludzkich, a następnie klonowania i analizy sekwencji produktów PCR. Linia górna pokazuje skalę (w parach zasad, bp). Druga linia przedstawia sekwencje genomową enowiny. Zaznaczono położenie kodonu start i stop dla translacji, początku sekwencji kodującej dojrzałą enowinę oraz miejsc 5' i 3' splicingu (patrz Fig. 21). W prawej części rysunku przedstawiono produkty uzyskane techniką RT-PCR na RNA pochodzącym z jajnika i kory czołowej wraz z drabinką DNA 100 bp. Zaznaczono położenie różnych wariantów mRNA wraz z ich wielkością (od kodonu start do stop). Białka po translacji przedstawiono po lewej stronie. Ramki opisują regiony obecne w cDNA. Linie przerywane przedstawiają sekwencję genomowego DNA wyciętą w czasie splicingu. Zacieniowane regiony przedstawiają sekwencję kodującą dojrzałą enowinę. Linia kropkowana zaznacza start sekwencji kodującej dojrzałą enowinę. Dwa transkrypty umożliwiające wytworzenie funkcjonalnego białka enowiny zaznaczono gwiazdkami po lewej stronie. (B) Rozmieszczenie w tkankach głównych wariantów splicingu. Fotografia przedstawia fragmenty PCR otrzymane techniką RT-PCR ze specyficznymi starterami dla enowiny przy użyciu różnych ludzkich cDNA. Strzałkami po lewej stronie zaznaczono 4 główne warianty splicingu (A do D). Wielkości podano po prawej stronie w oparciu o drabinkę DNA 100 bp użytą do kalibracji żelu.

Figura 23: Przewidywana sekwencja białka z długiego wariantu splicingu dla enowiny, otrzymanego przez wycięcie dwóch intronów z sekwencji DNA przedstawionej na Fig. 21. Do usunięcia pierwszego intronu zostały wykorzystane miejsca splicingu 5'-1 oraz 3'-1, a do usunięcia drugiego intronu miejsca splicingu 5'-2 oraz 3'-3. W wyniku tego powstała sekwencja cDNA posiadająca otwartą ramkę odczytu kodującą białko o 228 aminokwasach pokazane powyżej.

Figura 24: Przewidywana sekwencja białka z (wariantu krótkiego) alternatywnego splicingu dla enowiny, otrzymanego przez wycięcie dwóch intronów z sekwencji DNA przedstawionej na Fig. 21. Do usunięcia pierwszego intronu zostały wykorzystane miejsca splicingu 5'-1 oraz 3'-2, a do usunięcia drugiego intronu miejsca splicingu 5'-2 oraz 3'-3. W wyniku tego powstała sekwencja cDNA posiadają12

PL 209 952 B1 ca otwartą ramkę odczytu kodującą białko o 220 aminokwasach, pokazane powyżej. Sekwencja białka utraciła 8 reszt aminokwasowych w porównaniu z sekwencją przedstawioną na Fig. 23.

Figura 25: jest graficznym przedstawieniem wyników otrzymanych z eksperymentów zaprojektowanych dla porównania poziomów ekspresji enowiny w tkance zdrowej i chorej. Ekspresja enowiny i GAPDH jest przedstawiona w tkance mózgu, w stwardnieniu rozsianym oraz chorobie Alzheimer'a.

Figura 26: jest graficznym przedstawieniem otrzymanych wyników wykrycia poziomów ekspresji enowiny i GAPDH w chorobie Parkinson'a i raku.

Depozyty

Plazmid EVNmat/pRSETB zawierający sekwencję DNA kodującą enowinę, zdeponowano 6 maja 1999 pod numerem dostępu LMBP3931 w Belgian Coordinated Collections of Micro-Biologie (BCCM) w Laboratoriumvoor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Belgia zgodnie z postanowieniami Traktatu budapeszteń skiego z 28 kwietnia 1997.

Materiały i metody

Materiały

Stosowana natywna polimeraza Taq, ampicylina, IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktozyd), X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-galaktopiranozyd) oraz wszystkie enzymy restrykcyjne pochodzą z Boehringer Mannheim (Mannheim, Niemcy). 10 mM mieszaninę dNTP nabyto w Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Zestaw TOPO-TA cloning kit nabyto w Invitrogen BV (Leek, Holandia). Zestawy Qiagen plasmid mini lub midi -DNA purification kit, Qiaprep Spin Miniprep kit oraz Qiaquick gel extraction kit nabyto w Qiagen GmbH (Dusseldorf, Niemcy). Biblioteki cDNA, Marathon^Tm Ready cDNA kit, panele I i II z ludzkim cDNA (MTC™) z różnych tkanek, filtry do analizy typu Northern z różnych tkanek oraz zestaw Advantage-GC cDNA PCR kit otrzymano z Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA). Wszystkie reakcje PCR prowadzono w cyklerze GeneAmip PCR system 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). Pożywka (LB (Luria-Bertani) zawiera 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdży oraz 10 g/l NaCl. Szalki 2x YT/ampicylina zawierają 16 g/l tryptonu, 10 g/l ekstraktu drożdży oraz 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru oraz 100 mg/l ampicyliny.

Baza danych do przeszukiwania homologii i porównywania sekwencji

Przy użyciu programu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Alschul et al., 1990) przeszukano codziennie uaktualniane bazy danych EMBL/GenBank z ludzkimi sekwencyjnymi znacznikami ekspresji (EST) oraz z sekwencjami genomowymi, stosując jako sekwencje zadane całe sekwencje białek z cDNA dla pochodzącego z linii ludzkich komórek glejowych czynnika neurotroficznego (GDNF; numer dostępu Q99748), neurturyny (NTN, numer dostępu P39905) oraz persefiny (PSP; numer dostępu AF040962).

Dodatkowo przeprowadzano przeszukiwania programem BLAST przy użyciu sekwencji genomowej, o numerze dostępu AC005038 oraz kilku sekwencji EST obecnych w bazie danych GenBank i wykazano homologię do sekwencji genomowej.

Procent identyczności i procent podobieństwa pomiędzy członkami rodziny GDNF obliczono poprzez porównanie parami sekwencji przy użyciu programu BESTFIT (pakietu oprogramowania do analizy sekwencji Genetics Computer Group, wersja 8.0, University of Wisconsin, Madison, WI, USA). Przyrównania sekwencji DNA i białka wykonano przy użyciu programu ClustalW (EMBL, Heidelberg, Niemcy).

Synteza oligonukleotydów do PCR i sekwencjonowania DNA

Wszystkie startery oligonukleotydowe zamawiano z Eurogentec (Seraing, Belgia). Specyficzne dla wstawki startery do sekwencjonowania (15- oraz 16-mery) oraz startery do użycia w reakcjach PCR zaprojektowano ręcznie. DNA przygotowywano przy ażyciu kolumn Qiagen-tip-20 lub -100 aniono-wymiennych lub kolumn Qiaquick spin (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Niemcy) i odzyskiwano z kolumn w 30 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (sól sodowa), pH 8,0).

Reakcje sekwencjonowania przeprowadzano na obu niciach przy użyciu zestawu ABI prism BigDye Terminator Cycle sequencing kit i puszczano na sekwenatorze Applied Biosystems 377XL (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA). Do składania sekwencji oraz ręcznego edytowania użyto oprogramowania Sequencher™ (GeneCodes, AnnArbor, MI, USA).

Klonowanie nowego hoaologa GDNF

Przy projektowaniu starterów oligonukleotydowych do amplifikacji PCR użyto region DNA rozciągający się na obszarze nukleotydów 67411 do 68343 z sekwencji o nr dostępu w EMBL AC005038, której sekwencja przepisana na białko była homologiczna do dojrzałych NTN i PSP. Różne użyte startery przedstawiono w Tab. 1.

PL 209 952 B1

T a b e l a 1: Startery użyte do amplifikacji PCR fragmentów z AC005038.

Nazwa startera	Sekwencja startera
PNHsp1	5' - CGGTGCACTCAGGTGATTCCTCC - 3'
PNHsp2	5' - GGCAGCAAACCCATTATACTGGAACC - 3'
PNHsp3	5' - CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC - 3'
PNHsp4	5' - CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC - 3'
PNHap1	5' - GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG - 3'
PNHap2	5' - CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC - 3'

Startery PNHsp3 i PNHap1 użyto do amplifikacji fragmentu 502 bp na matrycy cDNA pochodzącego z różnych tkanek ludzkich (Marathon-Ready™ cDNA (Clontech Laboratories) z mózgu płodu, całego płodu, prostaty lub płuca oraz cDNA z kory czołowej, hipokampa i móżdżku) oraz ludzkiego genomowego DNA. W oparciu o sekwencję genomową z bazy danych EMBL/GenBank (nr dostępu AC005038) przewidywano, że fragment do amplifikacji posiada 76% par G+C. Zatem, amplifikację przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu Advantage-GC cDNA PCR kit (Clontech Laboratories,

Palo Alto, CA, USA) zoptymalizowanego do amplifikacji sekwencji DNA bogatych w GC. Reakcje PCR przeprowadzano w całkowitej objętości 50 μ|, zawierającej 1x bufor do reakcji GC cDNA PCR, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM starterów PNHsp3 i PNHap1, 1 μl mieszaniny polimerazy Advantage KlenTaq oraz 1 do 5 μl cDNA lub 0,5 μg genomowego DNA. Próbki grzano w 95°C przez 5 min a następnie przeprowadzano 35 cykli o profilu: 45 s w 95°C, 1 min w 58°C i 40 s w 72°C z etapem końcowym 7 min w 72°C. Następnie do próbek dodawano 2,5 jedn. natywnej polimerazy DNA Taq w celu dodania wystającego końca A. Produkty PCR analizowano w 1% (wag./obj.) żelu agarozowym w 1x buforze TAE (40 mM Tris-octan, 1 mM EDTA (sól sodowa), pH 8,3). Fragmenty PCR o spodziewanej wielkości (495 bp) wycinano z żelu i oczyszczano przy użyciu zestawu Qiaquick gel extraction kit. Fragmenty PCR sekwencjonowano w celu potwierdzenia ich tożsamości i klonowano w wektorze plazmidowym pCR2.1-TOPO przy użyciu zestawu TOPO TA cloning kit zgodnie z zaleceniami producenta. Około 20 ng oczyszczonego fragmentu mieszano z 1 μl wektora pCR2.1-TOPO w całkowitej objętości 5 μΚ Reakcje inkubowano w temperaturze pokojowej (20°C) przez 5 min 2 μl reakcji transformowano komórki kompetentne TOP1OF' (Invitrogen BV) przy użyciu transformacji szokiem cieplnym i wysiewano na szalki z 2x YT/ampicylina uzupełnione 10 mM IPTG i 2% (wag./obj.) X-gal dla uzyskania białych i niebieskich kolonii. Białe kolonie uzyskane po hodowli przez noc zbierano z szalek, hodowano w 5 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną 100 mg/l i otrzymywano plazmidy przy użyciu Qiaprep Spin Miniprep kit. Obecność wstawki o spodziewanej wielkości potwierdzano przez trawienie restrykcyjne EcoRI. Wstawki plazmidowe z kilku pozytywnych klonów sekwencjonowano a otrzymane sekwencje porównywano stosując program ClustalW.

W celu uzyskania dodatkowej sekwencji nowego homologa GDNF, fragment o spodziewanej wielkości 931 bp w oparciu o sekwencję z EMBL/GenBank (nr dostępu AC005038) amplifikowano za pomocą PCR przy użyciu starterów PNHsp1 i PNHap1. Reakcje PCR przeprowadzano w całkowitej objętości 50 zawierającej 1x bufor do reakcji GC cDNA PCR, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM starterów PNHsp1 i PNHap1, 1 μl mieszaniny polimerazy Advantage KlenTaq oraz 1 do 5 μl cDNA z móżdżku, kory czołowej lub hipokampa lub 0,5 μg genomowego DNA. Próbki grzano w 95°C przez 5 min a następnie przeprowadzano 35 cykli o profilu: 45 s w 95°C, 1 min w 58°C i 1 mm 30 s w 72°C z etapem końcowym 7 min w 12°C. Produkty PCR analizowano w 1% (wag./obj.) żelu agarozowym w 1x buforze TAE (40 mM Tris-octan, 1 mM EDTA (sól sodowa), pH 8,3). Drugą rundę amplifikacji przeprowadzano z zakotwiczonymi starterami (PNHsp2 i PNHap2). 1 μl reakcji z pierwszej rundy amplifikacji umieszczano w całkowitej objętości 50 zawierającej 1x bufor do reakcji GC cDNA PCR, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM starterów PNHsp2 i PNHap2, 1 μl mieszaniny polimerazy Advantage KlenTaq. Próbki grzano w 95°C przez 5 min a następnie przeprowadzano 35 cykli o profilu: 45 s w 95°C, 1 mm. w 58°C i 1 min 30 s w 72°C z etapem końcowym 7 min w 72°C. Produkty PCR analizowano w 1% (wag./obj.) żelu agarozowym w 1x buforze TAE. Fragmenty PCR o spodziewanej wielkości (870 bp) wycinano z żelu i oczyszczano przy użyciu zestawu Qiaquick gel extraction kit. Fragmenty PCR sekwencjonowano w celu potwierdzenia ich tożsamiości, poddawano działaniu 2,5 jedn. polimerazy Taq i klonowano w wektorze plazmidowym pCR2.1-TOPO przy użyciu zestawu

PL 209 952 B1

Ana|iza ekspresji genu enowiny poprzez ana|izę RT-PCR

Startery o|igonuk|eotydowe PNHsp3 i PNHap1 (patrz Tab. 1) stosowano do specyficznej amp|ifikacji PCR fragmentu 502 bp z enowiny. Amp|ifikacje PCR prowadzono na pane|ach z |udzkimi cDNA pochodzącymi z różnych tkanek (MTG™) norma|izowanych wzg|ędem poziomów ekspresji mRNA sześciu różnych genów typu housekeeping. Reakcje PCR ze starterami specyficznymi d|a enowiny prowadzono w całkowitej objętości 50 μ|, zawierającej 5 μ| cDNA, 1x bufor do reakcji GC cDNA PCR, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT™, 400 nM starterów PNHsp3 i PNHap1, 1 μ| mieszaniny po|imerazy Advantage K|enTaq. Próbki grzano do 95°C przez 30 s, a następnie przeprowadzano 35 cyk|i o profi|u: 30 s w 95°C, 30 s w 68°C. Próbki ana|izowano w 1,2% (wag./obj.) że|u agarozowym w 1x buforze TAE (40 mM Tris-octan, 1 mM EDTA (só| sodowa), pH 8,3) i obrazy barwienia że|i w roztworze bromku etydyny otrzymywano stosując zestaw Eag|e Eye II Video system (Stratagene, La Jo||a, CA, USA).

Przeszukiwanie pod kątem podobieństwa codziennie uaktua|nianej bazy danych EMBL/GenBank przy użyciu sekwencji białek neurturyny i persefiny dały sekwencję genomowego DNA kodującą przypuszcza|ne nowe białko podobne do neurotroficznych czynników GDNF, NTN i P3P, które nazwano enowiną (EVN). Dodatkowe przeszukiwanie bazy danych pod kątem homo|ogii przy użyciu sekwencji genomowego DNA otaczającego region kodujący enowinę dało ki|ka k|onów sekwencyjnych znaczników ekspresji (EST) pochodzących z różnych |udzkich tkanek ([nabłonka prostaty, nr dostępu AA533512 (ID1322952)], raka płuca [nr dostępu AA931637] oraz nowotworu przytarczycy [nr dostępu AA844072]). K|ony te zawierają sekwencję DNA |eżącą poza regionem homo|ogii z GDNF, PSP czy NTN, |ecz potwierdzają, że mRNA enowiny jest wytwarzany w tkankach norma|nych i nowotworowych.

Wstępna amp|ifikacja PCR przy użyciu starterów (PNHsp3 i PNHap1) zaprojektowanych w oparciu o sekwencję genomową dała fragment = 500 bp z cDNA płodu, mózgu płodu, prostaty, kory czołowej, hipokampa, móżdżku oraz z DNA genomowego, |ecz nie dała produktu d|a cDNA z płuca. K|onowanie i ana|iza sekwencji tych fragmentów dała sekwencję DNA o długości 474 bp, która po przepisaniu na białko daje sekwencję 139 reszt aminokwasowych, włączając siedem konserwatywnych reszt cysteiny charakterystycznych d|a wszystkich członków rodziny białek transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) (Kingsley, 1994) (Fig. 1). Sekwencja zawiera także motyw RXXR cięcia prodomeny (RAAR, pozycja aminokwasowa 23 do 26) (Barr, 1991). Podobne miejsce cięcia obecne jest w sekwencji białka GDNF, NTN i PSP w porównywa|nej pozycji w sekwencji prodomeny. Zakładając, że cięcie prodomeny enowiny występuje w tym miejscu in vivo, sekwencja dojrzałego białka EVN zawiera 113 reszt aminokwasowych (reszty 27 do 139 na Fig. 1) i ma wy|iczoną masę cząsteczkową 11965 Da i punkt izoe|ektryczny 11,8. W dojrzałej sekwencji występuje jedno potencja|ne miejsce N-g|ikozy|acji (NST w pozycji aminokwasowej 121-123). Ponadto, obecnych jest ki|ka innych regionów konserwowanych pomiędzy dojrzałymi formiami znanych czynników neurotroficznych GDNF, NTN i PSP (Fig. 2). W Tab. 2 podsumowano wyniki porównania sekwencji dojrzałych białek członków rodziny GDNF przy użyciu programu BESTFIT. Podano procent identyczności oraz procent podobieństwa. Do porównania wzięto sekwencje dojrzałych GDNF, NTN, PSP i EVN, zaczynające się w pierwszej reszcie aminokwasowej za miejscem cięcia RXXR.

T a b e | a 2: Porównanie parami dojrzałych |udzkich białek rodziny GDNF przy uż yciu programu BESTFIT.

Porównywane	% identyczności	% podobieństwa
1	2	3
EVN vs GDNF	38,8	47,2
EVN vs NTN	51	56,1

PL 209 952 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
EVN vs PSP	53,3	57,8
GDNF vs NTN	44,8	57,3
GDNF vs PSP	44,3	50
NTN vs PSP	50	54,4

Z porównań tych wynika, ż e dojrzałe białko enowiny jest bardziej spokrewnione z persefiną i neurturyną niż z GDNF.

Amplifikacja, klonowanie i analiza sekwencji większego fragmentu sekwencji DNA enowiny uzyskanego na matrycy cDNA z kory czołowej przy użyciu starterów zaprojektowanych w oparciu o sekwencję genomową z EMBL/GenBank (nr dostępu AC005038) dała sekwencję długości 819 bp (Fig. 3). Sekwencja ta zawiera przypuszczalny kodon start ATG w pozycjach nukleotydowych 30-32 i daje otwartą ramkę odczytu (ramka odczytu A na Fig. 3), która rozcią ga się do kodonu stop w pozycjach nukleotydowych 285-287. Sekwencja tego regionu przepisana na białko nie wykazuje podobieństwa z żadnym białkiem z bazy danych. Translacja sekwencji cDNA w drugiej ramce odczytu (ramka odczytu B) daje przewidywaną sekwencję białka o długości 159 reszt amidnokwasowych. Sekwencja ta zawiera miejsce cięcia RXXR (pozycja B43 do B46; pozycja nukleotydowa 460-471) oraz sekwencję odpowiadającą sekwencji dojrzałej enowiny (pozycja B47 do B159; pozycja nukleotydowa 472-810). Otwarta ramka odczytu zawiera miejsce cięcia RXXR i sekwencję kodującą dojrzałą enowinę rozciągającą się od pozycji nukleotydowej 334 (poprzedzona przez kodon stop w ramce) do kodonu stop w pozycji 811-813, lecz nie zawiera kodonu ATG dla pierwszej metioniny. Analogicznie do persefiny (Milbrandt et al., 1998) stawiamy hipotezę, że w większości transkryptów mRNA genu EVN obecny jest intron, który nie ulega wycięciu. GDNF i NTN również posiadają intron w odpowiadających regionach kodujących prodomenę (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).

Dla ustalenia obecności różnych transkryptów mRNA enowiny, przeprowadzono doświadczenia typu RT-PCR przy użyciu starterów położonych na końcu 5' sekwencji kodującej enowinę tuż po stronie 5' przed przypuszczalnym górnym kodonem start ATG (starter PNHsp5 [5'-GCA AGC TGG CTC AAC AGG AGG G-3'] oraz zakotwiczonego startera PNHsp6 [5' - GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG -3']) oraz starterów położonych na końcu 3' (starter PNHap1 i zakotwiczony starter PNHap2 [patrz Tab. 1]). Doświadczenia przeprowadzano na panelach z cDNA pochodzącym z wielu ludzkich tkanek (Clontech MTC panele I i II), na bibliotece cDNA z serca płodu (Clontech) i cDNA pochodzącym z ludzkiego móżdżku, hipokampa i kory czołowej (Masure et al., 1998). Pierwotne reakcje PCR przeprowadzano ze starterami PNHsp5 i PNHap1 w warunkach dla sekwencji bogatych w GC (Advantage GC-PCR kit, Clontech) przez 30 cykli jako opisano (95°C - 30 s, 60°C - 30 s, 72°C - 1 mm.). Zakotwiczone reakcje PCR przeprowadzano na 1 μΐ pierwotnego produktu PCR przy użyciu starterów PNHsp6 i PNHap2 w tych samych warunkach przez 30 cykli.

Otrzymane produkty PCR analizowano w 1,5% żelu agarozowym i mieściły się one w granicach wielkości ± 350 bp do ± 800 bp. Kilka prążków oczyszczono z żelu i fragmenty PCR sekwencjonowano bezpośrednio. Niektóre produkty PCR także sklonowane w wektorze pGR2.1-TOPO (TOPO-TA cloning kit, Invitrogen) a następnie zsekwencjonowano. Analiza sekwencji potwierdziła obecność różnych cząsteczek mRNA zawierających sekwencję enowiny. Otrzymane sekwencje fragmentów porównano z sekwencją genomową enowiny. Pozwoliło to nam zidentyfikować kilka możliwych miejsc splicingu 5' i 3' w sekwencji genomowej (Fig. 21). Wszystkie te miejsca splicingu odpowiadają sekwencjom konsesusowym dla donora i akceptora miejsca splicingu (Senapathy P., Shapiro M.B. i Harris N.L., 1990) miejsca styku, miejsca punktu rozgałęzienia oraz egzonów: Sequence statistics, identification and applications to genome project. Methods Enzymol. 183, 252-278). Zidentyfikowane różne warianty splicingu enowiny oraz ich obecność w różnych ludzkich tkankach podsumowano na Fig. 22. Tylko dwa z pięciu zsekwencjonowanych transkryptów dało funkcjonalne białko enowiny po translacji z kodonu start ATG. Te dwa transkrypty kodują białka o odpowiednio 228 lub 220 aminokwasach z przewidywanymi peptydami sygnałowymi o 47 i 39 resztach aminokwasowych. Przewidywane sekwencje białek tych dwóch wariantów przedstawiono na Fig. 23 (wariant długi) i Fig. 24 (wariant krótki). Wariant długi można przewidzieć na podstawie sekwencji przedstawionej na Fig. 21 wycinając pierwszy intron położony między 5'-1 i 3'-1 oraz drugi intron położony między 5'-2 i 3'-3. Po

PL 209 952 B1 translacji otwartej ramki odczytu otrzymuje się przewidywaną sekwencję białka przedstawioną na Fig. 23. Wariant krótszy można przewidzieć na podstawie sekwencji przedstawionej na Fig. 21 wycinając pierwszy intron położony między 5'-1 i 3'-2 oraz drugi intron położony między 5'-2 i 3'-3. Po translacji otwartej ramki odczytu otrzymuje się przewidywaną sekwencję białka przedstawioną na Fig. 24.

Wydaje się, że najdłuższy transkrypt występuje w większej ilości w większości tkanek, jak można sądzić na podstawie intensywności prążka na Fig. 22B. Krótsze transkrypty dają przesuniętą ramkę odczytu i powstające białko nie posiada sekwencji aminokwasowej homologicznej do GDNF, NTN i PSP. Dwa najmniejsze transkrypty nie mają nawet części dojrzałej sekwencji kodującej, w tym dwóch z siedmiu silnie zakonserwowanych reszt cysteiny. Na Fig. 22B przedstawiono rozmieszczenie głównych wariantów splicingu w różnych ludzkich tkankach. Funkcjonalny mRNA enowiny jest wytwarzany w prawie wszystkich testowanych tkankach włączając mózg, serce, nerkę, wątrobę, płuco, trzustkę, mięsień szkieletowy, okrężnicę, jelito cienkie, leukocyty krwi obwodowej, śledzionę, tarczycę, prostatę, jądro, jajnik, łożysko oraz serce płodu. W pewnych ludzkich tkankach (np. móżdżku, hipokampie), amplifikowany był jedynie niefunkcjonalny transkrypt. Jak nam wiadomo, występowanie niefunkcjonalnych transkryptów mRNA w takim, zakresie nie było wcześniej opisywane. Biologiczne znaczenie tego odkrycia pozostaje do dalszego badania. Chociaż ekspresja NTN i PSP w różnych tkankach nie została w pełni scharakteryzowana, poziomy ich ekspresji wydają się być znacznie niższe a ekspresja bardziej ograniczona do pewnych tkanek (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).

Wytwarzanie zrekombinowanej enowiny w E.coli

Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla enowiny

Fragment PCR 414 bp amplifikowano na matrycy ludzkiego genomowego DNA przy użyciu starterów PNHsp4 i PNHap2 (Tab. 1) i klonowano w wektorze pCR2.1-TOPO przy użyciu TA-clonning (Invitrogen). Sekwencje wstawki potwierdzano analizą sekwencji. Jeden klon zawierający wstawkę z sekwencją konsensusową dla enowiny (klon 36) użyto do konstrukcji wektora ekspresyjnego. Zaprojektowano dwa startery zawierające odpowiednie miejsca restrykcyjne na swoich końcach 5'. Starter do przodu PNHexp-sp1 (5'-GCG GAT CCG GCT GGC GGC CCG GGC A-3') zawierający miejsce restrykcyjne BamHI (podkreślono) oraz starter do tyłu PNHexp-ap1 (5'-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3') zawierający miejsce restrykcyjne Xhol (również podkreślono). Przy użyciu tych starterów na matrycy klonu 36 zamplifikowano fragmiont 343 bp kodujący dojrzałą enowinę (pozycje 81 do 422 na Fig. 1). Reakcję PCR przeprowadzano w całkowitej objętości 50 μ|, zawierającej 1x bufor do reakcji GC cDNA PCR, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 nM starterów PNHexp-sp1 i PNHexp-apl, 1 μΐ mieszaniny polimerazy Advantage KlenTaq oraz 1 ng plazmidu DNA z klonu 36. Próbki podgrzewano do 94°C przez 5 min a następnie przeprowadzano 25 cykli o profilu: 45 s w 94°C, 1 min w 58°C i 30 s w 72°C z etapem końcowym 7 min w 72°C. 50 μl uzyskanego produktu PCR oczyszczano używając zestaw Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) i DNA wypłukiwano w objętości 30 μ!. 25 μl oczyszczonego produktu trawiono w 30 μl przy użyciu 10 jedn. BamHI i 10 jedn. Xhol w 1x buforze B (Boehringer Mannheim) przez 1 godz. w 37°C. Po elektroforezie w 1% (wag./obj.) żelu agarozowym w 1x buforze TAE (40 mM Tris-octan, 1 mM EDTA (sól sodowa), pH 8,3) spodziewany prążek o długości 353 bp wycinano z żelu i oczyszczano przy użyciu zestawu Qiaquick gel extraction kit. Otrzymany fragment ligowano z wektorem pRSET 3 (Invitrogen) zlinearyzowanym BamHI i Xhol, Wstawkę z uzyskanego plazmidu (hEVNmat/pRSETB) potwierdzono kompletną analizą sekwencyjną. Uzyskany konstrukt koduje 146 aminokwasowe białko o spodziewanej masie cząsteczkowej 15704 Da zawierające znacznik 6x His na końcu NH2 w fuzji z sekwencją kodującą dojrzałą enowinę. Sekwencja końca NH uzyskanego białka jest zatem następująca MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (sekwencję dojrzałej enowiny podano pogrubioną czcionką, znacznik 6x His podkreślono).

Ekspresja enowiny w komórkach E.coli BL21(DE3)

Rekombinacyjną produkcję enowiny przeprowadzono zasadniczo tak jak opisano to dla neurturyny przez Creedon et al. (1997), z modyfikacjami. W celu wytworzenia zrekombinowanej enowiny, E. coli, szczep BL21(DE3) (Novagen), transformowano plazmidem hEVNmat/pRSETB i hodowano w pożywce 2xYT/ampicylina (16 g/l tryptonu, 10 g/l ekstraktu drożdży oraz 5 g/l NaCl oraz 100 mg/l ampicyliny) w 30°C (225 rpm) lub 37°C (300 rpm) do OD600 około 0,5 przed dodaniem IPTG do końcowego stężenia 0,2 mM dla zaindukowania ekspresji. Komórki zbierano przez odwirowanie po 3 godz. indukcji, płukano roztworem soli buforowanym fosforem, wirowano i zamrażano. W celu oczyszczenia białka i ponownego fałdowania, osady komórek zawieszano w buforze do sonikacji

PL 209 952 B1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM 2-merkaptoetanol, inhibitory proteaz (Complete™ protease inhibitor cocktail tablets (Boehringer Mannheim, 1 tabletka na 50 ml buforu) oraz 1 mg lizozymu na 500 mg osadu komórek). Komórki otwierano przez działanie ultradźwiękami, a ciała inkluzyjne zbierano przez wirowanie. Ciała inkluzyjne rozpuszczano i inkubowano w buforze A (8 M mocznik, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 200 mM NaCl, 1 mM 2-merkaptoetanol) przez 30 w 37°C przed dodaniem kulek z Ni-NTA (kwas nitrylotrioctowy z niklem, Qiagen). Po 40 min wytrząsania w 37°C, próbki płukano raz w buforze A i nanoszono na 5 ml kolumnę Ni-NTA. Kolumnę przepłukiwano kolejno buforemi A, 10 objętości kolumny, buforem A o pH 7,2, 10 objętości kolumny oraz buforem A o pH 7,2 + 10 mM imidazol, 10 objętości kolumny. Enowinę wypłukiwano z kolumny buforem A o pH 7, 2 + 200 mM imidazol, 4 objętości kolumny.

Ponowne fałdowanie enowiny uzyskiwano poprzez stopniową dializę przez noc w 4°C w buforze renaturującymi (0,1 M fosforan sodowy, 0,15 M NaCl, 3 μM cysteina, 0,02% Tween-20,10% glicerol, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,3) zawierającym malejącą ilość mocznika w każdym etapie (6 M do 4 M do 3 M do 2 M do 1 M 0,5 M do 0 M mocznik). Oczyszczone białko porcjowano, przechowywano w -20°C i później używano w testach funkcjonalnych.

Chromosomowa lokalizacja genu enowiny

Fragment 3,3 kb genu enowiny amplifikowano na matrycy cDNA z móżdżku używając starterów EVN(7)-sp1 (5'-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3') i PNHap1 (5'-GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G-3') zaprojektowanych w oparciu o sekwencję w EMBL o nr dostępu AC005038. Reakcję PCR prowadzono w całkowitej objętości 50 zawierającej bufor reakcyjny 1x Expand Long Template PCR (Boehringer Mannheim), 0,5 mM dNTP, 1 M GC-MELT™ (Clontech Laboratories), 400 nM starterów EVN(7)-sp1 i PNHap1 i 1 μl cDNA z móżdżku. Po wstępnym grzaniu 2 min, w 94°C dodawano 0,75 μl polimerazy Expand Long Template (Boehringer Mannheim) i przeprowadzano 10 cykli o następującym profilu: 10 s w 94°C, 30 s w 58°C i 3 min w 68°C. Następnie przeprowadzano 20 dodatkowych cykli ze wzrastającym czasem wydłużania w 68°C o 20 s w każdym cyklu. Włączono także na zakończenie 7 min w 68°C. Uzyskany fragment 3,3 kb oczyszczono po elektroforezie w 0,8% żelu agaroza/TAS i sklonowano w wektorze pCR2.1-TOPO przy użyciu TA-cloning (Invitrogen). Analiza całej sekwencji 3,3 kb wstawki z klonu potwierdziła, że uzyskana sekwencja cDNA odpowiada genomowej sekwencji z bazy danych EMBL (nr dostępu AC005038). Żaden intron nie był wycięty w cDNA pochodzącym z cDNA móżdżku.

Badania mapowania chromosomu prowadzono poprzez analizę hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) zasadniczo jak opisano (Heng et al., 1992, Heng i Tsui, 1993). Ludzkie limfocyty hodowano w 37°C przez 68-72 godz. przed działaniem 0,18 mg/ml 5-bromo-2'deoksyurydyny(BrdU) dla synchronizacji cykli komórkowych w populacji komórek. Zsynchronizowane komórki płukano i ponownie hodowano w 37°C przez 6 godz. Komórki zbierano i przygotowywano skrawki stosując standardowe procedury włączając działanie roztworem hipotonicznym, utrwalenie i suszenie na powietrzu. 3,3 kb sondę dla enowiny biotynylowano i używano do wykrywania FISH. Skrawki zapiekano w 55°C przez 1 godz., traktowano RNazą i denaturowano w 70% formamidzie w 2x NaCl/cyt (20x NaCl/cyt jest 3 M NaCl, 0,3 M cytrynianem dwusodowym, pH 7,0) przez 2 min w 70°C po czym odwadniano etanolem. Próbki denaturowano zanim naniesiono na skrawki ze zdenaturowanymi chromosomami. Po hybrydyzacji przez noc, skrawki przepłukiwano a sygnały FISH i wzór prążków dla 4',6-diamido-2fenyloindolu rejestrowano oddzielnie na filmie fotograficznym; przypisanie wyników mapowania FISH do prążków chromosomowych uzyskiwano poprzez nałożenie sygnałów FISH na chromosomy z prążkami uzyskanymi za pomocą 4',6-diamido-2-fenyloindolu (Heng i Tsui, 1993). W zastosowanych warunkach wydajność hybrydyzacji dla tej sondy wynosiła w przybliżeniu 72% (pośród 100 przebadanych obrazów mitozy, 72 z nich dawało sygnał na jednej parze chromosomów). Ponieważ zastosowano barwienie prążków 4',6-diamido-2-fenyloindolem do identyfikowania określonego chromosomu, uzyskano przypisanie sygnału pochodzącego z sondy do krótkiego ramienia chromosomu 1. Dokładną pozycję określano dalej w oparciu o sumę wyników z 10 fotografii (Fig. 4A). Wykrywanie typu FISH nie wykazało dodatkowego locus w zastosowanych warunkach, zatem uważamy, że enowina leży w ludzkim, chromosomie 1, w regionie p31.3-p32. Przykład wyników mapowania przedstawiono na Fig. 4B.

Na podstawie danych mapy genetycznej w NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap), można ustalić, że klon genomowy zawierający sekwencję enowiny (EMBL nr dostępu AC005038) jest położony w chromosomie 1, pomiędzy markerami

PL 209 952 B1

D1S2843 i D1S417. Odpowiada to regionowi p31.1 do p32.3 chromosomu 1, co potwierdza dane uzyskane za pomocą analizy FISH.

Rozmieszczenie enowiny w tkankach określone na podstawie analizy Northern i dot blot.

Filtry do analizy typu Northern zawierające 2 μg RNA bogatego w poli(A) pochodzącego z różnych ludzkich tkanek (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA USA; MTN™ blot, MTN™ blot II, płodowy MTN™ blot II) hybrydyzowano zgodnie z zaleceniami producenta z 897 bp fragmentem enowiny (znakowanym przy użyciu losowych starterów i a-³²P-dCTP (HighPrime kit, Boehringer Mannheim). Fragment ten wytwarzano poprzez amplifikację PCR przy użyciu starterów PNHsp1 i PNHap1 na matrycy cDNA z kory czołowej a następnie klonowanie w wektorze pCR2.1-TOPO. Fragment zawiera 897 bp z sekwencji enowiny do kodonu stop i obejmuje całą sekwencję kodującą dojrzałe białko enowiny.

mRNA enowiny wykrywano jako główny transkrypt o wielkości około 4,5 kb (Fig. 5A-C). mRNA enowiny ulega ekspresji w wielu tkankach, głównie w sercu, mięśniach szkieletowych, trzustce i prostacie. Pewne mniejszej wielkości transkrypty obecne są m.in. w łożysku (4 kb, 2,4 kb i 1,6 kb) oraz w prostacie (4 kb i 1,6 kb). W tkankach płodowych, dominujący transkrypt 2,4 kb obecny jest w wątrobie i w mniejszym stopniu w płucu. Inne transkrypty obecne są także w nerce, wątrobie, płucu i mózgu z płodu.

Dodatkowo matrycowy filtr z RNA (Clontech Laboratories), zawierający RNA bogaty w poli(A) z różnych ludzkich tkanek i stanów rozwojowych, hybrydyzowano z sondą 897 bp enowiny. Próbki RNA bogatego w poli(A) użyte do wykonania filtrów były normalizowane względem poziomów ekspresji mRNA ośmiu genów typu housekeeping przez producenta. mRNA enowiny jest wytwarzany powszechnie, lecz najwyższe poziomy mRNA były widoczne w prostacie, przysadce mózgowej, tchawicy, łożysku, płucu płodu, trzustce i nerce (Fig. 5D+E).

Konstrukcja wektorów fuzyjnych GFRa-IgG-Fc

Regiony cDNA GFRa-1, GFRa-2 i GFRa-3 (odpowiednio kodujące aminokwasy 27 do 427, 20 do 431 i 28 do 371) wyłączając sekwencje kodujące peptyd sygnałowy oraz region hydrofobowy na końcu COOH wymagany w zakotwiczaniu GPI sklonowane w ramce w wektorze ekspresyjnym. Signal pIg plus (R&D Systems Europe Ltd). Białka wytwarzane w oparciu o te konstrukty zawierają 17 aminokwasowy peptyd sygnałowy GD33 na końcu NH2, region białka GFRa oraz 243 aminokwasy z końca COOH ludzkiej domeny fuzyjnej IgG1-Fc. Komórki CHO transfekowano konstruktami fuzyjnymi GFRa a stabilnie stransfekowane komórki selekcjonowano stosując 500 μg G418. Stałe klony selekcjonowano przy użyciu przeciwciał anty Fc. W celu oczyszczenia białek fuzyjnych GFRa komórki hodowano w pożywce bez surowicy i pożywkę zbierano co 3 dni. Pożywkę wirowano i nanoszono na kolumnę z białkiem A (Protein A Sepharose, Pharmacia Biotech). Związane białko wymywano stosując 0,1 M cytrynian sodowy, pH 3,0 i zbierano do buforu 1 M Tris, pH 8,4. Stężenie białka określano mierząc absorbancję przy 280 używając współczynnika wzbudzenia 1,5. Te oczyszczone rozpuszczalne białka fuzyjne GFRa-1 do -3 stosowano do badania wiązania.

Analiza powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Badania powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) prowadzono w 25°G przy użyciu urządzenia BIAcore 3000. Analizy prowadzono z enowiną i NGF jako unieruchomionymi ligandami. Karboksylowane podłoże sensorowego chipa F1 najpierw aktywowano mieszaniną 1:1 400 mM N-etylo-N-(dimetyloaminopropylo)-karbodiimidu i 100 mM N-hydroksy-sukcynimidu przez 10 min. Następnie, zrekombinowaną enowinę i NGF nanoszono na aktywowaną powierzchnię w 10 mM buforze octanowym, pH 4,5 przy prędkości przepływu 5 gl/min. Niezajęte grupy reaktywne inaktywowano 1 M chlorowodorkiem etanoloaminy. Do badania wiązania, rozpuszczalny GFRa nanoszono w stężeniach 10-100 nM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej HEPES (150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05% P-20, 10 mM HEPES, pH 7,4) przy prędkości przepływu 10 gl/min. Asocjację monitorowano przez 3 min a dysocjację przez 1 min po czym przeprowadzano regenerację 5 mM NaOH. Dysocjację rozpoczynano przez nanoszenie soli fizjologicznej buforowanej HEPES. Do obliczenia stałych szybkości asocjacji (ka), szybkości dysocjacji (kd) oraz równowagi dysocjacji (KD obliczona jako ka/kd) użyto oprogramowania BIAcore evaluation 3.0.

Wyniki

Do mierzenia wiązania rozpuszczalnego GFRa1-3 do unieruchomionej enowiny użyto SPR. Specyficzne wiązanie do enowiny można było wykryć jedynie dla GFRa3. GFRa1 i GFRa2 nie wiązały się z enowiną. Obserwowane wiązanie GFRa3 było swoiste, gdyż nie obserwowano wiązania do NGF. W oddzielnym eksperymencie kontrolnym wykrywano swoiste wiązanie TrkA-Fc (receptor NGF) do unieruchomionego NGF i brak wiązania do unieruchomionej enowiny.

PL 209 952 B1

Na podstawie krzywych wiązania uzyskanych przy użyciu trzech różnych stężeń GFRa, otrzymano stałe przedstawione w Tab. 3. Wyniki te pokazują, że GFRa3 wiąże się swoiście z enowiną.

T a b e l a 3

	K_a (1/Ms)	Ka (1/s)	Kd, (M)
GFRa3	1,65 10⁵	5,08 10⁴	3,1 10^-9

Ponieważ GDNF, NTN i PSP wpływają na utrzymanie i przeżycie wielu różnych typów neuronów oczekuje się, że enowina ma podobne działanie na komórki nerwowe a możliwe, że także na inne typy komórek. Zatem można sobie wyobrazić, że enowiną może być zasadniczo przydatna w leczeniu zaburzeń neurologicznych, w tym choroby Parkinson'a, choroby Alzheimer'a, neuropatii obwodowej, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), choroby Huntington'a, ostrego uszkodzenia mózgu, stwardnienia rozsianego, nowotworów układu nerwowego, urazu obwodowego układu nerwowego, czy uszkodzenia i ekspozycji na neurotoksyny.

Enowina mogłaby też być przydatna w różnych aspektach leuroprotekcji. Biorąc pod uwagę wpływ na przeżywanie populacji różnych neuronów oraz na obserwowany odrost neurytów w naszych modelowych komórkach SHSY5Y, proponujemy, że związek ten może mieć zastosowanie w neuroprotekcji i neuroregeneracji.

Oparte jest to na następujących obserwacjach. Taksol indukuje apoptozę neuronów w komórkach PC12 szczurzej feochromocytomy różnicowanych za pomocą NGF (Nuydens et al., złożona do druku). Zatem cytotoksyczność indukowana taksolem posiada cechy apoptozy neuronów, widoczne jako fragmentacja DNA, znakowanie anneksyną V oraz protekcją bcl-2. Zatem, można wnioskować, że taksol indukuje apoptozę w zróżnicowanych komórkach SH-SY5Y. Pokazano obecnie, że enowina może zredukować śmierć komórek a zatem ogólnie może odwrócić apoptozę neuronów.

Związek ten może zatem być przydatny w stanach neurodegeneracyjnych, w których obserwowano apoptozę, jak udar (Hakim 1998), choroba Parkinson'a (Marsden et al., 1998), choroba Alzheimer'a (Nagy et al., 1998), choroba Huntington'a (Wellington et al., 1997), uraz układu nerwowego (Smirnova et al., 1998), neuropatia obwodowa (Srinivisan et al.,1998).

Jako przykład dla ostatniego wskazania klinicznego pokazaliśmy, że ten czynnik neurotroficzny istotnie chroni zróżnicowane komórki SH-SY5Y ludzkiego nerwiaka niedojrzałego przed toksycznością komórkową zaindukowaną taksolem.

Metodologia badania żywotności

Żywotność komórek określano poprzez dodanie 100 μl roztworu 1 mg/ml 5-karboksyanilidu

2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazoliny (XTT, Sigma) w DMEM (37°C) uzupełnionego 0,02 mM metylosiarczanem fenazyny (PMS, Sigma) w każdej studzience. Płytki były następnie inkubowane w 37°C przez 2,5 godz. Gęstości optyczne odczytywano (Molecular devices) przy 450 nm, stosując jako odniesienie 650 nm. Test XTT oparty jest na przekształceniu soli tetrazoliny XTT w czerwono zabarwiony formazan. Reakcja ta przeprowadzana jest przez enzymy mitochondrialne.

Metodologia badania różnicowania neuronów

1. Różnicowanie w komórkach SHSY5Y ludzkiego nerwiaka niedojrzałego

Komórki SHSY5Y różnicowano przez 5 dni 25 nM staurosporyną. Wpływ enowiny jest mierzony 72 godz. po rozpoczęciu eksperymentu (odniesienie Jalava et al., Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SHSY5Y human neuroblastoma cells through an a, b, z PKC independent pathway Journ cell Physiol 155, 301-312 (1993)).

2. Pomiar wydłużania neurytu

Zmiany morfologiczne neuronów określano automatycznie w następujący sposób. W skrócie, w odpowiednim czasie bezpośrednio do pożywki dodawano glutaraldehyd i pozostawiano w temperaturze pokojowej na 30 min Zapewniało to, że morfologia komórek w tym punkcie czasowym odzwierciedlała rzeczywisty stan. Komórki obserwowano za pomocą przekazywanego modu światła w mikroskopie Axiovert (Zeiss Oberkochen, Niemcy) wyposażonego w stację skanującą Marzhauser napędzaną przez Indy workstation (Silicon Graphics, Mountain View, USA). Obrazy zapisywano kamerą video MX5 (HCS). Przebadano około 3000 komórek w 64 uporządkowanych obrazach tworzących kwadratowe matryce 8x8 obrazów. Dokładne zestawienie obrazów potwierdziło, że neuryty mogą przechodzić z jednego pola obrazu do następnego. Automatyczne wykrywanie wydłużania neurytów, wyznakowanych poliklonalnym przeciwciałem tau prowadzono przy użyciu nieobciążonego detektora

PL 209 952 B1 struktur krzywoliniowych (Steger, 1998). Dzięki analizie przy użyciu odpowiedniego oprogramowania obliczono automatycznie całkowitą wielkość ciał komórkowych, liczbę ciał komórkowych oraz całkowitą długość neurytów.

W celu zbadania wpływu enowiny na różne typy komórek przeprowadzono dwa rodzaje testów: badanie syntezy DNA oraz badanie chemotaksji.

Badanie syntezy DNA

Komórki, włączając ludzkie fibroblasty skórne (39SK), ludzkie komórki śródbłonkowe żyły pępkowej (HUVEC), ludzkie komórki mięśni gładkich (HSMC), ludzkie chondrocyty oraz szczurze osteoblasty utrzymywano w DMEM zawierającym 10% FBS (39-SK, HSMC, szczurze osteoblasty) lub w określonych pożywkach (Chondrocyty i UVEC) w 37°C z 5% CO2 i 95% powietrzem. Do badania syntezy DNA, komórki wysiewano w 96-studzienkowych płytkach do hodowli komórkowych przy gęstości 5000 komórek/studzienkę w DMEM zawierającej 10% FBS i inkubowano przez 24 godz. Następnie pożywkę hodowlaną wymieniano na DMEM zawierającą różne stężenia enowiny oraz 0,1% BSA (dla 39-SK, osteoblastów, HSMC, chondrocytów) albo DMEM zawierający różne stężenia enowiny oraz 0,5% FBS (dla HUVEC) i komórki inkubowano przez 24 godz. Następnie pożywkę hodowlaną wymieniano na 100 μl DMEM zawierającego 5% FBS i 0,1 μ Ci [³H]-tymidyny. Po 2 godz. znakowania pulsowego, komórki utrwalano mieszaniną metanol/kwas octowy (3:1, obj./obj.) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Utrwalone komórki przepłukiwano dwukrotnie 80% metanolem. Komórki rozpuszczano w 0,05% trypsynie (100 μl/studzienkę) przez 30 min, a następnie w 0,5% SDS (100 μl /studzienkę) przez dalsze 30 min. Porcje lizatów komórkowych (180 μθ mieszano z 2 ml koktajlu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywność lizatów komórkowych przy użyciu licznika scyntylacyjnego płynów (Wallac 1409).

Badanie chemotaksji

Komórki utrzymywano jak opisano w DNA Synthesis Assay. Aktywność chemotaktyczną enowiny analizowano używając 12-studzienkowej zmodyfikowanej komory Boyden'a (McQuillan D.J., Handley C.J., Campbell M.A., Bolis S., Milway V.E., Herington A. C, (1986), Stimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insuline-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage, Biochem. J. 240:423-430). Komórki trypsynizowano przy użyciu 0,05% trypsyny i 0,5 mM EDTA i zawieszano w DMEM. Do dolnych studzienek komory Boyden'a dodawano porcje po 150 μl pożywek zawierających różne stężenia enowiny. Na górze dolnych studzienek umieszczano błonę poliwęglanową (8 μm) opłaszczoną 0,1 mg/ml kolagenu typu I, a na to nakładano górne studzienki. Do górnych studzienek nanoszono porcje po 100 μl komórek (70000 komórek/ml). Po czasie 6 godz. inkubacji aparat rozkładano. Komórki pozostające na górze błony usuwano. Błonę utrwalano 10% formaldehydem przez 15 min a następnie barwiono stężoną hematoksyliną Gill'a. Komórki zliczano w mikroskopie (powiększenie 250 x) i stosowano średnie ze zliczeń komórek dla pięciu powierzchni każdej studzienki. Każdy eksperyment powtarzano co najmniej cztery razy. Wyniki przedstawiano jako krotność kontroli (DMEM zawierający 0,1% BSA).

Jak pokazują ilustracje wyników na Fig. 8 do 18 enowina nie ma wpływu na proliferację żadnego z badanych typów komórek ani na migrację komórek HUVEC (Fig. 14) jak opisano powyżej. Wystąpił natomiast wpływ enowiny na komórki SH-SY-5Y nerwiaka niedojrzałego. Wskazuje to na selektywny wpływ enowiny na neurony.

Wykazano, że zarówno GDNF, jak i NTN biorą udział w sygnalizacji poprzez kompleks sygnalizacyjny złożony z podjednostki wiążącej ligand, GFRa-1 albo GFRa-2, oraz podjednostki sygnalizacyjnej, kinazy tyrozynowej białka cRET. Wydaje się, że enowina wywiera swój biologiczny wpływ poprzez podobny kompleks sygnalizacyjny złożony z partnera wiązania GFRa (albo GFRa-1, GFRa-2, ostatnio scharakteryzowany receptor sierocy GFRa-3 albo innych do tej pory nie scharakteryzowanych członków rodziny GFRa) w połączeniu cRET lub innymi czynnikami współdziałającymi w przekazywaniu sygnału. Rzeczywiście, nasze wyniki wiązania pokazują, że enowina może wiązać się z GFRa-3.

U ludzi, mutacje w GDNF lub cRET występujące w linii zarodkowej mogą prowadzić do wielu fenotypów chorobowych włączając liczne nowotwory układu gruczołów hormonalnych oraz rodzinną chorobę Hirschsprung'a (HSCR) (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Obie choroby związane są z brakiemi czynności ruchliwej jelita, a choroba Hirschsprung'a jest najczęstszą przyczyną wrodzonej niedrożności jelit z zatkania u dzieci. Interesujące, że myszy z uszkodzonym GDNF i cRET wykazują zadziwiająco podobne zmiany patologiczne z brakiem wytworzenia nerek lub brakiem jelitowych zwojów autonomicznych (Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichel et al.,

PL 209 952 B1

1996). Enowina może być zaangażowana w podobne zaburzenia jelit lub nerek, lub ze względu na to, że ulega powszechnej ekspresji, może odgrywać istotną rolę w rozwoju innych obwodowych narządów ciała.

Oddziaływanie ligandów z ich receptorami na ogół odbywa się poprzez oddziaływanie swoistych wiązań z określonych reszt obu białek. Fragmenty białka mogą służyć jako agoniści aktywujący receptor dia wywołania wspierającego wpływu na wzrost i przeżycie komórek. Części enowiny lub peptydy syntetyczne oparte o sekwencję białka enowiny mogą być zatem przydatne jako agoniści i antagoniści regulujący swój receptor GFRa3. Stosując syntezę peptydów lub techniki rekombinacji można wytwarzać hybrydowe czynniki wzrostu złożone z części pochodzących z GDNF, NTN lub PSP czy innego dowolnego czynnika neurotroficznego lub czynnika wzrostu z częściami enowiny w celu wytworzenia nowego syntetycznego czynnika wzrostu z nowymi właściwościami.

Przeprowadzono dwa doświadczenia pilotażowe w celu sprawdzenia czy enowina może zmieniać braki czucia zaindukowane taksolem u szczurów po wstrzyknięciu jej pod podeszwę łapy szczura. W pierwszym doświadczeniu badano czy pojedyncze traktowanie enowiną może znieść braki czucia zaindukowane taksolem, podczas gdy w drugim doświadczeniu badano czy enowina może zapobiegać rozwojowi braków indukowanych taksolem.

Zniesienie w czasie dysfunkcji czuciowych zaindukowanych taksolem

Procedura

Użyto samce szczurów Sprague-Dawley, o masie 300-340 gramów. Zwierzęta hodowano indywidualnie z dostępem do pokarmu i wody ad lib. Przed rozpoczęciem doświadczenia zwierzęta umieszczano w standardowych klatkach do obserwacji i po 15 min okresie przyzwyczajenia oceniano odruch na kłucie igłą. Aby to uczynić podeszwę prawej tylnej łapy zwierzęcia stymulowano igłą i reakcję na kłucie igłą określano jako obecną (wynik = 1) lub brak (wynik = 0). Podczas jednej sesji, procedurę powtarzano trzykrotnie z przerwami czasowymi 1 min pomiędzy 2 kolejnymi prezentacjami bodźca; tak, że test kłucia igłą składał się z trzech pomiarów reakcji na kłucie igłą. Do doświadczenia wzięto tylko te szczury, które miały prawidłowe reakcje w 3 kłuciach igłą.

Rano, przez 3 kolejne dni, zwierzęta otrzymywały codzienny zastrzyk pod podeszwę 50 μl taksolu (3 mg^l paklitaksel rozpuszczony w kremoforze i bezwodnym alkoholu plus woda) prawej tylnej łapy. Rano następnego dnia, ponownie oceniano odruch na kłucie igłą i wybierano zwierzęta nie wykazujące reakcji na 3 prezentacje bodźca. Zwierzęta te podzielono losowo na grupy (n = 10/grupę) otrzymujące pod podeszwę prawej tylnej łapy zastrzyk 75 μl nośnika, roztworu soli fizjologicznej albo 23 lub 130 μg/ml enowiny. Ponieważ nie obserwowano różnic pomiędzy wynikami dla zwierząt traktowanych nośnikiem albo roztworem soli fizjologicznej obie grupy połączono (grupa kontrolna). W 1, 4, 5 i 7 dniu po ostatnim traktowaniu przeprowadzano testy kłucia igłą rano (pomiędzy 8 a 9 rano) oraz popołudniu (pomiędzy 15:30 a 16:30). Ostatni test kłucia igłą przeprowadzono 8 dnia rano. Dla każdego zwierzęcia mierzono łączne wyniki reakcji na kłucie igłą w czasie trwania doświadczenia. Ponieważ łącznie przeprowadzono 9 testów kłucia igłą (każdy składający się z 3 prezentacji kłucia igłą) po ostatnim traktowaniu lekiem, maksymalny wynik jaki można było osiągnąć w czasie trwania doświadczenia wynosi 27.

Wyniki

Powtarzane przez 3 kolejne dni zastrzyki taksolu pod podeszwę łapy skutkowały powstaniem ostrej reakcji zapalnej z utratą odpowiedzi na stymulację przez kłucie igłą u większości zwierząt. Zastrzyki pod podeszwę łapy z roztworu soli fizjologicznej lub nośnika nie wpłynęły na braki zaindukowane taksolem. Przy pierwszym pomiarze, jedynie 4 z 20 kontroli wykazywały co najmniej 1 reakcję na trzykrotne kłucie igłą, a średni (± SEM) wynik kłucia igłą dla kontroli w pierwszym pomiarze wynosił 0,25 (± 0,12); kontrastuje to z początkiem doświadczenia gdzie średni wynik wynosił 3,0 (± 0,0), ponieważ wszystkie zwierzęta odpowiadały na kłucie igłą. Nawet po 8 dniach pomiarów reakcja u kontroli była ciągle zmniejszona, 11 spośród 20 wykazywało co najmniej 1 reakcję, a średni wynik kłucia igłą wynosił 0,57 (± 0,18). W grupie kontrolnej żaden ze szczurów nie wykazywał prawidłowej reakcji na wszystkie 3 bodźce. Łączny wynik kłucia igłą kontroli podczas trwania doświadczenia przedstawiono na Fig. 19. Ponieważ zwierzęta testowano 9 razy w czasie 8 dni, maksymalny wynik otrzymany dla 3 kłuć igłą w każdym teście wynosił 27. Jak widać na wykresie wstrzyknięcie pod podeszwę roztworu soli fizjologicznej lub nośnika nie znosiło braku zaindukowanego taksolem podczas całego czasu trwania doświadczenia. Średnia całkowitego łącznego wyniku kontroli na końcu doświadczenia wynosiła 5,10 (± 0,87); co stanowi 18,9% maksymalnego wyniku jaki można było osiągnąć.

PL 209 952 B1

Pojedyncze wstrzyknięcie pod podeszwę 75 μl enowiny w stężeniu 23 μg/ml powodowało, że po pierwszym pomiarze 4 z 10 szczurów wykazywało co najmniej 1 reakcję, a średni wynik kłucia igłą wynosił 0,70 (± 0,33). W 8 dniu, 10 wszystkich zwierząt odpowiadało co najmniej raz na kłucie igłą, a prawidłowa reakcja była obecna u 5 z 10 szczurów. Średni wynik kłucia igłą w tej grupie w 8 dniu wynosił 2,20 (± 0,29). W porównaniu z kontro|ami, średni łączny wynik pomiaru końcowego z 8 dni był znacząco podwyższony (test U Manna-Whitneya, dwustronny, p<0,01), osiągnął średni wynik kłucia igłą 14,50 (± 1,96) (Fig. 19). Stanowi to 53,7% wyniku maksyma|nego.

Również wstrzyknięcie pod podeszwę 130 μg/μl enowiny miało lepszą skuteczność w porównaniu z kontrolami. W pierwszym pomiarze po podaniu 130 μg/ml enowiny, 6 z 10 szczurów odpowiadało co najmniej raz, a średni wynik kłucia igłą wynosił 1,10 (± 0,35). W 8 dniu, wszystkie 10 zwierząt odpowiadało co najmniej raz na kłucie igłą, a średni wynik kłucia igłą wynosił 2,60 (± 0,22). Prawidłowa reakcja na 3 kłucia igłą obecna była u 8 z 10 szczurów. Średni łączny wynik kłucia igłą na końcu doświadczenia wynosił dla tej grupy 17,20 (± 1,94). Stanowi to 63,7% możliwego maksymalnego wyniku i jest znacząco poprawiony w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,01).

Zapobieganie w czasie dysfunkcjom czuciowym, zaindukowanym taksolem.

Procedura

Użyto samce szczurów Sprague-Dawley, o masie 300-340 gramów. Zwierzęta hodowano indywidualnie z dostępem do pokarmu i wody ad lib. Przed rozpoczęciem doświadczenia zwierzęta umieszczano w standardowych klatkach do obserwacji i po 15 min okresu przyzwyczajenia oceniano odruch na kłucie igłą. Aby to uczynić podeszwę prawej tylnej łapy zwierzęcia stymulowano igłą i reakcję na kłucie igłą określano jako obecną (wynik = 1) lub brak (wynik = 0). Podczas jednej sesji, procedurę powtarzano trzykrotnie z przerwami czasowymi 1 min pomiędzy 2 kolejnymi prezentacjami bodźca; tak, że test kłucia igłą składał się z trzech pomiarów reakcji na kłucie igłą. Do doświadczenia wzięto tylko te szczury, które miały prawidłowe reakcje w 3 kłuciach igłą. Po tym pomiarze kontrolnym, zwierzęta podzielono losowo na podgrupy (n = 10/grupę) otrzymujące pod podeszwę prawej tylnej łapy zastrzyk 75 μl nośnika, roztworu soli fizjologicznej albo 23 lub 130 μg/ml enowiny. Ponieważ nie obserwowano różnic pomiędzy wynikami dla zwierząt traktowanych nośnikiem albo roztworem soli fizjologicznej obie grupy połączono (grupa kontrolna). Przez 3 kolejne dni, zwierzęta otrzymywały pod podeszwę codzienny zastrzyk 50 μl taksolu (3 mg/ml paklitaksel rozpuszczony w kremoforze i bezwodnym alkoholu plus woda) prawej tylnej łapy. W 1, 4, 5 i 7 dniu po podaniu taksolu przeprowadzano testy kłucia igłą rano (pomiędzy 8 a 9 rano) oraz popołudniu (pomiędzy 15:30 a 16:30). Ostatni test kłucia igłą przeprowadzono 8 dnia rano. Dla każdego zwierzęcia mierzono łączne wyniki reakcji na kłucie igłą w czasie trwania doświadczenia. Ponieważ łącznie przeprowadzono 9 testów kłucia igłą (każdy składający się z 3 prezentacji kłucia igłą) po traktowaniu taksolem, maksymalny wynik jaki można było osiągnąć w czasie trwania doświadczenia wynosi 27.

Wyniki

Zastrzyki pod podeszwę z roztworu soli fizjologicznej lub nośnika przed podaniem taksolu nie zapobiegły uszkodzeniu zaindukowanemu taksolem w teście kłucia igłą. W pierwszym badaniu po podaniu taksolu, 8 z 20 szczurów odpowiadało co najmniej raz na kłucie igłą, a średni wynik kłucia igłą wyniósł 0,60 (± 0,18). W 8 dniu, uszkodzenie zaindukowane taksolem było stale obecne, tylko 8 spośród 20 zwierząt odpowiadało na bodziec i średni wynik wynosił 0,8 (± 0,25). Dwa zwierzęta wykazywały prawidłowy odruch na kłucie igłą. W czasie trwania doświadczenia łączny wynik kłucia igłą również był zredukowany, a średnia wartość wynosiła 6,55 (± 1,08), co stanowi 24,3% maksymalnego wyniku (Fig. 20).

Wstępne traktowanie za pomocą 23 μg/ml enowiny zredukowało uszkodzenia zaindukowane taksolem widoczne w teście kłucia igłą. W 1 dniu, 8 spośród 10 zwierząt odpowiadało co najmniej raz, a średni wynik kłucia igłą wynosił 1,70 (± 0,40). W 8 dniu, wszystkie zwierzęta odpowiadały na kłucie igłą, a średni wynik wynosił 2,50 (± 0,27). 7 zwierząt wykazywało prawidłową reakcję na wszystkie próby kłucia igłą. Biorąc pod uwagę łączną odpowiedź przez czas trwania doświadczenia (Fig. 20), średni całkowity wynik kłucia igłą był znacząco podwyższony (p<0,01), w porównaniu z poziomem, kontrolnym, do 18,40 (± 1,73); co stanowi 68,1% wartości maksymalnej.

Porównywalne wyniki uzyskano po wstępnym traktowaniu za pomocą 130 μg/ml enowiny. Tu, 6 z 10 szczurów odpowiadało podczas pierwszego badania, a średni wynik kłucia igłą wynosił 1,70 (± 0,31). W 8 dniu, wszystkie zwierzęta odpowiadały co najmniej raz na stymulację za pomocą kłucia igłą, a średni wynik wynosił 2,40 (± 0,22), a wszystkie 3 reakcje były prawidłowe u połowy zwierząt.

PL 209 952 B1

Biorąc pod uwagę łączny wynik, średni wynik uzyskany w 8 dniu wynosił 17,70 (± 1,92), co stanowi 65,5% wartości maksymalnej.

Przedstawione serie doświadczeń wykazują, że jednorazowe wstrzyknięcie pod podeszwę enowiny może zredukować braki czucia zaindukowane taksolem mierzone w teście kłucia igłą. Aktywność obserwuje się zarówno kiedy lek podany jest przed, jak i po podaniu taksolu.

Enowina jest możliwym kandydatem do podawania w zespołach bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną, w chorobach reumatyczno/zapalnych, jak również w zaburzeniach przewodnictwa oraz może odgrywać rolę modulatorową w procesach czucia po podaniu przezskórnym, domiejscowym, lokalnym, ośrodkowym (jak nadtwardówkowe, dooponowe i im podobne) oraz układowym.

Użyteczne jest ponadto zastosowanie enowiny jako narzędzia diagnostycznego do przeszukiwania zmian patofizjologicznych w wymienionych powyżej obszarach.

Porównanie ekspresji mRNA enowiny w tkankach normalnych i chorych

Ekspresję mRNA enowiny analizowano ilościowo przy użyciu systemu ABI Prism 7700 Sequence Detection (TaqMan; Perkin Elmer) stosując zastrzeżoną technologię opracowaną i stosowaną w Pharmagene Laboratories Ltd, Royston, Wielka Brytania). System ten wykorzystuje sondy fluorogenowe do wytworzenia specyficznych dla sekwencji sygnałów fluorescencyjnych podczas reakcji PCR. Sondę stanowi oligonukleotyd z przyłączonym fluorescencyjnym znacznikiem reporterowym oraz wygaszaczem, który położony jest pomiędzy zgodnym i przeciwnym starterem do PCR. W stanie nienaruszonym intensywność fluorescencji reporterowej jest tłumiona przez wygaszacz. Gdy sonda tworzy część kompleksu replikacyjnego, reporter fluorescencyjny jest odcinany od wygaszacza poprzez aktywność egzonukleazy od 5' do 3' właściwej polimerazie Taq. Wzrost sygnału reportera fluorescencyjnego podczas reakcji jest bezpośrednią miarą akumulacji produktu PCR. Wyjściowa liczba kopii docelowych sekwencji mRNA (Cn) jest ustalana poprzez określenie dla frakcji liczby cykli PCR (Ct), przy których po raz pierwszy wykrywa się produkt PCR - punkt, w którym sygnał fluorescencyjny przechodzi ponad progową linię podstawową. Ilościowy pomiar docelowego mRNA w próbce jest ustalany poprzez porównanie doświadczalnych wartości Ct ze krzywą standardową.

Preparatyka RNA i kontrola jakości

Całkowity RNA izolowano z całej lub częściowo pociętej tkanki, przy użyciu odczynnika Tri-Zol (Life Technologies, Gaithersburg, MD USA) według zaleceń producenta. Kontrolę jakości przeprowadzano dla wszystkicń próbek RNA i obejmowała ona oszacowanie integralności (cały 18S i 28S rybosomowy RNA) oraz określenia obecności występujących transkryptów w dużycń ilościach (aktyna) i niewielkich ilościach (receptor transferyny).

Projektowanie startera/sondy

Zaprojektowano parę starterów i sondę TagMan do amplifikacji specyficznej sekwencji enowiny starter 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3' starter 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3' sonda 5: 5' CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'

Dodatkowo zaprojektowano parę starterów i sondę TagMan, które obejmują intron i amplifikują część ludzkiego genu dla GAPDH starter 2: 5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3' starter 4: 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3' sonda 6: 5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'

Sonda 5 jest wyznakowana fluorem FAM a sonda 6 jest wyznakowana fluorem VIC.

Działanie DNazą na całkowity RNA

2,2 μg całkowitego RNA z każdej testowanej tkanki trawiono 2 jedn. DNazy wolnej od RNaz (Gibco BRL) przez 15 min w temperaturze pokojowej w 20 μΙ buforu 1x do DNazy (Gibco BRL). Reakcję hamowano przez dodanie 2 μΙ 25 mM roztworu EDTA. Próbki inkubowano następnie w 65°C przez 10 min w celu iaktywacji enzymu.

Synteza pierwszej nici cDNA

100 ng całkowitego RNA z każdej testowanej tkanki użyto jako matrycy do syntezy pierwszej nici cDNA. RNA w objętości 4 ml i obecności 50 nM starterów 1 i 2, 1x buforu II do PCR (Perkin Elmer) i 5 ml MgCl2 grzano do 72°C przez 5 min i schładzano powoli do 55°C. Po dodaniu wszystkich reagentów, 6 μΙ mieszaniny reakcyjnej inkubowano w 48°C przez 30 min a następnie inaktywowano enzym w 90°C przez 5 min. Końcowe warunki reakcji były następujące: 1x buforu II do PCR, 5 mM MgCl2, 1 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 jedn. odwrotnej transkryptazy MuLV (Gibco BRL).

PL 209 952 B1

Amplifikacja produktów syntezy pierwszej nici cDNA przy użyciu PCR cDNA pochodzący ze 10 ng całkowitego RNA z każdej próbki poddawano amplifikacji PCR w pojedynczej reakcji celem zidentyfikowania zarówno transkryptu docelowego, jak i GAPDH. Stężenia końcowe starter/sonda dla sekwencji docelowej wynosiły 300 nM starter 1, 300 nM starter 3 oraz 200 nM sonda 5, a te dla GAPDH wynosiły 20 nM starter 2, 20 nM starter 4 i 100 nM sonda 6. Końcowe stężenia innych reagentów wynosiły 4,5% glicerol, 1x bufor A TaqMan (Perkin Elmer), 6,25 mM MgCl2, 430 M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 jedn. AmpliTaq Gold. Amplifikację PCR przeprowadzano w zestawie ABI 7700 sequence detection system, wstępny etap aktywacji enzymu prowadzono w 94°C, przez 12 min, a następnie przeprowadzano 45 cykli o profilu: 15 s 94°C, 1 min (minimalny czas ramp) w 60°C.

Badanie chorób i tkanek

Porównywano ekspresję mRNA enowiny w tkankach pochodzących od chorych pacjentów i zdrowych osobników kontrolnych (Fig. 25 i 26). W tabeli poniżej przedstawiono choroby i odpowiednie tkanki, które badano. Dla każdego stanu chorobowego analizowano trzy próbki chore i trzy kontrolne.

Patologia	Tkanka 1	Tkanka 2	Tkanka 3
Choroba Alzheimer'a	kora skroniowa	hipokamp	kora potyliczna
Stwardnienie rozsiane	rdzeń kręgowy	okołokomorowa istota biała	móżdżek
Choroba Parkinson'a	istota czarna	skorupa	móżdżek
Rak	rak gruczołowaty okrężnicy	rak gruczołowaty kanałów piersiowych	rak płaskokomórkowy płuc

Analiza statystyczna

Dla każdej grupy z trzech tkanek obliczano średnią i odchylenie standardowe (SD) dla wartości Ct (które miały rozkład normalny), a następnie przekształcano w wartości Cn według wzoru n = 10^{((Ct-40,007)/-3,623)}. Analizę wariancji (ANOVA) przeprowadzono także na wartościach Ct dla porównania średniej poziomów wytwarzania mRNA enowiny w normalnych i chorych tkankach.

Na Fig. 25 i 26 przedstawiono średnią liczbę kopii (± SD; n = 3) mRNA enowiny w tkankach chorych i kontrolnych. Analiza statystyczna wykazuje znaczący wzrost poziomu ekspresji enowiny w okołokomorowej istocie białej pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (p = 0,013). Wewnętrzna kontrola z GAPDH nie wykazuje znaczących różnic (p = 0,79). Chociaż poziom ekspresji enowiny w około-komorowej istocie białej jest całkiem niski w normalnej tkance (średnio 270 kopii na 100 ng całkowitego RNA wobec 200000 kopii GAPDH), poziom jest trzykrotnie wyższy (825) u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Tylko jedna inna chora tkanka wykazuje znaczącą różnicę względem normalnej kontroli: w gruczolakoraku przewodowym sutka poziom wytwarzania mRNA enowiny jest 6 razy wyższy (6000 wobec 1000; p = 0,007), lecz wartość dla kontroli GAPDH jest także znacząco podwyższona (165000 wobec 44000; p = 0,03), co prawdopodobnie świadczy o ogólnie podwyższonych poziomach mRNA.

Podsumowując, pokazaliśmy, że poziomy mRNA enowiny są podwyższone w okołokomorowej istocie białej u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Zastosowanie testu ELISA, opartego na fosfo-swoistym przeciwciele, do przeszukiwania związków naśladujących enowinę w kompleksie receptora GFRa3/cRET.

Sposób ten można także stosować do identyfikacji agonistów i antagonistów innych receptorów neurotrofinowych takich jak GFRa1, GFRa2, GFRa4, TrkA, TrkB i TrkC.

Test

Stosując ten test zidentyfikowaliśmy agonistów i antagonistów neurotroficznych czynników wzrostu poprzez pomiar aktywności kluczowej kinazy sygnałowej aktywowanej w drodze neurotroficznej lub poprzez pomiar aktywacji kinazy receptora cRET. Aktywację mierzy się poprzez wykrycie ilości fosforylowanej kinazy lub kinazy receptora przy użyciu przeciwciał fosfo-swoistych. Użyjemy komórki NIH 3T3 wytwarzające przejściowo lub stale TrkA, TrkB, TrkC, GFRa1/cRET, GFRa2/cRET, GFRa3/cRET lub GFRa4/cRET.

Aktywacja kinazy p42/p44 MAP, kinazy PKB, c-jun, CREB, kinazy JNK/SAPK i innych kinaz wykrywana jest przy użyciu komercyjnie dostępnego przeciwciała fosfo-swoistego, cRET.

PL 209 952 B1

Stosowano następujący protokół:

- Wysiać komórki NIH 3T3 w 96-studzienkach w 10% surowicy cielęcej, komórki powinny mieć 80% koinfluencji przed stymulacją.

- Następnego dnia, wymienić pożywkę na pożywkę bez surowicy i komórki głodzić przez 18-24 godz.

- Po głodzeniu stymulować komórki związkami i czynnikami neurotroficznymi jako kontrolę pozytywną (10 ng/ml dla czynników neurotroficznych).

- Utrwalić komórki 4% formaldehydem w PBS w 4°C przez 20 min.

- Przepłukać komórki 3x 200 μl PBS/0,1% Triton przez 5 min.

- Zahartować komórki 100 μl 0,6% H₂O₂ w PBS/0,1% Triton przez 20 min.

- Przepłukać komórki 3x 200 μl PBS/0,1% Triton przez 5 min.

- Blokować komórki 100 μl 10% płodowej surowicy cielęcej w PBS/0,1% Triton przez 60 min.

- Inkubować komórki z przeciwciałem fosfo-swoistym w 50 μl 5% BSA/PBS/0,1% Triton, przez noc w 4°C. Rozcieńczenie przeciwciała powinno być określone doświadczalnie, sugerowany zakres 1:100-1:250.

- Przepłukać komórki 3x 200 μl PBS/0,1% Triton przez 5 min.

- Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem połączonym z HRP, rozcieńczenie 1:100 w 50 μl 5% BSA/PBS/0,1% Triton, przez 1 godz. w temperaturze pokojowej.

- Przepłukać komórki 3x 200 μl PBS/0,1% Triton przez 5 min.

- Rozpuścić 1 tabletkę OPD (Sigma) w 25 ml buforu (3,65 g kwas cytrynowy-H2O i 5,9 g Na₂HPO₄-2H₂O w 0,5 l H₂O, pH 5,6) i dodać 12,5 μl H₂O₂. Dodać 50 μl do każdej studzienki i inkubować przez 15 min w wytrząsarce (200 rpm), pod przykryciem z folii aluminiowej.

- Zatrzymać reakcję 25 μl H₂SO₄.

- Mierzyć OD490-650 na czytniku ELISA.

Hodowle dopaminergicznych neuronów śródmózgowiowych

Hodowla neuronów

Hodowle neuronów przygotowywano z brzusznego śródmózgowia płodu szczura za pomocą enzymatycznego i mechanicznego rozdrobnienia. Tkankę zbierano, przepłukiwano schłodzonym w lodzie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, wolnej od Ca²⁺ i Mg²⁺, zawierającym 0,6% glukozę (PBSG) i inkubowano przez 30 min w 37°C PBSG zawierającym 0,1% trypsynę. Zawiesinę komórek o gęstości 2,5 10⁵ komórek/cm² umieszczano w 96 studzienkowych płytkach NUNC do hodowli komórek. Przed tym, płytki hodowlane opłaszczano poli-L-ornityną i CDM zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej. Hodowle utrzymywano w chemicznie zdefiniowanej pożywce (CDM), składającej się z mieszaniny 1:1 pożywki Dulbecco's Modified Eagles i F12 Nutrient uzupełnionej glukozą (0,6%), glutaminą (2 mM), wodorowęglanem sodowym (3 mM), HEPES (5 mM), insuliną (25 μg/ml), ludzką transferyną (100 μg/ml), putrescyną (60 μg/ml), selenianem sodowym (30 nM), streptomycyną (100 μg/ml) oraz penicyliną (100 lU/ml).

Traktowanie czynnikami neurotroficznymi

Neurotrofiny rozpuszczano w 0,5% albuminy surowicy wołowej i stosowano jako roztwór podstawowy. Neurotrofiny dodawano 3 godz. po wstępnym wysianiu i 5 dniach w hodowli. Tę samą ilość 0,5% albummy surowicy wołowej dodawano do studzienek kontrolnych.

Pobieranie dopaminy o wysokim powinowactwie

Pobieranie dopaminy mierzono po 10 dniach. Do pobierania, komórki płukano dwukrotnie podgrzanym PBS uzupełnionym glukozą (5 mM), kwasem askorbinowym (100 mM) pargyliną (100 mM) i preinkubowano przez 10 min z tym samym roztworem. Roztwór do preinkubacji wymieniano na ten sam roztwór zawierający 50 nM [³H]DA i inkubacje kontynuowano przez 15 min w 37°C. Pobieranie zatrzymano 3 szybkimi płukaniami PBS schłodzonym w lodzie. Zgromadzoną [³H]-dopaminę uwalniano przez inkubację z zakwaszonym etanolem przez 30 min w temperaturze pokojowej. Radioaktywność określano po dodaniu 4 ml płynu scyntylacyjnego (Packard ultima gold MV) przy użyciu licznika scyntylacyjnego Packard. Niespecyficzne pobieranie określano poprzez dodanie 20 μM kokainy.

PL 209 952 B1

T a b e l a 4 Wpływ enowiny na pobieranie i [³H]-dopaminy

Traktowanie	Procent kontroli pobieranie [³H]-dopaminy	n
kontrola	100	5
enowina 300 ng/ml	111	4
enowina 1000 ng/ml	127	5
enowina 2000 ng/ml	152	5
enowina 4000 ng/ml	161	1
enowina 10000 ng/ml	165	2

Komórki hodowano przez 10 dni w obecności lub bez enowiny. Nietraktowane kontrole przyjęto jako 100%. Wyniki pochodzą z 1-5 niezależnych doświadczeń.

Literatura

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410.

Angrist, M., Bolk, S., Halushka, M., Lapchak, P.A. & Chakravarti, A. (1996) Germline mutations in glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF) and RET in a Hirschsprung disease patient. Nature Genetics 14, 341-344.

Baloh, R.H., Tansey, M.G., Golden, J.P., Creedon, D.J., Heuckeroth, R.O., Keck, C.L., Zimonjic,

D. B., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1997) TrnR2, a novel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Ret. Neuron 18, 793-802.

Baloh, R.H., Gorodinsky, A., Golden, J.P., Tansey, M.G., Keck, C.L., Popescu, N.C., Johnson,

E. M. & Milbrandt, J.(1998) GFRa3 is an orphan member of the GDNF/-neurturin/-persephin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,-5801-5806.

Barr, P.J. (1991) Mammalian subtilisins: the long-sought dibasic processing endoproteases. Cell. 66,1-3.

Beck, K.D., Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K., Moffat, B., Vandlen, RA., Rosenthal, A. & Hefti,

F. (1995) Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature 373, 339-341.

Bilang-Bleuel, A., Revah, F., Colin, P., Locquet, I., Robert J. J., Mallet, J. & Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cell-line-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,8818-8823.

Buj-Bello, A., Buchman, V.L., Horton, A., Rosenthal, A. & Davies A. M. (1995) GDNF is an agespecific survival factor for sensory and autonomic neurons. Neuron 15,821-828.

Buj-Bello, A., Adu, J., Pinón, L.G.P., Horton, A., Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V.L. & Davies, A.M. (1997) Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Ret receptor tyrosine kinase. Nature 387,-721-724.

Choi-Lundberg, D.L., Lin, Q., Chang, Y.N., Chiang, Y.L., Hay, CM., Mohajeri, H., Davidson, B.L. & Bohn, M.C. (1997) Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275,-838-841.

Creedon, D.J., Tansey, M.G., Baloh, R.H., Osborne, P.A., Lampe, P.A., Fahrner, T.J., Heuckeroth, R.O., Milbrandt, J. & Johnson, E. M. (1997) Neurturin shares receptors and signal transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023.

Durbec, P., Marcos-Gutierrez, C.V., Kilkenny, C, Grigoriou, M., Wartiowaara, K., Suvanto, P., Smith, D., Ponder, B., Costantini, F., Saarma, M., Sariola, H. & Pachnis, v. (1996) GDNF signalling through the RET receptor tyrosine kinase. Nature 381, 789-793.

Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L.M., Pelet, A., Dow, E., Abel L., Holder S., Nihoul-Fekete, C, Ponder, B.A. & Munnich, A. (1994) Mutations of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature 367, 378-380.

PL 209 952 B1

Gash, D.M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass, W.A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P.A., Collins, F., Hoffer, B. J. & Gerhardt, G.A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature 380, 252-255.

GFRa Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors for the GDNF ligand family. Neuron 19, 485.

Hakim A Ischemic penumbra: the therapeutic window. Neurology. 1998 Sep;-51-(3 Suppl 3):S44-6.

Henderson, C.E., Phillips, H.S., Pollock, R.A., Davies, A.M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, B., Vandlen, R.A., Koliatsos, V.E. & Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.

Heng, H.H.Q., Squire, J. & Tsui, L.-C. (1992) High resolution mapping of mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.

Heng, H.H.Q. & Tsui, L.-C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in situ hybridization. Chromosoma 102, 325-332.

Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Zimonjic, D.B., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a novel neurotrophic factor, is localized to mouse chromosomie 17 and humian chromosome 19p13.3. Genomics 44,-137-140.

Jing, S., Wen, D., Yu, Y., Holst, P.L., Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis, J.-C, Hu, S., Altrock, B.W. & Fox, G.M. (1996) GDNF-induced activation of the ret protein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-'', a novel receptor for GDNF. Cell 85, 1113-1124.

Jing, S., Yu, Y., Fang, M., Hu, Z., Holist, P.L., Boone, T., Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R. & Fox, G.M. (1997).

GFRa-2 and GFRa-3 are two new receptors for ligands of the GDNF family. J. Biol. Chem. 272,-33111-33117.

Kingsley, D.M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes & Development 8,-133-146.

Klein, R.D., Sherman, D., Ho, W.-H., Stone, D., Bennett, G.L., Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu, Q., Hongo, J.-A., Devaux, B., Poulsen, K., Armanini, M., Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips, H., Henderson, C.E., Takahashi, M. & Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interacts with Ret to form a candidate neurturin receptor. Nature 387, 717-721.

Kotzbauer, P.T., Lampe, P.A., Heuckeroth, R.O., Golden, J.P., Creedon, D.J., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1996) Neurturin, a relative of glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Nature 334, 467-470.

Lin, L.-F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S. & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell linederived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.

Mandel, R.J., Spratt, S.K., Snyder, R.O. & Leff, S.E. (1997) Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson's disease in rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,-14083-14088.

Marsden et al The causes of Parkinson's disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality. Ann Neurol. 1998 Sep;-44-(3 Suppl 1):-S189-96.

Masure, S., Cik, M., Pangalos, M.N., Bonaventure, P., Verhasselt, P., Lesage, A.S., Leysen, J.E. & Gordon R.D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial-cell-line-derived neurotrophic factor family receptor a-3 (GFRa-3). Eur. J. Blochem. 251,622-630.

Matsushita, N., Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, T. & Kiuchi, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203, 149-157.

Milbrandt, J., de Sauvage, F. J., Fahrner, T.J., Baloh, R.H., Leitner, M.L., Tansey, M.G., Lampe, P.A., Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P.T., Simburger, K.S., Golden, J.P., Davies, J.A., Vejsada, R., Kato, A.C., Hynes, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, L.C., Vandlen, R., Moffat, B., Klein, R.D., Poulsen, K., Gray, C, Garces, A., Henderson, C.E., Phillips, H.S. & Johnson, E.M. Jr. (1998) Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20,-245-253.

Moore, M.W., Klein, R.D., Farinas, I., Sauer, H., Armanini, M., Phillips, H., Reichardt, L.F., Ryan, A.M., Carver- Moore, K. & Rosenthal, A. (1996) Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. - Nature 382, 76-79.

PL 209 952 B1

Mount, H.T., Dean, D.O., Alberch, J., Dreyfus, C.F. & Black, I.B. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,-9092-9096.

Nagy Z et al The cell division cycle and the pathophysiology of Alzheimer's disease. Neuroscience. 1998 Dec;-87 (4):-731-9.

Naveilhan, P., Bandet, C, Mikaels, A., Shen, L., Westphal, H. & Ernfors, P. (1998) Expression and regulation of GFRa3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,-1295-1300.

Nuydens R, Dispersyn G, Van den Kieboom G, De Jong M, Connors R, Ramaekers F, Borgers M, Geerts H Bcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by inducing mutli-nucleation, submitted.

Oppenheim, R.W., Houenou, L.J., Johnson, J.E., Lin, L.F., Li, L., Lo, A.C., Newsome, A.L., Prevette, D.M. & Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nature 373,-344-346.

Pichel, J.G., Shen, L., Sheng, H.Z., Granholm, A.C., Drago, J., Grinberg, A., Lee, E.J., Huang, S.P., Saarma, M., Hoffer, B.J., Sariola, H. &Westphal, H.- (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 382, 73-76.

Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y., Barone, V., Seri, M., Ceccherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H. et al. (1994) Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature 367,-377378.

Sanchez, M.P., Silos-Santiago, I., Frisen, J., He, B., Lira, S.A. & Barbacid, M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature 382, 70-73.

Sanicola, M., Hession, C, Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C, Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, R.B. & Cate, R.L. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6238-6243.

Smirnova et al Thrombin is an extracellular signal that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons. J Neurobiol. 1998 Jul;-36-(1):-64-80.

Srinivisan et al Serum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complement-independent, calcium-dependent apoptosis in cultured neuronal cells. J Clin Invest. 1998 Oct 1;-102(7):-1454-62.

Steger C An unbiased detector of curvilinear structures IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence, 20, 2, 113-125 (1998).

Suvanto, P., Wartiovaara, K., Lindahl, M., Arumae, U., Moshnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N., Airaksinen, M.S., Palotie, A., Sariola, H. & Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localisation of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor'', a homologue to GDNFR'. Human Mol. Genet. 6, 1267-1273.

Tomac, A., Lindqvist, E., Lin, L.F., Ogren, S.O., Young, D., Hoffer, B.J. & Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo. Nature 373, 335-339.

Treanor, J.J.S., Goodman, L., de Sauvage, F., Stone, D.M., Poulsen, K.T., Beck, C.D., Gray, C, Armanini, M.P., Pollock, R.A., Hefti, F., Phillips, H.S., Goddard, A., Moore, M.W., Buj-Bello, A., Davies, A.M., Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R., Henderson, C.E. & Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nature 382, 80-83.

Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, A.S., Sieber, B. A., Grigoriou, M., Kilkenny, C, SalazarGrueso, E., Pachnis, V., Arumae, U., Sariola, H., Saarma, M. & Ibanez, C.F. (1996) Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Nature 381, 785-788.

Wellington et al Toward understanding the molecular pathology of Huntington's disease. Brain Pathol. 1997 Jul; 7-(3): 979-1002.

Widenfalk, J., Nosrat, C, Tomac, A., Westphal, H., Hoffer, B. & Olson, L. (1997) Neurturin and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor-'' (GDNFR-' ), novel proteins related to GDNF and GDNFR-'' with specific cellular patterns of expression suggesting roles in the developing and adult nervous system and in peripheral organs. J. Neurosci. 17,-8506-8519.

Widenfalk, J., Tomac, A., Lindqvist, E., Hoffer, B. & Olson, L. (1998) GFRa-3, a protein related to GFRa-1, is expressed in developing peripheral neurons and ensheathing cells. Eur. J. Neurosci. 10,-1508-1517.

PL 209 952 B1

Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y., Chao, H. H.-J., Seasholtz, A.F. & Dixon, J.E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RET receptor and activates nitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 271, 23619-23622.

Worby, C.A., Vega, Q.C., Chao, H.H.J., Seasholtz, A.E., Thompson, R.C. & Dixon J.E. (1998) Identification and characterization of GFRa-3, a novel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neurotrophic receptor family. J. Biol. Chem. 273, -3502-3508.

Yan, Q., Matheson, C. & Lopez, O.T. (1995) In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature 373,-341-344.

Lista skrótów

BLAST	podstawowe narzędzie do poszukiwania miejscowych przyrównań
pz	pary zasad
cDNA	komplementarny DNA
CNS	ośrodkowy układ nerwowy
EST	sekwencyjne znaczniki ekspresji
EVN	enowina
GDNF	linia komórek glejowych
GFRa	receptor α rodziny GDNF
GPI	glikozylo-fosfatydylo-inozytol
MTC	cDNA różnych tkanek
NTN	neurturyna
PCR	łańcuchowa reakcja polimerazy
PNS	obwodowy układ nerwowy
PSP	persefina
RT-PCR	PCR z odwrotną transkrypcją
TGF-β	transformujący czynnik wzrostu β
FISH	hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
MTN	Northern dla różnych tkanek
NGF	czynnik wzrostu komórek nerwowych
SPR	powierzchniowy rezonans plazmonowy

PL 209 952 B1

Lista sekwencji

<110>	Janssen Pharmaceutica N. V.
<120>	Neurotropowy czynnik wzrostu
<130>	50936/002
<140>	PCT/EP99/05031
<141>	1999-07-14
<150>	9815283.8
<151>	1998-07-14
<150>	09/248,772
<151>	1999-02-12
<150>	09/327,668
<151>	1999-06-08
<160>	15
<170>	Patentln wersja 2.0
<210>	1
<211>	339
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

PL 209 952 B1 <400> 1

gctgggggcc	cgggcagccg	cgctcgggca	gcgggggcgc	ggggctgccg	cctgcgctcg	60
cagctggtgc	cggtgcgcgc	gctcggcctg	ggccaccgct	ccgacgagct	ggtgcgtttc	120
cgcttctgca	gcggctcctg	ccgccgcgcg	cgctctccac	acgacctcag	cctggccagc	180
ctactgggcg	ccggggccct	gcgaccgccc	ccgggctccc	ggcccgtcag	ccagccctgc	240
tgccgaccca	cgcgctacga	agcggtctcc	ctcatggacg	tcaacagcac	ctggagaacc	300
gtggaccgcc	tctccgccac	cgcctgcggc	tgcctgggc			339
<:210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> Homo	s 3 ρ ί. θ n s
<400> 2
cgccgccgca	gccttctcgg	cccgcgcccc	cgccgcctgc	acccccatct	gctcttcccc	60
gcgggggccg	cgcggcgcgg	gctgggggcc	cgggcagccg	cgctcgggca	gcgggggcgc	120
ggggctgccg	cctgcgctcg	cagctggtgc	cggtgcgcgc	gctcggcctg	ggccaccgct	180
ccgacgagct	ggtgcgtttc	cgcttctgca	gcggctcctg	ccgccgcgcg	cgctctccac	240
acgacctcag	cctggccagc	ctactgggcg	ccggggccct	gcgaccgccc	ccgggctccc	30 0
ggcccgtcag	ccagccctgc	tgccgaccca	cgcgctacga	agcggtctcc	ttcatggacg	360
tcaacagcac	ctggagaacc	gtggaccgcc	tctccgccac	cgcctgcggc	tgcctgggct	420
gagggctcgc	tccagggctt	tgcagactgg	acccttaccg	gtggctcttc	ctgc	474

PL 209 952 B1 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45

Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys

70 75 30

Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser

90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110

Gly <210> 4 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 209 952 B1 <40C> 4

Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala Pro Prc Pro Pro Ala Pro Pro Ser 15 10 15

Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser 20 25 30

Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin Leu 35 40 45

Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val 50 55 60

Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His

70 75 80

Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro

90 95

Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr 100 105 110

Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp 115 120 125

Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 130 135 <210> 5 <211> 819 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagtttcccc tccacacagc taggagcoca tgcccggcct gatctcagcc cgaggacagc 60

PL 209 952 B1 ccctccttga ggtocttcot ccccaagccc acctgggtgc ectctttctc cctgaggctc 120 cacttggtct ctccgcgcag cctgccctgt ggcccaccct ggccgctctg gctctgctga 180 gcagcgtcgc agaggcctcc ctgggctccg cgccccgcag ccctgccccc cgcgaaggcc 240 ccccgcctgt cctggcgtcc cccgccggcc acctgccggg taggtgagag ggcgaggggg 300 ^CGGGG^CGOGG ctggcccggg acaccgcgcg tgactgggtc tcattccagg gggacgcacg 360' gcccgctggc gcagtggaag agcccggcgg ccgccgccgc agccttctcg gcccgcgccc 420 ccgccgcctg cacccccatc tgctcttccc cgcgggggcc gcgcggcgcg ggctgggggc 480 ccgggcagcc gcgctcgggc agcgggggcg cggggctgcc gcctgcgctc gcagctggtg 540 ccggtgcgcg cgctcggcct gggccaccgc tccgacgagc tggtgcgttt ccgcttctgc 600 agcggctcct gccgccgcgc gcgctctcca cacgacctca gcctggccag cctactgggc 660 gccggggccc tgcgaccgcc cccgggctcc cggcccgtca gccagccctg ctgcogaccc 720 acgcgctacg aagccgtctc cttcatggac gtcaacagca cctggagaac cgtggaccgc 780 ctstccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc tgagggctc 819 <210> 6 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gin Pro Leu Leu Glu Val Leu 15 10 15

Pro Pro Gin Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala Pro Leu

PL 209 952 B1

25 30

Gly Leu Ser Ala Gin Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala

40 45

Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser 50 55 60

Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly 65 70 75 80

His Leu Pro Gly Arg 85 <210 7 <210 159 <2I2> PRT <213> Homo sapiens <40 0 7

Leu Gly Leu Ile Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg 15 10 15

Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro 20 25 30

Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly 35 40 45

Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu 50 55 60

Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser

70 75 80

Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala

90 95

PL 209 952 B1

Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly A.la Gly Ala 10C 105 110

Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg 115 120 125

Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp 130 135 140

Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 145 150 155 <210> 8 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8

ctgatgggog	ctcctggtgt	tgatagagat	ggaaottgga	cttggaggcc	tctccacgct	60
gtcccactgc	ccctggccta	ggcggcaggt	gagtggttct	cccagtgact	cctacctggt	120
actgaggaaa	ggcggcttga	ctggtgaggg	agagcagggc	ttggcttggg	cagcggttag	180
gtgtgggagg	gaaaatggtc	agggagggac	caggtgaatg	ggaggaggag	cgggacttct	240
ctgaatggtc	ggtgcactca	ggtgattcct	cccctgggct	cccagaggca	gcaaacccat	300
tatactggaa	cctaggccct	tcctgagttc	ccoctccaca	cagctaggag	cccatgcccg	360
gcctgatctc	agcccgagga	cagcccctcc	ttgaggtcct	tcctccccaa	gcccacctgg	420
gtgccctctt	tctccctgag	gctccacttg	gtctctccgc	gcagcctgcc	otgtggccca	480
ccctggocgc	tctggctctg	ctgagcagcg	tcgcagaggc	otccctgggc	tccgcgcccc	54 0

PL 209 952 B1 gcagccctgc cccccgcgaa ggccccccgc ctgtcctggc gtcccccgcc ggccacctgc 600 cgggtaggtg agagggcgag ggggcggggc ggggctggcc cgggacaccg cgcgtgactg 660 ggtctcattc cagggggacg cacggcccgc tggtgcagtg gaagagcccg gcggccgccg 720 ccgcagcctt ctcggcccgc gcccccgccg cctgcacccc catctgccct tccccgcggg 780 ggccgcgcgg cgcgggctgg gggcccgggc agccgcgctc gggcagcggg ggcgcggggc 840 tgccgcctgc gctcgcagct ggtgccggtg cgcgcgctcg gcctgggcca ccgctccgac 900 gagctggtgc gtttccgctt ctgcagcggc tcctgccgcc gcgcgcgctc tccacacgac 960 ctcagcctgg ccagcctact gggcgccggg gccctgcgac cgcccccggg ctcccggccc 1020 gtcagccagc cctgctgccg acccacgcgc tacgaagcgg tctccttcat ggacgtcaac 1080 agcacctgga gaaccgtgga ccgcctctcc gccaccgcct gcggctgcct gggctgaggg 1140 ctcgctccag ggctttgcag actggaccct taccggtggc tcttcctg 1188 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 15 10 15

Pro Arg Arg Gin Ala Pro Leu Gly Leu Ser Ala Gin Pro Ala Leu Trp 20 25 30

Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser 35 40 45

PL 209 952 B1

Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro 50 55 60

Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg

70 75 80

Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Pro Pro Glu Pro Ser Arg Pro

90 95

Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg 100 105 110

Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala 115 120 125

Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly 130 135 140

Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Pue Cys Ser Gly

145 150 155 160

Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu

165 170 175

Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser 180 185 190

Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp 195 200 205

Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys 210 215 220

Gly Cys Leu Gly

225 <210> 10 <211> 220

PL 209 952 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 15 10 15

Pro Arg Arg Gin Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

25 30

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro 35 40 45

Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His 50 55 60

Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg

70 75 80

Pro Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro

90 95

Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 100 105 110

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin 115 120 125

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 130 135 140

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

145 150 155 160

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

165 170 175

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 180 135 190

PL 209 952 B1

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

195

200

35

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 210 215 <210> 11 <211> 766 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgatgggcg ctcctggtgt tgacagagat ggaacttgga gccccactgc ccctggccta ggcggcaggc tccacrtggt gtggcocacc ctggccgctc tggctctgct gagcagcgtc cgcgccccgc agccctgccc. cccgcgaagg ccccccgccL ccacctgccg gggggaccca cggcccgctg gtgcagtgga gcagccttct cggcccgcgc ccocgccgcc tgcaccccca ccgcgcggcg cgggctgggg gcocgggcag ccgcgctcgg ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc cacctggaga accgtggacc gcccctccgc caccgcctgc

Gly

220 cttggaggco ctctccgcgc gcagaggcct gtcotggcgt agagcecggc tctgctcttc gcagcggggg ctgggccacc gcgcgctctc cccccgggct tccttcatgg ggctgcctgg tccccacgct agcctgccct ccctgggctG cccccgccgg ggccgccgcc cccgcggggg cgcggggotg gctccgacga cacacgacct cccggcccgt acgtcaaeag gctgagggct

120

180

240

300

60

420

480

540

600

660

720

PL 209 952 B1

cgctccaggg	ctttgcagac	tggaccctta	ccggtggctc	ttcctg	7 66
<210> 12
<211> 742
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400 12
ctgatgggcg	ctcctggtgt	tgatagagat	ggaacttgga	cttggaggcc	tctccacgct	60
gtcccactgo	ccctggccta	ggcggcagcc	tgccctgtgg	cccaccctgg	ccgctctggc	120
tctgctgagc	agcgtcgcag	aggcctccct	gggctccgcg	ccccgcagcc	ctgccccccg	130
cgaaggcccc	ccgcctgtcc	tggcgt cccc	cgccggccac	ctgccggggg	gacgcacggc	240
ocgctggtgc	agtggaagag	cccggcggcc	gccgccgcag	ccttctcggc	ccgcgccccc	300
gccgcctgca	cccccatctg	ctcttccccg	cgggggccgc	gcggcccggg	ctgggggccc	360
gggcagccgc	gctcgggcag	cgggggcgcg	gggcagccgc	ctgcgctcgc	agccggtgcc	420
ggcgcgcgcg	ctcggcctgg	gccaccgctc	cgacgagctg	gtgcgtttcc	gctcctgcag	4 30
cggctcctgc	cgccgcgcgc	gctctccaca	cgacctcagc	ctggccagcc	taccgggcgc	540
cggggccctg	cgaccgcccc	cgggctcccg	gcccgtcagc	cagccctgct	gccgacccac	600
gcgctacgaa	gcggtctcct	tcatggacgt	caacagcacc	tggagaaccg	tggaccgcct	660
ctccgccacc	gcctgcggct	gcctgggctg	agggctcgct	ccaggccttt	gcagactgga	720
cccttaccgg	tggctcttcc	tg				742

<210 13 <210 603

PL 209 952 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13

ctgatgggcg	ctcctggtgt	tgatagagat	ggaacttgga	cttggaggcc	tctccacgct	60
gtcccactgc	ccctggccta	ggcggcaggg	ggacgcacgg	cccgctggtg	cagtggaaga	120
gcccggcggc	cgccgccgca	gccttctcgg	cccgcgcccc	cgccgcctgc	acccccatct	180
gctcttcccc	gcgggggccg	cgcggcgcgg	gctgggggcc	cgggcagccg	cgctcgggca	240
gcgggggcgc	ggggctgccg	cctgcgctcg	cagctggtgc	cggtgcgcgc	gctcggcctg	300
ggccaccgct	ccgacgagct	ggtgcgtttc	cgcttctgca	gcggctcctg	ccgccgcgcg	360
cgctctccac	acgacctcag	cctggccagc	ctactgggcg	ccggggccct	gcgaccgccc	420
ccgggctccc	ggcccgtcag	ccagccctgc	tgccgaccca	cgcgctacga	agcggtctcc	480
~tca tggacg	tcaacagcac	ctggagaacc	gtggaccgcc	tctccgccac	cgcctgcggc	540
tgcctgggct	gagggctcgc	tccagggctt	tgcagactgg	acccttaccg	gtggctcttc	600
ctg						603
<210> 14
<211> 439
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 14
ctgatgggcg	ctcctggtgt	tgatagagat	ggaacttgga	cttggaggcc.	tct ccacgct	60

PL 209 952 B1

gtcccactgc	ccctggccta	ggcggcagcc	tgccctgtgg	cccaccctgg	ccgctctggc	120
tctgctgagc	agcgtcgcag	aggcctccct	gggctccgcg	ccccgcaqcc	ctgccccccg	180
cgaaggcccc	ccgcctgtcc	tggcgtcccc	cgccggccac	ctgccggcgg	ctcctgccgc	240
cgcgcgcgct	ctccacacga	cctcagcctg	gccagcctac	tgggcgccgg	ggccctgcga	300
ccgcccccgg	gctcccggcc	cgtcagccag	ccctgctgcc	gacccacgcg	ctacgaagcg	360
gtctccttca	tggacgtcaa	cagcacctgg	agaaccgtgg	accgcctctc	cgccaccgcc	420
tgcggctgcc	tgggctgagg	gctcgctcca	gggctitgca	gactggaccc	ttaccggtgg	480
ctcttcctg						489
<210> 15
<211> 350
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 15
ctgatgggcg	ctcctggtgt	tgatagagat	ggaacttgga	cttggaggcc	tctccacgct	60
gtcccactgc	ccctggccta	ggcggcagcg	gctcctgccg	ccgcgcgcgc	tctccacacg	120
acctcagcct	ggccagccta	ctgggcgccg	gggccctgcg	accgcccccg	ggctcccggc	180
ccgtcagcca	gccctgctgc	cgacccacgc	gctacgaagc	ggtctccttc	atggacgtca	240
acagcacctg	gagaaccgtg	gaccgcctct	ccgccaccgc	ctgcggctgc	ctgggctgag	300
ggctcgctcc	agggctttgc	agactggacc	cttaccggtg	gctcttcctg		350

Claims

1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu określony jako enowina i posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę DNA.

3. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę cDNA.

4. Cząsteczka według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że posiada sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą sekwencji jednego z wariantów produktów splicingu przedstawionej na sekwencjach oznaczonych SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 albo 15.

5. Cząsteczka według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że posiada sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 2.

6. Wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, znamienny tym, że kodowany jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w jednym z zastrz. 1 do 3 i 5.

7. Wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową od pozycji 27 do 139 z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

8. Czynnik wzrostu według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

9. Wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, znamienny tym, że obejmuje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4.

10. Plazmid EVNmat/pRSETB zdeponowany w LMBP pod numerem dostępu LMBP 3931.

11. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA określoną w jednym z zastrz. 2 do 5.

12. Wektor ekspresyjny według zastrz. 11, znamienny tym, że ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę reporterową.

13. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana lub transfekowana wektorem określonym w zastrz. 12.

14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że stanowi komórkę eukariotyczną albo komórkę bakteryjną.

15. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej sekwencję wykazującą co najmniej 70% homologii aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

16. Cząsteczka kwasu nukleinowego określona w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako lek.

17. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w jednym z zastrz. 1 do 5 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

18. Zastosowanie neurotroficznego czynnika wzrostu wykazującego co najmniej 70% homologii aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji oznaczonej SEQ ID NO: 4 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

19. Neurotroficzny czynnik wzrostu określony w jednym z zastrz. 7 do 9 do zastosowania jako lek.

20. Zastosowanie neurotroficznego czynnika wzrostu określonego w jednym z zastrz. 7 do 9 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zespołów bólowych z zasadniczo obwodową lub ośrodkową komponentą neurogenną.

21. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w jednym z zastrz. 1 do 5 wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

22. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje czynnik wzrostu określony w jednym z zastrz. 7 do 9 wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

23. Przeciwciało, znamienne tym, że jest zdolne do wiązania czynnika wzrostu określonego w jednym z zastrz. 7 do 9, lub jego epitopu.

24. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje przeciwciało określone w zastrz. 23 wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

PL 209 952 B1

25. Sposób wykrywania w próbce obecności czynnika wzrostu określonego w jednym z zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję przeciwciała określonego w zastrz. 23 z próbką i wykrywa się wiązanie przeciwciała z tym czynnikiem wzrostu.

26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało sprzężone z cząsteczką reporterową.