JPH11513249A

JPH11513249A - プロテアーゼにより開裂可能なタンパク質を組込んだ組換えウイルス

Info

Publication number: JPH11513249A
Application number: JP9513224A
Authority: JP
Inventors: ラッセル，スティーブン・ジェームズ; コゼット，フランソワ−ロワ; モーリン，フランシス・ジョアン; ニルソン，ボゥ・ハンス・カート; ペン，カー−ファイ
Original assignee: メディカル・リサーチ・カウンシル
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1999-11-16
Also published as: AU716466B2; EP0854929A1; WO1997012048A1; CA2232669A1; AU7091196A

Abstract

(57)【要約】開示されるのは真核細胞に感染可能な組換えウイルス粒子であって、このウイルス粒子は、介在するリンカー領域を介してこの粒子の表面上に提示される異種のポリペプチドに融合された実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含み、この異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染するこのウイルス粒子の能力を調節し、かつ、リンカー領域に存在する特定のプロテアーゼ開裂部位に選択的に作用するプロテアーゼによってウイルス糖タンパク質から開裂可能である。ウイルス糖タンパク質からの異種のポリペプチドの開裂によって、糖タンパク質は標的細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用できるようになる。

Description

【発明の詳細な説明】名称：プロテアーゼにより開裂可能なタンパク質を組込んだ組換えウイルス発明の分野この発明は、プロテアーゼにより開裂可能なタンパク質を組込んだ組換えウイルス粒子および該組換え粒子のさまざまな応用に関する。レトロウイルスエンベロープレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質は、細胞表面受容体への特異的なウイルスの付着を媒介し、その結果ウイルスエンベロープと標的細胞膜との間の融合を引起こす。今日までに調べられたレトロウイルスエンベロープスパイク糖タンパク質はすべて、２つから４つのヘテロダイマーサブユニットを含有するホモオリゴマーである（Domsら、1993 Virology 193, 545）。各サブユニットは、そのＣ末端でより小さい膜貫通ポリペプチド（ＴＭ）に非共有結合的に付着する大きなウイルス外糖タンパク質成分（ＳＵ）を含み、膜貫通ポリペプチドはこの複合体をウイルス膜に固定する。ネズミＣ型レトロウイルスベクターの場合には、ＳＵはプロリンの豊富なヒンジによって接続される２つのドメインからなり、そのＮ末端ドメインは、受容体特異性を付与し、宿主域の異なる複数のネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）の間で高い保存度を示す（Battini ら、1992 J.Virol 66 , 1468-1475）。モロニーＭＬＶエンベロープは、マウスおよびラット起源の細胞でのみ見られるネズミカチオン性アミノ酸輸送体（ＣＡＴ−１）内のペプチドループに選択的に付着するので、同種指向性の宿主域を付与する（Albritton ら、1989 Cell 57, 659-666）。４０７０ＡＭＬＶエンベロープは、多数の哺乳動物種を通じて保存される、遍在性のＲＡＭ−１ホスフェート共輸送体におけるエピトープに付着し、両種指向性の宿主域を付与する（Millerら、PNAS 91, 78 -82；VanZeijlら、1994 PNAS 91, 1168-1172）。したがって、４０７０Ａエンベロープを有するレトロウイルスベクターは無差別にヒト細胞に感染する一方、モロニーエンベロープを有するベクターはヒト細胞に感染しない。タンパク質分解活性今日までに研究されたすべてのレトロウイルスにおいて、ＳＵおよびＴＭポリペプチドは、細胞表面への輸送の間にゴルジ区画におけるタンパク質分解性成熟を受ける一本鎖前駆体糖タンパク質から誘導される。開裂されていないエンベロープ前駆体糖タンパク質は、ウイルスに組込まれ得るが、膜融合を引起こすことはできない。タンパク質分解性成熟／活性を必要とすることは、多くのウイルス科の融合誘導膜糖タンパク質に共通した特徴であり、遍在するゴルジ区画セリンプロテアーゼ、フリン（furin）によって媒介されるのが最も一般的である。しかし、遍在する細胞間プロテアーゼによる開裂に対して耐性を示し、代わって、少数の宿主系においてのみ利用可能な、分泌されるプロテアーゼによって開裂されるウイルス膜糖タンパク質の十分に立証された例がある（KlenkおよびGarten, 1994 Trends Microbiol.2, 39）。さらに、ウイルスの侵入段階において赤血球凝集素が標的細胞プロテアーゼによって活性化される、インフルエンザウイルス株の少なくとも１つの例がある（Boycott ら、1994 Virology 203, 313）。これらの例においては、ウイルス膜糖タンパク質の結合反応はそのタンパク質分解性開裂によっては影響を受けず、膜融合を引起こすその能力のみが影響される。ＳＵのＮ末端伸長物としての非ウイルス性ポリペプチドの、レトロウイルスでの提示ＳＵ糖タンパク質の遺伝的にコードされた伸長物としてレトロウイルスベクターの表面で（糖）ポリペプチドの提示を可能にする一般的方法が開示されている（ＷＯ９４／０６９２０，メディカル・リサーチ・カウンシル）。ポリペプチドは（遺伝子工学によって）ＳＵ糖タンパク質のＮ末端部に融合され、その結果、ポリペプチドが移植されたエンベロープタンパク質は実質的に無傷のままであり、融合された非ウイルス性ポリペプチドリガンドはウイルス表面に提示される。今日までに、一本鎖抗体、細胞成長因子および免疫グロブリン結合ドメインを含む多数の異なったポリペプチドリガンド類をＭＬＶ系のレトロウイルスベクター上に提示するため、この方策が用いられてきた（ＷＯ９４／０６９２０，メディカル・リサーチ・カウンシル；ＷＯ９６／００２９４，メディカル・リサーチ・カウンシル；Cossetら、1994 Gene Therapy 1, S1 ；およびNilsonら、19 94 Gene Therapy 1, S17）。報告されてきた他のキメラのレトロウイルスエンベロープタンパク質（ＣＤ４キメラ、Kasaharaら、1994 Science266, 1373 ；Chu およびDornburg，1995 J.Virol.69, 2659 ；Somia ら、1995 PNAS 92, 7570）とは対照的に、Ｎ末端で伸長されたＳＵ糖タンパク質のウイルスへの組込みには、修飾されていないエンベロープ糖タンパク質の存在が必要とされない。原則として、このようなキメラエンベロープタンパク質を提示するウイルスは、（ＳＵのＮ末端ドメインを介して）その本来のウイルス受容体、および提示されるポリペプチドに対するコグネイト受容体の両者に多価的に付着できるであろう。これは上皮増殖因子（ＥＧＦ）を提示するレトロウイルスベクターについても当てはまることを我々は見出した。しかしながら、その厳密な性質、そのオリゴマー化する傾向およびそのＳＵ糖タンパク質への結合の態様によって、提示されるポリペプチドは、ＳＵのＮ末端ドメインと本来のウイルス受容体との間の相互作用に対して立体障害となり得る。Ｎ末端で伸長されたＳＵ糖タンパク質によるレトロウイルス親和性（向性）の変更ＭＬＶレトロウイルスベクター上で、それらの無傷のＳＵ糖タンパク質のＮ末端伸長物として、異なる受容体結合ドメインが提示されたとき、提示されるリガンドによって宿主域が拡大または制限され得るということが見出された（Cosset ら、1995 J.Virol．69，6314-6322）。かくして、宿主域の拡大の一例として、４０７０ＡＳＵからのＲＡＭ−１受容体結合ドメインを提示するネズミ同種指向性ベクターが、ＲＡＭ−１−陽性ヒト細胞に結合しかつこれに感染することができた。対照的に、宿主域の制限の一例として、ＥＧＦを提示する同種指向性および両種指向性ベクターはＥＧＦ受容体に結合できたが、その後非感染性の侵入経路に隔離され、ＥＧＦ受容体陽性細胞では力価が大幅に減じられる一方、ＥＧＦ受容体陰性細胞では正常な力価が示された。ＥＧＦ受容体陰性細胞は設計されたレトロウイルスベクターに十分に感染可能であったが、それらがＥＧＦ受容体を発現するよう遺伝的に修飾されたときは感染性の減少を示した。感染性の減少は、ＥＧＦ受容体発現のレベルに比例した。さらに、ＥＧＦ受容体によるウイルスの捕獲を競合的に阻害するため可溶性のＥＧＦを添加したときは、遺伝子導入が回復した。この後の例において、設計されたベクターは、本来のウイルス受容体またはＥＧＦに対する受容体に結合することができる。本来のウイルス受容体への付着によって標的細胞の感染が起こる一方、ＥＧＦ受容体への付着によっては標的細胞の感染は起こらない。標的細胞が両種の受容体を発現する場合には、２つの結合反応（ＲＡＭ−１への４０７０Ａエンベロープタンパク質の結合反応およびＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合反応）は競合して進行し、そして標的細胞に対するウイルスの感染力は、ＥＧＦ−ＥＧＦ受容体結合反応がＲＡＭ−１からウイルスを遠ざけるべく競合する効率に比例して減じられる。このメカニズムによって遺伝子導入が阻害され得る度合は、２つの結合反応（本来の受容体へのエンベロープタンパク質の結合反応およびそのコグネイト受容体への非ウイルス性リガンドの結合反応）の相対的アフィニティ、標的細胞表面上の２つの受容体の相対密度、およびウイルス表面上の非ウイルス性リガンドと無傷のエンベロープタンパク質との相対密度に依存する。加えて、遺伝子導入の阻害は、非ウイルス性リガンドに対する受容体の固有の特性、たとえば該受容体が標的細胞膜から突出する距離、標的細胞膜内でのその移動性、およびリガンド結合後の細胞表面でのその半減期などに影響される。ＳＵのＮ末端ドメインと本来のウイルス受容体との間での相互作用に対する立体障害によって別のメカニズムが提供され、これによって、ＳＵのＮ末端伸長物として提示されるポリペプチドはレトロウイルスの宿主域を制限できる。たとえば、４０７０ＡＭＬＶＳＵからのＮ末端ドメインをモロニーＭＬＶＳＵのＮ末端伸長物として提示するキメラエンベロープは明らかに、ＲＡＭ−１（４０７０ＡＳＵに対する受容体）に結合できるが、ｅｃｏＲ（モロニーＳＵに対する受容体）には結合できない。４０７０ＡＳＵからの提示されるドメインがモロニーＳＵ三量体の上に三量体のキャップを形成し、その受容体結合部位を完全に覆うこともあり得よう。もしこのモデルが正しいのであれば、無傷の４０７０ＡＳＵ糖タンパク質の受容体結合部位（これを通じてウイルスはヒト細胞に付着する）が、モロニーＭＬＶＳＵのＮ末端ドメインなどの、ヒト細胞に結合しない提示ポリペプチドによってマスクされている、キメラエンベロープを生成させることも可能なはずである。開裂可能ドメインのファージでの提示ポリペプチドリガンドをエンベロープ糖タンパク質のＮ末端伸長物として提示するレトロウイルスベクターと、遺伝子IIIタンパク質のＮ末端伸長物としてポリペプチドリガンドを提示する繊維状バクテリオファージとの間にはある種の類似性がある。開裂可能な結合ドメインを提示する繊維状「基質ファージ」のライブラリが、最近、既知のプロテアーゼに対する最適の基質を同定するため使用された（MatthewsおよびWells，1993 Science 260, 1113 ；Matthewsら、1994 Prote in Science3, 1197 ；Smith ら、1995 J.Biol.Chem．270, 6440）。しかし、繊維状ファージは本来哺乳動物細胞には感染せず、遺伝子IIIタンパク質に融合された開裂可能なドメインがそれを提示するファージの親和性（向性）に影響し得るということは立証されていない。発明の概要第１の局面において、この発明は、真核細胞に感染可能な組換えウイルス粒子を提供し、このウイルス粒子は、介在するリンカー領域を介して、この粒子の表面に提示される異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含む。この異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染するこのウイルス粒子の能力を調節するものであり、かつ、このリンカー領域に存在する特定のプロテアーゼ開裂部位に対して選択的に作用するプロテアーゼによってウイルス糖タンパク質から開裂可能なものである。そして、ウイルス糖タンパク質からのこの異種のポリペプチドの開裂によって、糖タンパク質は標的細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用できるようになる。このような粒子は、たとえば遺伝子治療のために必要とされるように、粒子内に存在し得る核酸配列を特定の所望する標的細胞に配達することの標的化において極めて有益である。他の局面において、この発明は核酸構造物を提供し、この核酸構造物は融合タンパク質をコードする配列を含む。この融合物は、介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含み、そこにおいて、融合タンパク質は、真核細胞に感染可能なウイルス粒子に組込まれ得、さらに、この異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染するこのウイルス粒子の能力を調節する一方、融合タンパク質からのこの異種のポリペプチドの開裂によって、ウイルス糖タンパク質は真核細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用できるようになる。さらなる局面において、この発明は、上に規定した複数の核酸構造物を含む核酸配列ライブラリを提供し、そこにおいて、介在するリンカー領域をコードする配列の少なくとも一部は各構造物中でランダム化され、それにより、各構造物は、ライブラリに集められた複数の異なるリンカー領域の１つを含む。この発明は上に規定したウイルス粒子のライブラリも提供し、各粒子は上に規定した核酸ライブラリからの単一の核酸構造物を含む。ここで使用する際に「実質的に無傷」という用語は、翻訳後プロセシング、オリゴマー化（もしあれば）、ウイルス組込および融合誘導特性を保つようにそのドメインをすべて保持しているウイルス糖タンパク質を指すことを意図している。しかし、これらの機能に大きな影響を与えることなく、ある種の変更（たとえば点突然変異、欠失、付加）を糖タンパク質に加えることができ、この発明の目的において、このような小さな変更を含む糖タンパク質は実質的に無傷であると見なされる。特定的には、特にＮ末端において、糖タンパク質はいくつかの（たとえば１から１０程度の）アミノ酸残基を欠いていてもよいが、その点を除いては野生型のタンパク質とほぼ一般的に同じ大きさであり、野生型のタンパク質と実質的に同じ生物学的特性を有する。介在するリンカー領域はかなり短いことが好ましいであろうし、典型的には４から３０のアミノ酸残基を含み、より典型的には５から１０の残基を含むであろう。異種のポリペプチドによる感染の調節を最大化する傾向のため、短いリンカーが好ましい。ある具体例において、適当なリンカー領域は、異種の提示されるポリペプチドの本来の部分として存在し得る。ウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染可能な任意のウイルスであってもよいが、アデノウイルスまたはレトロウイルス（特にＣ型のレトロウイルス）などの、遺伝子治療での使用に適したウイルス粒子であることが好都合であろう。ウイルス糖タンパク質はウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むことが典型的であろうが、異なるウイルス糖タンパク質に対応する配列を含むが全体として実質的に無傷の機能的タンパク質を構成するキメラのポリペプチドであってもよい。異種のポリペプチドは、短いアミノ酸配列（特にロイシンジッパーペプチド配列のように配列がオリゴマー化されるならば、１０から２０残基程度のペプチドなど）であってもよいが、３０またはそれ以上のアミノ酸残基からなることがより典型的であろう。必須というわけではないが一般にポリペプチドは機能的結合ドメインを含むであろう。リンカー領域を介してウイルス糖タンパク質に融合されるとき、異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染するウイルス粒子の能力を調節する。特定的には、異種のポリペプチドの存在は、ウイルス糖タンパク質により媒介される真核標的細胞の感染プロセスを阻害する役割を担う。「異種の」という用語は、本来融合されておらず、またさもなくばウイルス糖タンパク質に結合されていない任意のポリペプチドを指すことを意図している。異種のポリペプチドは、標的細胞の表面成分に対し特異的な結合アフィニティを有してもよいしまた有さなくてもよい。一具体例において、異種のポリペプチドはある細胞表面成分に対してアフィニティを有し、それへの結合がウイルスによる細胞の感染を誘導しないようなものである。この一般的な具体例において（各々が異なった特性を有する）さまざまな異なった例が考えられる。一例において、真核細胞は、ウイルス糖タンパク質に対する受容体（これに結合するとウイルスは細胞に感染できる）および異種のポリペプチドに対する非許容性受容体を発現し、ここで感染の阻害は、単に、標的細胞上のそれぞれの受容体に結合しようとするウイルス糖タンパク質と異種のポリペプチドとの間での競合によってもたらされる。異なる例において、それぞれの受容体およびそれらのリガンドの立体配座は、異種のポリペプチドのその受容体への結合が立体障害を起こすようなものであり、それにより、ウイルス糖タンパク質のその受容体への結合またはウイルスと細胞の融合が遮断される。第２の具体例において、異種のポリペプチドは、標的細胞上の非許容性受容体に結合しない一方、異種のポリペプチドの存在が、ウイルス糖タンパク質のその受容体への結合を妨げるのに十分な立体障害を生み出す役割を果たすか、または、結合を生じさせ得る一方で続いて起こるウイルス粒子の標的細胞との融合を阻害し、その結果、結合および／または融合段階においてウイルス粒子による細胞の感染が阻害される。特定の具体例において、異種のポリペプチドは、ウイルス粒子の表面に提示されるとき、オリゴマーを形成できる。典型的には、オリゴマーは二量体であるかまたはより好ましくは三量体であろう。このようなオリゴマー化によって、実質的に無傷のウイルス糖タンパク質とその受容体との間での相互作用の効率的な阻害が可能になり得、この阻害は、オリゴマー化された異種のポリペプチドのウイルス糖タンパク質からのタンパク質分解性開裂によって取除くことができる。介在するリンカーもオリゴマー化を受けてもよい。ウイルス糖タンパク質自体がオリゴマーを形成できる場合（たとえばレトロウイルスｅｎｖタンパク質の場合）には、ウイルス糖タンパク質の化学量論と同じ化学量論で異種のポリペプチドがオリゴマー化することが好ましい。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は両者とも、オリゴマー化し細胞表面リガンドに対し高いアフィニティを有することが知られているタンパク質である。これらのタンパク質の有効（オリゴマー形成および好ましくはリガンド結合）部分は、この発明により異種のポリペプチドとして使用するのに特に適しているであろう。この発明において、異種のポリペプチドは、プロテアーゼ開裂部位においてリンカー領域を開裂させるプロテアーゼ（すなわちペプチド結合を開裂させることができる分子）の選択的作用によりウイルス糖タンパク質から開裂させることができる。この開裂部位は、類似する部位が異種のポリペプチド中に存在してもよいが（異種のポリペプチドへのタンパク質分解性攻撃がその機能に悪影響を与えるかもしれないので、これは通常避けることが好ましい）、ウイルス糖タンパク質中に存在しないか、またはウイルス糖タンパク質において少なくともプロテアーゼに接近できない特有のペプチド配列に相当する。リンカー領域におけるプロテアーゼ開裂部位の大きさおよび数は有利に変更することができる。たとえば、同一のまたはそれぞれのプロテアーゼにより認識される２つまたはそれ以上の開裂部位が存在すると開裂が促進され得るが、一方、１つの長い開裂部位を使用すると開裂の特異性が増強される傾向になるだろう。多数の具体的なプロテアーゼおよびそれらが認識する開裂部位が当業者には周知である（たとえはVassalliおよびPepper，1994 Nature 370，14-15およびその参照文献を参照）。プロテアーゼは、組織の再構築、創傷の治癒、炎症および腫瘍の浸潤などの多くの生理的および／または病理学的過程に関係し、このようなプロテアーゼはこの発明において有用であろう。有用であろうプロテアーゼの具体的な種類は、（プラスミノーゲン／プラスミン酵素などの）セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよび（ゼラチナーゼＡおよび膜型ＭＭＰ（またはＭＴ−ＭＭＰ）などの）さまざまなタイプのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を含む。ウイルス糖タンパク質から異種のポリペプチドを開裂させる役割を果たすプロテアーゼは、ウイルス粒子を標的とすることが所望される細胞によってまたは少なくともその標的細胞が位置付けられている組織のみによって選択的に分泌されることが好ましい。プロテアーゼは、標的細胞型の細胞によって分泌されることが好ましく、また、それよりも好ましくはないが、標的細胞を含む組織から離れた（標的細胞以外の）細胞にのみよって分泌されることが好ましい。これによってさらに特異性の度合が高められるが、このことは標的化された遺伝子デリバリーのために粒子が使用されるときに望ましい。したがって、この発明は２段階の標的化を可能にし、そこにおいて、（標的細胞の表面上のリガンドに対し特異的なアフィニティを有するものなどの）異種のポリペプチドにより第１レベルの特異性を課すことができ、そして、標的細胞によって分泌されるかまたは標的細胞と同じ組織において分泌されるプロテアーゼによる異種のポリペプチドの選択的な開裂により、第２のレベルの特異性を課すことができる。代わりに、関連するプロテアーゼを外来的に添加してもよく、たとえばもしウイルス粒子が患者での標的化された遺伝子デリバリーのために使用されるならば、標的細胞が位置する組織にプロテアーゼを（たとえば注射によって）投与することができる。プロテアーゼ開裂部位の関連するプロテアーゼ（すなわち部位を認識し開裂するもの）に対する接近（アクセス）能力もさまざまであり得る。（たとえば５アミノ酸残基の）短い介在リンカー領域を使用すると開裂部位の接近能力は制限される傾向にあり、（たとえば１５から２０残基の）より大きなリンカー領域を使用すると開裂部位の接近能力は増加する傾向にあるということを本発明者は見出した。この現象はおそらく、ウイルス糖タンパク質および／または異種のポリペプチドの近接による開裂部位の立体障害によるものである。したがって、異種のポリペプチドの大きさを変えることによって開裂部位の接近能力を望むように変更することも可能なはずである。ある具体例において、開裂部位は、ウイルス粒子が真核細胞に結合される前に、関連するプロテアーゼに接近できる。一方、他の具体例において開裂部位は、ウイルス粒子が真核細胞に結合するまで、プロテアーゼに接近できない。この後者の具体例において、開裂部位は、異種のポリペプチドがそのコグネイト受容体に結合する結果生じる立体配座の変化により、接近可能になることができる。代わりに、ウイルス糖タンパク質がそのコグネイト受容体に結合することで開裂部位を接近可能にすることもでき、そうすると、異種のポリペプチドの開裂によりウイルス粒子の標的真核細胞への融合が可能になる。上に示したように、他の局面において、この発明は、非標的細胞に混じって存在する標的真核細胞へ核酸を選択的に配達する方法を提供する。この方法は、真核細胞に感染可能な組換えウイルス粒子を標的細胞および非標的細胞に投与することを含む。この粒子は、配達されるべき核酸と、介在するリンカー領域を介して粒子の表面に提示される異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含む融合タンパク質とを含み、この異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染するこの粒子の能力を調節し、かつ、リンカー領域に存在する特定のプロテアーゼ開裂部位に選択的に作用するプロテアーゼによって糖タンパク質から開裂可能であり、それにより、糖タンパク質からの異種のポリペプチドの開裂は、標的細胞の近くでまたは標的細胞で優先的に起こり、かつ、ウイルス糖タンパク質が標的細胞の表面においてそのコグネイト受容体と正常に相互作用するのを可能にする。この方法はたとえば、組織培養の線維芽細胞に致死核酸を配達することをインピトロで行なうことができ、その細胞は、培養において増殖のより遅いより分化した細胞型よりもしばしば早く増殖する。代わりに、この方法は、遺伝子治療の方法として、インビボで、または後にヒトもしくは動物の対象に再導入される細胞についてエクスビボで行なうことができる。ウイルス粒子が標的細胞に結合されるときにのみ、またはウイルス粒子が標的細胞に隣接しかくして標的細胞により分泌されるプロテアーゼにさらされるときにのみ、プロテアーゼ開裂部位の優先的な開裂が起こり得る。プロテアーゼの十分な濃度を確保するため、かつ、（プロテアーゼの局所的投与によって）配達の特異性をさらに補助するため、ウイルス粒子の投与後に、関連するプロテアーゼを外因的に添加することがより好ましい。（心筋梗塞の患者に与えられる、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびｔＰＡなどの酵素などの）いくつかのプロテアーゼはインビボで安全に与え得ることが既に知られている。さらなる局面において、この発明は、プロテアーゼにより開裂できる、または開裂できないアミノ酸配列をコードする核酸配列に関して核酸配列をスクリーニングする方法も提供する。既に述べたように、多くのウイルスエンベロープ糖タンパク質は、真核細胞において合成され、真核細胞の細胞輸出経路を通じて処理され、通常開裂に至るが、この開裂は感染性ウイルス粒子の生産には必須である。したがってこの発明は、真核細胞の輸出経路に存在するプロテアーゼによって開裂できるまたは開裂できないアミノ酸配列をコードする核酸配列について、核酸配列をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、真核細胞において複数の核酸配列を発現させることを含む。各配列は、ランダム化された介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質をコードする。この異種のポリペプチドの存在は、ウイルス糖タンパク質とそのコグネイト受容体との（結合または融合）相互作用を阻害する働きをし、そこにおいて、各核酸配列はウイルス組込を可能にするパッケージングシグナルをさらに含み、それにより、真核細胞の輸出経路に存在するプロテアーゼにより認識されるこれらの介在するリンカーが、異種のポリペプチドのウイルス糖タンパク質からの開裂を可能にし、結果として感染性ウイルス粒子の生産がもたらされる。この方法はさらに、このような開裂可能なリンカー領域の発現を誘導する核酸配列を、感染した細胞から回収することを含む。輸出プロテアーゼにより認識されるこれらのアミノ酸配列をつきとめるため、必要に応じて核酸配列決定を行なってもよい。上述の方法の修正によって、真核細胞輸入経路に存在するプロテアーゼによって開裂できるまたは開裂できないアミノ酸配列をコードする核酸配列について核酸配列のスクリーニングが可能になるであろう。上に説明したように、いくつかの具体例においては、異種のポリペプチドの存在下、ウイルス糖タンパク質のそのコグネイト受容体への結合がなお可能ではあるが、ウイルス粒子とそれが結合する真核細胞との融合は妨げられるであろう。そして、細胞輸入経路中のプロテアーゼによる異種のポリペプチドの開裂により細胞の感染が可能になるであろう。かくして、さらなる局面において、この発明は、プロテアーゼによって開裂できるまたは開裂できないアミノ酸配列をコードする核酸配列について核酸配列をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、真核細胞において複数の核酸配列を発現させることを含む。各配列は、ランダム化された介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質をコードし、この異種のポリペプチドの存在は、ウイルス粒子が結合された真核細胞とウイルス粒子との融合を阻害する働きをし、そこにおいて、各核酸配列はウイルス組込を可能にするパッケージングシグナルをさらに含む。この方法はまた、異種のポリペプチドを保持する（したがって非感染性である）ように生産されたウイルス粒子を濃縮することと、濃縮された粒子を、プロテアーゼを含む感染可能な真核細胞と接触させるかまたは濃縮された粒子をプロテアーゼの存在下で感染可能な真核細胞と接触させることとを含み、その結果、プロテアーゼにより認識されるこれらの介在リンカーのためにウイルス糖タンパク質からの異種のポリペプチドの開裂が可能となり、真核細胞の生産的感染が起こる。この方法はさらに、このような開裂可能なリンカー領域の発現を誘導する核酸配列を、感染した細胞から回収することを含む。上述のように、相当するアミノ酸配列をつきとめることを可能にするため、必要に応じて核酸配列決定を行なってもよい。粒子の合成の間に、輸出経路のプロテアーゼによって異種のポリペプチドがウイルス糖タンパク質から開裂され得る可能性があるので、濃縮ステップが必要とされる。本開示をもって、多くの可能な濃縮技術が当業者には容易に明らかであろう。たとえば、感染可能な細胞を感染させる前に、ウイルス粒子をアフィニティ濃縮技術に供することができ、抗体が異種のポリペプチドに対してアフィニティを有する抗体アフィニティカラムに該粒子を通すことができよう。異種のポリペプチドを保持する粒子はカラムに結合する一方、プロデューサ細胞からの輸出の間に異種のポリペプチドが開裂された粒子はカラムをそのまま通過するであろう。洗浄後、結合した粒子は（たとえば遊離の異種のポリペプチドまたは抗体により認識されるその一部との競合によって、またはｐＨもしくは他の要素の変化によって）溶出させることができ、次いで感染可能な「指示」細胞に感染させるため使用することができる。この発明は、例示の実施例により、および添付の図面を参照して以下にさらに説明される。図１は、キメラのエンベロープをコードするレトロウイルスベクター構造物の模式図である。図２および図３は、あるキメラポリペプチドのウイルス組込およびそれらのファクターＸａプロテアーゼに対する感度を示すウエスタンブロットの写真である。図４は、Ｘ−ｇａｌ含有プレートにおけるアッセイによって判定された、ファクターＸａ処理を施されたまたは施されていない標的細胞についてさまざまなβ −ガラクトシダーゼ形質導入ウイルスの感染力を示す写真である。図５は、この発明を用いて２段階の遺伝子配達標的化が達成され得る様子を示す摸式図である。図６Ａは、あるキメラポリペプチドのウイルス組込およびそれらのファクターＸａプロテアーゼに対する感度を示すウエスタンブロットの写真である。図６Ｂは、ファクターＸａ存在下でのまたは不在下でのある組換えウイルスの感染力を示す捧グラフである。図７は、キメラのエンベロープをコードするレトロウイルスベクター構造物の模式図である。図８Ａは、２つのウエスタンブロットの写真であり、上部はさまざまなキメラポリペプチドの電気泳動移動度を比較し、下部は存在するタンパク質の量を比較する。図８Ｂは、さまざまなキメラポリペプチドの、ファクターＸａプロテアーゼに対する感度を比較するウエスタンブロットの写真である。図８Ｃは、あるキメラポリペプチドのプロセシングを比較するウエスタンブロットの写真である。図９は、ファクターＸａ処理が施されたまたは施されていない、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ４３１細胞についての組換えウイルスの増殖を比較する一連の写真である。図１０は、キメラのエンベロープをコードするレトロウイルスベクター構造物の模式図である。図１１は、ファクターＸａプロテアーゼの不在（−）下でのまたは存在（＋）下での、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＡ４３１細胞におけるさまざまな組換えウイルスの（酵素形成単位「ｅ．ｆ．ｕ．」での）力価を示す３つの表Ａ、ＢおよびＣを示す。図１２は、キメラのエンベロープをコードするレトロウイルスベクター構造物の模式図である。図１３Ａは、さまざまなキメラポリペプチドのウイルス組込を示すウエスタンブロットの写真である。図１３Ｂは、ｐ−アミノフェニル水銀（ＩＩ）アセテート（ＡＰＭＡ）によりプロテアーゼが予備−活性化されている（＋）またはされていない（−）、プロ −ゼラチナーゼＡの存在（＋）下または不在（−）下での、さまざまなキメラポリペプチドの感度を比較するウエスタンブロットの写真である。図１４は、プロ−ゼラチナーゼＡの濃度に対してどのように組換えウイルスの感染力が依存するかを示す棒グラフである。図１５は、ＨＴ１０８０細胞またはＡ４３１細胞について３つの異なった組換えウイルスの感染力を比較する棒グラフである。図１５Ａは、ＨＴ１０８０細胞またはＡ４３１細胞上の組換えウイルスの増殖を比較する写真である。図１６は、ＨＴ１０８０（Ｈ）細胞またはＡ４３１（Ａ）細胞についてさまざまなウイルスの感染力を比較する４つの写真（Ｉ、II、IIIおよびIV）である。図１７は、ゼラチン分解活性の検出のためのゲルの写真である。図１８および図１９は、キメラのエンベロープをコードするレトロウイルスベクター構造物の模式図である。実施例実施例１概要親和性（向性）変更結合ドメインを、ファクターＸａ開裂性リンカーを介してネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープに固定し、その親和性（向性）をファクターＸａプロテアーゼにより調節できるレトロウイルスベクターを生成させた。リンカーがモロニーＭＬＶＳＵのアミノ酸＋７と融合されたときには、結合ドメインはファクターＸａによってベクター粒子から開裂させることができなかったが、モロニーまたは４０７０ＡＭＬＶＳＵ糖タンパク質のアミノ酸＋１と融合されたときには、効率的に開裂させることができた。開裂可能なＥＧＦドメインを提示するベクターはＥＧＦ受容体発現細胞において選択的に隔離されたが、ＥＧＦドメインがファクターＸａによってベクター粒子から開裂されたときには、それらの感染力は十分に回復した。エンベロープタンパク質のフラクションのみが開裂されたときには、感染力の部分的回復が観察された。一方、モロニーＭＬＶＳＵに融合される開裂可能なＲＡＭ−１結合ドメインを提示するベクターは宿主域が拡大され、その宿主域はファクターＸａでの処理により戻ることが可能であった。特定のプロテアーゼへの暴露により親和性（向性）が調節される、設計された結合特性を有するレトロウイルスベクターによって、レトロウイルス遺伝子配達を目標にする上で新規な戦略が容易になり得ることが示唆される。序説、結果および考察ＭＬＶから誘導されるレトロウイルスベクターは用途の広い遺伝子配達媒体であって、その宿主域は異なったエンベロープスパイク糖タンパク質の組込みによって変化させることができる（Miller，1992 Curr．Top．Microbiol．Immunol． 158，1；VileおよびRussell 、1995 British Medical Bulletin．51，12 ；Weis s，in Retroviridae，J．Levy，Ed．(Plenum Press，1993)，pp.1-108）。レトロウイルスエンベロープスパイク糖タンパク質は、標的細胞表面上の特定の受容体へのウイルスの付着を媒介し、続いてウイルスの脂質膜と宿主細胞との間の融合を引起こす。ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープスパイク糖タンパク質はホモ三量体であって、その中の３つのヘテロダイマーサブユニットは各々、そのＣ末端でより小さい膜貫通ポリペプチド（ＴＭ）に付着する大きなウイルス外糖タンパク質成分（ＳＵ）を含み、ＴＭはこの複合体をウイルス膜に固定させる（Augustら、1974 Virology 60，595 ；Ikeda ら、1975 J．Virol.16，53 ；Kamps ら、1991 Virology 184，687）。ＳＵはプロリンの豊富なヒンジによって接続される２つのドメインからなり、Ｎ末端ドメインは、受容体特異性を付与し、宿主域の異なるＭＬＶ間で高い保存度を示す（Battini ら、1992 J．Viro l．66，1468 ；Morganら、1993 J．Virol．67，4712 ；Battini ら、1995 J．Vi rol．69，713）。モロニーＭＬＶエンベロープは、マウスおよびラット起源の細胞にのみ見られるネズミカチオン性アミノ酸輸送体（ＣＡＴ−１）中のペプチドループに選択的に付着するので、同種指向性宿主域を付与する（Albritton ら、 1989 Cell 57，659 ；Albritton ら、1993 J．Virol．67，2091）。４０７０ＡＭＬＶエンベロープは、多くの哺乳動物種を通じて保存される遍在性のＲＡＭ −１ホスフェート共輸送体上のエピトープに付着し、両種指向性宿主域を付与する（Millerら、1994 Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91，78 ；VanZeijlら、19 94 Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91，1168 ；Kavanaugh ら、1994 Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A．91，7071）。したがって、４０７０Ａエンベロープを有するレトロウイルスベクターは無差別にヒト細胞に感染する一方、モロニーエンベロープを有するベクターは全くヒト細胞に感染しない。レトロウイルスベクターのエンベロープ糖タンパク質中に新たな結合ドメインを作ることにより、細胞選択性レトロウイルス遺伝子配達が最近達成された（Va lsesia-Wittmann ら、1994 J．Virol．68，4609 ；Kasaharaら、1994 Science 2 66，1373；Chu およびDornburg、1995 J．Virol．69，2659 ；Nikunjら、1995 P roc．Natl．Acad．Sci．USA 92，7570；Cossetら、1995 J．Virol．69，6314）。異なった受容体結合ドメインが、ＭＬＶレトロウイルスベクター上でそれらの無傷のＳＵ糖タンパク質のＮ末端伸長物として提示されたとき（Russell ら、19 93 Nucl．Aclds．Res．21，1081）、提示されるリガンドによって宿主域が拡大または制限され得ることが見出された（Cossetら、1995 J．Virol．69，6314）。したがって、４０７０ＡＳＵからのＲＡＭ−１受容体結合ドメインを提示する同種指向性ベクターはＲＡＭ−１−陽性ヒト細胞に感染できたが、一方、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を提示する両種指向性ベクターはＥＧＦ受容体に結合できたもののその後非感染性の侵入経路に隔離され、ＥＧＦ受容体陽性細胞での力価は大幅に減じられたが、ＥＧＦ受容体陰性細胞上では正常な力価がもたらされた。現在の研究において、我々は、その設計された親和性（向性）を特定のプロテアーゼによって調節できるレトロウイルスベクターの生成の可能性を探った。最初に、我々は、３つのアラニンを含有する短いリンカーによってＥＧＦドメインがモロニーＭＬＶＳＵのアミノ酸＋７に融合された、上述のＥＧＦ−ＭＬＶエンベロープキメラ（ＥＭｏ７）に、短いファクターＸａプロテアーゼに敏感なリンカー（アミノ酸配列ＩＥＧＲ）（Lottenbergら、1981 Methods Enzymol． 80，341）を挿入した。アラニンリンカーとモロニーＳＵのアミノ酸＋７との間にＸａ開裂シグナルが挿入され、以下に説明し図１に示す構造物ＥＸＭｏ７が得られた。図１には、すべての構造物の一般的フォーマットが模式的に示されており、提示されるリガンド（ＥＧＦまたは４０７０Ａ−ＭＬＶのＮ末端結合ドメイン）とＭＬＶエンベロープタンパク質（モロニーまたは４０７０Ａ）との間の融合の部位を囲む配列が、各構造物に関して詳細に示される。各構造物の横には、発現されるエンベロープ糖タンパク質単量体のＮ末端領域の模式図が示され、白抜きの円は（同種指向性）モロニーＭＬＶＳＵ糖タンパク質のＮ末端受容体結合ドメインを示し、黒い四角は（両種指向性）４０７０ＡＭＬＶＳＵ糖タンパク質のＮ末端受容体結合ドメインを示し、クルーの三角はＥＧＦを表わし、ファクターＸａ開裂部位は矢印で示される。ＬＴＲは、長い末端反復配列（ロング・ターミナル・リピート）、Ｌはエンベロープシグナルペプチド、ｐはポリアデニル化配列である。^NotＩクローン化部位も図示される。ＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌコア粒子およびｎ１ｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを発現するＴＥＬＣｅＢ６細胞（Cossetら、1995 J．Virol．69，7430-7436）において、キメラのエンベロープおよび対照である同種指向性（モロニー）エンベロープが発現された。トランスフェクションされたＴＥＬＣｅＢ６細胞からウイルスを含有する上清を採収し、ろ過し（０．４５μｍ）、９０分間０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼで消化し、超遠心分離にかけてウイルス粒子をペレット化した。ファクターＸａプロテアーゼでの処理の前（−）または処理の後（＋）に、キメラのエンベロープを組込んだレトロウイルス粒子をウエスタン免疫ブロット法（図２）により分析した。レーンＡ、ＢおよびＣは、それぞれ、Ｍｏ、ＥＸＭｏ１およびＥＸＭｏ７エンベロープを組込んだ、ペレット化されたレトロウイルスベクターを装填したものである。（Sambrook ら、Molecular cloning，A laboratory manual，（Cold Spring Habour，N．Y. ，1989）pp.16.33-16.36に説明されているように）異なったエンベロープ発現構造物をＴＥＬＣｅＢ６パッケージング細胞にトランスフェクションし、安定なフレオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性コロニーを広げプールした。細胞を、１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭにおいて増殖させ、集密状態になったとき３７℃から３２℃に移して７２時間インキュベートした。レトロウイルス粒子を含有する上清を、３２℃での１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭにおける一晩（１６時間）のインキュベーションの後採収し、ろ過して（０．４５μｍ）、その後２．５ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下で３７℃において９０分間０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａ（Promega）とともにインキュベートした。上清を、４℃で１時間ＳＷ４０ロータ（Beckman）において３００００ｒｐｍで遠心分離し、ペレット化されたウイルス粒子を１００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水中に再懸濁した。各サンプル２０μｌを還元条件下で１０％のポリアクリルアミドゲル上で分離し（Laemmli，Nature（London，277，680(1970)）、その後タンパク質をニトロセルロースペーパーに移した。ＳＵタンパク質を、ラウシャーネズミ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対する特定のヤギ抗体（Qu ality Biotech Inc，USA）、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヤギ抗体（DAKO Denmark）を使用して、既に説明されたように（Cossetら、1995 J． Virol．69，6314）検出し、増強された化学発光キット（Amersham Life Science ）を用いて展開した。ファクターＸａによってＥＧＦはＥＸＭｏ７エンベロープから開裂されず（図２、レーンＣ）、開裂部位がこの位置に挿入されたときにはプロテアーゼに対して接近不可能になることを示唆した。そこで我々は、３つのアラニンからリンカーなるまたは３つのアラニンとＩＥＧＲファクターＸａ開裂部位とからなるリンカーによって、ＥＧＦがモロニーＳＵのアミノ酸（＋７ではなく）＋１に融合される、キメラのエンベロープをコードする（以下に説明する）新しい構造物ＥＭｏ１およびＥＸＭｏ１を作った（図１を参照）。ＥＭｏ１およびＥＸＭｏｌのキメラエンベロープをビリオンに組込み、９０分間０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼで処理した後免疫ブロットで分析した。図２は、ＥＸＭｏ１エンベロープがファクターＸａによって開裂され、変更されていないモロニーＳＵと区別がつかない移動度を有するＳＵ開裂産物が得られたことを示す。ファクターＸａ開裂部位が欠損している対照ＥＭｏ１エンベロープは開裂されなかった。これらの結果は、ＩＥＧＲペプチドの認識を最適化しファクターＸａによって開裂するためには、キメラエンベロープにおけるＩＥＧＲペプチドの正確な位置付けが重要であることを示す。我々は既に、短い（ＡＡＡ）リンカーによりＥＧＦが４０７０ＡＳＵのアミノ酸＋５に融合されたキメラのエンベロープを提示するレトロウイルスベクターの宿主域が、ＥＧＦ受容体により媒介され制限されることを明らかにした（Coss etら、J．Virol．69，1995前掲書）。これらのキメラエンベロープを提示するレトロウイルスはＥＧＦ受容体に結合できたが、その後非感染性の侵入経路に隔離され、ＥＧＦ受容体陽性細胞における力価は大幅に減じられたが、ＥＧＦ受容体陰性細胞における力価はほぼ正常であった。そこで我々は、それぞれＡＡＡリンカーまたはＡＡＡＩＥＧＲリンカーによってＥＧＦが４０７０ＡＳＵのアミノ酸＋１に融合されたキメラのエンベロープをコードする（以下に説明する）プラスミドＥＡ１およびＥＸＡ１を構築した（図１を参照）。ＤＮＡ構造物本明細書では、変更されていないモロニーおよび４０７０ＡＭＬＶエンベロープをコードする（Cossetら、1995 J．Virol．69,前掲に記載の）発現プラスミドＦＢＭｏＳＡＬＦおよびＦＢ４０７０ＡＳＡＬＦをそれぞれ、ＭｏおよびＡと呼ぶ。ＥＡ、（以前はＥＭＯと呼んだ）ＥＭｏ７およびＡＭＯ発現プラスミドの構造もCossetら、（前掲）に記載される。ＥＸｏ７、ＥＭｏ１およびＥＸＭｏ１を生成させるため、ＰＣＲプライマーＮｏｔＸＭｏ７Ｂａｃｋ、ＮｏｔＭｏ１ＢａｃｋおよびＮｏｔＸＭｏ１Ｂａｃｋを（それぞれ）プライマーｅｎｖｓｅｑ７とともに使用し、^NotＩおよび^BamＨＩで消化され、ＥＭｏ７の^NotＩ／^BamＨＩ消化バックボーンにクローニングされた、Ｍｏ（ＦＢＭｏＳＡＬＦ）からの変更されたエンベロープフラグメントを増幅させた。ＥＡ１およびＥＸＡ１を生成するため、ＰＣＲプライマーＮｏｔＡ１ＢａｃｋおよびＮｏｔＸＡ１Ｂａｃｋを（それぞれ）プライマー４０７０Ａｆｏｒとともに使用し、^NotＩおよび^BamＨＩで消化され、ＥＡの^NotＩ／^BamＨＩ消化バックボーンにクローニングされたＡ（ＦＢ４０７０ＡＳＡＬＦ）からの変更されたエンベロープフラグメントを増幅させた。最後に、ＡＭＯからの^NdeＩ−^NotＩフラグメントをそれぞれＥＭｏ１およびＥＸＭｏ１の^NdeＩ／^NotＩ消化バックボーンにクローニングすることによって、（以下に示す）ＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１構造物を生成させた。すべての構造物の正確性はＤＮＡ配列決定により確認した。使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった（制限部位に下線を付す）。ＮｏｔＸＭｏ７Ｂａｃｋ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＣＡＣＣ（ＳｅｑＩＤＮｏ．１）；ＮｏｔＭｏ１Ｂａｃｋ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣ（ＳｅｑＩＤＮｏ．２）；ＮｏｔＸＭｏ１Ｂａｃｋ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．３）；ＮｏｔＡ１Ｂａｃｋ５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．４）；ＮｏｔＸＡ１Ｂａｃｋ５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．５）；ｅｎｖｓｅｑ７，５’−ＧＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＣＣ −３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．６）；４０７０Ａｆｏｒ，５’−ＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．７）図３は、発現されたＥＸＡＩエンベロープのドメイン間リンカー中のＩＥＧＲ配列がファクターＸａにより正しく認識され開裂された一方、対照ＥＡＩエンベロープの開裂はなかったことを示している。（ファクターＸａプロテアーゼでの処理の前（−）または処理の後（＋）の組換え両種指向性レトロウイルス粒子の免疫ブロットである）図３を参照し、レーンＡ、ＢおよびＣは、それぞれ、Ａ、ＥＡＩおよびＥＸＡＩエンベロープを組込んだペレット化されたレトロウイルスベクターを装填したものである。図２に関して上述したように分析が実行された。次に我々は以下のように、ＥＧＦ受容体陰性ヒト細胞系およびＥＧＦ受容体陽性ヒト細胞系におけるＥＡ１およびＥＸＡ１キメラエンベロープを組込んだベクターの力価を検定した。ＥＧＦ受容体発現細胞系、Ａ４３１（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）およびＥＪ（Bubenik ら、1973 Int．J．Cancer 11，765）を、５％のＣＯ₂雰囲気において３７℃で、１０％の胎仔ウシ血清（Gibco-BRL）で補足されたＤＭＥＭにおいて増殖させた。ジャーカットＴ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ８８０５）は、５％のＣＯ₂雰囲気において３７℃で１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＲＰＭＩにおいて増殖させた。感染のため、標的細胞を６ウェルのプレートに２×１０⁵細胞／ウェルで接種し、３７℃で一晩インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ−形質導入レトロウイルスを含むプロデューサー細胞上清を、血清を含まない培地における３２℃での一晩のインキュベーションの後にろ過した（０．４５μｍ）。２．５ｍｌの血清を含まない培地中の上清希釈物を、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で２時間、標的細胞とともにインキュベートした。次にレトロウイルス上清を取除き、４８から７２時間細胞をレギュラー培地でインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性の検出のため、既に説明されている（Takeuchiら、1994 J．Virol．6 8，8001）ようにＸ−Ｇａ１染色を行なった。６ウェルのプレートの下に置かれた格子を使用して、顕微鏡で青く染色されたコロニーを数えることにより、ウイルスの力価（酵素形成単位／ｍｌ）を計算した。ＥＡ１またはＥＸＡ１エンベロープを組込んだ両ベクターともＥＧＦ受容体陰性ジャーカット細胞に感染できたが、ＥＧＦ受容体発現ヒト細胞において選択的に隔離された。ただし、ＥＸＡ１の隔離はＥＡ１の隔離よりも不完全であった（表１）。ＥＧＦ受容体へのベクターの結合を防ぐため、可溶性ＥＧＦが競合体として添加されたとき、ＥＧＦ受容体陽性細胞におけるこれらの感染力は十分に回復でき（表１）、設計されたエンベロープのＥＧＦ受容体への結合によって隔離が特異的に媒介されることが確認された。我々は次に、ＥＸＡ１エンベロープにより付与された制限された宿主域を、提示されるＥＧＦドメインの開裂によって拡大する（すなわち両種指向性に戻す）ことができるかどうかをテストした。ＥＡ１またはＥＸＡ１エンベロープを組込んだベクターを、ファクターＸａの投与量を増やしながらファクターＸａで処理し、ＥＧＦ受容体発現Ａ４３１細胞において力価検定した（表２）。融合されたＥＧＦドメインを９０分間にわたって４μｇ／ｍｌファクターＸａで完全に開裂させる（図３）ことによって、ＥＸＡ１エンベロープを有するベクターの感染力は完全に回復したが、ＥＡ１エンベロープを保有するベクターの感染力には全く影響がなかった。ファクターＸａの濃度がより低いときにはベクター力価の部分的な回復が観察され、ベクター粒子のエンベロープタンパク質のフラクションのみが開裂されたときには、ベクター粒子が低レベルの感染力を回復させ得ることを示した。これらのデータは、ＥＧＦを提示するレトロウイルスベクターがＥＧＦ受容体によって競合的に隔離されることのさらなる証拠を提供するものであり、それらの親和性（向性）が、ＥＧＦドメインをウイルス表面から開裂させる特定のプロテアーゼによって調節できることを示している。ファクターＸａプロテアーゼは、エンベロープで包まれたウイルスの表面のプロ凝固剤リン脂質に直接結合することができ（PryzdialおよびWright，1994 Blo od 84，3749-3757）、したがって、設計されたベクター粒子のＥＸＡ１エンベロープが開裂された後に設計されたベクター粒子のリン脂質と安定して結びつくようになるかもしれない。そこで、Ａ４３１細胞におけるＥＸＡ１エンベロープを組込んだベクターの感染力の回復が、ＥＧＦの開裂によるものであり、粒子結合ファクターＸａプロテアーゼにより媒介されるのではないことを確認するため、対照実験を行なった。そこで我々は、ファクターＸａプロテアーゼにより開裂可能な（ＡＡＡＩＥＧＲ）または開裂不可能な（ＡＡＡ）リンカーによってモロニーＳＵのアミノ酸＋１にＲＡＭ−１受容体結合ドメインが融合されたキメラエンベロープをコードする、（上述の）プラスミドＡＸＭｏ１および対照プラスミドＡＭｏ１を構築した（図１）。予想したように、ＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１キメラエンベロープを組込んだベクターはＲＡＭ−１に結合でき、さまざまなヒト細胞系について目標とする感染を可能にし、ＡＸＭｏ１エンベロープのドメイン間リンカー中のＩＥＧＲ配列は、ファクターＸａにより正確に認識され、開裂された（データは示さず）。そこで我々は、ＡＸＭｏ１エンベロープにより付与された拡大された宿主域を、提示される４０７０Ａドメインの開裂によって制限（すなわち同種指向性に戻す）できるかどうかを試験した。４μｇ／ｍｌのファクターＸａで９０分間処理することにより、ＡＸＭｏ１エンベロープを有するベクターのヒト細胞に対する感染力は選択的に破壊されたが、マウス細胞に対する感染力は減じられなかった（表２）。ＡＭｏ１エンベロープを保有するベクターはプロテアーゼでの処理には影響されなかった。これらのデータは、ＡＭｏエンベロープを提示するレトロウイルスベクターの拡大された親和性（向性）が提示される４０７０Ａドメインによるものであるということを確認するものであり、Ａ４３１細胞におけるＥＸＡ１エンベロープを組み込んだベクターの感染力の回復は、ＥＧＦの開裂によるものであり、粒子結合ファクターＸａプロテアーゼにより媒介されるものではなかったことを示す。要約すると、我々は、ファクターＸａプロテアーゼに対する基質として作用するリンカーにより、ウイルスエンベロープ糖タンパク質に固定される開裂可能な結合ドメインを提示するレトロウイルスベクターを生成させた。この提示される結合ドメインはベクターに対し新規な宿主域特性を付与し、これらの宿主域の変化はベクターをファクターＸａで処理することによりもとに戻すことができる。原則的には、上記のもの以外の細胞表面受容体を認識する結合ドメインとともに、ファクターＸａ以外のプロテアーゼに対する基質であるリンカーを使用することが可能なはずである。特定のプロテアーゼへの暴露によって親和性（向性）が調節される、設計された結合特異性を有するレトロウイルスベクターにより、レトロウイルス遺伝子配達を目標とするための新規な戦略が容易になるであろう。＊ＦＡＣＳ分析により測定されたＥＧＦの受容体の状態 †＋１μＭのヒトＥＧＦ（R&D systems,英国）の存在下でのレトロウイルスベクターを用いた細胞のインキュベーションを示す。＊ βガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルスを含むろ過された上清を、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂を添加して、３７℃で９０分間さまざまな濃度（０．００１５６、０．２５および４μｇ／ｍｌ）のファクターＸａ（Promega）とともにプレインキュベートした。処理された上清を、次に、標的細胞に加え、（１２）に説明するようにウイルスの力価を測定した。実施例２本発明者らは、ＥＸＡ１エンベロープを組込んだベクターが、それらの提示されるＥＧＦドメインの開裂に際して、ＥＧＦ受容体陽性細胞におけるその感染力を回復するかどうかを立証する道をさがした。そこで、ＥＡ１またはＥＸＡ１エンベロープを組込んだベクターをファクターＸａで処理し、ＥＧＦ受容体発現Ａ４３１細胞において力価を検定した。９０分間にわたって４μｇ／ｍｌのファクターＸａで、融合したＥＧＦドメインを完全に開裂させると、ＥＸＡ１エンベロープを有するベクターの感染力が完全に回復されたが、ＥＡ１エンベロープを保有するベクターの感染力には全く影響がなかった（図４）。図４は、キメラＥＧＦ−４０７０ＡＭＬＶベクター粒子を用いたＡ４３１細胞の、ファクターＸａにより媒介される感染を示す。β−ガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルス（Ａ、ＥＡ１またはＥＸＡ１）を含むろ過された上清を、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂ を添加して、３７℃で９０分間、０（−）μｇ／ｍｌまたは４（＋）μｇ／ｍｌの濃度のファクターＸａ（Promega）でプレインキュベートした。そして上述のように、処理された上清を標的細胞の形質導入のために使用した。Ｘ−ｇａｌで染色されたプレートを拡大せずに写真に撮った。ファクターＸａの濃度がより低いときにベクター力価の部分的な回復が見られ（表２）、ベクター粒子のエンベロープタンパク質のフラクションのみが開裂されたとき、ベクター粒子は低レベルの感染力を回復できることを示した。これらのデータは、ＥＧＦを提示するレトロウイルスベクターがＥＧＦ受容体によって競合的に隔離されるというさらなる証拠を提供し、かつ、ＥＧＦドメインをウイルス表面から開裂させる特定のプロテアーゼによりそれらの親和性（向性）を調節できることを示す。上に概説した２段階のターゲッティング戦略においては、設計された結合ドメインを介してのキメラエンベロープの標的細胞への付着が、キメラエンベロープの開裂に先立って行なわれる。そこで、細胞表面で開裂されたＥＧＦ受容体結合ベクター粒子がそれらの標的細胞の感染に至り得るかどうかを判定するため、我々はこのベクターをＥＧＦ受容体陽性Ａ４３１細胞およびＥＪ細胞に付与し、細胞を洗浄し、ファクターＸａプロテアーゼでそれらを処理した。ＥＧＦ受容体上に隔離され次にファクターＸａプロテアーゼにより開裂されたとき、ＥＸＡ１エンベロープを組込んだベクターはそれらの標的細胞の感染に進んだが、ＥＡ１エンベロープを組込んだベクターは感染に至らなかったことを、表３が示す。目標を定めることができ注入可能なベクターが利用できると、選択された標的組織へのインビボでの直接的な遺伝子配達を必要とする遺伝子治療法の開発は非常に容易になるはずである。この報告において我々は新規な２段階ターゲッティング戦略の実行可能性を立証したが、これは、特定の受容体／プロテアーゼの組合せを発現する細胞に感染するよう設計されたレトロウイルスベクターの生成を可能にするであろう。腫瘍の浸潤の間に協働して細胞外マトリックスを分解するプロテアーゼ（Poustis-Delpont ら、1992 Cancer Research 52，3622-3628；Va ssalliおよびPepper、1994 Nature 370、14-15；Satoら、1994 Nature 370，61- 65；およびChenら、1995 Breast Cancer Res．Treat．31，217-226）、やはり膜プロテアーゼである造血分化抗原（Shipp およびLook、1993 Blood 82，1058-10 70）またはＨＩＶの侵入経路に関係している膜プロテアーゼ（MuraKamiら、1991 Biochim．Biophys．Acta 1079，79-284）など、この点で、有用となり得る多くの膜結合プロテアーゼがある。既知のプロテアーゼに対する最適の基質を同定するため、最近、開裂可能な結合ドメインを提示する繊維状「基質ファージ」のライブラリが使用された（Matt hewsおよびWells、1993 Science 260，1113-1117 ；Matthewsら、1994 Protein Science 3，1197-1205 ；およびSmith ら、1995 J．Biol．Chem．270，6440-644 9）。原則的には、ランダム化されたリンカー配列を備える、Ｎ末端で伸長されたエンベロープを発現する同様のレトロウイルスディスプレイライブラリを生成できるはずである。このようなライブラリは、新規の細胞内プロテアーゼもしくは膜結合プロテアーゼを同定するために設計されるか、または新規の細胞特異的受容体−プロテアーゼの組合せを目標とするキメラエンベロープを分離するために設計される、選択戦略の基礎を提供するであろう。＊ βガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルスを含む２ｍｌのろ過された上清とともに、４℃で１時間、Ａ４３１細胞およびＥＪ細胞をインキュベートした。そして、冷たい、血清を含まない培地で、細胞を二度洗浄し、血清を含まない培地において３７℃で２時間、０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａ（Promega）とともに細胞をインキュベートした。１０％の胎仔ウシ血清で補足された培地を用いた４８時間のインキュベーションの後、表１に記載するように、ウイルスの力価を測定した。実施例３概要上述のように、レトロウイルスベクター粒子上にそのエンベロープスパイク糖タンパク質のＮ末端伸長物として、いくつかのポリペプチドが提示された。キメラエンベロープのフォールディング、組立、輸送、ウイルス組込み、受容体の付着および融合の誘発は、Ｎ末端ポリペプチドの独特な構造的および機能的特性に依存して、Ｎ末端ポリペプチドによりさまざまに影響され得る。この実施例において、ホモ三量体４０７０ＡＳＵ糖タンパク質からのＲＡＭ−１結合ドメインは、ホモ三量体モロニーＳＵ糖タンパク質のＮ末端に移植されたとき、ホモ三量体モロニーＳＵ糖タンパク質によるＲｅｃ−１に媒介される感染を強力に阻害し得ることを、本発明者らは立証する。また、４０７０ＡエンベロープのＮ末端に融合されるとき、短い三量体ロイシンジッパーペプチドは、４０７０ＡエンベロープによるＲＡＭ−１に媒介される感染を阻害できるが、単量体螺旋状ペプチドはこれを阻害できないことも示す。開裂シグナルをキメラエンベロープに作りこみ、ファクターＸａプロテアーゼを添加することによって、提示されるポリペプチドをベクター粒子から開裂できるようにした。三量体ポリペプチドを提示するすべてのエンベロープにおいて、ウイルス上に組込まれたエンベロープから三量体Ｎ末端伸長物が開裂されたとき、Ｒｅｃ−１またはＲａｍ−１により媒介される感染に対する立体化学的遮断が逆転した（取り消された）。これらのデータは、阻害Ｎ末端伸長物によりエンベロープの機能が隠されてしまうのは、これらが移植されたＳＵ糖タンパク質三量体の先端で、その三量体複合体に組立てられる結果であることを示唆している。レトロウイルスベクター標的化についてのこの意味を考察する。ＭＬＶから誘導されるレトロウイルスベクターは、用途の広い遺伝子配達媒体であって、その宿主域特性は、特定の受容体に対するその付着を媒介し続いて融合を引起こす膜糖タンパク質により決定される。ネミズ白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質は、ウイルスの表面にホモ三量体複合体として提示される（Fassら、Nature Structural Biology 3 ：465-469 ；Kamps ら、Viro logy 184：687-694）。三量体の各サブユニットは２つの部分、ＳＵとＴＭとからなる。ＳＵ（表面）成分は、全くウイルス外にあり、より小さなＴＭ成分を介してレトロウイルスに付着し、ＴＭ成分はこの複合体をウイルス膜に固定させる（Pinterら、Virology 91 ：345-351）。ＳＵ糖タンパク質のＮ末端ドメインは、受容体特異性を付与し、宿主域の異なる複数のＭＬＶの間で高い保存度を示す（Battiniら、J．Virol．69：713-719）。モロニーＭＬＶエンベロープは、ネズミカチオン性アミノ酸輸送体に結合するので、同種指向性の宿主域を付与する（ Albritton ら、J.Virol．67 ：2091-2096 ；Albritton ら、Cell 57 ：659-666 ）。４０７０ＡＭＬＶエンベロープは、多数の哺乳動物種を通じて保存されるＲＡＭ−１ホスフェート輸送体に付着し、両種指向性の宿主域を付与する（Kavanaugh ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91 ：7071-7075）。標的細胞受容体との結合が生じた後、三量体ＳＵ−ＴＭ複合体は大規模な立体配座の再配置を被るものと考えられ、これがウイルス膜と標的細胞膜との間での融合プロセスを引起こす。本発明者らおよびその同僚らは、そのＳＵ糖タンパク質に新たな決定因子を作りこむことによって、選択された標的細胞へのレトロウイルスベクターの侵入を目標とするための異なった戦略を探究してきた（Cossetら、J.Virol.69：6314-6 322 ：Nilsonら、Gene Ther．3：280-286 ；Russell ら、Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，N．Y.；Valsesia-Wittmann ら、J．Virol． 68：4609-4619 ；Valsesia-Wittmann ら、J．Virol．70：2059-2064）。前掲実施例においては、プロテアーゼ−基質の相互作用を通じてレトロウイルスベクターのターゲッティングを可能にする新規な２段階戦略が説明され、ここでは、レトロウイルスベクターが、設計された結合ドメインを介して標的細胞に付着し（第１段階）、その後ウイルスを結合ドメインに繋ぐ設計されたリンカーが特定のプロテアーゼにより開裂され（第２段階）、ウイルスは標的細胞の感染に進むことができる。この２段階ターゲッティング戦略の欠点は上述のように、ベクター付着の特異性を支配している一方で、開裂可能な結合ドメインは、非標的細胞上のその本来の受容体にＳＵ三量体が付着する能力を完全には遮断しないということである。したがって、開裂されなかったベクターは、Ｒａｍ−１受容体を通じて非標的細胞に感染する能力を保持する。この欠点を克服するため、開裂されていないベクターの感染力を完全に阻害する一方、選択されたプロテアーゼへの暴露によって感染力を十分に回復できるようなエンベロープ変更物の開発に、我々は関心を寄せてきた。モロニーＭＬＶエンベロープキメラの同種指向性感染力の特徴を調べるための（本明細書に記載する）実験の過程で、Ｒａｍ−１標的化ＡＸＭｏ１エンベロープを提示するベクター（Nilsonら、Gene Ther．3：280-286）は、それがまずファクターＸａプロテアーゼにより開裂されないと、同種指向性受容体（Ｒｅｃ− １）を通じて効率的に細胞に感染できないことが見出された。ＡＸＭｏ１エンベロープのこの特性を説明するため、我々は、提示されるＲＡＭ−１結合ドメインはそれが移植されたモロニーＳＵ糖タンパク質三量体の先端で三量体複合体を形成し、そのためにそのＲｅｃ−１結合部位が遮断されるのではないか、という仮説を立てた。さらにこの仮説をテストするため、我々は、４０７０ＡＳＵ糖タンパク質上にオリゴマー化するロイシンジッパーペプチド（Harbury ら、Scienc e 262 ：1401-1407）を移植し、このキメラエンベロープを組込んだレトロウイルスベクターの特徴を調べた。材料および方法プラスミド構造物４０７０ＡＭＬＶおよびモロニーＭＬＶの変更されていないエンベロープは、それぞれ、発現プラスミドＦＢ４０７０ＡＳＡＬＦ（Ａ）およびＦＢＭｏＳＡＬＦ（Ｍｏ）でコードされた（Cossetら、1995 J．Virol．69，7430-7436）。ファクターＸａプロテアーゼにより開裂可能な（ＡＡＡＩＥＧＲ）または開裂不可能な（ＡＡＡ）リンカーによって、モロニーＳＵのアミノ酸＋１に、４０７０ＡＳＵからのＲＡＭ−１受容体結合ドメインが融合されているキメラエンベロープをコードする、構造物ＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１については既に説明されている（Nilsonら、Gene Ther．3：280-286）。３つのアラニンからなるリンカーまたは３つのアラニンとＩＥＧＲファクターＸａ開裂部位とからなるリンカーによりＥＧＦが４０７０ＡＳＵのアミノ酸＋１に融合されているキメラエンベロープをコードする、構造物ＥＡ１およびＥＸＡ１も説明されている（Nilsonら、Gene Ther．3：280-286）。螺旋状ペプチドを提示するベクターを構築するため、４０７０ＡＭＬＶエンベロープと提示されるＥＧＦドメインとの間に、１２のアミノ酸（ＡＡＡＧＧＧーのそれぞれがある、プラスミドｐＥＧＳ１ＸＡ１およびｐＥＧＳ３ＸＡ１がまず生成された。ＰＣＲプライマーＮｏｔＧＳ１ＸＡ１ｂａｃｋおよびＮｏｔＧＳ３ＸＡ１ｂａｃｋ（のそれぞれ）をプライマー４０７０Ａｆｏｒとともに使用して、^NotＩおよび^BamＨＩで消化され、ＥＡ１の^NotＩ／^BamＨＩで消化されたバックボーンにクローニングされた、ＥＸＡ１からの変更されたエンベロープフラグメントを増幅した。図７は、螺旋状ペプチドＡＡ、ＶＬおよびIIが４０７０ＡＭＬＶＳＵの残基＋１に融合されているキメラエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミド構造物の模式図である。その一般的フォーマットが概略的に示され、これらペプチドとＳＵタンパク質との間のリンカーおよび螺旋状ペプチドのアミノ酸配列（１文字の略号）が詳細に示される。ＬＴＲは、長い末端反復配列（ロング・ターミナル・リピート）であり、Ｌはエンベロープシグナルペプチドである。７反復のａ位置およびｄ位置にあるアミノ酸残基は太字で示す。プラスミドｐＶＬＸＡ１、ｐＶＬＧＳ１ＸＡ１およびｐＶＬＧＳ３ＸＡ１を生成させるため、ＰＣＲプライマーＧａ１４ＶＬｂａｃｋおよびＧａ１４ＶＬｆｏｒを用い、それらのそれぞれから合成を開始させることによりＰＣＲフラグメントを生成させ、次に、外側のプライマーＧａ１４ｂａｃｋおよびＧａ１４ｆｏｒを用いて、フラグメントをさらに増幅した。このＰＣＲ産物を^SfiＩおよび^N ^ot Ｉで消化し、ＥＸＡ１、ｐＥＧＳ１ＸＡ１およびｐＥＧＳ３ＸＡ１の^SfiＩ／^N ^ot Ｉで消化されたバックボーンにクローニングした。プラスミドｐＡＡＸＡ１およびｐＡＡＧＳ３ＸＡ１を生成させるため、ＰＣＲプライマーＧａ１４ＡＡｂａｃｋおよびＧａ１４ＡＡｆｏｒを用い、それらのそれぞれから合成を開始させることによりＰＣＲフラグメントを生成させ、次に、外側のプライマーＧａ１４ｂａｃｋおよびＧａ１４ｆｏｒを用いて、フラグメントをさらに増幅した。このＰＣＲ産物を^SfiＩおよび^NotＩで消化し、ＥＸＡ１およびｐＥＧＳ３ＸＡ１の^SfiＩ／^NotＩで消化されたバックボーンにクローニングした。プラスミドｐIIＸＡ１、ｐIIＧＳ１ＸＡ１およびｐIIＧＳ３ＸＡ１を生成させるため、ＰＣＲプライマーＧａ１４ IIｂａｃｋおよびＧａ１４ IIｆｏｒを用い、それらのそれぞれから合成を開始させることによりＰＣＲフラグメントを生成させ、次に、外側のプライマーＧａ１４ｂａｃｋおよびＧａ１４ｆｏｒを用いて、フラグメントをさらに増幅した。このＰＣＲ産物を^SfiＩおよび^NotＩで消化し、ＥＸＡ１、ｐＥＧＳ１ＸＡ１およびｐＥＧＳ３ＸＡ１の^SfiＩ／^NotＩで消化されたバックボーンにクローニングした。ＤＮＡ配列決定によって、すべての構造物の正しい配列が確かめられた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した（制限部位には下線を付す）。ＮｏｔＧＳ１ＸＡ１ｂａｃｋ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１０）；ＮｏｔＧＳ３ＸＡ１ｂａｃｋ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１１）；Ｇａ１４ＶＬｂａｃｋ（^SfiＩ部位を有する），５’−ＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＡＧＧＴＡＴＡＣＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１２）；Ｇａ１４ＶＬｆｏｒ（^NotＩ部位を有する），５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＡＴＡＣＣＴＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１３）；Ｇａ１４ＡＡｂａｃｋ（^SfiＩ部位を有する），５’−ＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１４）；Ｇａ１４ＡＡｆｏｒ（^NotＩ部位を有する），５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１５）；Ｇａ１４ IIｂａｃｋ（^SfiＩ部位を有する），５’−ＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１６）；Ｇａ１４ IIｆｏｒ（^NotＩ部位を有する），５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＴＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１７）；Ｇａ１４ｂａｃｋ，５’−ＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ．１８）；Ｇａ１４ｆｏｒ，５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．１９）；および４０７０Ａｆｏｒ（上述）。標的細胞系およびウイルスの生産ＧＰ＋ＥｎｖＡＭ１２細胞（Markowitz ら、Virology 167：400-406）は、ネズミ細胞系ＮＩＨ３Ｔ３から誘導され、干渉によってＲＡＭ−１受容体を遮断するＭＬＶ−Ａエンベロープを発現する。ＮＩＨ３Ｔ３、ＧＰ＋ＥｎｖＡＭ１２およびヒト細胞系Ａ４３１（Giardら、J．Natl．Cancer Inst．51，1417- 1421）を、１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭで増殖させた。リン酸カルシウム沈澱法（Takeuchiら、J．Virol．68：8001-8007）によって、異なったエンベロープ発現構造物をＴＥＬＣｅＢ６パッケージング細胞（Cossetら、J．V irol．69：7430-7436）にトランスフェクションし、安定したフレオマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）耐性コロニーを広げ、プールした。１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭで細胞を増殖させ、集密状態になったとき３７℃から３２℃に移し、７２時間インキュベートした。１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（感染用）、または、２％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭ（免疫ブロット用）において３２℃で一晩（１６時間）インキュベーションの後、レトロウイルス粒子を含む上清を採収した。すべての上清を使用前にろ過した（０．４５μｍ）。免疫ブロット１％のトリトンＸ−１００、０．０５％のＳＤＳ、５ｍｇ／ｍｌのデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中でウイルスプロデューサ細胞を溶解した。溶解産物を４℃で１０分間インキュベートし、１００００×ｇで１０分間遠心分離にかけて核をペレット化した。４℃で１時間、ＳＷ４０ローター（ Beckman，USA）において３００００ｒｐｍで、ろ過されたウイルス上清（１０ｍｌ）を超遠心分離することにより、ウイルスサンプルが得られた。ペレット化したウイルス粒子を１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。（細胞溶解産物については３０μｌ、または、ペレット化されたビリオンについては１０μｌの）サンプルを、還元条件下で１０％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてニトロセルロースペーパーにタンパク質を移した。ファクターＸａでの開裂のため、１０μｌのペレット化されたウイルス粒子を、分離ゲル上に流す前に、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下で３７℃で９０分間、０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａ（Promega，USA）とともにインキュベートした。それぞれ１／１０００および１／１００００に希釈された、ラウシャーネズミ白血病ウイルス（ＲＬＶ）ｇｐ７０ＳＵまたはＲＬＶｐ３０キャプシドタンパク質（ＣＡ）のいずれかに対する特定のヤギ抗体（Quality Biotech Inc，USA）を用いて、既に説明されたように（Cossetら、J．Virol．69：6314-6322）、ＳＵタンパク質を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヤギ抗体（DAKO，Denmar k）および増強された化学発光キット（Amersham Life Science，UK）によってブロットを展開した。標的細胞の感染標的細胞を６ウェルのプレートに２×１０⁵細胞／ウェルで接種し、３７℃で１晩インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルスを含むプロデューサー細胞上清を、血清を含まない培地で３２℃で１晩インキュベートした後、ろ過した（０．４５μｍ）。採収した上清を、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂ の存在下で３７℃で９０分間、０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａ（Promega）とともにインキュベートした。８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で６時間、２ｍｌの血清を含まない培地中の上清希釈物を標的細胞とともにインキュベートした。そしてレトロウイルス上清を取除き、４８から７２時間レギュラー培地で細胞をインキュベートした。βガラクトシダーゼ活性の検出のため、Ｘ−Ｇａ１染色を、既に説明されている（Tatuら：EMBO J．14：1340-1348）ように行なった。６ウェルのプレートの下に置かれた格子を使用して顕微鏡で青く染色されたコロニーを数えることにより、ウイルスの力価（酵素形成単位／ｍｌ）を計算した。結果Ｒａｍ−１ターゲッティングドメインを発現するエンベロープによるＲｅｃ−１媒介感染ＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１は、開裂不可能な（ＡＡＡ）またはファクターＸａにより開裂可能な（ＡＡＡＩＥＧＲ）リンカーにより、４０７０ＡＳＵからのＲＡＭ−１受容体結合ドメインがモロニーＳＵのアミノ酸＋１と融合されている、既に説明されたキメラエンベロープである（Nilsonら：Gnen Ther．3：280-28 6）。ＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１エンベロープを組込んだウイルスをペレット化し、０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼで開裂させ、プローブとして抗エンベロープ抗血清を用いて免疫ブロットで分析した。ファクターＸａにより開裂可能なＮ末端ＲＡＭ−１結合ドメインを発現するキメラエンベロープのレトロウイルス組込みおよび開裂による、可逆性の感染阻害を、図６Ａおよび図６Ｂに図示する。図６Ａは、ファクターＸａプロテアーゼでの処理の前（−）または処理の後（＋）のＭｏ、ＡＭｏ１またはＡＸＭｏ１エンベロープを組込んだ、ペレット化された組換えレトロウイルス粒子を、ＳＵ糖タンパク質に対する抗血清でプローブした、免疫ブロットである。図６Ｂは、ファクターＸａプロテアーゼで処理されたまたは処理されていない、β−ガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルス（ＡＭｏ１、ＡＸＭｏ１、ＭｏおよびＡ）を含む、採収されたプロデューサー細胞上清で、標的細胞系ＧＰ＋ＥｎｖＡＭ１２が感染されたときの結果を示す。Ｘ−ｇａｌ染色によりβ−ガラクトシダーゼ活性の検出が行なわれ、力価はｅ．ｆ．ｕ．／ｍｌで表わされた。キメラエンベロープが（変更されていないモロニーＳＵよりは効率的ではなかったが）等しく効率的にビリオンに組込まれ、ＡＭｏ１エンベロープはそうではなかったが、ＡＸＭｏ１はファクターＸａプロテアーゼにより開裂され、変更されていないＭｏＳＵと区別できない移動度を持つＳＵ開裂産物を得たことが、図６Ａから明らかである。次に、対応するＲａｍ−１受容体を干渉によって遮断する４０７０Ａエンベロープを過剰に発現するＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタント（ＧＰ＋ＥｎｖＡＭ１２）、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、これらのＲａｍ−１標的化ベクターの感染力をテストした。Ｒｅｃ−１およびＲａｍ−１の両者を発現する変更されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してはベクターＡＭｏ１およびＡＸＭｏ１は十分に感染力を持ち、力価は１０⁶ｅｆｕ／ｍｌを超えた（図示せず）が、Ｒａｍ− １が欠損した細胞に対してはこれらの感染力は大幅に減じられ、これらが同種指向性受容体Ｒｅｃ−１を利用できなかったことを示唆した（図６Ｂ）。この結果は、予想されなかったものであって、単量体の増殖因子ドメインまたは１本鎖抗体フラグメントを提示する同様のキメラモロニーＳＵ糖タンパク質で得られた結果と対照的であった。該キメラモロニーＳＵ糖タンパク質で得られた結果においてはＲｅｃ−１に媒介される感染は、提示されるドメインによって深刻なダメージを受けることはなかった（Agerら：Human Gene Ther.，印刷中；Cossetら、J ．Virol．69：6314-6322）。このことから、提示されるＲａｍ−１結合ドメインは、それが移植されたモロニーＳＵ糖タンパク質三量体の先端で三量体の複合体を形成しており、それによって、Ｒｅｃ−１結合部位を遮断しているおよび／またはＲｅｃ−１媒介融合の誘発に干渉しているのではないかという説が導かれた。このような遮断は、ベクターからＲａｍ−１結合ドメインを開裂させることによって取り消すことができると予想され、この予測にたがわず、Ｒａｍ−１ターゲッティングドメインがファクターＸａプロテアーゼによってその表面から開裂されたとき、Ｒｅｃ−１に対して陽性の、Ｒａｍ−１が欠損した細胞に対して、ＡＸＭｏ１ベクターの感染力が十分に回復した（図６Ｂ）。螺旋状ペプチドを提示するキメラ４０７０Ａエンベロープの構築三量体のポリペプチドが三量体のエンベロープ糖タンパク質のＮ末端に融合されたとき、三量体のエンベロープ糖タンパク質の機能を遮断できるという考えをさらにテストするため、そして、この考えを両種指向性ＭＬＶＳＵ糖タンパク質に適用できるかどうかを判断するため、我々は、ファクターＸａにより開裂可能なリンカーを介して単量体のまたは三量体化する螺旋状ペプチドが４０７０ＡＳＵのアミノ酸＋１と融合されたキメラエンベロープをコードする一連の構造物を作った（図７）。これらの研究のために選ばれた螺旋状ペプチドは、三量体の超螺旋の形成を強制したり（ＶＬおよびIIペプチド）またはオリゴマー化を防いだり（ＡＡペプチド）することが知られている７反復のａ位置およびｄ位置に系統的なＶ、Ｌ、ＩまたはＡ（１文字のアミノ酸略号）置換を伴う、二量体のＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドの変異体であった（Harbury ら：Science 262 ：1401-1407）。これらの構造物を設計しているとき、我々は、提示されるＶＬおよびIIペプチドが下地である４０７０ＡＳＵ糖タンパク質にあまりに近接して繋がれると、提示されるＶＬおよびIIペプチドのオリゴマー化が妨害されるのではないかと憂慮した。そこで、４０７０ＡＳＵ糖タンパク質と提示される９）からなるリンカーを挿入することにより変化させた。この太字体で示す配列はファクターＸａにより認識され開裂されることが知られているものである（Ni lsonら：Gene Ther．3：280-286）。キメラ４０７０Ａエンベロープの発現、ウイルス組込みおよび開裂ＡＡ、ＶＬおよびIIキメラエンベロープならびに対照である両種指向性（４０７０Ａ）エンベロープを、ＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌコア粒子およびｎ１ｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを発現するＴＥＬＣｅＢ６細胞に安定にトランスフェクションした（Cossetら、J．Virol．69：7430-7436）。この安定にトランスフェクションされたＴＥＬＣｅＢ６細胞から、ウイルスを含む上清を採収し、超遠心分離して、ウイルス粒子をペレット化した。次に、ウイルスのコアタンパク質およびエンベロープタンパク質の存在に関して、免疫ブロットでペレットを分析した（図８Ａ）。図８は、４０７０ＡＭＬＶＳＵのＮ末端伸長物としてファクターＸａにより開裂可能な螺旋状ペプチドを発現するキメラエンベロープのウイルス組込みおよび開裂を示す。図８Ａは、キメラエンベロープを組込んだペレット化レトロウイルス粒子の免疫ブロットである。各レーンの内容は以下のとおりである。すなわち、１：ＶＬＸＡ１、２：ＶＬＧＳ１ＸＡ１、３：ＶＬＧＳ３ＸＡ１、４：ＡＡＸＡ１、５：ＡＡＧＳ３ＸＡ１、６：IIＸＡ１、７：IIＧＳ１ＸＡ１、８：II ＧＳ３ＸＡ１および９：Ａである。免疫ブロットの上部は抗ＳＵ抗血清でプローブされ、下部は、ｐ３０ＣＡタンパク質を検出するため抗ｐ３０抗血清でプローブされた。図８Ｂは、キメラエンベロープのファクターＸａに媒介される開裂を図示しており、ファクターＸａプロテアーゼでの処理の前（−）または処理の後（＋）のＡ、ＶＬＸＡ１、ＡＡＸＡ１、IIＸＡ１またはＥＸＡ１エンベロープを組込んだ、ペレット化された両種指向性組換レトロウイルス粒子を、抗ＳＵ抗血清でプローブした免疫ブロットの形をとる。図８Ｃは、ウイルスを生産するＴＥＬＣｅＢ６トランスフェクタントＡ、ＶＬＸＡ１、ＡＡＸＡ１、IIＸＡ１および対照であるトランスフェクションされていないＴＥＬＣｅＢ６から調製された細胞溶解産物を、抗ＳＵ抗血清でプローブした免疫ブロットである。各サンプルに存在するベクター粒子の数を、ｐ３０ＣＡタンパク質を検出するためｐ３０抗血清で染色して測定すると、ほぼ等しいことがわかった（図８Ａ）。しかし、抗ＳＵ抗血清で染色して、異なったキメラエンベロープのウイルス組込みの効率を比較したときは、オリゴマー化するペプチドの存在が組込みに大きな影響を与えることがわかった。対照単量体ペプチド（ＡＡ）を提示するエンベロープは野生型の４０７０Ａエンベロープとほぼ同程度に効率的に組込まれた一方、ＶＬペプチドを提示するエンベロープの組込みははるかに非効率的であり、IIペプチドを提示するエンベロープでは視認できる組込みはなかった。螺旋状ペプチドを、それが移植されたＳＵ糖タンパク質から開裂させることができるかどうかを判定するため、ウイルスペレットを０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼで消化し、前と同様に免疫ブロットで分析した。図８Ｂは、発現されるエンベロープＶＬＸＡ１、ＡＡＸＡ１および対照ＥＸＡ１がファクターＸａプロテアーゼで開裂されているとき、移動度のシフトがあり、螺旋状ペプチドが実際にＳＵから開裂されていることを示している。IIＸＡ１キメラエンベロープの組込みはレベルが低いため、このベクターについては開裂は見られない。この免疫ブロットは、キメラエンベロープＡＡＸＡ１が、ＶＬＸＡ１の１０倍効率的に組込まれたことも示す。ＶＬおよびIIキメラエンベロープの不十分な組込みをさらに調べるため、我々は、ウイルスを生産するＴＥＬＣｅＢ６トランスフェクタントから調製された細胞溶解産物の免疫ブロットを行なった。図８Ｃは、３つのキメラエンベロープすべての、プロセシングを受けていない前駆体が細胞溶解産物において検出できることを示す。しかし、ＶＬおよびIIエンベロープ前駆体はＡＡ前駆体ほど存在量が多くない。また、ＶＬおよびII前駆体の成熟ＳＵへのプロセシングは、ＡＡ前駆体のプロセシングに比べ大きく損なわれており、これらのキメラエンベロープが小胞体からゴルジ区画へ効率的に移送されないことを示している。開裂前および開裂後のキメラエンベロープを提示するベクターの感染力螺旋状ペプチドが、それらが融合された４０７０Ａエンベロープの機能をマスクしていたかどうかを判定するため、我々は、ベクターを、ファクターＸａプロテアーゼでの開裂前および開裂後、Ｒａｍ−１を発現する細胞である、ＮＩＨ３Ｔ３およびＡ４３１上で力価検定した（表４および図９）。図９は、ファクターＸａにより開裂可能なＮ末端のオリゴマー化するペプチドを発現するキメラエンベロープＶＬＸＡ１の開裂による、感染の可逆的な阻害を示し、かつ、Ｘ−ｇａ１染色後のウイルスで感染された細胞の拡大図である。キメラエンベロープＶＬＸＡ１は、ＮＩＨ３Ｔ３およびＡ４３１細胞において感染の強い阻害を示しており、これはファクターＸａの添加によって消すことができる。ＡＡペプチドを提示する対照ベクターの力価は、野生型両種指向性ベクターの力価に匹敵し、この力価はファクターＸａ開裂後も変化せず、ＡＡペプチドが下地である４０７０Ａエンベロープの機能に大きく干渉しないことを示す。逆に、三量体化するＶＬおよびII螺旋状ペプチドを提示するベクターにおいては両細胞系において力価が大幅に減じられ、これはファクターＸａ開裂によって２０００倍も増強された。ＶＬＸＡ１キメラエンベロープの場合には、４μｇ／ｍｌファクターＸａプロテアーゼでの開裂によって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞での力価は１５１ｅｆｕ／ｍｌから３×１０⁵ｅｆｕ／ｍｌに増加し、Ａ４３１細胞においては３１８ｅｆｕ／ｍｌから１０⁵ｅｆｕ／ｍｌに増加した（図９）。II螺旋状ペプチドを提示するベクターにおいては、おそらくはIIペプチドを提示するキメラエンベロープの組込みが減じるために、ＶＬペプチドを提示するものに比べて概してより低い力価を示した。ドメイン間の間隔は、開裂されていないベクターの力価に対しても、ファクターＸａプロテアーゼへの暴露後観察された力価の増強度に対しても、明らかな影響をほとんど及ぼさなかった。考察上記実施例において、我々は、ホモ三量体の４０７０ＡＳＵ糖タンパク質からのＲａｍ−１結合ドメインは、ホモ三量休のモロニーＳＵ糖タンパク質のＮ末端に移植されると、ホモ三量体のモロニーＳＵ糖タンパク質によるＲｅｃ−１媒介感染を阻害できることを示した。また、我々は、単量体の螺旋状ペプチドではできないが、短い三量体のロイシンジッパーペプチドでは、４０７０ＡエンベロープのＮ末端に融合されると、４０７０ＡエンベロープによるＲａｍ−１媒介感染を阻害できることも示した。いずれの場合にも、ウイルスに組込まれたエンベロープから三量体Ｎ末端伸長物を開裂させるためファクターＸａプロテアーゼを用いることによって、Ｒｅｃ−１媒介またはＲａｍ−１媒介感染に対する遮断を取り消すことができた。我々は、これらの阻害Ｎ末端伸長物によってエンベロープの機能がマスクされるのは、これらが移植されるＳＵ糖タンパク質三量体の先端で、これらが三量体複合体に組立てられる結果であると考える。我々が４０７０Ａエンベロープに融合させたＶＬ、IIおよびＡＡペプチドは、ＧＣＮ４ロイシンジッパーの突然変異体であって、そこにおいて、二量体形成を誘導する保存され埋もれている残基は、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニン残基と置換されている（Harbury ら：Science 262 ：1401-1407）。ＶＬ突然変異体はオリゴマー化して、極度に安定な（Ｔ_m９５℃）２本鎖および３本鎖のα−ヘリックス超螺旋構造を形成するが、一方、II突然変異体はＶＬ構造物よりもさらに安定な（Ｔ_m＞１００℃）３本鎖の超螺旋のみを形成する。ＡＡペプチドにおいては、ＧＣＮ４ロイシンジッパーの疎水性コア残基はすべてアラニンで置換され、突然変異体ペプチドのオリゴマー化を防ぐ一方、その螺旋構造を保存する。変更されていない４０７０Ａエンベロープに比べてごくわずかな組込みの減少しか示さなかった、対照ＡＡペプチドを提示するキメラエンベロープに対し、ＶＬおよびIIペプチドを提示するキメラエンベロープのレトロウイルス組込みは大幅に損なわれていた。ＶＬキメラエンベロープのウイルスペレットにおける存在量はＡＡキメラエンベロープのそれの約１０分の１であり、IIキメラエンベロープの組込みはあまりにも貧弱だったため、ペレット化されたビリオンの免疫ブロットでは視認できなかった。トランスフェクションされたＴＥＬＣｅＢ６細胞からの細胞溶解産物を抗エンベロープ抗血清で免疫ブロットすると、各キメラエンベロープに対する前駆体ポリペプチドの細胞内存在量が、ウイルスペレットにおけるそれらの存在量と密接に相関することがわかった。したがって、ＶＬおよび IIキメラエンベロープのウイルス組込みが低いのは、ウイルスプロデューサー細胞でのそれらのフォールディングおよび／または発現が貧弱である結果である。現在のところ、何がＶＬおよびIIキメラエンベロープの発現を損なわせるのかは明らかでない。異なった（オリゴマー化するまたは対照の）キメラエンベロープ発現プラスミドをトランスフェクションした後得られた安定に形質導入されたＴＥＬＣｅＢ６クローンの数または大きさには差異がなかったので、いずれのタンパク質もウイルスプロデューサー細胞に対して毒性を持たないものと思われる（データは示さず）。ＶＬおよびIIエンベロープ前駆体が小胞体内において未熟なオリゴマー化をするために、ＶＬおよびIIエンベロープ前駆体の細胞内での存在量が少ないという、別の可能性もあるだろう。発生期のポリペプチド鎖のそれらのＮ末端ＶＬまたはIIペプチドを介しての未熟なオリゴマー化は、個別のサブユニットのフォールディングに深刻なダメージを与え、それらの凝集および加速的なタンパク質分解性破壊を導くかもしれない。この考え方に沿って、関連する系において、十分にフォールディングされたサブユニットをホモ三量体に組立てできるよりも前に、インフルエンザ赤血球凝集素単量体のシャペロンにより誘導されるフォールディングが小胞体において完成することが知られている（Valses ia-Wittmann ら：J．Virol．68：4609-4619）。II螺旋状ペプチドが極めて安定な三量体を形成すること、およびＶＬペプチドがこれよりも若干弱い相互作用物を形成するという事実によって、ＶＬペプチドを提示するキメラエンベロープが、IIペプチドを提示するキメラエンベロープよりも良好な組込みを行った理由が説明されるかもしれない。この考えをテストするため、我々はこの研究で使用したＶＬおよびIIペプチドに比べ安定性が低い（すなわち融解温度が低い）三量体のロイシンジッパーペプチドを提示するキメラエンベロープを生成させることを計画している。ＶＬまたはIIキメラエンベロープを保有するベクターはすべて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ４３１細胞において感染の阻害を示し、これはファクターＸａプロテアーゼによってベクターからペプチドを開裂させることによって逆転可能であった。これらのエンベロープの組込みレベルが下がっているために、これらの力価は野生型のレベルまで完全には回復しなかった。したがって、ＶＬおよびIIペプチドは、それらが融合されるレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の機能をマスクする、オリゴマー化ペプチドアダプターとして機能する。オリゴマー化ペプチドが下地の結合ドメインをマスクすることによってベクターのその標的細胞への結合が遮断される結果、感染が阻害されるのかもしれない。そうではなく、オリゴマー化するペプチドの存在がエンベロープ三量体の解離を妨げ、融合を遮断するのかもしれない。残念ながら、ＶＬおよびIIキメラエンベロープの組込みが減損しているため、研究を総合しても有用な情報が得られず、我々はこれらのメカニズムのうちいずれがより支配的であるかを決定できていない。ＮＩＨ３Ｔ３およびＡ４３１細胞に感染させるためＶＬおよびIIペプチドを提示する開裂されていないベクターを用いたとき、低レベルのバックグラウンドの感染力が一貫して観察された（表４）。このバックグラウンドは、Ａ４３１細胞におけるよりも、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においての方が若干高く、４０７０ＡＳＵとオリゴマー化ペプチドとの間に挿入されたリンカーペプチドの長さが増加するに伴い増加する傾向にあった。標的細胞から誘導される内因性プロテアーゼにより小数のキメラエンベロープが開裂されるため、このバックグラウンドの感染力が生じるものと我々は考える。開裂可能なＥＧＦドメインを提示するキメラエンベロープを用いた以前の研究において、我々は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ４３１細胞から放出されるプロテアーゼにより、ＩＥＧＲファクターＸａ開裂部位をわずかに開裂できることを観察した。我々はまた、ファクターＸａ開裂部位と提示されるＥＧＦドメインとの間のリンカー配列の長さを増加させると、これらの内因性プロテアーゼに対するファクターＸａ部位の接近能力が増すことも見いだした。要約すると、開裂可能な三量体のペプチドアダプターを４０７０ＡＳＵエンベロープ糖タンパク質のＮ末端に融合させることにより、レトロウイルスベクターの感染力を可逆的に阻害できることを我々の結果は明らかにしている。アダプターをＳＵ糖タンパク質から開裂させるプロテアーゼに、ベクター粒子を暴露することにより、感染力は回復する。我々が現在開発している２段階（標的化された付着、標的化された開裂）ターゲッティング戦略において、非標的細胞の感染を防ぐため、これらのアダプターが有用であろうと予測される。この研究において使用されたＶＬおよびIIペプチドアダプターを提示するキメラエンベロープの発現は貧弱であった。そこで、それらが提示されるキメラエンベロープの発現にダメージを与えない、同様のマスキングアダプターを明らかにすることを我々は試みている。実施例４ＥＧＦ結合ドメインを有する開裂可能なオリゴマー化するアダプターを含むレトロウイルスの構築材料および方法プラスミド構造物ベクターｐＥＧＦＬＶＡ１およびｐＥＧＦＬＶＸＡ１は、開裂不可能な＋１に融合された、オリゴマー化するペプチドＬＶを提示し、かつさらに、ＥＧＦ結合ドメインを提示する。これらのベクターを生成させるため、ＰＣＲプライマーＧａ１４ＬＶ、Ｇａ１４ＬＶｂａｃｋおよびＧａ１４ＬＶｆｏｒを用い、オリゴマー化するペプチドＬＶをコードするＰＣＲフラグメントを組立てた（Harbury ら：1993 Science 262，1401-1407）。このＰＣＲ産物を^NotＩおよび^Eag Ｉで消化し、ＥＡ１およびＥＸＡ１の^NotＩ消化バックボーンにクローニングした。図１０は、２つの構造物の模式図を示す。ＤＮＡ配列決定により構造物の正しい配列を確かめた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した（制限部位には下線を付す）。Ｇａ１４ＬＶ，５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＧ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．２２）；Ｇａ１４ＬＶｂａｃｋ（^NotＩ部位を有する），５’−ＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．２３）；Ｇａ１４ＬＶｆｏｒ（^EagＩ部位を有する），５’−ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣ−３’（ＳｅｑＩＤＮｏ．２４）．標的細胞系およびウイルスの生産ネズミ細胞系ＮＩＨ３Ｔ３およびヒト細胞系Ａ４３１を、１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭにおいて増殖させた。リン酸カルシウム沈殿法によってエンベロープ発現構造物をＴＥＬＣｅＢ６パッケージング細胞にトランスフェクションし、安定したフレオマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）耐性コロニーを広げプールした。１０％の胎仔ウシ血清で補足されたＤＭＥＭで細胞を増殖させ、集密状態になったとき、３７℃から３２℃に移し、７２時間インキュベートした。１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭにおいて感染のために３２℃で１晩（１６時間）インキュベートした後、レトロウイルス粒子を含む上清を採収した。使用前にすべての上清をろ過した（０．４５μｍ）。標的細胞の感染標的細胞を、６ウェルのプレートに２×１０⁵細胞／ウェルで接種し、３７℃ で１晩インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ形質導入レトロウイルスを含む採収された上清を、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下で、３７℃で９０分間０ μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのファクターＸａ（Promega）とともにインキュベートした。２ｍｌの血清を含まない培地中の上清希釈物を、８μｇ／ｍｌのポリブルンの存在下で６時間、標的細胞とともにインキュベートした。次に、レトロウイルス上清を取除き、４８から７２時間、細胞をレギュラー培地でインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性の検出のためＸ−Ｇａ１染色を行ない、６ウェルのプレートの下に置かれた格子を使用して顕微鏡で青く染色されたコロニーを数えることにより、ウイルスの力価（酵素形成単位／ｍｌ）を計算した。キメラエンベロープを組込んだウイルスの宿主域特性オリゴマー化するペプチドが、それが融合された４０７０Ａエンベロープの機能をマスクしているかどうかを判定するため、Ｒａｍ−１を発現する細胞ＮＩＨ３Ｔ３およびＡ４３１において、ファクターＸａプロテアーゼで開裂させる前および開裂させた後、我々はベクターの力価を検定した（図１１）。いずれのベクターも野生型の両種指向性のベクターと比べ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ４３１細胞における力価が大幅に減少した。４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼでＥＧＦＬＶＸＡ１を開裂させると、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ４３１細胞における力価は２００倍にまで増加した。しかし、ファクターＸａ開裂シグナルを保有しない対照ベクターＥＧＦＬＶＡ１の開裂では、このような力価の増加は起こらなかった。これらのデータは、単量体結合ドメインは、特定のプロテアーゼによって開裂されるまでは、下地のエンベロープの機能を遮断する、三量体化アダプターの部分として提示され得ることを示している。実施例５脈管形成、炎症および腫瘍の浸潤は、細胞外マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の過剰な発現に関係する。したがって、ＭＭＰは治療における有望な標的である。ＭＭＰインヒビターを用いる代わりとして、我々はＭＭＰ−活性化可能な遺伝子配達システムを開発している。ここで、活性化されたＭＭＰによって効率的に開裂される阻害アダプターを組込んだベクターの構築について我々は説明する。ＭＭＰに対して敏感なベクターは、内因性の膜結合ＭＭＰを発現する標的細胞において選択的に開裂活性化作用を受け、遺伝子配達が劇的に増強された。ＭＭＰにより活性化可能なベクターは、患部を治療用遺伝子の標的とするための新たな可能性を提供するであろう。脈管形成、組織の再構築、炎症および創傷の治癒において、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が重要であり、これは、癌の浸潤および転移ならびに慢性関節リューマチにおける関節軟骨の破壊を含むさまざまな病理学的過程において重要な役割を果たす（Liottaら、1991 Cell 64，327 ：Woessner Jr.，1991 FASEB J．5，2145 ；Rayおよび Stetler-Stevenson 1994 Eur．Respir．J．7，2 062 ；Karelinaら、1995 J．Invest．Dermatol．105，411）。既知のＭＭＰは、マトリライシン、コラゲナーゼ１−３、ストロメライシン１−３、ゼラチナーゼＡおよびゼラチナーゼＢならびに細胞膜に固定される４つの膜型ＭＭＰ（ＭＴ− ＭＭＰ）のグループを含む（Satoら、1994 Nature 370，61 ；Takinoら、1995 J ．Biol．Chem．270，23013 ；Willおよび Hinzmann．1995 Eur．J．Biochem．23 1，602；Puenteら、1996 Can．Res．56，944）。ほとんどのＭＭＰはチモーゲンの形で分泌され、それらのタンパク質分解活性を働かせることができるようにするためにはその前に活性化が必要である。酵素の正味の活性はまた、ＭＭＰの組織インヒビター（ＴＩＭＰ１−３）によって調節される。一旦活性化されると、ＭＭＰは、カスケード経路内で互いに協働し、細胞外マトリックスの分解を引起こす。腫瘍の浸潤については、ゼラチナーゼＡ（ＧＬＡ；ＭＭＰ−２）およびＭＴ−ＭＭＰが特に関係がある。プロ−ＧＬＡはストロマ線維芽細胞によって分泌され、腫瘍細胞膜上、特に腫瘍の浸潤が進行する領域に集中する（Afzal ら、19 96 Lab．Invest．74，406 ；Nomuraら、1996 Int．J．Can.(Pred．Oncol.)69，9 ）。これは、プロ−ＧＬＡ−ＴＩＭＰ−２複合体として、ＭＴ１−ＭＭＰに結合し、ＭＴ１−ＭＭＰは、腫瘍細胞の表面におけるその開裂の活性化を媒介する（ Stronginら、1995 J．Biol．Chem．270，5331 ；Emmert-Buckら、1995 FEBS Let ters 364，28 ；Gilles ら、1996 Int．J．Can．65，209）。事実、ＭＴ１−ＭＭＰにより媒介されるプロ−ＧＬＡの活性化は、癌の進行において重要であると考えられ、浸潤性または転移性の腫瘍において、活性なＧＬＡの濃度の上昇がしばしば見られる。したがって、新規治療薬の有望な標的としてＭＭＰの活用は極めて興味深く、現在多くの臨床試験によっていくつかの一般的または特殊なＭＭＰインヒビターが、ＭＭＰ関連疾患の治療におけるそれらの有用性についてテスト中である（Hodgson、1995 Biotech．13，554 ；Ecclesら、1996 Can．Res．56 ，2815）。そこで、ＭＭＰインヒビターの使用の代替案として、我々は、ＭＭＰにより活性可能な遺伝子配達システムの使用を提案する。この実施例は、膜結合ＭＭＰにより、ヒトＥＧＦ受容体発現癌細胞に対する感染力が強力に活性化される、標的化レトロウイルスベクターの生成を説明する。短い開裂不可能なまたはプロテアーゼにより開裂可能なリンカーを介して４０７０Ａネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＳＵエンベロープ糖タンパク質のＮ末端コドンに、ＥＧＦの５３アミノ酸受容体結合ドメインをコードするｃＤＮＡが結合されている、一連のキメラエンベロープ発現構造物を生成した。概括すると、キメラベクターＥ．ＡおよびＥ．Ｘ．Ａは、^SfiＩ制限部位および^NotＩ制限部位が両端に位置するＥＧＦｃＤＮＡが、ドメイン間の３アラニンからなるリンカー（Ｅ．Ａ．）または３アラニンとＩＥＧＲファクターＸａ開裂配列とからなるリンカー（Ｅ．Ｘ．Ａ）とともに、野生型４０７０ＡＭＬＶＳＵ（表面タンパク質ｇｐ７０）エンベロープのＮ末端コドン＋１に挿入されているものである。図１２は、キメラエンベロープ発現構造物、Ｅ．Ａ、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．Ａ、Ｅ．Ｘ．ＡおよびＥ．ＭＭＰ．Ａの模式図である。エンベロープ構造物はＴＥＬＣｅＢ６補足細胞にトランスフェクションされ、ウイルス生産クローンを５０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含有する１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ選択培地にプールし広げた。矢印は、それぞれのプロテアーゼによって開裂され得る部位を示す。構造物Ｅ．ＭＭＰ．ＡおよびＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａを得るため、Ｅ．Ａについて（上述の）プライマー４０７０Ａｆｏｒとともに、ＰＣＲプライマーＡ１Ｇｅ１ＡＮｂ（５’ ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣ，ＳｅｑＩＤＮｏ．２７）またはＮＬ１Ａ１Ｂ（５’ ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣ，ＳｅｑＩＤＮｏ．２８）をそれぞれ用いて、５’伸長物として、ＭＭＰにより開裂可能なリンカー（ＰＬＧＬＷＡ）または開裂不可能なリンカー（Ｇ₄Ｓ）をコードする、４０７０ＡＳＵコード配列の^NotＩが末端についたＰＣＲフラグメントを生成させた。ＰＣＲフラグメントを^NotＩおよび^BamＨＩで消化し、Ｅ．Ａの^NotＩ−^Bam ＨＩで消化されたバックボーンにクローニングし、構造物Ｅ．ＭＭＰ．ＡおよびＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａを生成させた。ＤＮＡ配列決定により、構造物の配列をチェックし確かめた。Ｅ．ＡおよびＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａキメラエンベロープはそれぞれ、開裂不可能なリンカーＡＡＡおよびＡＡＡＧＧＧＧＳ（ＳｅｑＩＤＮｏ．２５）（１文字のアミノ酸略号）を含み、Ｅ．Ｘ．Ａエンベロープは、ファクターＸａにより開裂可能なリンカーＡＡＡＩＥＧＲを含み、Ｅ．ＭＭＰ．Ａエンベロープはリンカー示した配列はＧＬＡおよびＭＴ１−ＭＭＰにより認識され開裂されることが知られている（Yeら、1995 Biochem．34，4702；Willら、J．Biol．Chem．271，印刷中）（図１２）。前掲実施例で説明したように、モロニーＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌタンパク質およびｎ１ｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを発現するＴＥＬＣｅＢ６補足細胞に、このキメラエンベロープ構造物および野生型の４０７０Ａエンベロープ発現構造物を安定にトランスフェクションした。機能的エンベロープ発現プラスミドでのこれらの細胞のトランスフェクションに際し、ｌａｃＺマーカー遺伝子を導入できる、感染性のエンベロープに包まれたベクター粒子が培養上清中に回収される。プールされたトランスフェクション済ＴＥＬＣｅＢ６細胞の集密プレートからウイルス上清が採収され、超遠心分離によりウイルス粒子がペレット化され、プローブとして抗エンベロープ抗血清を用いた免疫ブロットが行なわれた。免疫ブロットは、前掲実施例で説明したように行なった。この結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。図１３Ａは、ＥＧＦキメラベクター（レーン２＝Ｅ．Ａ；レーン３＝Ｅ．Ｘ．Ａ；レーン４＝Ｅ．ＭＭＰ．Ａ；レーン５＝Ｅ．Ｇ₄Ｓ．Ａ）と野生型４０７０ＡＳＵ（レーン１およびレーン６）のウイルス組込みの比較を示す免疫ブロットである。図１３Ｂは、精製されたｐ−アミノフェニル水銀（１１）アセテート（ＡＰＭＡ）−活性化ゼラチナーゼＡ（ＧＬＡ）による、Ｅ．ＭＭＰ．Ａ中の、ＭＭＰにより開裂可能なリンカーの開裂を立証する免疫ブロットである。Ｅ．ＭＭＰ．Ａウイルスペレットのアリコートを、それぞれ、ＰＢＳのみ（レーン１）、ＡＰＭＡ−活性化ＧＬＡ（最終濃度は３２μｇ／ｍｌ；レーン２）、および、最終濃度２ｍＭのＡＰＭＡ（レーン３）とともにインキュベートした。レーン４は、変更されていない野生型の４０７０Ａ−ＳＵを示す。野生型４０７０Ａ−ＳＵと比較した移動度の減少によって示されるように、４つのキメラエンベロープがすべて発現されビリオンに組込まれたこと、および、４つの異なった組換えウイルス株においてエンベロープ組込みの相対的効率が比較できるものであったことが、図１３Ａから明らかである。ＧＬＡがＥ．ＭＭＰ．ＡベクターにおけるＰＬＧＬＷＡ配列を認識でき、したがって、下地の４０７０ＡＳＵ糖タンパク質を分解せずにキメラウイルスエンベロープからＥＧＦドメインを開裂させるかどうかを判定するため、我々は、Ｅ．ＭＭＰ．Ａおよび対照ウイルスペレットのアリコートを、ＰＢＳ、ｐ−アミノフェニル水銀（ＩＩ）アセテート（ＡＰＭＡ）またはＡＰＭＡ活性化ＧＬＡとともに、３７℃で３０分間インキュベートし、その後上述したように免疫ブロットを行なった（ゼラチナーゼＡ（ＧＬＡ）はチモーゲンの形で精製され、使用前に２５℃で１時間ＡＰＭＡ（２ｍＭ）とともにインキュベートして活性化する必要がある。再懸濁したＥ．Ｘ．Ａ、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．ＡまたはＥ．ＭＭＰ．Ａウイルスペレット、１０μｌを、ＰＢＳ、ＡＰＭＡ（最終濃度２ｍＭ）またはＡＰＭＡ活性化ＧＬＡ（３２μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で３０分間インキュベートした）。活性化ＧＬＡを用いたＥ．ＭＭＰ．Ａ−ＳＵの処理において、野生型４０７０Ａ−ＳＵと同じ移動度のバンドが回復され、さらなるＧＬＡに媒介される分解なしに、このキメラエンベロープからＥＧＦドメインが効率的に開裂され得ることが示された（図１３Ｂ）。Ｅ．Ｇ₄Ｓ．ＡおよびＥ．Ｘ．ＡキメラエンベロープはＧＬＡでの処理によっては影響を受けず、開裂はＭＭＰに対して敏感なリンカーに特異的なものであることを示した（図示せず）。我々の以前のデータ（Nilsonら、1996 Gene Therapy 3，280）は、Ｅ．Ｘ．Ａベクターの感染力は、ＥＧＦ受容体陽性Ａ４３１細胞においては最小であったが、ファクターＸａプロテアーゼでキメラエンベロープを開裂させることによって、十分にかつ選択的に回復できることを示した。この結果は、本研究で生成させたＥ．Ｘ．Ａベクター株を用いて確認された。ベクター株は、Ａ４３１細胞においてＥＧＦ受容体に強く結合し、ファクターＸａプロテアーゼによって表面からＥＧＦドメインが開裂された後力価を１０³ｅｆｕ／ｍｌから１０⁶ｅｆｕ／ｍｌに上昇させた（データは示さず）。Ａ４３１細胞における、Ｅ．Ａ、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．ＡおよびＥ．ＭＭＰ．Ａベクターの感染力は低く、１０²−１０³ｅｆｕ／ｍｌの間であり、ファクターＸａプロテアーゼでの処理によっても大幅には増加しなかった（図示せず）。ＭＭＰにより開裂可能なＥ．ＭＭＰ．Ａベクターの感染力がＧＬＡによって活性化できるかどうかを判定するため、我々は、外因性のプロ−ＧＬＡの濃度を増加させつつＡ４３１細胞について感染を行なった。Ａ４３１細胞はプロ−ＧＬＡを活性化してＧＬＡにすることが知られているので、ＡＰＭＡによるプロテアーゼの予備−活性化は必要なかった。感染アッセイのため、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中のＡ４３１細胞を、２４ウェルの組織培養プレート（Corning，New York）に、１ウェルあたり３×１０⁴の密度で接種し、３７℃で１晩置いた。翌日培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄した。さまざまな量（最終濃度２−４０μｇ／ｍｌ）のプローＧＬＡを、２００μｌのろ過されたＥ．ＭＭＰ．Ａウイルス上清と混合し、その後混合物をＡ４３１細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄した。次に、細胞を３７℃で７２時間１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中でインキュベートし、冷ＰＢＳ中で１度洗浄し、０．５％のグルタルアルデヒド−ＰＢＳ中に１５分間固定し、再びＰＢＳで１度洗浄し、そして、３７℃で１晩Ｘ−ｇａｌとともにインキュベートした。ベクターにより形質導入されたコロニー（青いコロニー）の数を数え、力価がウイルス上清１ｍｌあたりのｅｆｕとして表わされた。図１４のグラフは、Ａ４３１細胞における、Ｅ．ＭＭＰ．ＡＭＭＰ感受性ベクターの力価の増加（ｅｆｕ×１０^-4／ｍｌ）が、細胞に添加されたプローゼラチナーゼＡ（プロ−ＧＬＡ）の量と相関することを示している。外因性のプロ−ＧＬＡの濃度が、２μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌに増加するにつれて、投与量に依存した態様で、Ｅ．ＭＭＰ．Ａベクターの感染力が増加したことがわかった。プロ−ＧＬＡの不在下での１．３×１０³ｅｆｕ／ｍｌから、４０μｇ／ｍｌのプロ−ＧＬＡの存在下での６．５×１０⁴ｅｆｕ／ｍｌへと、力価は５０倍に増加した。開裂不可能なＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａベクターの力価は、プロ−ＧＬＡの不在下での１．２×１０²ｅｆｕ／ｍｌから、４０μｇ／ｍｌのプロ−ＧＬＡの存在下での１．４×１０²ｅｆｕ／ｍｌとなり、相対的に変化がなかった。Ｅ．Ｘ．Ａの感染力は、４０μｇ／ｍｌのプロ−ＧＬＡの存在下で３倍にしか増加していないので（図示せず）、感染力の活性化は、ＭＭＰにより開裂可能なリンカーを備えるベクターに特有のものであった。我々は、次に、外因性ＭＭＰの不在下で内因性の標的細胞由来ＭＭＰがＥ．ＭＭＰ．Ａベクターを活性化する可能性を探った。ＨＴ１０８０は、構造的にＭＴ１−ＭＭＰおよびプロ−ＧＬＡを生成するヒト線維芽細胞系である（Okada ら、 1995 Proc．Natl．Acad．Sci．92，2730）。そこで、我々は、ＨＴ１０８０細胞およびＡ４３１細胞上で、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．Ａ、Ｅ．Ｘ．ＡおよびＥ．ＭＭＰ．Ａのウイルス上清を、外因的にプロ−ＧＬＡを添加することなく、３７℃で６時間インキュベートした。ろ過されたＥ．Ｘ．Ａ、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．ＡまたはＥ．ＭＭＰ．Ａウイルス上清２００μｌを、８μｇ／ｍｌのポリブレンとともにＡ４３１細胞またはＨＴ１０８０細胞に添加し、３７℃で６時間の後、インキュベーション培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄した。細胞を３７℃で７２時間１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭにおいてインキュベートし、その後Ｘ−ｇａ１で染色した。図１５は、Ａ４３１細胞およびＨＴ１０８０細胞におけるＥＧＦキメラベクターの力価を示すグラフである。青いβ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーの数によって示されるように、Ａ４３１細胞におけるよりもＨＴ１０８０細胞における方がＥ．ＭＭＰ．Ａベクターの感染力が高いことを、図１５Ａは示している。１０ｍｌのろ過されたＥ．ＭＭＰ．Ａウイルス上清のうち１ｍｌを、３７℃で３０分間、５ｍＭのＣａＣｌ₂とともにインキュベートし、その後、それぞれの細胞タイプにおいて３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、血清を含まないＤＭＥＭ中で細胞を洗浄し、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートし、その後、それらをＸ−ｇａｌで染色した。それぞれの力価を、ｅｆｕ／ｍｌウイルス上清として示す。外因性のプロ−ＧＬＡの不在下ではＡ４３１細胞におけるベクターの感染力は低く、以前の結果と一致した。しかし、ＨＴ１０８０細胞においては、ＭＭＰにより開裂可能なベクターＥ．ＭＭＰ．Ａの感染力は、ＭＭＰ耐性の対照ベクターＥ．Ｇ₄Ｓ．ＡおよびＥ．Ｘ．Ａと比較して２桁高いオーダーで活性化された（図１５、図１５Ａ）。したがって、添加される外因性のＭＭＰが全くない場合に、ＭＭＰ依存性のＥ．ＭＭＰ．Ａベクターの力価がより高いのは、ＨＴ１０８０細胞により内因的に生産されるＭＭＰによるその開裂のためであるはずである。ＭＭＰ活性化可能Ｅ．ＭＭＰ．Ａベクターが、Ａ４３１細胞に優先して、ＭＭＰを発現するＨＴ１０８０細胞を選択的に標的化できるかどうかを判定するため、我々は同じペトリ皿上で同時に両方の細胞タイプにベクターを感染させた。我々はカバーガラス上でＡ４３１細胞とＨＴ１０８０細胞とを別個に増殖させ、それらを同一のペトリ皿に載せ、Ｅ．ＭＭＰ．Ａまたは対照ベクターを含む上清を添加した。６ウェルのプレートに含まれる２５ｍｍの Thermanoxカバーガラス（ Corning）上に、Ａ４３１細胞とＨＴ１０８０細胞とを別個に接種し、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭにおいて、１晩置き、その後、培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄した。細胞で覆われたカバーガラスを１０ｃｍのペトリ皿（Falcon）に置き、Ｅ．Ｇ₄Ｓ．Ａ（１：１．５希釈）、Ｅ．ＭＭＰ．Ａ（１：１．５）または４０７０Ａ（１：２０）上清を、８μｇ／ｍｌのポリブレンとともにペトリ皿に添加した。３７℃で６時間のインキュベーション期間の終了時に、培地を取除き、Ｘ−ｇａｌ染色の前に、細胞を７２時間１０％のＦＣＳ −ＤＭＥＭ中でインキュベートした。この結果を図１６に示す。ＨＴ１０８０（Ｈ）細胞およびＡ４３１（Ａ）細胞において増殖されたＥ．ＭＭＰ．ＡベクターはＩおよびIIに、対照Ｅ．Ｇ₄Ｓ．ＡベクターはIIIに、野生型４０７０ＡベクターはIVに示す。Ｅ．ＭＭＰ．Ａは、ＨＴ１０８０細胞およびＡ４３１細胞の両方の細胞タイプに与えられたとき、Ａ４３１細胞に優先して、ＨＴ１０８０細胞に感染した。野生型４０７０Ａベクターおよび開裂不可能なリンカーを備えるＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａベクターはこのような優先性を示さなかった（図１６）。これらの実験において、ＭＭＰ活性化可能Ｅ．ＭＭＰ．Ａベクターは、ＨＴ１０８０細胞の不在下よりもその存在下において、効率的にＡ４３１細胞に感染するということはなかった。このことは、ＨＴ１０８０細胞から培地に放出される可溶性ＧＬＡがベクターの活性化においては重要な役割を果たしていないことを示唆する。その代わり、この結果は、Ｅ．ＭＭＰ．Ａベクターの開裂活性化がＨＴ１０８０細胞の表面に局在すること、および、これが、これらの細胞上のＥＧＦ受容体に結合するベクター粒子に作用する膜結合ＭＭＰにより媒介されることを強く示している。ＭＭＰにより開裂可能なベクターの開裂活性化においてＭＴ−ＭＭＰが重要な役割をはたすことは、天然のＭＭＰインヒビター、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ −２ならびに合成阻害剤ＣＴ１３３９を用いた実験の結果によって裏付けられた。阻害の研究のため、最終濃度が１０μｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２（５μｇ／ｍｌ）またはＣＴ１３３９（１ｍＭ）を使用した。これらの阻害剤を、２００μｌの希釈された（１：１０）Ｅ．ＭＭＰ．Ａまたは希釈されていないＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａウイルス上清に添加した。次にこの混合物を、血清を含まないＤＭＥＭで１度洗浄されたＡ４３１細胞またはＨＴ１０８０細胞に添加し、細胞を３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、この細胞を血清を含まないＤＭＥＭで１度洗浄し、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートし、その後Ｘ−ｇａｌで染色した。形質導入されたコロニーの数を正確に数えられるよう、Ｅ．ＭＭＰ．Ａ上清を希釈し、力価を得た。Ａ４３１細胞についての阻害研究は１６μｇ／ｍｌのプロ−ＧＬＡの存在下で２００μｌの希釈されていないＥ．ＭＭＰ．ＡまたはＥ．Ｇ₄Ｓ．Ａを用いて行なわれた。天然のＭＭＰインヒビターＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２または合成阻害剤ＣＴ１３３９を添加してまたは添加せずに、１６μｇ／ｍｌのプロ−ＧＬＡの存在下でＡ４３１細胞に、または、外因性のプロ−ＧＬＡの不在下でＨＴ１０８０細胞に、ＭＭＰ依存性のＥ．ＭＭＰ．Ａベクターを添加した。値（平均±ＳＤ、ｎ＝３）は、（阻害剤を含まない）対照における力価の減少と比較した（阻害剤を含むものの）力価の減少をパーセンテージで表わす。３つの阻害剤はすべてＧＬＡに対して強い活性を有しており、外因性ＧＬＡによるＥ．ＭＭＰ．Ａベクターの活性化を妨げることができる（表５）。しかしながら、ＴＩＭＰ−２およびＣＴ１３３９とは異なり、ＴＩＭＰ−１は、ＨＴ１０８０細胞における内因性ＭＭＰによるＥ．ＭＭＰ．Ａの活性化を効率的に遮断できなかった（表５）。ＴＩＭＰ−１と他の阻害剤との重要な違いは、ＴＩＭＰ− １が、ＨＴ１０８０細胞において発現されるＭＴ１−ＭＭＰに対しては弱い活性しか示さないという点である（図１７、以下に説明）。したがって、これらの実験は、Ｅ．ＭＭＰ．ＡベクターのＨＴ１０８０に媒介される活性化において、ＭＴ−ＭＭＰが中心的な役割を果たしていることを裏付けている。図１７は、ＨＴ１０８０細胞上の内因性プロ−ＧＬＡの細胞の活性化に対する、ＴＩＭＰ−１または合成ＭＭＰ阻害剤ＣＴ１３３９の効果を示すゼラチンザイモグラムである。いずれのの阻害剤も存在しない状態（レーン１）、１０μｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１の存在下で（レーン２）または３０μｇ／ｍｌのＴＩＭＰ− １の存在下で（レーン３）、および１μＭのＣＴ１３３９の存在下で（レーン４）、あるいは１０μＭのＣＴ１３３９の存在下で（レーン５）、Ｅ．ＭＭＰ．Ａウイルス上清を、３７℃で６時間、ＨＴ１０８０細胞上でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、０．５ｇ／ｍｌの変性Ｉ型コラーゲンを含む７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに、この上清のアリコートを載せ、４℃で１時間電気泳動を行ない、その後、２．５％のトリトン−Ｘ１００中で１５分間２回にわたってこのゲルをインキュベートしてＳＤＳを取除き、水中で洗浄し、１００ｍＭのトリス、３０ｍＭのＣａＣｌ₂、０．００１５％のＢｒｉｊおよび０．００１％のＮａＮ₃中で、室温で１晩インキュベートした。次に、このゲルを０．２５％のクマシーブリリアントブルーグリーン（Sigma）で染色した。ゼラチンザイモグラム上のゼラチン分解活性の位置は、青く染色されたバックグラウンド中の明瞭なバンドとして検出できる。リガンド−受容体の相互作用を通じてレトロウイルスベクターの標的を定める多くの試みがさまざまな形で成功している（Valsesia-Wittmannら、1994 J．Vir ol．68，4609 ；Cossetら、1995 J．Virol．69，6314 ；Kasaharaら、1994 Scie nce 266，1373；Matanoら、1995 J．Gen．Virol．76，3165；Somia ら、1995 Pr oc．Natl．Acad．Sci．92，7570）。ここで我々は２段階ターゲッティング戦略を採用したが、これは、プロテアーゼ−基質の相互作用の特異性を利用して、受容体によりねらいが定められるレトロウイルスベクターの感染力を活性化することを可能にする。我々は既にベクター活性化のため外因性のファクターＸａプロテアーゼの添加を用いてきたが、この方策はインビボでの遺伝子治療においては用途がかなり限られてしまうかもしれない。ここにおいて初めて、我々は、内因的に生産された疾患関連プロテアーゼによって感染力を活性化できるレトロウイルスベクターを明らかにした。このベクターは、ヒト腫瘍細胞系において、膜結合ＭＭＰにより最適に開裂および活性化される。我々が探求してきたこのターゲッティング戦略は、ＨＩＶ侵入メカニズムと興味深い相似性を有し得るものである。ＨＩＶ侵入メカニズムにおいては、ＣＤ４への最初のウイルス付着が、ｇｐ１２０における立体配座の再配置またはタンパク質分解性開裂、および最近特徴付けられたＨＩＶ共−受容体の１つへの第２のウイルス付着を導く（Fengら、1996 Science 272，872 ；Dengら、1996 Nature 381，661；Handley ら、1996 J．Virol．70，4451）。したがって、設計されたＳＵ糖タンパク質を有するＣ型レトロウイルスベクターは、ＨＩＶのような本来的に生じるウイルスにより用いられる侵入メカニズムを突き止めるためのモデルシステムとして開発できるだろう。この報告において我々が説明したタイプの標的化ベクターが、癌などのＭＭＰ関連疾患における遺伝子治療の新たな可能性を開くことが望まれる。このような疾患においては、脈管形成、浸潤性および転移能力のために、腫瘍沈積物のＭＭＰ生産が増加することが必要であり、この増加が悪い予後と密接に相関している（Murrayら、1996 Nature Med．2，461）。実施例６三量体結合ドメイン、ＴＮＦアルファおよびＣＤ４０リガンドのレトロウイルスにおける提示以下の実験は、ＴＮＦアルファまたはＣＤ４０リガンドをＮ末端伸長物として保持するキメラエンベロープを、レトロウイルスベクター粒子に組込むことができ、そこで、三量体結合ドメインは、それが融合されたエンベロープ糖タンパク質の上にキャップを形成していると思われることを示すものである。したがって、これらのキメラエンベロープを組込んだベクターの両種指向性感染力は、低い一方、三量体リガンドをこれらの表面から開裂させることによって大幅に増強される。細胞系前掲実施例においてＴＥＬＣｅＢ６細胞系を説明している。ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ４３１（ヒト扁平上皮癌；ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）およびＨＴ１０８０（ヒト線維芽細胞；ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）細胞系を、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；PAA Biologicals，UK）、ベンジルペニシリン（６０ｍｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭ（Gibco-BRL ，UK）において、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で増殖させた。Ｂ細胞系である、Ｄａｕｄｉ（ヒトバーキットリンパ腫；ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）、Ｒａｊｉ（ヒトバーキットリンパ腫；ＡＴＣＣＣＣＬ８６）およびＫ４２２（ヒト非ホジキンＢ細胞；Dryer ら、1990 Blood 75 ：709-714）、ならびにＴ細胞系である、ジャーカット（ヒト急性Ｔ細胞白血病；ＡＴＣＣＴＩＢ１５２）を、１０％のＦＣＳ、ベンジルペニシリン（６０ｍｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）で補足されたＲＰＮＩ１６４０（Gibco -BRL）において、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で増殖させた。キメラエンベロープ発現ベクターの構築ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）−４０７０ＡＳＵキメラエンベロープ発現ベクターである、ＴＮＦ−ａ．Ａ、ＴＮＦ−ａ．ＧＳ．Ａ、ＴＮＦ−ａ．Ｘ．Ａ、ＴＮＦ−ａ．ＸＡ、およびＴＮＦ−ａ．ＭＭＰ．Ａは、^SfiＩおよび^N ^ot Ｉ制限部位が両端に位置し、異なるリンカーによって野生型の４０７０ＡＭＬＶＳＵエンベロープのＮ末端コドン＋１に挿入される、ＴＮＦ−ａｃＤＮＡ（Wangら、1995 Science，228 ：149-154）を有する（図１８）。ＴＮＦ−ａ．Ａベクターは、３アラニン（ＡＡＡ）リンカーにより結合され、ＴＮＦ−ａ．ＧＳ．Ａは開裂不可能なＡＡＡＧ₄Ｓリンカーにより、ＴＮＦ−ａ．Ｘ．ＡはファＸａプロテアーゼはアルギニン残基の後ろでＩＥＧＲを開裂させ、ＰＬＧＬＷＡリンカーはゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびＭＴ−ＭＭＰに対してグリシン残基とロイシン残基との間で感受性である。ＣＤ４０Ｌ−４０７０ＡＳＵキメラエンベロープ発現ベクターは、^SfiＩおよび^NotＩ制限部位が両端に位置し、前述のように４つの異なったリンカーによって４０７０ＡＭＬＶのＮ末端コドン＋１に挿入される、ＣＤ４０ＬｃＤＮＡの部分を有する。これらのベクターは、ＣＤ４０Ｌ．Ａ、ＣＤ４０Ｌ．ＧＳ．Ａ、ＣＤ４０Ｌ．Ｘ．ＡおよびＣＤ４０Ｌ．ＭＭＰ．Ａと名付けられる（図１９）。三量体ヒトＴＮＦ−ａの１５５のアミノ酸をコードする、ＰＣＲ誘導^SfiＩ−^N ^ot ＩＤＮＡフラグメントを、ｃＤＮＡテンプレートおよび２つのプライマー、すなわち ^SfiＩ部位を有するｓＴＮＦｂａｃｋ（５’＞ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＣＣＧ，ＳｅｑＩＤＮｏ．２９）と、 ^NotＩ部位を有するｎＴＮＦｆｏｒ（５’＞ＡＡＧＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＡＣＣＧＡＡＧ，ＳｅｑＩＤＮｏ．３０）とを用いて生成させた。三量体ＣＤ４０Ｌ（Gly 116 - Leu 261 ；Karpusasら、1995 Structure，3 ： 1031-1039）の可溶性細胞外ドメインの１４５のアミノ酸をコードする、^SfiＩ−^Not ＩＰＣＲフラグメントを、ｃＤＮＡテンプレート（ＡＴＣＣ７９８１３）および２つのプライマー、すなわち ^SfiＩ部位を有するｓＣＤ４０Ｌｂ（５’＞ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＴＧＣ，ＳｅｑＩＤＮｏ．３１）と、 ^NotＩ部位を有するｎＣＤ４０Ｌｆ（５’＞ＡＡＧＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧ，ＳｅｑＩＤＮｏ．３２）とを用いて生成させた。それぞれのＰＣＲフラグメントを、^SfiＩおよび^NotＩ制限酵素で消化し、^SfiＩ−^NotIで消化されたＥＡ．１バックボーンまたはＥＸＡ．１にクローニングし、それぞれ、ＴＮＦ−ａ．ＡまたはＣＤ４０Ｌ．ＡおよびＴＮＦ−ａ．Ｘ．ＡまたはＣＤ４０Ｌ．Ｘ．Ａを得た（ Nilsonら、1996 Gene Therapy 3 ：280-286）。ＴＮＦ−ａ．ＧＳ．ＡまたはＣＤ４０Ｌ．ＧＳ．ＡおよびＴＮＦ−ａ．ＭＭＰ．ＡまたはＣＤ４０Ｌ．ＭＭＰ．Ａを得るため、^SfiＩ−^NotＩで消化されたＴＮＦ−ａまたはＣＤ４０ＬのＰＣＲフラグメントをそれぞれ、^SfiＩ−NotＩで消化されたＥ．ＧＳ．ＡバックボーンまたはＥ．ＭＭＰ．Ａバックボーンにクローニングした（Pengら、A gene delivery system activatable by disease-associat ed matrix metalloproteinases，寄託済）。この構造物の配列は、ＤＮＡ配列決定によりチェックされ確かめられた。ウイルスの生産さまざまなＴＮＦ−ａおよびＣＤ４０Ｌエンベロープ発現プラスミドを、リン酸カルシウム沈殿法（Sambrookら、1989，Molecular cloning ：A laboratory m anual）によりＴＥＬＣｅＢ６パッケージング細胞に、安定にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、３７℃で１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で増殖させ、５０μｇ／ｍｌのフレオマイシン（Sigma，Poole，Dorset， UK）を用いて選択した。耐性コロニーをプールし広げ、採収する前に、集密細胞を３２℃７２時間の条件に移した。そして、血清を含まないＤＭＥＭとともに３２℃で集密細胞を１晩インキュベーションした後、ウイルス上清を採収しろ過した（０．４５μｍ，Acrodisc，Gelman Sciences MI，USA）。そして、これらのろ過された上清を、免疫ブロット、結合アッセイまたは感染アッセイのいずれかのために用いた。免疫ブロット免疫ブロットのため、ろ過されたウイルス上清を、ＳＷ４０ローターにて４℃ で１時間３００００ｒｐｍで超遠心分離（Beckman，USA）することによって、ウイルス粒子をペレット化した。次に、ペレットを１００μｍの冷ＰＢＳ中に再懸濁し、さらなる分析まで−７０℃で保存した。ウイルスタンパク質のアリコート（１０μｌ）を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（Hybond ECL，Amensham Life Science，UK）上に電気的に移動させ、ラウシャー白血病ウイルスｇｐ７０−ＳＵエンベロープタンパク質に対するヤギ抗血清（Quality Bioteck，USA）での免疫染色によって検出し、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体（DAKO，De nmark）によって検出し、増強された化学発光キット（Amersham）によって展開した。細胞においてプロセシングされたもの（ＳＵ）およびプロセシングされなかったもの（ＳＵ＋ＴＭ）を検出するために、ウイルス補足細胞をペトリ皿（直径１０ｃｍ）上で集密状態となるまで増殖させ、冷ＰＢＳ中で１度洗浄し、そして、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトン−Ｘ、０．０５％のドデシル硫酸ナトリウム、５ｍｇ／ｍｌのデオキシコール酸ナトリウムおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含む細胞溶解緩衝液とともに、４℃で１０分間インキュベートした。溶解された細胞をプレートからかき取り、懸濁物を１００００×ｇで２０分間遠心分離にかけ、核をペレット化した。電気泳動および免疫ブロットのために上清３０μｌを用いた。結果：キメラＴＮＦ−ａ−４０７０ＡＳＵに対する免疫ブロット上にはエンベロープタンパク質の視認できるバンドはなく、エンベロープ発現がほとんどないかまたは全くないことを示した。細胞溶解産物を試験したとき、プロセシングされなかった（ＳＵ＋ＴＭ）キメラエンベロープタンパク質はあったが、検出可能なプロセシングされた（ＳＵ）エンベロープタンパク質はほとんどなかった。ＣＤ４０Ｌ−４０７０ＡＳＵに対する免疫ブロットの結果は、キメラエンベロープ発現および組込みを示し、キメラエンベロープ間の発現は、最も発現の多かったＣＤ４０Ｌ．ＭＭＰ．Ａ−ＳＵを除いては同程度であった。感染アッセイｉ．キメラベクターによる細胞の感染：三量体のリガンドによる４０７０Ａの感染力の遮断ＴＮＦ−ａおよびＣＤ４０Ｌキメラベクターの、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ４３１およびＨＴ１０８０細胞における感染力をテストした。６ウェルの組織培養プレート（Corning，New York）に１ウェルあたり約１×１０⁵細胞の密度で、３７℃ で１晩細胞を接種した。翌日培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄した。ろ過されたウイルス上清のアリコート（１ｍｌ）を用いて、８μ ｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で細胞を感染させた。６時間のインキュベーション期間の終了時に、培地を取除き、細胞を血清を含まないＤＭＥＭ中で１度洗浄し、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭを添加した。次に、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、Ｘ−ｇａｌで染色した。細胞を冷ＰＢＳ中で１度洗浄し、１５分間０．５％のグルタルアルデヒド−ＰＢＳに固定し、冷ＰＢＳ中で１度洗浄し、３７℃で１晩Ｘ−ｇａｌとともにインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子とともに形質導入されたコロニー（青いコロニー）の数を数え、力価を、酵素形成単位（ｅｆｕ）／ｍｌウイルス上清として表わした。ｉｉ．ファクターＸａプロテアーゼによるウイルス上清の処理：プロテアーゼによる感染力の遮断の反転ろ過された上清のアリコート（１ｍｌ）を、４μｇ／ｍｌのファクターＸａプロテアーゼ（New England Biolabs，UK）の存在下でまたは不在下で、３７℃で１時間、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂とともにインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、上清をＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＨＴ１０８０細胞に６時間添加し、次いで上清を除去し、１０％のＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で洗浄し、維持した後、上述と同じようにＸ−ｇａｌで染色した。結果：ＴＮＦ−ａ−４０７０ＡキメラＴＮＦ−ａ−４０７０Ａベクターの、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨＴ１０８０細胞における力価は低かった（表６）。このように感染力のレベルが低いのは、キメラエンベロープ発現のレベルが低いためであったかもしれない。しかし、これは、４０７０Ａ−ＳＵにおける三量体ＴＮＦ−ａの提示のためであったかもしれない。三量体は、両種指向性ベクターの感染力を遮断できた。なお、この両種指向性ベクターは、ヒトＴＮＦ−ａ受容体を保持しないネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞においては強い感染力を持つはずである。この三量体ＴＮＦ−ａによる感染力の遮断は、ファクターＸａプロテアーゼを添加し、ＴＮＦ−ａ．Ｘ．Ａベクター上のＴＮＦ−ａリガンドを開裂させてしまうことにより反転させることができ、４０７０Ａ−ＳＵは細胞に結合し細胞を感染させるようになった。結果的に、ファクターＸａプロテアーゼでの処理の後、ＴＮＦ−ａ．Ｘ．Ａベクターの力価は、ＨＴ１０８０細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞において、それぞれ４倍および６０倍に増加した（表７）。ＣＤ４０Ｌ−４０７０ＡキメラＣＤ４０Ｌ−４０７０Ａキメラの感染力は、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ４３１およびＨＴ１０８０細胞において野生型の感染力よりも顕著に低く（表８）、エンベロープにおけるＣＤ４０Ｌの提示がベクターの感染力を遮断することを示す。ファクターＸａプロテアーゼによるＣＤ４０Ｌ．Ｘ．Ａの処理によって、ベクターの感染力は劇的に増加する（表９）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (31)優先権主張番号９６０４５６２．０ (32)優先日 1996年３月４日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者モーリン，フランシス・ジョアンイギリス、シィー・ビィ・１４・ティ・エイチケンブリッジ、ヒューラット・ロード、19 (72)発明者ニルソン，ボゥ・ハンス・カートスウェーデン、エス−240 10 ダルビー、ハラルド・ハインツ、ベー・11 (72)発明者ペン，カー−ファイイギリス、シィ・ビィ・１２・イー・ティケンブリッジ、ハービィ・ロード、ハウス・５【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．真核細胞に感染可能な組換えウイルス粒子であって、介在するリンカー領域を介して、前記粒子の表面に提示される異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含み、前記異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染する前記ウイルス粒子の能力を調節し、かつ、前記リンカー領域に存在する特定のプロテアーゼ開裂部位に対して選択的に作用するプロテアーゼによって前記ウイルス糖タンパク質から開裂可能なものであり、そのため、前記ウイルス糖タンパク質からの前記異種のポリペプチドの開裂によって、前記糖タンパク質は標的細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用できるようになる、組換えウイルス粒子。２．プロテアーゼ開裂シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の組換えウイルス粒子。３．前記異種のポリペプチドは、真核細胞の表面のコグネイト受容体に対し特異的な結合アフィニティを有し、これに結合することによっては前記ウイルス粒子による細胞の感染は可能にならない、請求項１または請求項２に記載の組換えウイルス粒子。４．前記異種のポリペプチドは、真核細胞の表面成分に対し特異的な結合アフィニティを持たない、請求項１または請求項２に記載の組換えウイルス粒子。５．前記異種のポリペプチドは、前記ウイルス糖タンパク質の、前記真核細胞上のそのコグネイト受容体に対する結合に対して立体障害となる、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。６．前記異種のポリペプチドは、エンベロープに包まれたウイルス粒子とそれが結合された真核細胞との融合に対して立体障害となる、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。７．前記異種のポリペプチドは、オリゴマーとして提示される、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。８．前記異種のポリペプチドは、二量体または三量体として提示される、請求項７に記載の組換えウイルス粒子。９．前記異種のポリペプチドは、融合されたウイルス糖タンパク質がオリゴマー化する場合の化学量論と同じ化学量論でオリゴマー化される、請求項７または請求項８に記載の組換えウイルス粒子。１０．前記ウイルス粒子が真核細胞に結合される前、前記プロテアーゼ開裂部位は関連するプロテアーゼ（すなわちこの開裂部位を認識するもの）に接近可能である、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１１．前記ウイルス粒子が真核細胞に結合された後にのみ、プロテアーゼ開裂部位は関連する前記プロテアーゼに接近可能である、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１２．前記異種のポリペプチドが真核細胞上のそのコグネイト受容体と結合した後、前記プロテアーゼ開裂部位は接近可能となる、請求項１１に記載の組換えウイルス粒子。１３．前記ウイルス糖タンパク質が真核細胞上のそのコグネイト受容体と結合した後、前記プロテアーゼ開裂部位は接近可能となる、請求項１１または請求項１２に記載の組換えウイルス粒子。１４．前記プロテアーゼ開裂部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）および膜結合プロテアーゼからなるグループから選択されるプロテアーゼにより開裂される、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１５．前記プロテアーゼ開裂部位は、ファクターＸａ、ゼラチナーゼＡ、膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびプラスミンからなるグループから選択されるプロテアーゼにより開裂される、請求項１４に記載の組換えウイルス粒子。１６．前記プロテアーゼ開裂部位は、組織の再構築、創傷の治癒、炎症および腫瘍の浸潤からなるプロセスの１つまたはそれ以上に関係するプロテアーゼによって開裂される、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１７．特定の真核標的細胞へのねらいを定めた核酸の配達に適している、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１８．アデノウイルスを含む、前掲請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。１９．エンベロープに包まれたウイルスを含む、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の組換えウイルス粒子。２０．レトロウイルスを含む、請求項１９に記載の組換えウイルス粒子。２１．Ｃ型レトロウイルスを含む、請求項１９または請求項２０に記載の組換えウイルス粒子。２２．融合タンパク質をコードする配列を含み、前記融合タンパク質は介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含むものであり、そこにおいて、前記融合タンパク質は真核細胞に感染可能なウイルス粒子に組込むことができるものであり、さらに、前記異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染する前記ウイルス粒子の能力を調節する一方、前記融合タンパク質からの前記異種のポリペプチドの開裂によって、前記ウイルス糖タンパク質が前記真核細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用できるようにするものである、核酸構造物。２３．請求項２２に記載の複数の核酸構造物を含むライブラリであって、各構造物において、前記介在するリンカー領域をコードする配列の少なくとも部分がランダム化され、それにより、各構造物はライブラリに表わされる複数の異なったリンカー領域の１つを含む、複数の核酸構造物を含むライブラリ。２４．請求項２から請求項２１のいずれか１項に記載のウイルス粒子のライブラリであって、各粒子は、請求項２３に記載のライブラリからの単一の核酸構造物を含む、ウイルス粒子のライブラリ。２５．真核細胞の輸出経路に存在するプロテアーゼによって開裂され得るまたは開裂され得ないアミノ酸配列をコードする核酸配列について、核酸配列をスクリーニングする方法であって、真核細胞において複数の核酸配列を発現させ、その各配列は、ランダム化された介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質をコードするものであり、前記異種のポリペプチドの存在は、前記ウイルス糖タンパク質とそのコグネイト受容体との相互作用を阻害する役割を果たすものであり、そこにおいて、前記核酸配列の各々は、さらにウイルス組込みを可能にするパッケージングシグナルを含むものであり、そのために、前記真核細胞の輸出経路に存在するプロテアーゼにより認識される前記介在するリンカーが前記異種のポリペプチドの前記ウイルス糖タンパク質からの開裂を可能にして、その結果、感染性のウイルス粒子を生成させるものであり、このような開裂可能なリンカー領域の発現を誘導する核酸配列を、感染した細胞から回収することを含む、核酸配列をスクリーニングする方法。２６．プロテアーゼによって開裂され得るまたは開裂され得ないアミノ酸配列をコードする核酸配列について、核酸配列をスクリーニングする方法であって、真核細胞において複数の核酸配列を発現させ、その各配列は、ランダム化された介在するリンカー領域を介して異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質をコードするものであり、前記異種のポリペプチドの存在は、ウイルス粒子が結合された真核細胞と該ウイルス粒子との融合を阻害する役割を果たすものであり、そこにおいて、前記核酸配列の各々は、さらにウイルス組込みを可能にするパッケージングシグナルを含むものであり、前記異種のポリペプチドを保持する（したがって非感染性である）よう生成されたウイルス粒子を濃縮し、プロテアーゼを含むまたはプロテアーゼの存在下にある感染可能な真核細胞と前記濃縮された粒子とを接触させ、それにより、前記プロテアーゼにより認識される前記介在するリンカーによって前記ウイルス糖タンパク質からの前記異種のポリペプチドの開裂が可能となり、その結果として前記真核細胞の生産的感染が起こり、このような開裂可能なリンカー領域の発現を誘導する核酸配列を、感染した細胞から回収することを含む、核酸配列をスクリーニングする方法。２７．前記プロテアーゼは外因的に添加されるか、または、感染可能な真核細胞の輸入経路内に存在する、請求項２６に記載の核酸配列をスクリーニングする方法。２８．請求項２５、２６または２７のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキットであって、ウイルス組込みを可能にするパッケージングシグナル、ならびに実質的に無傷のウイルス糖タンパク質、ランダム化された介在するリンカー領域もしくはこのようなランダム化された配列を受取ることができるＤＮＡの一部および前記ウイルス糖タンパク質と真核細胞上のそのコグネイト受容体との相互作用を阻害する役割を果たす異種のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする配列を含む核酸構造物と、その使用説明書とを含む、キット。２９．実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含むウイルスによって感染可能な真核細胞をさらに含む、請求項２８に記載のキット。３０．非標的細胞にまじって存在する標的真核細胞へ核酸を選択的に配達する方法であって、標的細胞および非標的細胞に真核細胞に感染可能な組換えウイルス粒子を投与することを含み、前記粒子は、配達されるべき核酸、および介在するリンカー領域を介して前記粒子の表面に提示される異種のポリペプチドに融合される実質的に無傷のウイルス糖タンパク質を含む融合タンパク質を含むものであり、前記異種のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の真核細胞型に感染する前記粒子の能力を調節し、かつ、前記リンカー領域に存在する特定のプロテアーゼ開裂部位に選択的に作用するプロテアーゼによって前記糖タンパク質から開裂可能なものであり、そのため、前記糖タンパク質からの前記異種のポリペプチドの開裂は、前記標的細胞の近くでまたは前記標的細胞において優先的に起こり、かつ、前記ウイルス糖タンパク質が前記標的細胞の表面のそのコグネイト受容体と正常に相互作用するのを可能にする、核酸を選択的に配達する方法。３１．関連する前記プロテアーゼは、前記組換えウイルス粒子の投与後に、インビボで外因的に投与される、請求項３０に記載の核酸を選択的に配達する方法。３２．特定の前記プロテアーゼは、前記標的細胞によってまたは前記標的細胞と同じ組織において分泌されるものである、請求項３０に記載の核酸を選択的に配達する方法。