JPH04504361A - 感染性標的化複製―欠陥ビリオン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５’　ＬＴＲ，ウィルスパッケージング配列、前記Ｋ１１ｌ遺伝子の少なくとも １つのコピー及び３’　ＬＴＲを含んで成る構造体を含んで成る二元ベクター。

７−　前記ｔ　ｒ　ａ　ｎ　ｓ遺伝子がレトロウィルスエ互工、Ｌ！２ｉ及びｅ ｎｖ遺伝子である請求の範囲第６項記載の二元ベクタ８．前記Ｋ１１ｌ遺伝子が Ｈ３Ｖ−ｔχ遺伝子である請求の範囲第６項記載の二元ベクター。

９、前記構造体が前記Ｋ１１ｌ遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る請 求の範囲第６項記載の二元ベクター。

１０、移動性遺伝子要素の宿主範囲を変えるための方法であって： パッケージング細胞中に少な（とも第１及び第２構造体を形質転換し、ここで前 記第１構造体は次の構造を有するプロウィルスを含んで成り： ５’　ＬＴＲ−−Ｐ、Ｓ、−−（Ｖ、Ｇ、）０−、−−Ｇ、Ｉ。

−−（Ｖ、　Ｇ、　）。−、−−３／　ＬＴＲ（ここで前記Ｐ、Ｓ、はウィルス パッケージング配列を意図し、前記ｖ、Ｇ、は新規ウィルス粒子の成熟のために 必要とされるｔｒａｎｓ作用ポリペプチドをコードする遺伝子の１つを（ｔｒａ ｎｓ遺伝子）意図し、そして前記Ｇ、１．はＫ１１ｌ遺伝子を意図する）；そし て前記第２構造体及び場合によっては、第３及び第４構造体は次の構造を有し： （５’　ＬＴＲ）、−−（Ｐ）ｂ　−−（Ｖ、Ｇ、）　ｃ−−Ｔ、Ｒ。

（ここでＰは５’　ＬＴＲ以外のプロモーターを意図し、Ｔ。

Ｒｏは転写終結領域を意図し、ａ、ｂ及びＣは整数であり、ａ及びｈは０〜１で あり、ここでａ十すの合計は少なくとも１であり、そしてＣは１〜３である）； ここで前記構造体は、複数の前記ｔｒａｎｓ遺伝子を含んで成り；前記パンケー ジング細胞を増殖する（それによって前記遺伝子が発現され、そして前記移動性 遺伝子要素が得られる）ことを含んで成り、前記移動性遺伝子要素の宿主範囲が 、それが１種のメンバーの特異的結合対（ｓｂｐｍ）を含むように前記移動性遺 伝子要素の細胞表面糖タンパク質を変性することによって変更され、ここで前記 変性が：ａ、前記増殖の後、前記移動性遺伝子要素の前記糖タンパク質に前記ｓ ｂｐｍを非分散的に結合し；又はす、結合のための官能成分を含んで成る変性さ れた糖タンパク質が生成されるように、前記糖タンパク質をコードするｔｒａｎ ｓ遺伝子を変更し；そして 前記増殖の後、前記ｓｂｐｍを前記官能成分に非分散的に結合し；又は Ｃ０前記ｓｂｐｍを含んで成る変性された糖タンパク質が生成されるように、前 記糖タンパク質をコードするｔ　ｒａｎ上遺伝子を変更することを含んで成るこ とを特徴とする方法。

１１、前記ｓｂｐｍが、腫瘍特異的抗原又はウィルスタンパク質に対する受容体 リガンド又は抗体又はそのフラグメントである請求の範囲第１０項記載の方法。

１２、前記ｓｂｐｍが、前記特異的結合対の第２メンバーに結合することができ るＣＤ４．Ｈ８表面抗原又はそのフラグメントである請求の範囲第４項記載の方 法。

１３、移動性遺伝子要素であって、少なくとも実質的に複製−欠陥の哺乳類ウィ ルスに由来し、そして特異的結合対（ｓｂｐｍ）の１つのメンバーを含んで成り 、それによって、それが前記特異的結合対の第２メンバーを含んで成る特定の標 的細胞を感染することができることを特徴とする移動性遺伝子要素。

１４、前記哺乳類ウィルスが、レトロウィルスである請求の範囲第１３項記載の 移動性遺伝子要素。

１５、前記標的細胞が特異的結合対の少なくとも２種の異なった第２メンバーを 含んで成る請求の範囲第１３項記載の移動性遺伝子要素。

１６、前記第２ｓｂｐｍが結腸癌又は胃癌に対して少なくとも実質的に特異的な 抗原である請求の範囲第１３項記載の移動性遺伝子要素。

１７、前記第２ｓｂｐｍがｇｐ１２０又はＨ８表面抗原である請求の範囲第１３ 項記載の移動性遺伝子要素。

１８、前記第２Ｓｂｐｍがペプチドホルモン受容体である請求の範囲第１３項記 載の移動性遺伝子要素。

明　細　書 皐仇　、　−ピリオン ゛　に・　るクロス−丁フ　−レンス 本出願は、引用により本明細書に組込まれる、１９８９年３月２０日に出願され たＵＳＳＮ　３２６，１９５号の一部継続出願である、１９８９年４月５日に出 願されたＵＳＳＮ　３３４．００６号の一部継続出願である。

本発明は、パッケージング細胞及び標的の哺乳類細胞中に細胞増殖阻害遺伝子を 導入することができる複製欠陥ピリオンを含んで成る二元ベクター並びにその調 製及び使用方法に関する。

宜−五 癌の化学療法及び種々のウィルス性疾患の処理方法はしばしば、抗悪性剤又は抗 ウィルス剤の全身的な適用を使用して来た。これらの薬物は、ウィルス感染細胞 内の腫瘍細胞又はウィルスの増殖を阻害し、そして／又は殺害するために、正常 な細胞に対立するものとして腫瘍細胞又はウィルス感染細胞に対して種々の程度 の特異性を有する。従って、高い投与量のホルモン関連化合物、たとえばヘキセ ストロール又は細胞毒性剤、たとえばメトトレキセート及びナイトロジェンマス タードが癌の治療のために使用されており；ウィルス複製の阻害に対して特異的 な薬物、たとえばＡＺＴはウィルス疾患の治療のために使用されて来た。不幸に は、これらの薬物のための治療インデックスは、狭（なる傾向があり、そしてこ れらの処理の副作用が強くなる。

哺乳類細胞中に種々の遺伝的容量を導入する能力、特にヒト中に構築された遺伝 子を導入する能力は、癌の化学療法の分野及び慢性的なウィルス疾患の治療にお いて広い見通しの機会を表わす。毒素をコードする遺伝子又は実質的に致死生成 物をコードする遺伝子、集合的にはＫ１１ｌ遺伝子の癌細胞又はウィルス感染細 胞への導入は、正常な細胞に対する最少の効果を伴って、標的細胞の増殖の選択 的阻害又は殺害を可能にする。インビボで特定の標的細胞の増殖の阻害又はその 細胞の殺害の実質的な成攻は、遺伝子が発現される条件下で標的細胞中にＫ１１ ｌ遺伝子を導入することである。

細胞中にそのような遺伝子を導入する最っとも効果的な手段は、ウィルス粒子中 に封入されるＤＮＡ又はＲＮＡ０形で存在する。ＤＮＡ及びＲＮＡ自体は細胞に より十分に摂取されず；対照的に、ウィルス粒子の形でのＤＮＡ及びＲＮＡは、 ひじょうに効果的に摂取され、そして特定のウィルスのための受容体により介在 される。標的細胞への遺伝子の移行を介在することができるウィルス粒子の調製 を可能にする特定の細胞が構成された。これらの細胞は、ウィルス粒子のアセン ブリーのために必要なウィルスタンパク質を供給する。これらの特定の細胞によ りウィルス粒子中にパッケージされるゲノム、ＲＮＡ又はＤＮＡは、いづれかの 遺伝子、本出願の場合、Ｋｉｌ上遺伝子を含むことができる。ウィルスタンパク 質をコードする遺伝子が、パッケージされたウィルスゲノムから除去された。従 って、生成されるウィルス粒子は複製することができない。特定の細胞、いわゆ るパッケージング細胞は、ウィルスの増殖を支持するために、追加のウィルス、 たとえばヘルパーウィルスを必要とする構造体からヘルパーウィルスをもはや必 要としない複雑な細胞にＤＮＡ及びＲＮＡウィルスの両者について誘発して来た 。

パンケージング細胞により生成される複製欠陥性ヘルパーフリーＲＮＡ腫瘍ウィ ルスは、ヒト細胞内皮系統に由来する細胞を形質転換するために使用さＩ巣た。

これらψウィルス及びそれらのパッケージング細胞は、ネズミ白血病ウィルス、 ゲッシ動物細胞を感染するＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ ）の２種の菌株及びネズミ及びヒトの両細胞を感染する４０７０Ａ菌株に由来し た。レトロウィルスにより遺伝的に構築されたヒト細胞内皮細胞は、酵素欠損： 遺伝子療法の相互関係のために提供されて来た。しかしながら、これらの遺伝的 に構築された細胞をヒトに安定して導入するためには、骨髄移植を必要とする。

移植の調製においては、患者は、残留骨髄細胞を除去するために、移植片の調製 において致死量のＸ−照射を与えられるべきである。従って、骨髄移植は費用が かかり、そして不確実な生存性を包含する。

ウィルスパッケージングシステムはまた、皮膚繊維芽細胞中に遺伝子を移行する ために使用されて来た。皮膚繊維芽細胞の形質転換は、構築された遺伝子が致死 的な全身のＸ−照射の必要性を伴わないで、ヒトに導入され得る利点を提供する 。

ＤＮＡウィルス、たとえば５Ｖ４０（パボーバウィルス）の場合、ＣＯ５−７細 胞がヘルパーフリー感染性復製欠陥ＳＶ４０ウィルス（Ｇｌｕｚｍａｎ、１９８ １）を構成するために使用された、ＣＯ３−７細胞は、ｏｒｉ又は複製の起点を 有さないＳＶ４０ゲノムを含む。その細胞は、他の所望する遺伝的情報によるウ ィルスゲノムの感染においてＳＶ４０Ｔ抗原の置換を可能にする５Ｖ４０Ｔ抗原 を生成する。しかしながら、本発明の場合、ＣＯ３−７細胞は不適切なパンケー ジング細胞である。ＣＯ３−７細胞において発現される初期領域ＳＶ４０遺伝子 置換ベクター（Ｔａｎｔｉｇｅｎ置換）は、高いレベルの複製−欠陥怒染性ヘル バーフリーウィルスを生成するが、しかしまた、内因性ウィルスゲノムによる相 同組換えにより複製コンビテン）７ｇ染ウィルスを生成する。

後期領域ＳＶ４０置換ベク９−　（ＶＰ　Ｉ、ＶＰ２又はＶＰ３を置換する）は 、パッケージされるべき及び感染性であるヘルパーウィルスを必要とする。多分 、ＣＯ３−７細胞は、感染性ウィルスを生成するために後期遺伝子、ＶＰＩ、Ｖ Ｐ２及びＶＰ３を十分に発現することができない。

またヒンビボにおける特定の標的細胞の増殖の阻害又は殺害の実質的な成攻は、 特定の細胞タイプにおけるＫ１１ｌ遺伝子の制御された発現である。これは組織 特異的エンハンサ−／プロモーターにより達成される。エンハンサ−／プロモー ターは、特定の細胞タイプにのみ見出されるある調節タンパク質を結合するＤＮ Ａ要素である。この綴金は、遺伝子の細胞−特異的転写を導びく、エンハンサ− ／プロモーターは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肝細胞、肝癌細胞、ＨＩＶ−１感染細胞及 び多くの他の組織／器官のために記載されて来た。従って、毒素遺伝子への組織 −器官特異的エンハイブー／プロモーターの結合は、特定の細胞タイプを殺害す ることができる。

細胞表面ウィルス受容体の相互作用は時々、細胞特異的であるが、そのような相 互作用は、必ずしも組織／器官又は細胞特異性ではない。従って、特定の細胞タ イプに対する増強された特異性を有する感染性複製欠陥ウィルスベクターを開発 することに特定の興味がある。これは、組織特異性ウィルス結合及びＫ１１ｌ遺 伝子の組織／器官特異性転写の組合せにより達成され得る。特定のパッケージン グ細胞により生成されるヘルパーフリーピリオンは、特定の細胞タイプに標的を 向けるピリオンを助ける性質により構成される。さらに、組織特異的エンヘンサ ー／プロモーターの転写制御下での及びパッケージング細胞により包封されるＫ ｉ　ｌ　１遺伝子（選択された細胞タイプにおいてのみ毒素遺伝子を発現できる ベクターを生成する）が構成される。従って、治療学は次の２種のレベルの選択 性により生成される：細胞表面結合、及び遺伝子発現の時間特異的制＠、これら のベクターは、標的細胞、たとえばウィルス感染細胞又は癌細胞の殺害において 、増強された特異性を有する。

ΣｊＬ幼吠 ネズミ白血病ウィルス株４０７０Ａからのｅｎｖ遺伝子及びＭｏＭｕＬＶからの ｍ及びＵ±遺伝子と導入することによって製造される。ヒト細胞を感染すること ができるレトロウィルスパッケージング細胞の製造法は開示されている。

これらのウィルス粒子は、ヒト細網内皮細胞、ヒト肝細胞及びヒト表皮ケラチン 細胞を感染するために使用され来た。！。

Ｍ、Ｖｅｒｍａ、　Ａ、Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、Ｅｖａｎｓ＋　１９８ ５年７月２９日に出願された−０８６００９２２及び１．Ｒ，Ｍｏｒｇａｎ　ａ ｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ＋　１９８６年６月３０日に出願された−０８ ７００２０１を参照のこと。

ヘルパーウィルスの存在下で宿主細胞性非ウィルス性ＲＮＡを非特異的にパッケ ージングするウィルス粒子は、Ｌｉｎ１ａｌ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８１）３８　：　３８０〜３８２　；　Ｌｉｎ１ａｌ、 　ｆｌｅ、、ｃｅ旦（１９７８）旦：　１３７１〜１３８１　；　Ｗａｔａｎａ ｂｅ　ａｎｄ　Ｔｅｍ１ｎ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　 （１９８２）７９　：　５９８６〜５９９０に記載されている。ネズミ及び鳥類 遺伝子療法のために企画される、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭ ｕＬＶ）及び鳥類細胞内皮ウィルスから生成されるヘルパーフリーレトロウィル スが、Ｍａｎｎ、　星ｅ　、　＊Ｃｅ１ｌ（１９８３）３３　：　１５３〜１５ ９　；及び−ａｔａｎａｂｅ　ａｎｄ　Ｔｅｍ１ｎ＋　Ｍｏ１ａｎｄ　Ｃｅｌ　 Ｂｉｏｌ（１９８３）　３　：　２２４１〜２２４９により開示された。

広範囲の種類の哺乳類細胞、たとえば種々のヒト細胞を感染することができるヘ ルパーフリーパッケージドウィルス粒子が、Ｃｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａ ｎ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＩＪＳＡ　。

（１９８４）８−１　：　６３４９〜６３５３により記載されている。類似する パッケージング細胞系が、Ｍｔｌｌｅｒ、　星＆、、Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ（１９８５）　５　：　４３１〜４３７により記載された。

ヘルパーフリー複製欠陥ＲＮＡ腫瘍ウィルスが、フィブロネクチン産生細胞系（ Ｓｃｈｓｅａｒｚｂａｕｅｒ＋　星＋？、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃ ｉ　ＵＳＡ　（１９８７）８４　：　７５４）　；クラス■ヒト主要組織適合性 抗原（ＫｏｒＩｌａｎ　ｆ、Ｋｅ、、Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ ＳＡ　（１９８７）８４　：　２１５０）　；成長ホルモン（Ｍｏｒｇａｎ、星 ？、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）２３７　：１４７６）　；アデノシンデア ミナーゼ（Ｐａｌｍｅｒ、星煮−＋Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ　（１９８７）８４　：　１０５５）　；第■因子（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　ａｎ ｄ　Ｖｅｒｍａ。

Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８８）８５　：　３１５０）　； 及びフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（Ｐｅｎｇ＋　星＆、、Ｐｒｏ　Ｎａｔ ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８８）８５　：　８１４６）を確率するた めに使用されて来た。パッケージングシステムはまた、肝細胞（Ｌｕｄｌｅｙ、 星＆、＋Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８７）８４　： 　５３３５及びＷｏｌｆｆ、星？、＋Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ（１９８７）８４　：　３３４４）及び皮膚繊維芽細胞（Ｍｏｒｇａｎ＋ ’ｃζ、、　（１９８７）肚；　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　ａｎｄ　Ｖｅｒｎａ、　（ １９８８）前足；及びＰａｌｍｅｒ、星イ、、（１９８７）前記）を形質転換す るためにも使用されて来た。

隣接する宿主由来の染色体ＤＮＡ中への５’　ＬＴＲからのＤＮＡの制御されて おらず且つ実質的な腫瘍化転写を排除するために５’　ＬＴＲの長い末端反復体 中の５’ＬＴＲｅｉ域、エンハンサ−配列、ＣＡＡＴ　ｂｏｘ”及び’ＴＡＴＡ ｂｏｘ”の変更が、Ｙｅｅ、星＆、、Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ ＳＡ　（１９８７）８４　：　５１９７により記載されて来た。３’　ＬＴＲの 変性が、Ｙｕ、　ｆｔ＆　、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ （１９８６）８３　：　３１９４〜３１９８にり記載された。感染性ウィルスの 組換え及び回収のための可能性が減じられるパッケージング細胞がＤａｎｏｓ　 ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８８）旦５　：　６４６ ０〜６４６４　；　Ｂｏｓｓｅｌｎ＋ａｎ、ｑ？、、Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ　（１９８７）　７　：　１７９７〜１８０６　；及びＭａｒｋｏｗ ｉｔｚ、ｑ？、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　（１９８Ｂ）６２：１１２０〜１１２４によ り記載された。

パッケージング細胞がまた、アデノウィルスのために単離された（Ｓｈｉｒｏｋ ｉ　ａｎｄ　Ｓｈｉ＠ｏｊｏ＋　１９７１　；　Ｇｒａｈａｔａｆｔζ、、１９ ７７；及びＧｒｏｄｚｉｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｋｌｅｓｓｉｇ　１９８０）。これ らのパッケージング細胞を用いて、Ａｄ５の宿主域突然変異体（Ｈａｒｒｉｓｏ ｎ　ｆｔ　煮、　＋１９７７）、　Ａｄ５の欠失突然変異体（Ｊｏｎｅｓ　ａｎ ｄ　５ｈｅｎｋｅ　１９７９）＋　ＭＤＩ２のｔｓ突然変異体（Ｓｈｉｒｏｋｉ 　ｆｉ！　煮、　、　１９７６）及び多量のアデノウィルスベクター発現外来性 遺伝子（Ｂｅｒｋｎｅｒ星（！’　、、　１９８７　；　Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ａ ｎｄ　ｌ１ａｓｓｅ１１．１９８７　；　５ｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ星ｅ　＋ｌ 　１９８７　；　Ｘｈｕ星煮、、　１９８８）が得られた。同様に、単純ヘルペ スウィルスのためのパッケージング細胞が単離された＜Ｋｉｙａｕｒａ　ｆｉ＆ 　煮、　、　１９７４　；Ｍａｅｎａｄ　ａｎｄ　Ｔｉｍｂｕｒｙ、　１９７６ ）　ｏヘルペスウィルスパッケージング細胞を用いて、単純ヘルペスウィルスタ イプ２のｔｓ突然変異体（Ｋｉｍｕｒａ　２？、＋１９７４　；　Ｍａｃｎａｂ ａｎｄ　Ｔｉｍｂｕｒｙ　１９７６）　；及び外来性遺伝子のヘルペスウィルス 発現ベクター（Ｒｏｉｚｍａｎａｎｄ　Ｊｅｎｋｉｎｓ＋　１９８５　；　Ｔｈ ｏａ＋ｓｅｎ　星＆、＋１９８７）が調製された。

プロモーター及びエンハンサ−は、哺乳類細胞においてｍＲＮＡをコードする遺 伝子を調節する。プロモーターは、転写の出発部位からのすぐ上流の５′部位に 位置する。エンハンサ−は、プロモーターからの転写の速度を早め、離れた拒理 でｃｉｓ−結合プロモーター上に作用し、配向依存性でな（、そして転写単位か ら上流（５′）及び下流（３′）に位置する。エンハンサ−はまず、ウィルスの ために説明された。

後に、ホルモン及び金属イオンによる誘発性で且つ特定の組織においてのみ見出 されるエンハンサ−が説明された（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｔＳ、Ｇｏｏｄｂ ｏｕｒｎ、　ａｎｄ　Ｊ、＾、Ｆｉｓｈｅｒ＋　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３６：１２３７〜１２４５）。１種の組織タイプ上でのみ合成されるタンパク質 が組織特異的エンハンサ−により時々調節される。たとえば筋肉中のアクチン及 びミオシン；眼中のレンズ結晶。−に−１ｌｌ遺伝子の組織特異的発現のために は、組織特異的エンハンサ−が特定の興味の対象である。

Ｂ細胞及びＴ細胞エンハンサ−が最良の特徴づけられた組織特異的エンハンサ− である。免疫グロブリンは、Ｂ細胞においてのみ合成される。ＩｇＧＨ及びＬ鎖 エンハンサ−が、塩基対の最少機能領域を有する）のイントロン内に見出された （Ｇｉｌｌｉｅｓ、　Ｓ、Ｄ、、Ｓ、Ｌ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｖ、Ｔ、Ｏｉ、 　Ｓ、Ｔｏｎｅｇａｉｌａ、　Ｃｅ１１３３　：　７１７〜７２８）、これらの エンハンサ−は、Ｂ細胞においてのみ機能し、Ｔ細胞、結腸細胞及び試験された 他の組織タイプにおいては機能しない。免疫グロブリン鎖エンハンサ−は、Ｂ細 胞においてのみ存在するエンハンサ−結合タンパク質が遺伝子ｃｉｓからエンハ ンサ−への転写を活性化するので、Ｂａ１ｌ胞において機能する。同様に、Ｔ細 胞特異的子細胞受容体（ＴＣＰ）は、Ｔ細胞上においてのみ見出される。ＴＣＲ の発現は、Ｔ細胞エンハンサー二α鎖エンハンサ−（Ｗｉｎｏｔｏ、　Ａ、、ａ ｎｄ　Ｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ＋　１９８９＋　ＥＭＢＯＪ、　８　：　７２９ 〜７３３）及びデルタ鎖エンハンサ−（Ｒｅｄｏｎｄｏ、　Ｊ、Ｍ、、Ｓ、Ｈａ ｔａ＋　Ｃ，Ｂｒｏｃｋｔｅｈｕｒｓｔ、　ａｎｄ　Ｍ、Ｓ−Ｋｒａｎｇｅｌ、 １９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　：１２２５〜１２２９）により制御される 。

肝臓特異的エンハンサ−が、肝臓に独占的に発現される遺伝子のために見出され た。これらは：αフェトタンパク質、トランスチレチン、α１−抗トリブトシン 、フィブリノーゲン及びアルドラーゼを包含する（Ｃｏｕｒｔｏｉｓ＋　Ｇ、、 Ｊ、Ｇ、Ｍｏｒｔｏｎ。

Ｌ、　Ａ、Ｃａｏ＋ｐｂｅｌｌ、　Ｇ、Ｆｏｕｒｅｌ　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｃｒａ ｂｔｒｅｅ、　１９８７＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　６Ｂ８〜６９２　； 　Ｆｅｕｅｒｍａｎ、　Ｍ、Ｈ，、Ｒ，Ｇｏｏｄｂｏｕｔ、　Ｒ，Ｓ、Ｉｎｇｒ ａｔｓ、　ａｎｄ　Ｓ、Ｍ、Ｔｉｌｇｈｍａｎ、１９８９＋　Ｍｏ１ｅｅ、Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、　９　：　４２０４〜４２１２）。肝細胞に対してのみならず 、また肝癌細胞に対しても特異的であるＢ型肝炎Ｓ抗原エンハンサ−において特 に興味がある（Ｃｈａｎｇ＋　Ｈ，に、、Ｂ、Ｙ、Ｗａｎｇ＋　Ｃ，Ｆｌ、Ｙｕ ｈ、　Ｃ，Ｌ、Ｗｅｉ、　ａｎｄ　Ｌ。

Ｐ、　Ｔｉｎｇ＋　１９８９＋　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９　：５ １８９〜５１９７；Ｃｈａｎｇ。

Ｏ，に、、ａｎｄ　Ｌ、Ｐ、Ｔｉｎｇ＋　１９８９＋νｉｒｏｌｏｇｙ　１７０ 　：１７６〜１８３）。

光皿皇！ｈ 動物ウィルス、便利にはレトロウィルス又はバボーバウイルスに由来する新規の 複製欠陥二元ベクター並びにその調製法及び使用が、哺乳類標的細胞にＫ１１ｌ 遺伝子を導入し、そして発現するために供給される。二元ベクターは、（１）新 規のウィルス粒子の成熟のために必要とされるｔ　ｒａｎｓ作用ウ作用ウィルス ポリペフッドドする核酸配列をその染色体に含むパフケージング細胞及び（２） 少なくとも１種のＫ１１ｌ遺伝子がパッケージング細胞により誘発されるｔ　ｒ ａｎｓ作用ウィルス機能を置換している変性されたゲノムを含んで成る移動性遺 伝子要素を含んで成る。移動性遺伝子要素の変性されたゲノムは、それぞれレト ロウィルス及びバボーバウィルスのためのψ配列又はｖｒｆを含む、パッケージ ング細胞における変更されたウィルス表面受容体成分遺伝子の発現により、又は ピリオンへの特異的結合対の１つのメンバーの共有結合により移動性遺伝子要素 中に導入される変性されたりガント−受容体相互作用が、その移動性遺伝子要素 を標的細胞に向けるために使用される。パッケージング細胞が、移動性遺伝子要 素を生成するために増殖される。Ｋ１１ｌ遺伝子は、移動性遺伝子要素による感 染により直接標的細胞に移される。パッケージング細胞は、次に標的細胞を感染 する移動性遺伝子要素の特効性を提供するためにインド、弘で移動性遺伝子要素 を生成することができる。Ｋ１１ｌ遺伝子の組織特異的発現は、Ｋ１１ｌ遺伝子 の発現を制御するために追加のＤＮＡ配列、たとえば組織特異的エンハンサ−／ プロモーターを導入することによって、任意に達成され得る。

’ｏａｔ豆 第１図は、パンケージング細胞ＰＣＲＩＰｅｎＶ−の構造を示す。

第２図は、ｐＮｃｌにおけるＭｏＭｕＬＶプロウィルスの構造を示す。

第３図は、ｐＵｃ１９−ｅｎｖ−のＮｄｅｌ−Ｎｓｉｌ挿人体の構造を示す。

第４図は、プラスミドｐＮＣ３Ｈ−１，ｐＮＣ−３Ｒ−２等の構造を示す。

第５図は、ｐＮＣ−ＣＤ４の構造を示す。

第６図は、エエエ、ＬＬＬ及びｅｎｖの第二コピーを有する３種の構造体を示す 。

第７図は、ｐＮＣ−Ｈ３Ｖ−ｔｋ　（２）　の構造を示す。

第８図は、ｐＮＣ−Ｈ３Ｖ−ＡＳの構造を示す。

第９図は、ｐＮＣＨ３Ｖ　Ｘ　（ここでＸはプロテアーゼ、リボヌクレアーゼ又 はＤＮアーゼである）の構造を示す。

第１０図は、ＳＶ４０の遺伝子地図を示す。

第１１図は、ＶＰＩ、ＶＦ６及びＶＦ３についての３種の構造体を示す。

第１２図は、ｐＮｃＨ３ＶＫｉ　１１の構造を示す。

第１３図は、ｐＮｃｓＶ　１の構造を示す。

第１４図は、ジフテリアＡ　ｔ　ｏ　ｘ挿入体の構造を示す。

第１５図は、ＳＶ４０及びＬＰＶゲノムの代表的な図を示す。

第１６図は、ｐＮＣＬＶ２及びＬＰＶベクターの構造を示す。

第１７図は、産生ミニクロモソームの構造を示す。

第１８図は、Ｔ細胞エンハンサ−／プロモータージフテリアＡ毒素の構造を示す 。

第１９図４；！、ＨＩＶ−１エンハンサ−／プロモータージフテリアＡ毒素の構 造を示す。

第２０図は、Ｂ型肝炎ウィルスエンハンサ−／プロモータージフテリアＡ毒素の 構造を示す。

豊定■■盪皇坦ｌ 新規二元ベクター及びその調製方法及び使用法が、特定の哺乳類宿主細胞中で転 写し、そして発現することができる基ｉｌｌ遺伝子の前記特定の宿主細胞、特に ヒト細胞中への導入のために提供される。その二元ベクターは、パフケージング 細胞及び移動性遺伝子要素を含んで成る。ベクターの細胞結合のための宿主範囲 は、ベクターの移動性遺伝子要素の細胞表面リガンド−受容体相互作用の変性に より決定される。

細胞結合における変性は、パッケージ細胞中への、変性されたウィルス表面受容 体成分遺伝子、たとえばレトロウィルスｅｎｖ遺伝子又はパボーバウィルスのＶ ＰＩ遺伝子の導入により達成され得る。他方、ピリオン表面受容体成分は、ベク ターが標的細胞上にｓｂｐの他のメンバーを含んで成る細胞表面抗原又はペプチ ドホルモン受容体に結合するように、細胞表面抗原又はペプチドホルモンに対す る特異的結合対（Ｓｂｐ）の１つのメンバー、たとえば抗体を含んで成る標的手 段に結合され得る。

標的宿主細胞の増殖の阻害又は殺害は、Ｋ１１ｌ遺伝子、たとえば毒素遺伝子、 アンチセンス転写物又は他のｔ　ｒａｎ土作用制御要素をコードする核酸配列の 導入により提供される。さらに、そのベクターは、スクリーニング又は選択によ り標的細胞におけるベクター又はそのフラグメントの検出のために使用され得る マーカーを包含することができる。パッケージング細胞は、標的細胞中への対象 の核酸配列を含むミニクロモソームの移行のために適切な条件下で標的哺乳類細 胞を怒染せしめるために使用されるミニクロモソームを含む移動性遺伝子要素を 生成するために増殖される。Ｋｉｌ±遺伝子に関係する遺伝子型又は表現型が発 現される場合、その結果は、細胞増殖の阻害又は標的細胞の殺害である。

Ｋ１１ｌ遺伝子の組織特異的発現はさらに、標的細胞殺害の特異性を狭くする。

組織特異的遺伝子発現は、高い特異性のエンハンサ−／プロモーターの使用によ り達成され；それは、あるタイプの細胞においてのみ存在するタンパク質に結合 されるＤＮＡ配列である。これらのタンパク質は、これらの細胞においてのみ発 現されるある遺伝子の発現を制御する転写の活性化剤である。組ｔ／ａ／器官特 異的エンハンサー／プロモーターの存在は、疾病が生じた特定の器官又は細胞タ イプに抗−瘍剤及び抗−ウィルス剤を向ける機会を提供する。

これは、（ａ）毒性又は実質的に毒性のタンパク質をコードする細胞遺伝子中に 導入し、そして（ｂ）高い特異性のエンハンサ−／プロモーターを有するそのよ うな遺伝子の発現を制御することによって行なわれる。従って、１種の特定の器 官の細胞、ウィルスのための受容体を有する細胞及び特定の活性化剤、たとえば エンハンサ−／プロモーターを有する細胞が殺害されるであろう。

本発明の目的は、特定の標的細胞にワンウェイ非可逆的手段で、Ｋ１１ｌ遺伝子 として一般的に言及される抗増殖性又は細胞毒性遺伝子物質を伝達することがで きる二元ベクターを生成することである。次のものを含む種々の手段のいづれか で細胞増殖の阻害又は細胞毒性を提供する核酸配列かに上土上遺伝子により向け られるゆＫ１１ｌ遺伝子は、必須細胞成分又は腫瘍遺伝子のアンチセンス転写物 の合成を提供することによって、必須細胞の機能に直接影響を及ぼすことができ る。Ｋ１１ｌ遺伝子はまた、増殖細胞、たとえばジフテリア毒素、又は阻害又は 毒素化合物の形成を触媒することができる毒素、たとえばアシクロバー（ａｃｙ ｃｌｏｖｔｒ）からａ　ｃ　ｙ　１　ｏ−ＧＴＰを形成するカスケード反応の一 部であるヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖ−ｔｋ）を直接阻害するこ とができるポリペプチドをコードすることができる。後者の場合、アシクロバー が投与される場合、抗ウィルス剤ａｃｙｌｏ−ＧＴＰが形成される。

二元ベクターは、（１）新規のウィルス粒子の成熟において必要とされるｔ　ｒ ａｎｓ作用ポリペプチドをコードするパッケージング細胞及び（２）また悪染性 の複製不完全ピリオン及びミニクロモソームを含んで成る移動性遺伝子要素から 成る。二元ベクターは次の通りに調製される。ｔｒａｎｓ作用ウィルス機能をコ ードするウィルス遺伝子が野生型ウィルスゲノムから除かれ、そしてウィルスの ために許容できるパッケージング細胞の染色体中に挿入される。“パッケージン グ細胞”とは、必要なウィルスパッケージングタンパク質を生成する遺伝的に構 成された哺乳類組繊細胞を意図する。ウィルスパッケージングタンパク質のため の遺伝子物質は、移動性遺伝子要素により移行されず、従ってウィルスは複製す ることができない。パフケージング細胞により生成されるピリオン、すなわち二 元ベクターの移動性要素は、標的細胞の増殖を阻害し、又は殺害するように企画 された遺伝子が、パッケージング細胞の染色体中に導入されたｔｒａｎｓ作用機 能を置換している変性されたゲノム又はミニクロモソームを含む。

パッケージング細胞は、ウィルスのために許容できるいづれかの動物細胞、又は ウィルスのために許容できるようにするために変性された細胞であり；又はパッ ケージング細胞は、たとえば形質転換剤、たとえばリン酸カルシウムの使用によ りプロウィルス構造体のために許容性にされる細胞であり得る。レトロウィルス のためにパッケージング細胞として使用され得る細胞系は、ゲラ歯動物細胞、た とえばＮＩＨ／３Ｔ３細胞及び他のネズミ細胞；懸濁細胞系、たとえばチャイニ ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＬ９２９細胞を含み；パボーバウィルス のための細胞系はアフリカングリーンモンキーからのＢ５Ｃ−１又はＶＥＲＯ細 胞又はヒト細胞、たとえばＷＩ３８を包含し；そしてアデノウィルスのための細 胞系はＫＢ細胞及びＨ，ｅＬａ細胞を包含する。パッケージング細胞として特に 興味ある細胞は、特にグルココルチコイド受容体に欠失するヒト細胞である。多 くの場合、ポリオーマウィルスＴ抗原によるトランスフェクションにより正常な ヒト細胞を不滅化することが所望され、そして血清フリー懸濁培養にその培養を 適合せしめることが所望される。

所望する複製欠陥移動性遺伝子要素を生成することができるパッケージング細胞 を調製するために、少なくとも第１及び第２構造体がパッケージング細胞中に形 質転換され、その構造体はレトロウィルスのために下記に例示される。第１構造 体、すなわち移動性遺伝子要素は、転写の順に次の成分を有して調製される： ５’、ＬＴＲＰ、Ｓ、　（Ｖ、Ｇ、　）’＋１−！　Ｇ、！。

（Ｖ、Ｇ、）ｏ−ｚ　３’　ＬＴＲ（ここで５’　ＬＴＲ及び３’　ＬＴＲはそ れらの通常の意味を有し；Ｐ、Ｓ、はウィルスパッケジング配列を意図し；Ｖ、 Ｃ，はｔｒａｎｓ作用遺伝子を意図し、そしてＧ、１．はＫ１１ｌ遺伝子を意図 し、そして構造体の成分は操作的に結合される）。

パッケージング細胞を構成するために使用される、第２構造体、及び場合によっ ては第３及び第４構造体は、転写の方向に次の成分、たとえば転写開始領域、ｌ ！ＪＬ、　ｕ±及びｅｎｖ遺伝子の少なくとも１種の遺伝子及び転写停止領域を 含んで成り、ここでそれらの成分は操作的に結合される。これらの構造体の一般 的な構造は次の通りである：（５’　−ＬＴＲ）、　−−ＣＰ”）　ｔ、−（Ｖ 、Ｇ、）ｃ−−Ｔ、Ｒ（ここで５’　ＬＴＲ及び■、Ｇ、は上記の通りであり； Ｐは５’　ＬＴＲ以外のプロモーターを意図し、Ｔ、Ｒは翻訳停止領域、ポリア デニル化シグナル及び転写ターミネータ−を意図し；ａ、ｂ及びＣは整数であり 、ａ及びｂは０〜１であり、ここでａ十すの合計は少なくとも１であり、そして Ｃは１〜３、通常１〜２である）。さらに、Ｖ、Ｃ，は同じｔｒａｎｓ作用遺伝 子、たとえばＪＬＬＪＬＪＬＬＪＬ又は■ユ±　Ｕ上の一つのコピー又は多くの コピーを含んで成る。従って、−ａ的に、第２構造体は、パンケージングφ配列 及び３’　ＬＴＲを有さない、ウィルスエエエ及びＵ±遺伝子の個々の少なくと も一つのコピーを供給するであろう。第３構造体は、ψ配列及び３’　ＬＴＲを 有さない変性されたｅｎｖ遺伝子を含むであろう、すでに供給されていなければ 、第４構造体は、ψ配列及び３’　ＬＴＲを有さないエエｌ又はＬ立上遺伝子の 少なくとも１つのコピーを供給するであろう。パンケージング細胞により生成さ れる所望する複製欠陥ピリオンは、５’ＬＴＲ及びψ配列を含むゲノム、Ｋｉ　 ｌ　Ｉ遺伝子及び３’　ＬＴＲを有するであろう。ψパッケージング配列及び１ ユニ、！土工及び変性されたｅｎｖ遺伝子を供給する構造体は、いづれかの動物 のレトロウィルス、特にＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス、鳥類の白血病ウ ィルス又はＨＴＬＶウィルスに起因することができる。

上記構造体に類似する構造体が、バボーバウィルスを用いて二元ベクターのため に調製され得、ここで工ｌｌ、ＬＬＬ及びｅｎｖはＴ−抗原ＶＰＩ、ＶＰ２及び ＶＦ６により置換されている。Ｐ、すなわちプロモーターは好ましくは、誘発性 エンハンサ−／プロモーター、たとえばメタロチオネインプロモーター又はネズ ミ哺乳類（ＭＭＴＶ）プロモーターである。

実質的に複製欠陥性のピリオンを得るためには、感染ウィルスの可能性ある相同 組換え再構成を制限すべきである。従って、パッケージング細胞により実質的に 複製欠陥性のピリオンの生成するためには、パッケージング細胞の調製のための 好ましい方法は、少なくとも２種の突然変異ウィルスゲノム、最っも好ましくは ３種の突然変異ウィルスゲノムをパフケージング細胞中に導入することである。

この包含スケムは、感染性ウィルスの再構成に導びく相同の組換えを効果的に表 わすであろう。２種のｔｒａｎｓ作用ウィルス遺伝子が使用される場合に生じる 組換えの確立はｌＸｌ０−’以下であり；３種の異なった突然変異ウィルス遺伝 子の使用により、感染性ウィルスの組換え再構成の確立はｌＸｌ０−”以下にな る。

レトロウィルスに関しては、パッケージング細胞の構成の最っとも好ましい方法 において、エエＪＬ、　ＬＬＬ及びｅｎｖ遺伝子が、いづれか従来の手段、たと えばリン酸カルシウム沈殿法により、３種の異なったプラスミド上で、好ましく は連続的にいづれかの順序でパッケージング細胞中に形質転換される。ＤＮＡウ ィルスに関しては、バボーバウィルスから調製され、そしてＳＶ４０の後、パタ ーン化されるようなベクター、すなわち大きなＴ抗原を有するか又は有さない５ Ｖ４０ｏｒｉが、二元ベクターの移動性要素に維持され得る。Ｔ抗原はまた、パ ッケージング細胞により供給され得るが、しかしｏｒｉは移動性遺伝子要素に存 在すべきである。Ｔ抗原が移動性遺伝子物質に存在する場合、ミニクロソームは 標的細胞中で高いコピー数に複製し、Ｋ１１ｌ遺伝子の発現を高める。Ｔ抗原が ミニクロソームに存在しない場合、そのミニクロソームは標的細胞中で複製しな いであろう。ＳＶ４０の後でパターン化されたパボーバウィルスベクターは、天 然においてエビソーム性であり且つ一時的である。従って、ミニクロモソームに よりコードされるＫ１１ｌ遺伝子は、活性態様で細胞を殺すのに十分に致死的で あるべきである。これは、Ｋ１１ｌ遺伝子をＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ及びプロテ アーゼのような活性に制限する。これらのベクターは一時的であるので、それら が宿主細胞を永久的に遺伝的に構築しない場合、それらはヒトへの使用のために 特に魅力的である。

高い力価のピリオンを産生ずるためには、高い産生性パッケージング細胞が、た とえばイムノアッセイ、ＰＡＧＥ及び同様の手法により、量的により多くのＩＬ ＩＬ、Ｌｌ上及び土エヱ又はＴ抗原ＶＰＩ、ＶＦ６及びＶＰ３発現生成物を製造 するパッケージング細胞のためにトランスフェクトントをスクリーニングするこ とにより同定される。高い産生性パンケージング細胞が同定された後、すぐにそ れらは、Ｋ１１ｌ遺伝子を含むプロウィルス構造体を用いてトランスフェクトさ れ得る。得られるトランスフェクトントは、上記のようにして選択され得、そし てそのようにして得られたパッケージング細胞は、ウィルス遺伝子を発現し、そ して所望する実質的に複製欠陥性ピリオンを生成するために増殖される。この目 的は、ワンウェイ非可逆的手段で標的細胞に遺伝子物質を移行することができ、 そしてウィルスのために許容できる宿主細胞の染色体中に導入されるべきｔ　ｒ ａｎｓ作用ポリペプチドの遺伝子のための二元ベクターを生成することである。

パッケージング細胞を有さない染色体的に組込まれた遺伝子は、超感染性ウィル スゲノム中に移行され得す、さらにミニクロモソームは感染ウィルスを産生ずる ことができるはずである。

類似するベクターはまた、ＤＮＡウィルス、たとえばアデノウィルスタイプ、ヘ ルペスウィルスおよびバポーバウィルス、たとえばＳＶ４０、リンパ栄養性パボ ーバウィルス（ＬＰＶ）、ＢＫウィルス（ＢＫｖ）及びＪＣウィルス（ＪＣｖ） に由来することができる。バポーバウィルス、すなわちまたプソイドピリオンと 呼ばれる、移動性遺伝子要素中にパンケージングするミニクロモソーム（移動性 ＤＮＡ）に関しては、構造体のための最少必要条件は、ｏｒｉ及び約７５〜１０ ２％の５２４３ｂｐを有する環状ゲノムである。ＳＶ４０の場合、ＣＯ３−７細 胞が必要なｔｒａｎｓ作用遺伝子を捕捉することができ、ヘルパーフリーの感染 性（但し複製欠陥性）のＳＶ４０ウィルスの構成を可能にすることができる（Ｇ 　ｌ　ｕ　ｚｍａｎ、１９８１）、ＣＯ３−７細胞は５Ｖ４０Ｔ抗原を産生じ、 従ってウィルスゲノム中のＳＶ４０Ｔ抗原は他の遺伝子物質により置換され得る 。特に、ＳＶ４０．ＬＰＶ、ＢＫ及びＪＣウィルスのｔ　ｒａｎｓ作用遺伝子の ゲノム及び分布が十分に確立される。従って、外側のカプシドタンパク質により 制御される場合、ウィルス結合の細胞タイプに影響を及ぼす部位特異的突然変異 が容易に評価され得る。

ＤＮＡウィルス、特にバボーバウィルスは、移動性遺伝子物質の源としてレトロ ウィルスよりも利点を提供することができる。最っとも研究されたＤＮＡウィル ス、すなわち５ｖ４０は、ウィルス精製、化学結合法、製造及び品質制御を容易 にする多くの所望する特徴を有し、すなわちウィルスはパッケージング細胞、た とえばＣＯ３−７及びＣＭＴ４において１０”　〜１０’　ｐｆｕ　／＠ｌの力 価に増殖し；ウィルスは４°Ｃで安定性であり；ウィルスの感染性が過酷な処理 、たとえばデオキシコレート及び塩化セシウム処理を耐え；十分にパッケージさ れた感染性ウィルスが塩化セシウムにおける欠損する空のカプシドから容易に単 離され得；ウィルスがヒトにおいて疾病を引き起こさず；Ｓ■４０ミニクロモソ ームは正の選択性圧力を伴わないで感染された細胞から一定不変に失われ；形質 転換（＝）及び複製（＋）であるＴ抗原突然変異体が、Ｔ抗原誘発性腫瘍の関与 を回避するＳＶ４０ミニクロモソーム複製を支持するために使用され得；ＳＶ４ ０ミニクロモソームが遺伝的に安定し：そして細胞殺害遺伝子が、多くの細胞タ イプにおいて活性的である初期ＳＶ４０プロモーター又は高いＴ−細胞選択性で あるＨＩＶ−ＩＬＴＲ及びＴ−細胞受容体エンハンサー／プロモーター、高い選 択性であるＩｇＧＨ鎖エンハンサ−／プロモーター又は高い肝細胞癌細胞選択性 であるＢ型肝炎ウィルス表面抗原エンハンサ−／プロモーターにより制御され得 る。

奪格ウィルス療法を考慮する場合、バボーバウイルスミニクロモソームの過渡発 現は、ヒトの遺伝子工学に関与する関心に有意な改良点を表わす。奪格ウィルス 療法の目的は、副作用を伴わないで又はヒト染色体との残留する遺伝的妨害を持 続しないで細胞タイプに特異的に影響を及ぼすことである。

両栄養性レトロウィルスが遭遇する多くのヒト細胞にプロウィルスを運び、そし てそれを形質転換する場合、この目的は達成されない。多くの細胞は、必要では ないが、永久的に遺゛伝的に構築される。たとえばＳＶ４０後の後にパターン化 されたバポーバウィルスミニクロモソームの使用により、遺伝子の組織特異的発 現が達成され得るが、非標的細胞の永久的な遺伝子学的構築は生じない。ウィル ス治療物は代謝され、そしていづれかの従来の医薬生成物としてちょうど良い時 に弱まる。

宿主範囲のウィルスは一般的に、ピリオンの表面上のウィルス表面受容体成分の 部分により一部決定される。ウィルス宿主範囲はさらに、遺伝子発現を制御する エンハンサ−／プロモーターによる感染された細胞の独得な分子生物学により決 定される。い（つかのウィルスは特定の細胞タイプに結合する。パッケージング 細胞により生成されるウィルスはまた、天然の表面受容体成分の使用により特定 の細胞タイプにも結合し；それはまた、変更された受容体成分を用いて細胞にも 結合することができる。たとえば、糖タンパク質受容体成分が供給され得、その 受容体はｓｂｐの１つのメンバーを含む。

糖タンパク質遺伝子は、その生成されるピリオンが特定の細胞タイプに向けられ るように変性され得る。特定のアミノ酸配列、たとえばＨＩＶ　ｇｐ１２０を認 識するＣＤ４配列は、当業者に知られている方法を用いて、レトロウィルスのエ ユヱ遺伝子又はパポーバウィルスのｖＰ１遺伝子に融合され得る。ｅｎｖ遺伝子 又はＶＰＩ遺伝子の不変域に融合される腫瘍特異的抗原のＦ　（ａｂ’　）、フ ラグメントのためのＨ鎖抗体を含んで成る遺伝子融合体がまた、標的手段として も使用され得る。融合された遺伝子は、パッケージング細胞中への形質転換のた めに適切なプラスミド中に挿入され得る。この場合、特定の抗体り鎖がまた、パ ッケージング細胞中にクローン化されるべきである。

さらに、ウィルス表面受容体糖タンパク質は、たとえば有機化学的手段、たとえ ばスルフヒドリル基により結合するためにアミノ基、たとえばヒスチジンを遊離 する糖タンパク質の突出部分にリシン、ヒスチジン又はシスティン残基を付与す るために突然変異を導入することによって変性され得る。

細胞特異的試薬、たとえば特定抗体、たとえば膵臓癌又は異癌に対する抗体、他 の腫瘍特異的抗原又は膜受容体に対する抗体のＦ（ａｂ’）フラグメントが、グ ルタルアルデヒド、ビリオデート又はマレイミド化合物により又は当業者に知ら れている他の手段により、変更されたウィルスに結合され得る。そのような結合 はまた、野生型又は未変性ウィル人ｅｎ−ｙ−遺伝子糖タンパク質生成物に直接 的に行なわれ得、ここで結合は、炭水化物成分、スルフヒドリル基、アミノ基又 は結合のために利用できる他の基に行なわれる。この方法により結合され得る他 のリガンドの例は、ＨＩＶ感染されたリンパ球の標的を決定するためにＨＩＶ　 ｇｐ１２０に対する抗体、ＨＩＶ感染された細胞の標的を決定するために可溶性 ＣＤ４タンパク質、トランスフェリン受容体の標的を決定するためにトランスフ ェリン及びそれらのそれぞれの細胞受容体の標的を決定するためにｓｂｐの他の メンバー、たとえばガストリン、セクレチン又はコレシストキニンを包含する。

糖タンパク質をコードされたｅｎｖ遺伝子又はＶＰＩ遺伝子に標的手段を結合す る好ましい方法は、レトロウィルスエンベロープ糖タンパク質又はバポーバウィ ルスＶＰＩに抗体のヒンヂ部のスルフヒドリル基を結合することである。結合に 関しては、たとえばＩｓｈｉｋａｗａ、星煮、、Ｌユ斐ｙ和朋互鮭−（１９８３ ）　４　：　２０９を参照のこと。他の結合基は、炭水化物結合及びアミノ基結 合を包含する。抗体又は抗体、特にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の免疫反応性 Ｆａ、ｂ’又はＦ（ａｂ’）、部分の場合、当業者に良く知られた方法を用いて 、ウィルス粒子の表面に直接的に結合され得る。ピリオン−ＭＡｂ接合体が標的 細胞のエンドソーム区画に達した後、すぐにピリオンは、通常のウィルス感染路 に進行する。共有結合されたＭＡｂは、これらの工程を阻害することができ又は できないかも知れない。

特定のウィルスの天然の選択性を用いることによって、特定の細胞タイプの標的 を決定することもまた可能である。たとえばいくつかのバボーバウィルスは狭い 宿主範囲を示す。

ＬＰＶはリンパ球のみを感染する。同様に、ＢＫＶは腎臓及び肝臓細胞のみを感 染する。ＪＣＶはダリア細胞のみを感染する。

ＬＰＶは、８９７８球にミニクロモソームを運ぶ候補体であり得る。Ｉｇｈμ鎖 エンハンサ−の−に−鎖の使用により、ＬＰＶ誘導のＫ１１ｌベクターは、Ｂ細 胞疾患、たとえばＢ細胞白血病を処理すると思われる。最近、Ｔリンパ球におい ても複製するＬＰＶの変異体が単離された。（Ｋａｎｄａ、　ｆｌ　ｅ　、　＋ ムシｔｒｏｌ　（１９８５）５５　：　９６〜１００）。この変異体ＬＰＶ、す なわちＬＰＶ−７６は配列決定されており、そしてその変化はＬＰＶ−７６の宿 主範囲を拡張の原因であり、そしてＶＰＩにおける３種のアミノ酸の変化が存在 する。（Ｋａｎｄａｒ　星？−ｊ、Ｖｉｒ。

１　（１９８６）５９　：　５３１〜５３４）。ＡＩＤＳ（７）場合、ＬＰＶ− ７６又はより特定にはＬＰＶ−７６のＶＰＩの使用が、独立的にＢ及びＴリンパ 球にウィルスベクターを向ける。ｔａｔ敏感性ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲの使用は、適 切に企画された一時的な発現ミニクロモソームの非ＨＩＶ−１ｉ染細胞に比べて 、ＨＩＶ−１感染された細胞において１，０００倍の強さの転写活性を提供する であろう。従って、ＡＩＤｓ及びリンパ球疾患は、治療物として企画されるウィ ルスベクターの治療標的を表わす。

ウィルスベクター含有ミニクロモソームは、次の通りにパボーバウィルス、たと えばＳＶ４０を用いて開発され得る。

毒性遺伝子が５’−）ＩＩＶ−Ｉ　ＬＴＲのｔａｔ反応性領域ＴＡＲにより制御 され得る、ＳＶ４０初期置換ベクターが企画される。従つて、この領域は、１４ ．５ｋｄのｔａｔ部分を欠く細胞中において転写的に不活発である。実際、ＨＩ Ｖ−Ｉ　ＬＴＲは、活性化された核因子（ＮＦＡＴ−１）（Ｓｈａｗ、１９８８ ）、陰性調節因子（ＮＲＦ）（Ｒａｔｎｅｒ。

１９８８）、核因子ｋｂ　（ＮＦＫＢ）（Ｎａｂｅｌ、１９８７；Ｔｏｎｇ、１ ９８７）、Ｓｐｌ　（Ｊｏｎｅｓ、１９８６）ＴＡＴＡ−ボックス転写因子（Ｔ ＦＩＩＤ）（Ｇａｒｃｌａ。

１９８７）、リーダー結合タンパク質（Ｌ　Ｂ　Ｐ　）　（Ｊｏｎｅｓ。

星煮、、如匹」肥旦匹懸旦２　：　１１０１〜１１１４．１９８８）及びＣＣＡ ＡＴ転写因子（ＣＴＦ）（Ｊｏｎｅｓ、　星＆、、１９８８．３１記）のための 結合部位を含む；さらに、Ｐｅｔｅｒｌｉｎ、　皇＆、＋　（１９８８）Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ＨＩＶ１工ＩＤ５２　：　（ｓｕｐｐｌ、１ ）　：５２９〜５４０も参照のこと。ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ内で位置Ｏから＋４８ ０に転写されるｍＲＮＡに見出されるＴＡＲは、ＨＩＶ１０００倍の強さの遺伝 子発現をもたらすｍＲＮＡ転写物を安定化し、そして輸送する。毒素発現を制御 するためにＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ−３５０〜＋８０（７）使用は、ＨＩＶ−１ウイ ルス感染細胞において特異的に活性的なＫ１１ｌ　５え叉二を生成する。

主要特徴が損なわれていないＳＶ４０後期機能、ＨＩ　Ｖ−１５’ＬＴＲ及びＨ ＩＶ−１５’ＬＴＲ１より駆動されるＫ１１ｌ遺伝を有するＳＶ４０　ｏｒｉで あるミニクロモソームが、ＣＯＳ　−７（Ｇｌｕｚｓａｎ、　Ｃｅ旦（１９８１ ）２３　：　１７５〜１Ｂ２）又はＣＭＴ４（Ｇｅｒａｒｄ、ｆｅｅ、　（１９ ８５）Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５　：３２３１〜３２４０）細胞に調 製され得る。ＣＯ３−７細胞は野生型Ｔ抗原並びにｔｒａｎｓ型でのＶＰＩ、Ｖ Ｆ６及びＶＦ６のための要素をなす、ＣＭＴ４は、メタロチオネイン　プロモー ターによる野生型Ｔ抗原のために誘発性である。ＨＩＶ−１５’ＬＴＲは、ＣＶ Ｉ又はＶＥＲＯ細胞、又はパボーバウィルスバッケージング細胞を構成するため に使用される細胞において転写的に不活性であるべきである。従って、股上１土 遺伝子は、非毒性Ｈ３Ｖ−工ｌ遺伝子生成物のみならず、またより攻撃的な機構 、たとえばアンジオゲニン、すなわち３６９ｂｐのＤＮＡによりコードされる１ ４，０００ドルトンのりボヌクレアーゼ（Ｋｕｒａｃｈｉ＋　星？、、（１９８ ５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｎ２４　：　５４９４〜５４９９）及びリシン又はジ フテリア毒素Ａ鎖遺伝子を包含する。より攻撃的なＫ１１ｌ遺伝子生成物、たと えばアンジオゲニン、リシンＡ又はジフテリアＡ鎖の場合及びＨＩＶ−１５’Ｌ ＴＲ構遺体がパッケージング細胞構造体において適切に転写的に不活性でない場 合、アンジオゲニンインヒビター（Ｌｅｅ、　ｆｌ　ｅ　、、　（１９８８）Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２７　：　８５４５〜８５５３）又はアンチセンスＲＮ Ａが、毒素に耐性の毒素細胞変異体からパッケージング細胞を保護するために使 用され得、又は構成され得る。これらのインヒビター又は変異体耐性遺伝子は両 性レトロウィルスにより容易に導入され得、それによって所望しない毒素遺伝子 発現からパッケージング細胞を保護する。

組換えが複製コンピテントピリオンを生成しないことを示すことがまた必要であ る。ＣＯ３−７細胞により包封されるミニクロモソームは、組換えにより感染性 ウィルスを生成した。これは、ＳＶ４０がヒト治療のために提供されない場合、 関係ない。レトロウィルスパッケージング細胞、ｐｓｉ−２゜ｐ　ｓ　ｉ　−Ａ Ｍ及びＰＡ−３１７に関する研究かまた、組換えによる感染性ウィルスを示した 。この組換えは、相同配列を必要とすることが示され、そして約ｌＸｌ０−’の 速度で生じる。上記のように、３１種のＭｕＬＶ　ｔｒａｎｓパッケージング因 子工ｌ工、ＬＬ上及びｅｎｖの２種の構造体への分離は、組換え感染ウィルスの 出現を検出可能レベル以下に下げる。それぞれｌＸｌ０−’の確立での２種の独 立した相同組換え出来事の機会がＩ　Ｘ　１０−”であることを確立は示す、こ れは検出できない頻度である。従って、ｔｒａｎｓ機能ウィルスつンパク質の２ 種の別々の挿入体を有する新規パッケージング細胞の開発が必要とされるであろ う（Ｇｌｕｚａ＋ａｎ、　（１９８１）！　；Ｄａｎｏｓ＋　星？、＋（１９８ ８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｉｃ、ＵＳＡ　８５ｉ６４６０〜６４６４ ）。

ＳＶ４０　ｏｒｉ複製陽性であるが形質転換陰性である変異体ＳＶ４０　Ｔ抗原 を含み、そしてまた、別々の細胞染色体に、カプシドタンパク質、たぶんＶＦ６ 又はＶＦ６の１つのための組込み部位を含むＣＶＩ、ＣＶＩＦ又はＶＥＲＯ細胞 における新規構造体が、特別にこの問題を解決するであろう。これらの構造体を 用いて、非増幅性ＳＶ４０ミニクロモンームがＳＶ４０カプシドにより標的細胞 に運ばれ、そしてリンパ球及びＨＩＶ−１惑染細胞特異的転写が生じるであろう 。この転写は、標的細胞を殺すように企画された機能をコードするであろう。

ミニクロモソームにＴ抗原を含まない方法の欠点は、感染性ミニクロモソームの 一時的な増幅の欠乏である。これは、標的細胞における所望する毒性の欠乏をも たらす。ＳＶ４０ｏｒｉ及び複製可能Ｔ抗原を包含することが、この問題を解決 する。ミニクロモソームＤＮＡは一時的に増幅され、遺伝子生成物は一時的に増 幅され、そして増強された毒性が達成され得る。しかしながら、ＳＶ４０Ｔ抗原 の細胞形質転換及び細胞不滅化能力提供されるべきである。

ＳＶ４０　Ｔ抗原は培養において細胞形質転換を担当することが前から知られて おり、そして細胞形質転換は動物において腫瘍化性に関係して来た（Ｏｓｂｏｒ ｎ、星＆１．Ｊ、Ｖｉｒｏ１．（１９８５）１５　：　６３６〜６４４　；　Ｋ ｉｍｕｒａ、　星？、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　（ｔｌｓＡ） （１９７５）７２　：　６７３〜６７７）。５Ｖ４０Ｔ抗原の使用に関する関心 は、形質転換能力に欠失する変異体Ｔ抗原の使用により減じられ得る。

ＳＶ４０　Ｔ抗原は、多機能７０８−アミノ酸リンタンパク質である。大きなＴ 抗原の集中的な突然変異分析は、この多機能タンパク質の別々の領域がこれらの 種々の機能を介在することを示した（Ｍｏｈｒ、星＆、、Ｊ、Ｖｔｒｏ１．（１ ９８９）６３：４１８１〜４１８８　；　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、　星Ｊ、、Ｍ ｏ１．Ｂｉｏ１．Ｍｅｄ、　（１９８７）　４　：　６３〜８０）を参照のこと ）。

Ｔ抗原の形質転換活性は、タンパク質のＮ−末端５′に位置する（Ｓｏｍｐａｙ ｒａｃ、　ｔ＆、、カニ１」Ｊ（１９８８）１６３　：　３９１〜３９６）。

マウスにおけるｐ５３非ウィルス腫瘍抗原のＴ抗原安定化は、Ｔ抗原誘発性細胞 形質転換の機構のための論理上の候補体であるが、ＳＶ４０による形質転換のた めに必要とされない。

代わりに、且１結合部位が包含されると思われる。欠失され又は不活性化される 場合、網膜芽細胞腫の進行の素因を作るＲｂ惑支受性遺伝子Ｆｒｉｅｎｄ、星？ 、、（１９８６）３１ｉｑ）は、５Ｖ４Ｔ抗原アミノ酸残基１０５〜１１４の置 換及び内部欠失突然変異体は、軟寒天におけるフォーカス形成及び増殖により測 定される場合、且】感受性タンパク質との複合体化に失敗し、そして形質転換を 誘発するのに失敗したタンパク質を生成した。従って、ＡＡ１０５〜１１４にお ける突然変異によりミニクロモソーム複製を支持するが、しかし細胞形質転換を 支持しない突然変異ＳＶ４０大Ｔ抗原が、ミニクロモソーム構造体中に導入され 得る。

非増幅性ＳＶ４０ミニクロモソーム治療物のためのパッケージング細胞の構成に おいて記載されたように、他のパッケージング細胞構造体が、ＣＯ５−７及びＣ ＭＴ４細胞に見出される突然変異体Ｔ抗原と野生型Ｔ抗原との間の組換えの可能 性を排除するために、増幅可能なミニクロモソーム構造体のために必要とされる 。この場合、ＣＶ−１又はＶＥＲＯ由来の細胞は、カプシドタンパク質のみを含 む。ミニクロモソーム構造体を増幅するためのパッケージング細胞は、別々の構 造体上にＶＦ６及びＶ’　Ｐ　３のＳＶ４０後期領域を含むであろう。いくつか の構造体は、ＬＰＶ、ＢＫＶ及びＪＣウィルス、ＳＶ４０に密接に関係するウィ ルスに基づかれている。

約Ｉ　Ｘ　１０’　／ｍｌの力価が、ピリオンタンパク質がメタロチオネインプ ロモーターにより駆動されるそのようなパッケージング細胞から予測され得る（ Ｇｅｒａｒｄ、Ａ＆、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ。

１、（１９８５）５：３２３１〜３２４０；Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ、７ｊ？、、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　（１９８８）８５　：　９０ ０７〜９０１１）　。

細胞特異的感染。ＬＰＶ及びＢＫＶからのＶＰＩ、及びＬＰＶ、ＢＫＶ、Ｔ−細 胞受容体、及びリンパ球疾患及び肝癌の標的の決定において有用なり型肝炎ウィ ルスからのエンハンサ−かまた調製され得る。ＨＩＶ−１治療は、既知の活性化 されたリンパ球転写活性化剤及び既知のＨＩＶ−１ｔｌ工遺伝子生成物に依存す る。奪格的ウィルス療法をより一般的な治療アプローチに開発するためには、標 的の細胞核転写活性剤因子の環境の特定の知識を要し、又は特定の受容体相互作 用を通して特定の細胞タイプにウィルスの標的を向けることを要する。最近、Ｓ Ｖ４０が細胞の頂上でプロテアーゼ及び炭水化物感受性受容体に結合しくＣ１ａ ｙｓｏｎ、　（１９８８）　（引例］　；　Ｃ１ａｙｓｏｎ、ｆ（？、、Ｊ、Ｖ ｉｒｏ１．　（１９８９）６３　：　１０９５〜１１００）、そしてクラスＩの 主要組織適合性複合体タンパク質に特異的に結合する（Ａｔｉｍｏｏｄ、星＆、 、Ｊ、Ｖｉｒｏ１．（１９８９）６３：４４７４〜４４７７）ことが報告された 。ＳＶ４０ウィルス細胞受容体の相互作用を担持するＶＰＩ上のポリペプチド配 列は未知である。

いくつかの他のウィルスの受容体の相互作用は、相当詳細に知られている（Ｃｒ ｏｗｅｌｌ、　ｆｆ＆、、Ｖｉｒｕｓ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｅｎｔ ｒｙ　Ｉｎｔｏ　Ｃｅｌｌ（Ｃｒｏｗｅｌｌ　ａｎｄ　Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏｌ ｏ＋版）　Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ、ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　（１９８６）　１ 〜９ページ）、ＨＩＶ及びサル免疫欠損疾病（ＳＩＶ）のｇｐ１２０：ＣＤ４相 互作用が最良に研究される。最近、ライノウィルスのための細胞受容体が、■Ｃ ＡＭ−１、すなわち他の免疫グロブリン超遺伝子種のメンバーであることが示さ れた（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、ｑ＆、、ｃｅｌｌ（１９８９）５６：８４９から８５ ３　；　Ｇｒｅｖｅ＋　ｑ　ｅ　、　＋　Ｃｅ旦（１９８９）５６　：　８３９ 〜８４７）。

ピコナウィルスのための推定上のピリオン表面結合部位、すなわちキャニオン受 容体がまた、高く保持される（Ｃｏｌｏｎｎｏ。

星ζ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８Ｂ）８５　： 　５４４９〜５４５３　；　Ｒｏｓｓｍａｎ、＊ｅ７．ｎ匹蝕■（１９８８）１ ６４　：　３７３〜３Ｂ２）。

ＳＶ４０はほとんどのヒト細胞を感染し、そしてＬＰＶはＢリンパ球を感染する ので、ＳＶ４０カプシドへの受容体タンパク質の結合は、標的細胞にウィルスを 選択的に向けることができる。たぶん、結合する可溶性ＣＤ４は、ＳＶ４０又は ＬＰＶをＨＩＶ−１感染リンパ球に向けるであろう。抗体フラグメントはまた、 毒素に結合される抗体がインビトロでＨＩＶ−１感染細胞を選択的に殺害するた めに使用されたように、ピリオンをｐ４１又はｇＰ１２０発現細胞にも向ける（ Ｃｈａｕｄｈａｒｙ、　ｆｆ？、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３５５　：３６９ 〜３７２）。

種々のリガンド、たとえばトランスフェリン、モノクローナル抗体及び多くのウ ィルスの細胞への受容体介在結合は、被覆されたピット中への受容体−リガント 複合体の輸送により生じる。被覆されたビットは、内部の小胞中に細胞膜をたた み込み、そして発芽せしめる。（Ｐａｓｔａｎ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｓ ＋とｎ虱（１９８１）２１４　：　５０４〜５０９）。次に、内部小胞はエンド ソームと融合する。エンドソームにおけるエンドサイト−シスされた物質の運命 が変えられる。トランスフェリンの場合、エンドソームのｐＨ環境が形状の変化 を引き起こし、Ｆｅ：１＋を放す。次に、トランスフェリン及びトランスフェリ ン受容体は、追加の使用のために細胞表面に再循環される。トランスフェリン受 容体に対するＭＡｂがリジンＡ鎖に結合される場合、５０％のＭＡｂ−リシン接 合体が表面に再循環され、そして媒体中に開放される。しかしながら、ウィルス は、ＳＶ４０及びアデノウィルスの場合、明らかに損わないでエンドソームを通 過するが、しかしインフルエンザウィルスの場合、エンドソーム内の低いｐＨが 、ｌ（Ａ分子をフソゲニック（ｆｕｓ　ｏｇｅｎ　ｉ　ｃ）にする血球凝集素（ ＨＡ）の不可逆的な形状変化のきっかけになる。ＨＡの成熟形は、２種のサブユ ニッ）　ＨＡ　１及び）ＨＡ２から成る。形状変化は、中性ｐｎで、ＨＡの三量 体内に隠されるＨＡ２のアミノ末端疎水性ドメインを暴露する。ある変動により 、類似する機構が、α−、ラブド及びフラビウィルス及びいくつかのネズミＲＮ Ａ腫瘍ウィルスの侵入のために示されており１標的細胞膜の細胞表面成分へのす べての結合が、エンドソーム内に吸収され、そして低ｐＨ依存性融合を受ける（ Ｓｉｍｏｎｓ　ｆｔ　ｅ　、　、　（１９Ｂ２）Ｓｃｉ、＾ｓ、２４６：５６〜 ６６）。

ＭＡｂ指図ウィルスの使用は、エンドサイト−シス路を通して生存し、そしてそ れを通過するためにウィルスの天然の適合性を使用する利点を有する。エンドソ ームに見出されるタンパク質分解酵素がピリオンの暴露に関与する場合、それは 、たとえばカテプシン又はペプチダーゼによりエンドソーム小胞におけるウィル スの標的部分のタンパク質分解を提供するアミノ酸配列を包含するために使用さ れ得る。カテプシンＤ１すなわちエンドソームに見出されるブレ解糖酵素は、− Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−の間を分解する。隣接するアミノ酸は重要でない、　（Ｂ１ｕ ｎ＋　ａｎｄ　Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 口Ｓ＾（１９８８）８９５　：　３９７５〜３９７９　；　Ｄｔｍｅｎｔ　ａｎ ｄ　５ｔａｈｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（１９８５）２６０　：　１５３１１〜１５３１７）、従って、たとえばエンド ソーム環境下で切断可能な、Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントピリオンとの間の ペプチド橋は、ＡＡｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＡＡ）−（ここでｎ＋ｍは約１５よ りも多くない）であろう０例として、メトトレキセートに接合されるモノクロー ナル抗体がＵｓｅｔａｏｔｏ　ｆｌ　ｌ　、、Ｃａｎｃｅｒ　！＋＊ｍｕｎｏ１ ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ＋（１９８９）２８　：　９〜１６により開示されてい る。

さらに、標的成分からの標的化されたピリオンの増強された開放性が、エンドソ ームの低いｐｕ環境の開発により達成され得る。厳密な化学的環境下で、スルフ ィド結合は、還元剤の存在下でｐＨ５，５で還元される。エンドソームの低いｐ Ｈの他に、エンドソーム環境かまた、還元環境である場合、ジスルフィド結合は 、エンドソームにおいて不安定である。従って、Ｆ　（ａｂ’　）、フラグメン ト又は他の標的成分とピリオンとの間へのジスルフィド橋の使用は、エンドソー ムにおいて不安定である結合を提供し、従って、ピリオンを開放する。

すべての腫瘍に対する“完全な”モノクローナル抗体、又は一定の癌のすべての 腫瘍に対する腫瘍特異的抗体の初期請求は無視されて来た。しかしながら、腫瘍 細胞との高い親和性結合（″特異的”結合）及び正常な成人細胞との最少又は制 限された非特異的結合（“非特異的”結合）を有するＭＡｂは、黒色腫及び胸、 腸及び直腸の癌の放射性イメージングのために有用であることが示された。また 、非特異的ＭＡｂ細胞毒性が高い抗体濃度でのみ明らかになり、標的細胞のため の低い固有細胞毒性により必要とされる問題が明らかになり、又は放射性イメー ジを生成するために多くのＭＡｂ−細胞表面相互作用のための必要性が明らかに なる。

この非特異的細胞毒性は、完全な抗体分子を使用する現在の治療手段により強調 される。Ｆｃフラグメントは、抗体の循環半減期を高めるために、接合体調製の ための便利な化学結合部位を提供するために、及びＦｃ受容体介在の細胞毒性Ｔ 細胞殺害を助けるためにＭＡＤｍ製に保持されて来た。しかしながら、Ｆｃフラ グメントの保持性はまた、正常な細胞へのＦｃ受容体介在結合を高め、そして２ 〜４の１．■、注入への土ヱ　ｌ？、Ｊｆ免疫治療を制限する強い体液性免疫応 答に寄与する。Ｆ（ａｂ’）、フラグメントへの免疫応答は、最少であることが 示された。Ｆ　（ａｂ’　）ｚ治療の欠点は不Ｚ旦本でのフラグメントの短い半 減期であるが、しかし固相（たとえばピリオン）にＦ（ａｂ’）、を結合するこ とによって、現在のＭＡｂ療法の半減期及び免疫原性問題が最少化され得る。

治療用薬物への結合を伴って又は伴わないでのＭＡｂは、胃腸悪性及び白血病／ リンパ腫における４７１？土で細胞特異性であることが示された。Ｅｐｅｎｅｔ ｏｓ　ｆ、Ｋ　煮、　＋　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ（１９８２）２：９９９〜１０ ０４゜さらにＭＡｂのパネルによる、腫瘍の悪性進行の種々の段階での腫瘍バイ オプシーの免疫組織化学的な型分類が、一定の腫瘍タイプ内での抗原異質性の存 在を確証した。これは、（１）マイクロ転移の初期検出、（２）良性及び悪性病 変間の相違点及び（３）腫瘍予知に基づいて情報を与えた（＾ｕｋｅｒｍａｎ　 ｆＬ　ｅ、＋　（１９８７）　：　Ｕｌｄｈａ＋ｎ、　Ｒ，に、、（版）”Ｐｒ １ａｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　″、　Ｒａｖ ｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ２１〜４７ページ）、治療的観点から、“カクテル” 又はいくつかのＭＡｂの混合物のための必要性が認識された。多くのＭＡｂ、通 常、異なった抗原決定基を認識する２〜５種のＭＡｂを含んで成るカクテルの使 用が、異種の患者人口に認識される一定の腫瘍タイプの百分率を実質的に改良し た。Ｌｉａｏ星？、、Ｃａｎｏｒ　Ｉｏ＋ａ＋ｕｎｏ１　１ｎｎｕｎｏｔｈｅｒ （１９８９）２８　：　７７〜８６゜ＡＩＤＳ及び−次肝細胞癌のような疾病に 関する使用のために、ｇＰ１２０及びＣＤ４及びＢ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈ ＢｓＡｂ）に対して向けられたＭＡｂの特定の相互作用が使用され得る。しかし ながら、抗原異質性を有する癌においては、この問題は、ＭＡｂのカクテルの使 用により選択的に処理され得る。ウィルス感染の宿主範囲を指図するＭＡｂの結 合において、種々のエピトープ部位に向けられる多くのＭＡｂを含んで成るこの カクテルは、ＭＡｂ及びピリオンの結合反応の前、予備混合され得る。他方、Ｋ １１ｌ遺伝子を含む治療用とりオンはすべて同一であるので、その混合物は、結 合の後に調製され得る。

対象のＫ１１ｌ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、従来の技法、たとえば所望す るコード配列を定義するために一緒に連結され得るオーバーラツプ一本領を用い て合成され得る。

それらの末端は、制限部位を提供するように企画され得、又は一端又は両端は連 結のためにプラント末端化され得る。

他方、Ｋ１１ｌ遺伝子は種々の技法により単離され得る。

たとえば、ｍＲＮＡが単離され、ｍ　ＲＮ　Ａが逆転写され、そして得られる一 本鎖（ｓ　５）ＤＮＡが日本類（ｄｓ）ＤＮＡ及び単離される（ｄｓ）ＤＮＡを 調製するために鋳型として使用され得る。もう１つの技法は、ＤＮＡ片を単離し 、そして対象の遺伝子における最っとも保存された配列の領域を含んで成るプロ ーブを用いて、適切に変性し、対象の配列を同定することである。そのプローブ は、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも１０、好ましくは少なく とも工４、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドであるべきである。

対象の遺伝子の完全な長さまでのより長いオリゴヌクレオチドがまた、有用であ る。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの両方が使用され得る。

対象のＫ１１ｌ遺伝子は、Ｉ（ＳＶ−ｔｋ遺伝子及びＲＮアーゼ、プロテアーゼ 及びＤＮアーゼをコードする遺伝子を含む。使用される他のＫ１１ｌ遺伝子は、 たとえばヒト腫瘍学で指図されたアンチセンスＲＮＡ、たとえばＨ−ｒａｓ、に −ｒａｓ又はＮ−ｒａｓ遺伝子を含む。アンチセンスＲＮＡは一般的に、約５〜 １００ｂｐ；好ましくは約２ｏｂｐの長さであろう。従って、たとえば、アンチ センスＲＮＡは、ＨＩＶゲノムの種々の官能部位で合成され得る（たとえばＧｕ ｔｃｈ　＆Ｌｉｄｄｅｌ　１　（１９８８）を参照のこと）。レトロウィルスＲ ＮＡ　（Ｒ領域）の末端で反復される）（ＩＶ配列内の又は近くの部位、スプラ イス受容体及びスプライスドナ一部位に相補的なアンチセンスオリゴマーが特に 使用される。

転写終結に関して、ＲＮＡ切断及びポリアデニル化領域は、ｍＲＮＡ転写物のた めに適切な成熟性を提供し、そして効果的な発現のために必要である。生来の３ ′−未翻訳領域は十分であるが、しかしより効果的な発現を提供するスプライス 部位を含むＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルがまた使用され得る。他方特 定の細胞タイプにおいて高く発現される遺伝子に由来する３′−未翻訳領域（た とえば骨髄細胞におけるＩｇ）は、対象の遺伝子と融合され得る。特定の終結領 域は、それらが対象の遺伝子の発現を提供する限り、本発明に対して臨界ではな い。

対象の核酸配列の個々の操作及び核酸構造体の成熟の後、その得られるプラスミ ドはクローン化され、そして単離され、そして必要により、対象の特定の成分が 、適切な配列が得られたことを確証するためにその配列を成熟したことについて 分析されるであろう。操作の性質に依存して、所望する配列がプラスミドから切 り出され、そして種々のベクター中に導入され、又はプラスミドが制限され、そ して所望する成分が、適切に操作される。

多くの場合、シャトルベクターが使用され、ここで前記ベクターは、異なった復 製システムを必要とする異なった宿主において複製することができる。これは、 ２種の宿主において機能する追加のマーカーを必要とし又は必要としない。その ようなマーカーが必要とされる場合、それらはベクターに含まれ得る。そのカセ ット、２種の複製システム及びマーカーを含むプラスミドは、必要に応じて１つ の宿主から他の宿主に移行され得る。選択に関しては、いづれか有用なマーカー が使用され得る。所望により、抗生物質又はメトトレキセートに対する耐性が興 味の対象である。しかしながら、選択のためのマーカーは便利さのためにひじょ うに所望されるが、形質転換された細胞をスクリーニングするための他の方法が 説明されて来た。たとえば、形質転換された細胞は、それらが製造する特定の生 成物により、たとえば免疫学的又は酵素学的方法によりスクリーンされ得る。次 に、対象の種々の構造体が精製されるであろう。

パッケージング細胞により生成され、そして発現の調節を提供するフランキング 領域及びＫ１１ｌ遺伝子を含んで成るピリオンは、いづれか便利な手段、たとえ ば静脈内又は皮下注射及び経口又は鼻腔内投与により意図された宿主中に導入さ れ得る。他方、レトロウィルスの場合、パッケージング細胞自体が、たとえば皮 膚細胞及び同様のものを移植することによって宿主中に導入され得、ここで細胞 は増殖し、そしてウィルス遺伝子を発現し、そして宿主中において所望するピリ オンを直接生成する。

本発明の組成物は、Ｋｉｌ！遺伝子として広範囲の種類の毒素を使用することが できる。使用され得る遺伝子は、基土１１遺伝子及びアンチセンスＲＮＡを含む 。Ｈ３Ｖ−工ｌ遺伝子は、レトロウィルス構造体において好ましい細胞毒性遺伝 子である。標的細胞にＨ５Ｖ−１笠遺伝子を運ぶための特定のレトロウィルス細 胞標的ベクターが開発され得る。次に、標的細胞は、Ｈ３Ｖ−エエによりリン酸 化されるが、しかしヒトチミジンキナーゼによってはリン酸化されないアシクロ バーの投与の後、殺され得る。Ｈ３Ｖ−工Ｘ含有細胞におけるアシクロバーモノ ホスフェ−）　（ａｃｙｃ　ｌｏ−ＧＭＰ）の合成の後、通常の細胞酵素が、ａ ｃｙｃｌｏ−ＧＤＰ及びａｃｙｃｌｏ−ＧＴＰの連続的な合成を触媒する。Ａｃ ｙｃｌｏ−Ｃ；ＴＰは、２種の方法で機能する：　（１）ＤＮＡポリマラーゼの インヒビターとして及び（２）ＤＮＡ中への導入に基づいて、アシクロバーが鎖 の終結を引き起こす。

正常な哺乳類細胞に比べて、Ｈ３Ｖ−工ｌ含有細胞のためのアシクロバーの毒性 において３００〜３０００倍の差異が存在し、そしてアシクロバーはその低いヒ ト毒性のために注目される。アシクロバーは、カプセル、軟膏に及び静脈内使用 のための粉末として利用できる。アシクロバーのｔＶ投与は７５０〜３０００ｍ ｇ／ｍ”　７日の範囲であるが、但し通常のＩＶ投与量は、１０”ｇ／ｍｌのピ ーク血清レベルを得るために５Ｉ１ｇ／ｋｇである。ＴＩ／アは、正常な腎機能 を有する患者において２．５時間である。経口投与の生物学的利用能は、ＩＶ投 与に比べて約２０％である（Ｇｉｌｍａｎ、＊＆、、（１９８５）Ｇ。

ｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅａｔｉｃｓ　第７版）。関連するヌク レオチド類似体、たとえば類似して機能するＥ５−（２−ブロモビニル）−２′ デオキシウリシフ　（ＢＶＤＵ）、９−　（４−ヒ）’ｏキシー３−Ｃヒドロキ シメチル）ブドー１−イルコグアニン、２′−フルオロ−５−ヨード−アラ−Ｃ （Ｆ　Ｉ　Ａ　Ｃ）　（Ｈａｒｎｄｅｎ、　ｆｌｅ、、ムＭｅｄ、Ｃｈｅｍ、　 （１９８７）３０　：　１６３６〜１６４２　；　Ｈａｒａｄａ、　ｑ　煮、、 Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｘ、　（１９８７）３０　：　２２６〜２２９　；　Ｄｅｃ ｌｅｒｃｑ＋　７Ｗ？、、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（１９８ １）１４３　：８４６〜８５２）が記録され、そして医薬として利用できる。

このタイプのシステムの利点は、Ｈ３Ｖ−ｔｋ遺伝子を含むゲノムが標的細胞中 に導入される場合、標的細胞がＨＩＶ感染性Ｔ４リンパ球、肝癌細胞、膵臓癌細 胞、又はパッケージング機構がウィルスに特異的に向いているいづれか他の細胞 のいづれかであろうと、それがＨ３Ｖ−ｔｋ−（７）合成に向くであろうことで ある。標的細胞の感染に基づいて、ヘルペスウィルスチミジンキナーゼが細胞内 に生成される。それは、細胞殺害が生じるアシクロバーの適用に基ついてのみ存 在する。

癌の化学療法は、ＤＮＡ合成の阻害で従来通り指図されて来た。上記Ｈ３Ｖ−工 Ｘ遺伝子及びアシクロバーの使用は、この先例を従える。しかしながら、標的細 胞はまた、ＤＮＡ合成の無関係に殺害され得る。実質的には、この活性化学療法 は、治療の期間を短くする。これは特に所望され、そして多くの染色体の一時的 な発現はバボーバウィルスに由来する。

例として、リポソームＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ、たとえばアンジオゲニン 、又はＡＤＰが延長因子２　（ＥＦ−２）をリボシル化するジフテリア毒素が、 タンパク質合成のために必要とされる。毒素並びにデキサメタシンにより誘発で きるマウス哺乳類腫瘍（ＭｏＭＴＶ）ウィルス５’　ＬＴＲを含むプロウィルス 又はミニクロモソームが使用され得る。このタイプの構造体は第９図に例示され る。

アンジオゲニンからパッケージング細胞を保護するためには、ヒト胎盤リボヌク レアーゼインヒビター（Ｓｈａｐｉｒｏ　ａｎｄＶａｌｌｅｅ、　Ｐｒｏ、Ｎａ ｔ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８７）８４　：　２２３８〜２４４１）が、グ ルココルチコイド受容体を欠くパッケージング細胞中にクローン化され得る。レ トロウィルス構造体においては、リボヌクレアーゼインヒビターが、ｐＣＲＩＰ ｅｎｖ−における欠陥ｅｎｖ遺伝子を置換するためにクローン化され得る。これ は、パッケージされるべきレトロウィルス遺伝子に含まれるアンジオゲニンの活 性からパッケージング細胞を保護する効果を有する。次に、アンジオゲニン遺伝 子が、ＭＭＴＶＬＴＲのＵ　３　ｅＪ［域に由来するデキサメタシン誘発性プロ モーターエンハンサ−（Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　ａｎｄ　Ｆａｎ、　Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌｏ　（１９８５）５４　：１３３１４４；Ｐｏｎｔａ、ｑ＆、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９８５）８２：１０２０〜１０２４）又はＭｏ ＭＳＶ　ＬＴＲ内に位置するｍｏｌｏｎｅｙネズミ内腫ウィルス（ＭｏＭＳＶ） エンハンサ−（Ｍｉｋｓｉｃｅｋ、　星煮、、釦旦（１９８６）μし２８３〜２ ９０）の下流にクローン化され得る。

これらの構成の効果は、上記の標的化方法のいづれかを用いて、特定のグルココ ルチコイド受容体−含有細胞タイプに標的を向けられるゲノムを供給することで ある。続いて患者がグルココルチコイド、たとえばデキサメタシンにより処理さ れる場合、標的細胞が細胞の細胞質内にアンジオゲニンを合成し、それによって 細胞を活性的に殺害する。

実際のＫ１１ｌ遺伝子、すなわちアンジオゲニンをコードする遺伝子は、十分な レベルのりボヌクレアーゼインヒビターがパッケージ細胞に存在する限り、他の りポヌクレアーゼ遺伝子、たとえば膵臓リボヌクレアーゼをコードする遺伝子に より置換され得る。リボヌクレアーゼのグルココルチコイド誘発により、たぶん パッケージング細胞は、有害量でリボヌクレアーゼを発現しないであろう。他の りポヌクレアーゼ及びそれらのインヒビター、たとえば膵臓リボヌクレアーゼ及 び種々の天然の細胞質リボヌクレアーゼインヒビターがまた使用され得る（Ｂｌ ａｃｋｂａｒｎ　ａｎｄ　Ｍｏｏｒｅ＋　１９８２）。

明らかに、リボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼインヒビターの概念は、プロ テアーゼ及びプロテアーゼインヒビター並びにＤＮアーゼ及びＤＮアーゼインヒ ビター（たとえば制限酵素及び特定のメチラーゼ、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素 Ａ鎖及びポリオウィルスＡＡＺタンパク質）を包含するように変更され得る。セ リンプロテアーゼの場合、トリプシンが、パッケージング細胞構造体中にウシ膵 臓トリプシンインヒビターをクローン化することによって阻害される（Ｇｅｂｈ ａｒｄ。

星？、、（１９８６）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　＋　Ｅｌ ｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。他方、ゾリン（ｂｄ ｅｌ　Ｉ　１ｎｓ）は、トリプシン、プラスミン及び精子アクロシンを阻害する ために使用され得、そしてニグリンはチモトリブシン及びサブチリシンを阻害す るために使用され得る（Ｓｅｅｍｕ　１１　ｅｒ　ｆｌ　（！：’　、　、　Ｐ ｒｏ　ｔｅｉ　ｎａｓｅＩｎｂｉｂｉｔｏｒｓ（１９８６）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。他のセリンプロテイナーゼインヒビ ターは、Ｋｕｎｉｔｚ及びＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋタイプの大豆トリプシンイン ヒビターを包含する（Ｉｋｅｒａｋａ　ａｎｄ　Ｎｏｒｉｏｋａ、　Ｐｒｏｔｅ ｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　（１９８６）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅ ｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）アンチセンスＲＮＡはまた、細胞保護又は阻害 遺伝子として作用することができる。

保護は本発明の使用のために記載されて来たが、標的細胞におけるＫ１１ｌ遺伝 子の発現又はＫ１１ｌカスケードの開始のために外来性誘発システムの使用によ り例示されるように、これらの保護は、本発明の実施に必要ではなく、そして使 用環境に依存して排除され得る。

本明細書に記載される遺伝子療法投与ビークルは、アンチセンスＲＮＡを生成す るために標的細胞をクログラム化するための現想的なベクターを表わす。アンチ センスＲＮＡは、ヒト腫瘍遺伝子、たとえばヒトＨ−ｒａｓ、に−ｒａｓ、又は Ｎ−ｒａｓ遺伝子で方向づけされ得る。ヒトは肺癌細胞からのに−ｒａｓ遺伝子 の配列、及び−次胃癌からのｖ−ｒａ工に相同の腫瘍遺伝子の配列が同定された （Ｓｈｉｍｉｚｕ＋　ｆｊ、　（！ｌ’　、　＋（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３ ０４　：４９７〜５００　；５ｈｉｏ＋ｉｚｕ、ｆｔζ＋ｌ　（１９８５）Ｐｒ ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８２　：　５６４１〜５６３４）。

ヒトに使用するために、特に癌の処理のためには、■×１０４／細胞のプソイド ピリオンの収量が予測され得る。２Ｘ１０ｈ／ｌａ胞が培養流体（Ｖｅｒｏ、マ イクロキャリヤー発酵）ｌａｌ当たりに仮定される場合、収量は名目上２Ｘ１０ ”／１１１になるであろう。完全な緩解期における患者は、身体の腫瘍細胞負荷 にかかわらず、残留１０９〜１０１０、名目上５ＸＩＯ９／細胞を有する。全身 の腫瘍細胞負荷に対するプソイドピリオンの２００倍過剰量が処理に所望される 場合、ｌＸｌ０”のピリオンが注射（６０Ｉ！ｇ）当たり必要とされる。

これは、５０ｍ１の培養物からの生成を表わす。処理が２５回の注射を包含する 場合、１人の患者の処理は約１．２５１の組織培養物を要する。本発明は、さら に詳細に説明するために次の例により例示されるが、これらの例は本発明を限定 するものではない。

実−一■ 基本的なりＮＡ技法は、Ｄ　ａ　ｖ　ｉ　ｓ　（Ｄａｖｉｓ、ＡＪ、５（１９８ ０）Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ａ　Ｍａｎｕ ａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ旦些且旦とにより記載される通りである。

ＤＮＡ切断、スプライシング及び連結のための酵素は、Ｎｅ紳Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）からであり、そして製造業者の規定 に従って使用される。ＤＮＡフラグメントは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ合成機（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）上で合 成される。１種のＳＨ又はＮＨ２構造の他のものへの転換は、一本＃ＪＩＦＩ　 Ｍ１３ｍｐＨＤＮＡにハイブリダイズされ、そしてフレノウフラグメントＤＮＡ ポリマラーゼＩにより完全な二本鎖環状に合成される所望する変化物を含む合成 オリゴヌクレオチドにより突然変異誘発により行なわれる（Ｍｅｓｓｉｎｇ（１ ９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　Ｈリー：２０〜７８）　、他方、 相補的ＤＮＡ鎖が、第３図に示される１、６ｋｂのＮｄｅｌ−Ｎｓ１１フラグメ ント内の２種のユニークな制限フラグメント間に置換され得る二本鎖ＤＮＡフラ グメントを生成するために、合成され、そしてハイブリダイズされる（Ｈｅｎｄ ｅｒｓｏｎ、　ｌ　ｅ　、　＋（１９８６）Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ　３２ 　：　１６３７〜１６４１）　、特にことわらない限り、番号システムは、５′ 末端から出発するＭｏＭｕＬＶを言及する。ＤＮＡ）ランスフエフジョンは、Ｇ ｒａｈａｍ　ａｎｄＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄ ｅｒ　Ｅｂ（１９７３）狼エリ」■５２　：　４５６〜４６７）の方法によるも のである。

■土 ｄ至上■星製 バ・・　−ジング 種々の突然変異を試験するために使用される細胞は、記載されるようなｐＣＲＩ Ｐｅｎｖ−を含むＮＩＨ／３Ｔ３である（Ｄａｎｏｓ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａ ｎ　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５　；　 ６４６０〜６４６４）　、第１図に示されるＰ　ＣＲＩ　Ｐ　ｅ　ｎ　ｖ−は、 構築されたＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖを含むｐＢＲ３２２ａｍＰ耐性プラスミドで ある。Ｍ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖは５’　ＬＴＲを含み、Ｂａ１ｌ（２１２）とＰ ｓｔｌ　（５６３）（ここで数字はＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　ＬＶの５′未満からである ）との間に欠失を有するψである。

フラグメントにより置換されている（ＣｏｌｉｃｅｌｌＬ７Ｊ＆、＋（１９８５ ）Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１９９　：５３７〜５３９）。これらのパッケ ージング細胞は、ψＣＲＩＰｅｎｖ−細胞と呼ばれる。

プロウ　ルス　の プラスミドｐＭＯＶ−ψ＋　（Ｍａｎｎ、　ｆＬ＆、、（１９８３）　Ｃｅ１１ ３３　：　１５３〜１５９）を、Ｘｈｏｌ　（１５６０）及び５ｆｉｌ（５３８ ２）により切断する。ユニークなＸｈｏ１部位（１５６０）で、Ｘｈｏｌ−Ｂａ ｍｌアダプターを付加し、そしてΣ１上１部位（５３８２）で、ＢａｍＨＩ−３ ｆｉｌアダプターを付加する： Ｘ　ｈ　ｏ　１−Ｂ　ａ　ｍＨＩ　＝ＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡε１ Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　−Ｓ　ｆ　ｉ　１　＝ＣＡＴＣＣＧＧＣＣＮＮＮＣＣＧＧＮ ｐ　ｘ　１　（Ｊｏｙｎｅｒ、　ｆｆ？、＋　（１９Ｂ２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ７９　：　１５７３〜１５７７）からのＨ３Ｖ− １ｋ　（３，５ｋｂ）のＢａｍＨＩフラグメントをクローン化する。これは、高 い力価でパッケージされ（Ｂｅｎｄｅｒ、　ｚｚ、、　（１９８７）　Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、６１：１６３９〜１６４６）ｌＪＬｉＪＬ−、−Ｊｌ！！上−、ｅｎｖ ”であり、そして野生型ＭｏＭｕＬＶよりも約３５０ｂｐ短いψ−ＭｏＭｕＬＶ −Ｈ３Ｖ−±ｌ十変異体を生成する。このプラ大変異体ｐＮＣｌ　（ＮｏｖａＣ ｅ　１１）と呼ばれる。ｐＮｃｌにおけるＭＯＭｕＬＶプロウィルスの構造は、 第２図に示される。

肛 ｅｎｖ゛　云　の７然・　１光 ユニークＮｄｅｌ−Ｎｓｉｌフラグメント（５４０１〜７０５４）を、突然変異 誘発のためにサブクローンする。突然変異誘発の後、Ｎｄｅｌフラグメントをｐ Ｎｃｌ中に置換し、そしてＣＲＩＰｅｎｖ−細胞中にトランスフェクトする。得 られるウィルス粒子を、所望する性質、たとえば怒染性、宿主範囲、特定の受容 体の共有結合による宿主範囲の変更及び発現されたＨ３Ｖ−ｔｋによりアシクロ バーへの応答に従っての細胞殺害について試験する。ｅｎｖ遺伝子がこの構造体 において適切にスプライスされていない場合（）（ＳＶ−ｔｋ及びｅｎｖの両者 の発現が達成されない）、２種の遺伝子、たとえばｅｎｖのための別々のプロモ ーターの他の構成が、それらの２種の遺伝子が適切に発現されるまで、行なわれ る。

ウィルス産生についての試験は、ＸＣオーバーレイアッセイ及び逆転写酵素活性 アッセイによる（Ｒｏｗｅ、　星煮、、　（１９７０）■皿旦■　剣し１１３６ 〜１１３９）。

ＰＯＣｌ２は単一のＮｄｅ１部位（ｐＵｃ１９の番号システム内で１８３）を含 み、そしてＮ５ｉ１部位は含まない。凡ｄｅ１部位を、ＮｄｅｌによりｐＵｃ１ ９を切断し、Ｓ１ヌクレアーゼにより処理し、そして連結することにより除去す る。ｐＵｃ１９における複数のクローニング部位を、Ｅｃ。

Ｒ１及びＨｉｎｄｌ［［により切断し、ポリリンカーを除去する。

その場所に、Ｎｄｅｌ−Ｎｓｉｌアダプター：　ＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣ Ｔ を挿入し、ｐＵｃＩ９ａを得る。ｐＵｃ１９ａ中へのＮｄｅｌ　（５４０１）− Ｎｓｔｌ　（７０５４）の挿入は、ｐＵｃ１９−ｅｎｖ−をもたらし、Ｎｄｅｌ −Ｎｓｉｌ挿入体内にユニークな制限部位を有するｐＵｃ１９誘導体は、第３図 に示される。

ｅｎｖ終結は７７７２で存在する。ｅｎｖ５８７６−７０５４の領域において、 １５個のシスティン残基のためのコドンが存在する。これらのシスティン残基が マレイミドアダクトとの結合のために、並びに−３Ｆ（基を創造する任意の突然 変異のために利用できるかいづれかを試験するために、結合が、Ｈｅｎｄｅｒｓ ｏｎ＋星Ｊ、＋　ＣＨｅｎｄｅｒｓｏｎｆＬｅ、＋　（１９８６）　ＣＣ１１ｎ ｉｃａｌＣｈｅ　３２　：　１６３７〜１６４１）の方法に類似する方法で行な われる。

突然変異誘発された遺伝子をｐＵｃ１９誘導体から除き、そしてｐＮｃｌ中に配 置する。ｅｎｖ遺伝子における一連の種々に配置されたーＳ）１基を、第４図に 示されるようにして構成する。得られたプラスミドは、ＰＮＣ−３Ｈ−１，ｐＮ Ｃ−３Ｆ（−２，等と呼ばれる。これらのプラスミドを、ＮＣ−３Ｈ−１，ＮＣ −３Ｈ−２，等を創造するＣＲＩＰｅｎｖ−細胞、ｅｎｖＳＨ−１，ｅｎｖＳＨ −２，等を生成する細胞、Ｈ３Ｖ−ｔｋ遺伝子を含むヘルパーフリーウィルス中 にトランスフェクトする。結合のためにＮＨ−２基を有するリシン残基を導入す る類似する構造体を、ｐＮｃｌに移行されたｐＵＣ１９−１ｒＬＬ−に創造し、 ここでそれらはｐＮＣ−ＮＨ−１，ｐＮＣ−ＮＨ−２，等と呼ばれる。これらの プラスミドをＣＲＩＰｅｎｖ−細胞中に移行し、ＮＣ−ＮＨ−１，ＮＣ−ＮＨ− ２，等を創造し、そしてこれは、Ｈ３Ｖ−エエ遺伝子を含むｅｎｖＮＨ−１，ｅ ｎｖＮＨ−２ヘルパ一フリーウイルス粒子を生成するであろう。パンケージング 細胞が５ネズミのエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）　ウィルスヲ生成する ために企画され、そしてそれはヒト細胞を感染することはできない。

劃１− ７　の　は・　されたｅｎｖ　タンパク　への　の　の持金 腫瘍特異的抗体を、腫′瘍抗原表示細胞のみを感染するために、突出するｅｎｖ ［タンパク質、ｅｎｖ−３Ｈ又はｅｎｖＮ　Ｈｚ基に特異的に結合する。変性さ れたｅｎｖ糖タンパク質を得るために、ｅｎｖ遺伝子における突然変異を行ない 、有機化学的手段により結合するためにスルフヒドリル又はアミノ基を生成する 。特定の抗体、たとえば膵臓癌又は他の腫瘍特異的抗原又はホルモン受容体に対 する抗体のＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを、細胞特異的試薬を製造するために創 造する。

結合のために利用できる反応性成分、たとえばアミノ、炭水化物、スルフヒドリ ルに依存して、これらの細胞特異的試薬は、グルタルアルデヒド、ベリオデート 又はマレイミド化合物により、生来又は変性されたｅ　ｎ　ｖｌｉタンパク質を 含んで成るウィルス遺伝子投与ビークルに結合される。好ましい試薬は、抗体の ヒンジ域のスルフヒドリル基と結合するためにマレイミド試薬を含む。たとえば 、Ｉｓｈｆｋａｗａ、星イ＋ｌ　（１９８３）Ｌ」斐！巴邦互鮫−工；２０９ヲ 参照のこと。この方法により結合され得る他のリガンドの例は、ＨＩＶｉ染され たリンパ球を標的化するためにＨＩＶ　ｇｐ１２０に対する抗体、Ｈ１■感染さ れた細胞を標的化するために可溶性ＣＤ４タンパク質、トランスフェリン受容体 を標的化するためにトランスフェリン及びそれらのそれぞれの細胞表面受容体を 標的化するために他のメンバーの特異的結合対、たとえばガストリン、セクレチ ン、コレシストキニン又はソマトメジンＣを包含する。

獣 ’　されたｅｎｖ　ンコク　へのＣＤ４　ンバク　の−人ＨＩＶ感染Ｔ４リンパ 球を感染するように企画されたウィルスはまた、ｅｎｖ遺伝子のＮ−末端にＨＩ Ｖ　ｇｐ１２０により認識されるＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を融合するこ とによって製造される。この場合、細胞表面上でＨＩＶｇｐ１２０を特異的に作 り出す１４９７３球にＨ３Ｖ−１文含有プロウィルスによる感染を指図すること が可能である。

Ｃｈａｎｄｈｅｒｇ、星？、、　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３５５　：３６ ９〜３７２゜ＮＣ−ＣＤ４の８ ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で優先的に発現される５５ｋＤａの約４３５ 個のアミノ酸のポリペプチドである。

ＣＤ４は、免疫グロブリンのメンバーであり、そしてＴ細胞のＣＤ４サブセツト の増殖を調節することができるように思える。ＨＩＶ感染細胞を特異的に殺害す ることが示されている。ブヱヱ上至±Ｘ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ のアミノ酸１〜３及び２５６〜６１３に融合されるＣＤ４のＮ−末端１７８アミ ノ酸（Ｃｈａｕｄｈｅｒｙ＋Ｒ？、、　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３５５　 ：３６９〜３７２）が、ｐＮＣＩ中に置換され、そしてＣＲＩＰｅｎｖ−細胞中 に移行される。ウィルスを、ＨＩ　Ｖ９染された１４９７３球に対する感染性に ついて試験する。次に、アシクロバーを、ＨＩＶ感染された細胞を殺害するその 能力について試験する。

ｐ　Ｖ　Ｃ４０３（Ｃｈａｕｄｈｅｒｙ、星＆、、（１９８Ｂ）　Ｎａｔｕｒｅ 　３３５　：３６９〜３７２）からのＣＤ４の初めの１７８個のアミノ酸を、ｐ ＵＣ１９−ｅｎｖ−におけるＢｓｔＢｌｌ、Ｎｃｏｌ、Ｂｓ工ＸＩ、ＢａｍＨＩ 及びＴＴＨＩ［［−Ｉ中に配置する。ｐＶＣ４０３を、Ｎｄｅｌ及び５ａｃｌよ り一部切断し、ＣＤ４の１７８ＡＡ及びプ’／　（上天±ス外毒素Ａの部分を除 く。このフラグメントをＰＵＣ１９−ｅｎｖ−のユニークＢｓ　ｔＥ１１部位中 に挿入するためには、読み枠を整合された次のアダプターを必要とする。

Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＶａｌＧ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ 　Ａ　Ａ　ＣＡ　ＣＣＴ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ＣＤ４ｅｎｖ　ＣＴ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｔ　 Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　にのリンカ−は、ｐＶｃ４０３の約２５０ｂｐの Ｎｄｅｌ−３工且１フラグメントに連結され、そして次に、ＢｓｔＥｌｌにより 切断されたｐＵｃ１９−ｅｎＶ−に連結される。この構造体を、ヌクレオチド６ ０２５でＭｏＭｕＬＶｅｎｖを切断するＮｃｏｌにより切断し、それによってｅ ｎｖの遠隔領域からリンカ−を除去する。Ｎｄｅｌでの部分的切断は、ｐＶＣ４ ０３に担持されるプソイドモナス外毒素Ａの約７５ｂｐのドメイン■を除去する 。次に、この線状ｐＵｃ１９−ｅｎヱーを、次のＮｄｅｌ−Ｎｃｏｌアダブクー と整合して配置ＣＤ４ＣＡＴＡＴＣ八八ＴＣＡＴＧ Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃｅｎｖこのプラスミドを Ｎｄｅｌ及びＮ５ｉ１により切断し、そしてそのフラグメントをｐＮｃＩ中に配 置し、第５図に示されるプロウィルス構造体を有する所望するｐＮＣ−ＣＤ４を 創パユ立：ジング　びウィルスの　ｈ に・して　・な プロウィルス　ＮＣ−Ｈ３Ｖ−ｔｋ　２　の変異体ウィルスが有用であるものと して同定された後（細胞標的化相互作用できる）、ψ＋プロウィルス及びパッケ ージング細胞の二元ベクター系を調製する。実験的には、プロウィルスのトラン スフェクションの前、ｅｎｖ＋細胞の選択を回避するためにプロウィルス型でｅ ｎｖ遺伝子を突然変異誘発せしめることが便利である。しかしながら、産生にお いては、選択されるｅｎｖ遺伝子を、パフケージング細胞の染色体に移行する。

パッケージング細胞のＤＮＡ中にｅｎｖ遺伝子を組込むために、ｐＮＣ−３Ｈシ リーズ、ｐＮＣ−ＮＨシリーズ又は上記のｐＮＣ−ＣＤ４からの所望するＮｄｅ ｌ−ＮｓｉｌフラグメントをＮＩＨ／３Ｔ３細胞に移行する。（Ｄａｎｏｓ　ａ ｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｒｉ（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ 、ＵＳＡ　旦５　：　６４６０〜６４６４）　。

ナンセンス変異体又はｐ　ＣＲＩ　ＰＪＬＬＬ　−２変異における欠失体を、Ｘ ｈｏ１部位（１５６０）のみならず、またＮ工ｕｌ　（２１２０）、Ｂｃｌｌ　 （２７４０）、及び５ａｉｌ（３７０５）部位で挿入する。ＮＩ）（／３Ｔ３細 胞を、除去すしたｅｎｖのＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａｌフラグメントを有するｐｃＲＩ Ｐｅｎｖ−により及び欠陥のある１’ＣＲＩＰＩＬＬ２１つより連続的に形質転 換する。

エエエ、ＬＬＬ及び変異体ｅｎｖ遺伝子を、十分なコンビラントパッケージング 細胞になることが運命づけられている細胞中に移行するために、類似する型に従 って３種の異なった構造体が使用される。−膜化された型は、５’　ＬＴＲのゲ ノム構造、ψ−、５’　ＬＴＲにより駆動されるトランスウィルス遺伝子生成物 、５’　ＬＴＲスプライスドナー及びｅｎｖスプライス受容体により駆動される 同じトランスウィルス遺伝子生成物の第２コピー及びＳＶ４０ポリＡである。

ａ）５’　ＬＴＲ，ψ−２ＬＬＪＬ、ＬＪＬ、Ｓ■４０ポリＡ。

ｂ）５’　ＬＴＲ，ψ、、ＬＬ上、　ＬＬＬ、Ｓ　Ｖ　４０ポリＡ。

ｃ）５’　ＬＴＲ，ψ−、ｅｎｖ、ｅｎｖ、ＳＶ４０ポリＡ。

ｐＮＣＪＬＬＬ、ＪＬＬＩＬの構造は、第６ａ図に示される。この構造体のため の出発材料は、ｐＣＲＩＰｅｎｖ−及びｐＭ。

Ｖ−ψ−（ｍａｍａ、　ｆｌｅ、、Ｃｅ１ｌ（１９８３）３３　：　１５３〜１ ５９）である。

ｐｃＲＩＰｅｎｖ−を、ＪＬＬＬターミネータ−（２２３５）から下流でＢｃ　 Ｉ　Ｉ　（２７４０）により切断する。ｅｎｖスプライス受容体部位を含むＮｄ ｅｌ　（５４０１）　〜５ｂａＩ（５７６６）を、ＢｃｌＩ部位中にクローン化 する。

Ｓｂａ　Ｔ部位から出発して、ＤＮＡの２本鎖はＭｏＭｕＬＶ　ｂｐ６１５−７ ３９である。５′末端（６１５）で、エエ五遺伝子のＰｓ　ｔ　１　（７３９） を適合するために約１５ｂｐまでのｄｓＤＮＡリンカ−が存在する。次に、ｐＭ ＯＶ−ψ−からのＰｓｔｌ　（７３９）−Ｂｃｌ　１　（２７４０）フラグメン トを付加する。Ｂｃｌｌ及びＣ１ａｌを連結するように企画された約１０ｂｐま でのｄｓＤＮＡリンカ−が、ｐｃＲＩＰｅｎｖ−にＳＶ４０ポリＡを付加する。

ＰＮＣＬＬＬ、ｕ土の構造は第６ｂ図に示される。出発材料は再びｐｃＲＩＰｅ ｎｖ−及びｐＭＵＶ−ψ−である。

ｐＣＲＩＰｅｎｖ−をＨｉｎｄＩ［［により切断し、そしてｐＭＯＶ−ψ−をＮ ｒｕｌ　（２１２０）及びＬＬＬＩ（５８１６）により切断する。Ｈｉｎｄｎｌ 及びＮｒｕ　Ｉ部位を、約１５ｂｐまでのｄｓＤＮＡアダプターにより連結する 。ｍ１部位を、ｐＭＯＶ−ψ−からのｅｎｖスプライス受容体フラグメント、す なわちＮｄｅＩ　（５４０１）　−Ｘｂａｌ　（５７６６）のＮｄｅｌ　（５４ ０１）に約１５ｂｐまでのもう１つのｄｓＤＮＡアダプターにより連結する。１ ５ｂｐを越えないｄｓＤＮＡアダプターが、再びｐＭＯＶ−ψ−からのＵ上遺伝 子のＮｒｕｌ　（２１２０）　−辻Ｊ」−Ｉ　（５７６６）に５ｂａＩ（５７６ ６）を連結せしめる。約１５ｂｐまでのｄ　ｓ　ＤＮＡ且Ｌ１１−　ＣＩ　ａ　 Ｉアダプターがこの構造体をｐｃＲＩＰｅエヱーに連結せしめる。この構造体に おけるアダプターは、正しい読み枠を維持する必要はない。

ｐＮＣｅｎｖ、ｅｎｖの構造が第６Ｃ図に示される。１ユヱ遺伝子は、次の所望 するｐＮＣ−ｅｎｖシリーズ：　ＰＮＣ−３Ｈシリーズ、ｐＮＣ−ＮＨシリーズ 又はｐＮＣ−ＣＤｄシリーズ、又はウィルスの細胞特異的宿主範囲を変えるよう に企画された類似するｐＮＣ−ｅｎｖシリーズの構造体から生じる。ｐＮＣ−ｅ ｎｖ−ｅｌｖの主鎖はｐｃＲＩＰｇａｇ−２である（Ｄａｎｏｓ　ａｎｄ　Ｍｕ ｌｌｉｇａｎ、　１９８ＥＬ　ｆｉ）　＊　Ｐ　ＣＲＴＰｅｎｖ−をＨｉｎｄｌ ｌにより切断しそしてｄ　５ＤＮＡアダプターを、ｅｎｖスプライス受容体部位 をまた含む５ｆｉｌ（５３８２）　−Ｎｓ　ｉ　Ｉ　（７０５４）ｅｎｖフラグ メントにＮｄｅｌ　（５４０１）−ＢＳＳＨＩＩ　（８２１２）を連結するため に使用する。所望するｐＮＣ−ｅｎｖシリーズからの変更されたｅｎｖ遺伝子の Ｎｓ　ｉ　Ｉ　（７０５４）部位を、ｐＣＲＩＰｇａｇ−２のｅｎｖ遺伝子のＮ ｓ　ｉ　Ｉ　（７０５４）に読み枠を整合して連結する。

次の３種のプラスミド、ｐ　Ｎ　ＣＪＬＬＬ、　ＪＬＬＬ、Ｐ　Ｎ　Ｃｚ土上、 １土上及びｐＮＣｅｎｖ、ｅｎｖを、連続的な手段でＮＩＨ／３Ｔ３細胞中にト ランスフェクトし、所望する生成パッケージング細胞を結果として生成する。

上記パッケージング細胞に関しては、二元ベクターシステムの第２部分は、対象 の所望する遺伝子を移行するように企画されたψ＋プロウィルスである。ｐＮＣ −Ｈ３Ｖ−ｔｋ（２）の構造は第７図に示される。

氾 の　イブにおけるアンチセンスＲＮＡの　のためにパフ　−ジング　びプロウィ ルスの アンチセンスＲＮＡはまた、細胞阻害又は細胞活性阻害遺伝子としても作用する ことができる。ここに記載される遺伝子療法投与ビークルは、アンチセンスＲＮ Ａを生成するために、標的細胞をプログラミングするための理想的なベクターを 表わす。特定の例として、ＨＩＶ感染されたＴ４リンパ球のためのアンチセンス 構造体が示される。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、　ｆｌ　＆　。

（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、　１１ζ、、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ ｃａｄ　Ｓｃｉ、　８５　：　５５０７−５５１１．）は、）ＩＩＶゲノムの種 々の機能的部位に２ｏｂｐの長さのアンチセンスＲＮＡを合成した。レトロウィ ルスＲＮＡ（Ｒ領域）の末端で反復される配列内の又は近くの部位、スプライス 受容体部位及びスプライスドナ一部位に相補的なオリゴマーは、最っとも効果的 であることが、Ｇｏｏｄｃｈ　ｉ　ｌ　ｄ　、　ｑ　ｅ。

により見出された。

上−ＮＣ−ｔｋ−Ａ盈坐拷底 次の４種のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機で合成し、そしてｐＮＣ−Ｈ３ Ｖ−ｔｋ　（２）におけるＨ３Ｖ−エエψ第１ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ挿入体中 に挿入する。

臓Ｉ趣壇１位　ＢａｍＨＩオ謀ブマ−５′−５４−プロウィルスＣａ　ｐ　ＧＡ ＴＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴ ＣＡＧＴＣＡＣＴＡＧ　ＮＣ−ＦＩＳＶ−ｔｋ−ＡＳＩ５′未翻訳　ＧＴＡＣＣ ＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣ領域　ＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴ ＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧ　ＮＣ−Ｈ５Ｖ−ｔｋ−Ａｓｓスプライス受容体／　ＧＴ ＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣｐ　ｏ　Ｉ　ｙ　（Ａ）　ＧＴ ＡＣＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＴシグナルＣＣＧＴＴＣＡＡＡＡ ＴＡＡＣＴＣＣＧＡＡＣＴＡＧ　ＮＣ−Ｈ５Ｖ−ｔｋ−ＡｓｓＨ３Ｖ−ｔｋ遺伝 子及びアンチセンス転写体を含むｐＮＣ−Ｈ３Ｖ−ｔｋ−ＡＳ　（ＡＳ＝アンチ センス）プロウィルスゲノムの構造は、第８図に示される。

班亘 ＳＶ４０ニーベタ　−の 新しいＳＶ４０ウィルス粒子の成熟のために必要とされるポリペプチドをコード する遺伝子は、ＶＰＩ、ＶＦ６及びＶＢ２である（第１０図を参照のこと）。Ｖ ＰＩ、ＶＦ６及びＶＢ２は独立して、高い発現ベクター上に配置される。その構 造体は、ＭｕＬＶ５’　ＬＴＲプロモーター又はメタロチオネインプロモーター を用いて調製され、又は宿主細胞におけるいづれか他の強いプロモーター構造体 が使用され得る。ＶＰｉ、ＶＦ６及びＶＢ２のための３種の構造体の構造は、そ れぞれ第１１ａ、ｌｌｂ及びｆｌｅ図に示される。これらの３種の構造体は、ｐ ｃＲＩＰｅｎｖ−及びＳＶ４０に基づかれ、そしテｐ　Ｎ　ＣＶヱｊ、ＶＰＩ、 ｐＮＣＶＰ２．ＶＦ６及びｐＮＣＶＰ３．ＶＢ２と命名される。ｐＮｃＶＰｌ、 ＶＰ土の構造は第９ａ図に示される。番号付はシステムは、特にことわらない限 り、ＭｏＭｕＬＶからである。ｐｃＲＩＰｅｎｖ−をＨｉｎｄＤＩ　（２１２） 及びＣ１ａ　Ｉ　（７６７４）にヨリ切断し、そして５ｖ４０をＲｓａ　Ｉ　（ ＳＶ４０，１４６７）及びＢｃｌ　Ｉ　（ＳＶ４０，２７７０）により切断する 。

ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＲｓａ１部位を、約１５ｂｐまでのｄｓＤＮＡアダプターに より連結する。

Ｂｃ１１部位を、Ｂｃｌｌ−Ｎｄｅ■アダプターにより、エエ叉スプライス受容 体（Ｓ、Ａ、）部位、すなわちＮｄｅＩ−ＸｂａＴ　（５４０１−５７６６）に 連結する。ＶＰＩの第２コピーを、ＸｂａＩ−ＲｓａＩアダプターによりＸｂａ 　！部位中に連結する。最後に、ＢｃｌＩ−Ｃ１ａ！アダプターが、ｐＣＲＩＰ ｅｎｖ−からのＳＶ４０ポリＡ配列を有する構造体を完結せしめる。この構造体 におけるアダプターは正しい読み枠で維持される必要はない。

第１１ｂ図は、ｐＮＣＶＰ２．ＶＦ６（７）構造体を示す。この構造体は、ｐＣ ＲＩＰｅｎｖ−及びＳＶ４０を用いることにおいて類似する。ｐＣＲＩＰｅｎｖ −を、ＨｉｎｄＩ［［及びＣ１ａＩにより切断する。大きなプラスミドの主鎖は 、５ｖ４０　ＶＦ６の２つのコピーにより再構成される。小さなフラグメントを さらにＮｄｅＩ及びＳｂａ　Ｉにより切断し、！結する。ＶＰ２Ａｃｃｌ　（Ｓ Ｖ４０，１６２８）を、ＮｄｅＩに対するアダプターによりＳ、Ａ、に連結する 。Ｓ、Ａ。

Ｘｂａ　Ｉを、アダプターにより、且１ｌＴ１　（ＳＶ４０．　３４４）でＶＦ ６（７）第２コピーに連結する。Ａｃ　ｃ　Ｉ　（ＳＶ４０゜１６２８）を最後 に、Ｃ１ａｌ　（５６７４）に対するアダプターによりｐｃＲＩＰｅｎｖ−に連 結する。この構造体におけるアダプターは、正しい読み枠を整合して維持される 必要はない。

第１１ｃ図は、ｐＮＣＶＰ３．ＶＢ２の構造を示す。この構造体は、ＰＣＲＩＰ ｅｎｖ−及びＳＶ４０に由来する。

ｐＣＲＩＰｅｎｖ−をＨｉｎｄＩＩ［及びＣ１ａｌにより切断し、プラスミド主 鎖を得る。小さなフラグメントをさらに、Ｎｄｅｌ及びＸｂａｌ　（５４０１〜 ５７６６）により切断し、Ｓ。

Ａ、を得る。Ｈｉｎｄｌｌ［（２１２）部位を、アダプターにより５Ｖ４０Ｈａ ｅＩＩ　（８３２）部位に連結する。５Ｖ４０ＡｃｃＩ　（１６２８）を、合成 されたｄｓＤＮＡアダプターにより５’　Ｓ、Ａ、Ｎｄｅ　Ｉ　（５４０１）に 連結する。Ｓ。

Ａ、Ｘｂａｌ　（５７６６）を、アダプターによりＶＢ２　且ａｅｕ（３２）に 連結する。ｄｓＤＮＡのアダプターを合成し、ＡｃｃＩ−Ｃ１ａＩ　（ＳＶ４０ ．１６２８〜７６７４）を連結し、構造体を完結する。これらのアダプターは、 読み枠を整合して維持される必要はない。第９ａ、９ｂ及び９０図に示される３ 種の構造体は、ＳＶ４０のための許容系、たとえばＣＶＩ、ＥＳＣ−１又はＶＥ ＲＯ中に連続的にトランスフェクトされ、ＳＶ４０パッケージング細胞を得る。

ＶＰＩ構造体の部位特異的突然変異誘発は、細胞特異的受容体の共有結合のため のＳＨ−又はＮＨ２−基を生成する。

これらの受容体は、ＳＶ４０二元ベクターの移動性要素の宿主範囲を定義する。

これらの構造体を、パターン化する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、　ｆｌｅ、、Ｃ１１ ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｎ＋１ｓｔｒ　（１９８６）３２　：　１６３７〜１６４１ ）。

構造体のＳＨシリーズは、ｐＮＣ３Ｖ−３Ｈ−１，ｐＮＣ３Ｖ−３Ｒ−２、等と して、又は他方、リシン置換に関しては、ｐＮｃｓＶ−ＮＨ−１，ｐＮｃｓＶ− ＮＨ−２、等そして知られている。

ＳＶ４０由来のベクターの移動性要素は、初期及び後記プロモーターの両者をコ ードする、Ｔ抗原及びｏｒｉをコードする５Ｖ４０ｎｔ２５３３−５２４３−２ ９４を含む。ＳＶ４０後期プロモータの下流に、所望するＫ１１ｌ遺伝子が存在 する。ＳＶ４０は、パッケージされ得る狭い範囲のＤＮＡサイズを有し、最大約 ２２５０ｎｔが収容され得る。１：れは、アンジオゲニン（３６９ｎｔ）（ｋｕ ｒａｃｈｉ　ｆｅｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８５）２４　：　５４ ９４〜５４９９）　、ジフテリア毒素の１６０５ｎｔのＡ鎖（Ｇｒｅｅｎｆ　１ ｅｔｄ　ｌ　ｅ　、　＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　８０　：　 ６８５３〜６８５７）、ヒト細胞毒性リンパ球からの７４１ｎｔのセリンプロテ アーゼ（Ｔｒａｐａｒｔ、　Ｒｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ’ｉ、 （１９８８）８５：６２９４〜６９２８）及び同様のものをコードするのに十分 な空間である。

この構成は、数字付システムがｏｒｉにおけるユニークな１エ上１部位で始まる 、ユニークなりａｍＨｌ　（２５３３）に挿入されるｐＢＲ３２２によりＥ、コ リ中で行なわれる。この構造体は、ｐＮＣＨ３Ｖｋ　ｉ　１１として第１０図に 示される。上記パッケージング細胞をトランスフェクトする前、ｐＢＲ３２２主 鎖を、ＢａｍＨＩによる切断及び再連結により除去する。これらの構造体におけ る異なったｋｉｌｌ遺伝子を、小さなりＮＡフラグメント（約１００ｂｐ）とに 合成し、ハイブリダイズし、そして適切な遺伝子中に一緒に連結するＣ１１ｅｎ ｄｅｒｓｏｎ、ｆｌｅ、、　（１９８６）、Ｍｊｉ：Ｌ）　、合成された遺伝子 を、Ｓ■４０ベクター中に連結し、ｐＮｃＨ３Ｖｋ　ｉ　１１を得る。

上記二元ウィルスベクターを、特定の標的細胞の増殖を阻害するために使用し、 ここでベクターの標的化は、変性されたピリオン表面糖タンパク質により提供さ れる。標的細胞の増殖を、ウィルスベクターにおけるｋｉｌｌ遺伝子の遺伝子産 生により、又は細胞阻害生成物を生成するようにｋｉｌｌ遺伝子生成物の作用に より直接阻害する。そのベクターはインビトロ及びインビボの両者で使用される 。

■■ ＳＶ４０プソイドビリ、ｔｙａ８１収 ＳＶ４０プソイドピリオンを、ＣＯ３−７細胞に構成する（Ｇｕｚｍａｎ、　（ １９８１）Ｃａ旦　２３　：　１７５〜１８２）。開始構造体は、Ｈ鎖免疫グロ ブリンエンハンサ−の制御下でジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）を含む初期Ｔ抗 原置換ベクターである。クローニング方法は、Ｄａｖｉｓ＋　（１９８０）Ａｄ ｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏ ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇに記載される。酵素は、製造業者 による指針に従って使用される。Ｄ　Ｎ　Ａ　！！’ＡｐｐｌｔｅｄＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８ＯＡ上で合成される。

ｐｓＶ４０を、ユニークなＥｃｏＲ１部位でｐＢＲ３２２にＳＶ４０　ＤＮＡを クローニングすることによって調製する。ｐＢＲ３２２のＰｖａ　Ｉ［−Ｐｓ　 ｔ　Ｉフラグメントを、ｐＢ　Ｒ３２７（Ｌｕｓｋｙ　＆　Ｂｏｔｃｈａｎ　Ｎ ａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ＞（１９８１）２９３　ニア９〜８１）の５ａｉｌ −ＰｓｔＩにより置換し、毒素配列を除去する。多くのクローニング部位（ＭＣ ３）、すなわち毒素ＭＣ３を合成し、そしてヱ土ｌＩ　（Ｓ　Ｖ　４０数字付は システムｎｔ４７３９）中にクローン化する。Ｔ抗原の２種の小さなりｂｖＴＩ フラグメント（ｎｔ８５０〜２９０４．及び２９０４〜４４１６）を除去する。

小さなポリＡ含有ＳＶ４０Ｂｃ　１１−ＢａｍＨ１フラグメント（ｎｔ２７７０ 〜２５３３）を重複し、そして第２の複数クローニング部位（ポリＡＭＣ３）を 、重複間の連結部に挿入し、第１３図に示されるｐＮｃｓＶｌを創造する。

ｐＮｃｓＶｌにおいて、５Ｖ４０ｏｒｉ及び後期官能価ＶＰｌ、ＶＰ２．ＶＰ３ ．ｌエエ土遺伝子、及び後期ポリＡ部位は損なわれていない。初期領域は、Ｔ抗 原の５′コード領域の短い領域、Ｔ抗原転写物を終結するターミネータ−１ＤＴ −Ａ及び調節エンハンサ−及びプロモーター要素の挿入のためのＭＣ３（Ｉ　ｇ ＧＸンハンサー２８９ｂｐ　Ａ１ｕＩフラグメント、及びＨ鎖プロモーター）、 ＳＶ４０スプライス部位、ＳＶ４０初期ポ初期ポリ及部位２複数クローニング部 位、すなわちポリＡ　ＭＣ３を含む。ポリＡ　ＭＣ３は、追加のＡｌｕｒエンハ ンサ−及びアンチセンスＴ３ＲＮＡポリマラーゼプロモーターのために存在する （０”Ｃｏｎｎｅｒ、虹、、」ｃｔｅｒｉｏｌ　（１９８７）１６９　：４４５ ７〜４４６２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ、　星＆、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓ ｃｉ、　（１９８９）８６　：　５４００〜５４０４）　、これは、ＳＶ４０プ ソイドピリオンに１３１０ｂｐの利用可能なコード空間を生成する。ＳＶ４０は 、野生型５２４３ｂｐＩ）１５〜１０２％ノミニクロモソームをパッケージする ことができる（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ。

Ａｎａｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８３）　１３５　；　１〜１５）。

Ｔ抗原における１３１０ｎｔのギャップを、翻訳ターミネータ−、オリゴヌクレ オチドスペーサー、及びＴの初めの少々のヌクレオチドを終結するためのポリＡ シグナル（ＴＧＡ−オリゴ（ｎ＝２０）−ＡＡＴＡＡ）　、を抗原、２７９ｂｐ のＩｇＧＨ鎖エンハンサ−（Ａ　１　ｕ　Ｉフラグメントｆ　ｐＳｅｒ　、　Ａ 　１　ｕ−ａ　）　（Ｈａｙｄａｙ、？ＩＣ＆、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３ ０７　：　３３４〜３４０）、ＩｇＧＨ鎖プロモーター、第２の２７９ｂｐのＩ ｇＧＨ鎖エンハンサ−及び５８２ｎｔのＤＴ−Ａ遺伝子（ＦＩａｘｗｅｌｌ、星 ？、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、（１９８６）　４６　：　４６６０〜４６６４） により置換する。ＳＶ４０初期置換ベクターを、単一のＥｃｏＲ１部位で切断す ることによってこのプラスミドから除去し、ゲル精製し、そして連結により環状 化する。エレクトロポレーションによるＤＮＡのトランスフェクションは、この 構造体の毒性及び細胞特異性を示す。これによるＣＯ３−７細胞のトランスフェ クションは、プソイドピリオンを生成する。この構造体は、他の細胞タイプと比 較して、Ｂ細胞に対して８０〜９０％の特異性を示すことが予測される。

五■ アンチセンスＳＶ４０プソイ゛ビ’）−に７（Ｄ１戊ＳＶ４０プソイドピリオン を、例■に記載されているようにして構成する。アンチセンス構造体を付加し、 すなわちＴ３ＲＮＡポリマラーゼプロモーターにより駆動する（０”Ｃｏｎｎｅ ｒ、　ｆｌｅ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８７）１６９　：４４５７〜 ４４６２）　、　Ｔ３ＲＮＡポリマラーゼ及びＴ３プロモーターはひじょうに特 異的であり、そして真核生物細胞において機能する（Ｄｅｕｓｃｈｌｅ。

ｆｅｅ　、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８９）　８６　 ：　５４００〜５４０４）　。Ｃ０３−７細胞におけるＴ３ＲＮＡポリマラーゼ 、及びＤＴ−Ａ遺伝子の３′末端でのＴ３プロモーターの包含は、アンチセンス ＲＮＡ不活性化ＤＴ−ＡｍＲＮＡを生成する。アンチセンスＲＮＡは、それらが Ｔ３ＲＮＡポリマラーゼを含まない場合、標的の腫瘍細胞には存在しない。この 構造体は第１４図に示される。

ＳＶ４０は、サル及びヒト超厚のほとんどの細胞タイプをインビトロ及びインビ ボで感染せしめる。ＳＶ４０は効果的にヒトリンパ球を感染せしめる（Ｏｐｐｅ ｎｈｅｉｍ、　ｇ　ｅ　、　＋　Ｐｒｏｃ、　−Ｎａｔ、Ａｃｕｄ、Ｓｃｉ、　 （１９８６）　８３　：　６９２５〜６９２９　；　Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　ｆｌ 　ｅ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８５）８２　：　１５８〜１６ ２）。上記ＳＶ４０プソイドピリオンは、初期プソイドピリオンのインビトロで の存効なデータを提供するであろう。ＳＶ４０は、予備動物モデルの４ｙｅ±で の治療データを得るために使用され得る。

±Ｘ ＬＰＶプソイド臣ニオ」ゴυｌ或 ＬＰＶは、ＳＶ４０よりもより狭い宿主範囲を有し、それはサル及びヒト超厚の Ｂ細胞腫瘍細胞のみを感染する。宿主範囲の制限は、エンハンサ−及びＶＰＩ配 列の機能である。

ＬＰＶエンハンサ−は、遺伝子発現をＢ及びＴ細胞に制限しくＭｏ５ｔｈａｆ、 星＆、、伸旦（１９８５）３１５　：５９７〜６００　；Ｃｈｅｎ。

ｆｌｅ、、Ｊ、Ｖｔｒｏｌ、（１９８９）６３：２２０４〜２２１４）　、とこ ろがＶＰＩはＬＰＶをＢ細胞に制限する（Ｋａｎｄａ、ｆ、Ｋｅ、、Ｊ、Ｖｔｒ ｏｌ。

（１９８６）５９　：　５３１〜５３４）。第５図は、ＳＶ４０及びＬＰＶゲノ ムの代表的な図を示す（Ｆｒｉｅｄ、ｆｉ　＆　、　、（１９８６）　前記；Ｐ ａｗｌｉｔａ、ｆｉｅ、、ｎ皿肋■（１９８５）１４３　：１９６〜２１１）。

その類似性は著しい。ゲノム機構は同一である。２種のウィルスは交差反応せず 、さらに４１％のＤＮＡ配列の同一性を示す。

ＶＰＩのアミノ酸配列、すなわち主要ピリオンポリペプチドは、５４％以上の同 一性を共有する。

ＤＴ−４クローニングの生成、標的細胞毒性及び組織特異的エンハンサ−は、上 記ＳＶ４０の研究で解決されるであろう。ＬＰＶの研究は、安全な包含性複製メ ンコンピテントプソイドビリオンを生成するように企画されるであろう。パッケ ージング細胞は、ＣＯ３−１及びＣＯ３−７，Ｐｓ　ｉ　−２゜Ｐｓｉ−ＡＭ細 胞、及び別々の宿主細胞染色体挿入物上でのピリオン機能の２種の遺伝子分離を 用いて、モデルとして構成されるであろう（Ｇｕｚｍａｎ、　ｑｇ、　Ｃｅ１ｌ （１９８１）２３　：　１７５〜１８２　；Ｍａｎｎ、　ｌｅ、、Ｃｅ旦（１９ ８３）５３　：　１５３〜１５９　；　Ｃｏｎｅ、　ｌｉｅ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（１９８４）８１：６３４９〜６３５３ ；Ｄａｎｏｓ、ｆｌｅ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８Ｂ）８５　：　６４６０〜６ ４６４）　。

目的は、可能な最高の力価構造物を生成することである。

これは、適切なパッケージング細胞を企画することによって達成される。パッケ ージング細胞は、プソイドピリオン産生に止」シコんで供給されるべきピリオン タンパク質をコードする。最高のプソイドピリオン力価は、ＬＰＶカプシドを生 成する懸濁培養における、リンパ腫パッケージング細胞（ＢＪＡ　−Ｂ　）　０ ［１ｅｔｎ、　ｆｉｌ　ｅ　、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ １９７４）７１　：　３２８３〜３２８６）により達成され得る。他方、ＣＶ− １，Ｖｅｒｏ又はＢＪＡ−Ｂパッケージング細胞に産生される５Ｖ４０−ＬＰＶ ハイブリッドカプシドが最良であろう。Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス遺 伝子投与ビークルのエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）からアンビトロピッ ク（ａｍｐｈｉｔｒｏｐｉｃ）宿主範囲への変化は、エコトロピックエ互工及び Ｌ±上遺伝子の保持を包含するが、しかしアンピトロピックネズミ白血病４０７ ０Ａ株からのｅａｖ遺伝子を置換した。同様に、ＬＰＶベクターのための必要条 件は、ＬＰＶＶＰＩを利用することである。ＶＦ６．ＶＦ６．ｏｒｉ及びＴ抗原 はＳＶ４０からである。パッケージング細胞におけるＴ抗原、ＶＰＩ、ＶＦ６及 びＶＰ３発現は、アンビトロビックレトロウィルスＰｓｉ　−ＡＭによるパッケ ージング細胞の染色体中へのクローン化を引き、起こすであろう。これらの遺伝 子は、誘発性メタロチオネインプロモーターにより制御されるであろう。このプ ロモーターシステムは、ＣＶ−１細胞におけるＳＶ４０プソイドピリオン産生の ためのＴ抗原の産生と適合できることが示された（Ｓｅｔｔｌｅａ＋ａｎ、など 、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８８）８５　：　９００７〜９０１１）　。

第１６図は、ｐＮｃＬＶＰ２、すなわちＬＰｖピリオンポリペプチドを含むＢＪ Ａ−Ｂパッケージング細胞に調製されるＬＰＶ　ｏｒｔミニプラスミド構造体を 示す。これは、第１３図のｐＮｃｓＶｌに類似するように思われるが、但し、そ の配列はＬＰＶであり、そして制限切断部位が異なり、さらに官能領域は同一で ある。さらに、５Ｖ４０ｏｒｉ、５Ｖ４０Ｔ抗原及びＬＰＶ　ＶＰＩ、ＶＦ６及 びＶＦ６を存するミニクロモソームは、ｐＮｃＬＶｌのＫｌユＩ　（ｎ　ｔ　２ ９４　）−ＥｃｏＮｌ　（ｎｔ５０２７）ｏｒｉフラグメントとｐＮＣＬＶ２の ＳｍａＩ−ＮｃｏＩｏｒｉフラグメントとを交換することによって構成されるで あろう。

適切なパッケージング細胞は、レトロウィルス（例Ｖを参照のこと）について記 載されているようにして、この研究の結果から生成されるであろう。プイソドビ リオン中にパッケージソゲするミニクロモソームに関して、その必要条件は土工 上及び５２４３ｂ、の環状ゲノム７５〜１０２％である。大きなプラスミドはパ ッケージされない。産生ミニクロモソームは、第１７図に示されるように反対の 方向に向けられた第１４図に示される毒素挿入体の２種のコピーを含むであろう 。

毒素ＭＣ３へのｏｒｉのいずれかの側上での配列は、適切な大きさく５２４０ｂ ｐ）の構造体を製造するためにｌａｃ　Ｚ配列から構成される未関係ＤＮＡであ ろう。

上記二元ウィルスベクターは、特定の標的細胞の増殖を阻害するために使用され 得る。標的細胞の増殖は、ウィルスベクターにおけるＫ１１ｌ遺伝子の遺伝子産 生により、又は細胞阻害生成物を産生ずるＫ１１ｌ遺伝子生成物の作用により直 接的に阻害される。組成物及び方法が、たとえばＨＩＶ−１感染細胞に及びウィ ルス物質がパボーバウィルスである場合、他の細胞タイプに外来性遺伝子を一時 的に発現するためにビークルとして使用され得る。バボーバウィルスの原型とし て、たとえば切除療法又はより遺伝的なウィルス療法としてのＳＶ４０の利点は 次の２点である：　（１）標的及び非標的細胞の一時的な遺伝子工学学としての ＳＶ４０ミニクロモソームの発現が生ぜず、そして（２）ＳＶ４０が安定し、そ して製造可能である。Ｔ抗原依存性複製により増幅されたＳＶ４０ミニクロモソ ーム並びに非増幅構造体が使用され得る。

パポーバウィルスは、それらが狭い宿主範囲を一般的に有し、そしてそれらが組 織特異的ウィルス治療を開発するために使用され得る追加の利点を提供する。

Ｕ土 ＬＰＶ−７６の ＬＰＶ−７６は、サル及びヒト起源のＴ細胞及びＢ細胞の両者を感染するＬＰＶ の変異体である（Ｋａｎｄａ、星煮、、Ｊ、νｉｒ。

１、（１９８６）１４３　：　１９６〜２１１）。ＬＰＶに比較して、Ｔ細胞を 包−食するように宿主範囲を広めることを担当するＬＰＶ−７６における変異は 、ＶＰＩにおける３個のアミノ酸変化である。

さもなければ、そのウィルスは同一である。例Ｘに記載される治療に基づいて構 築するためには、２つの追加条件を必要とする。まず、パッケージング細胞は、 ＶＰＩ又はＬＰＶＯ代わりにＬＰＶ−７６のＶＰＩを発現すべきである。第２に 、第１４図に示され、そして産生ミニクロモソームに導入されるＤＴ−Ａ毒素挿 入体が、遺伝子発現をＴ細胞に制限するように再企画されるべきである。

バフケージング細胞の構成は、次の通りである。ＰＶＩにおける適切な変異体を 、３ｋｂのＰａｔｌフラグメント上のＬＰＶ−７６から除去する（Ｋａｎｄａ、 　星よ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８５）５５：９６〜１００）。このフラグメ ントを、さらに、ｖＰｌのみを含むように小さくする。パンケージング細胞を、 例Ｘに記載されるようにして、ＣＶ−１，ＶＥＲＯ，又はＢＪＡ−Ｂ細胞に生成 する。

Ｔ細胞切除治療物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＰ）エンハンサ−／プロモーターの発 現制御下でＤＴ−Ａ毒素を用いて構成される。そのＴ細胞受容体は、α＋β又は γ＋δ鎖のいづれかにより構成される細胞表面へテロダイマー分子である。α遺 伝子は、従来のヘルパー及びキラーＴ細胞（ＣＤ４”　ＣＤ８−及びＣＤ４−　 ＣＤ８”　）に発現され、ところがδ鎖はＣＤ４−　ＣＤ８−　Ｔ細胞に主に発 現される。α及びδ遺伝子の両者を含む単一の遺伝子座は、興味あるものである 。なぜならば、急性及び慢性リンパ球白血病に由来するＴ細胞（Ｔ−ＡＬＬ及び Ｔ−ＣＬＬ）が、この遺伝子座のトランスロケーションを包含するからである。

旧ｎｏｔｏ星煮、　（Ｗｉｎｏｔｏ＋　Ａ、、ａｎｄ　Ｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ 、ＥＭＢＯＪ、　（１９８９）　８　：　７２９〜７３３）により記載される。

０，５ｋｂのＪ２１−０゜５Ｂｇｘ及びＪ２１−０゜５Ｐｖフラグメント内のα 鎖エンハンサ−を、最少の２３０ｂｐのＰｖｕｌＩ／ＢｇｌＩ［エンハンサ−フ ラグメントとして配列決定した。このエンハンサ−は、核因子、ＡＰＩ、ＡＰ２ ゜ＡＰ３．ＡＰ４．Ｓｐ　１．ＮＦ−Ａ１゛（ＮＦ−Ａ２）又はＮＦ−ＫＢのた めの結合部位を欠く。このエンハンサ−は、Ｔ細胞特異的であり、下リンパ球細 胞においてのみ発現され、非リンパ球細胞のためのＢ−リンパ球には発現されな い。このエンハンサ−は、第１８図に示されるようにＤＴ−Ａ発現を制御するで あろう。

第１８図に示される毒素挿入体を、その中に示される毒素挿入体を置換する第１ ７図に示される生成プラスミドに挿入する。この構成に使用され得る他のＴ細胞 エンハンサ−は、ＴＣＲβ及びＣＤ３δサブユニツトをコードする遺伝子のため に見出されるエンハンサ−を包含する（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ　ｆＸ　ｅ　 、　＋Ｔ細胞、すなわちＨＩＶ−１感染Ｔ細胞のサブセットに対して独占的に有 効な治療剤が構成され得る。）ＩＩＶ−１はＡＩＤＳの原因物質であり、そして ＣＤ４“細胞を感染せしめる。）ＩＩＶ−１ゲノムによりコードされるｔａｔタ ンパク質により定義されるエンハンサ−１ＴＡＲ，及びｔ　ａ　をタフバク質に 感応性で、そしてＨＪＶ−１５’−ＬＴＲのθ〜＋８０の転写配列にコードされ るｍＲＮＡ配列が、ＨＩＶ−１感染細胞にユニークである。

この治療剤のために使用されるパッケージング細胞は、この例の初めに記載され るＬＰＶ〜７６からのＶＰ−１を使用する。エンハンサ−／プロモーター挿入体 は、第１９図に示される。

−１３０〜＋８０（７）Ｉ（ＩＶ５’−ＬＴＲを、ｐ　ＨＩ　Ｖ−ＣＡＴからＸ ｌ」ｊ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントとして誘導する（Ｐｅｔｅｒｌｉｎ７ｊ ？、、　ＡＩＤＳ　（１９８２）　２ｓｕｐｐ１．　：　５２９〜５４０）。第 １９図における挿入体は、第１７図に示される生成ミニクロモソームにおける毒 素挿入体を置換する。この治療剤は、ＨＩＶ−１により感染されたＴ細胞のみを 殺害するであろう。

氾 ＢＫＶプソイドウィルスの ＢＫウィルス（ＢＫＶ）は、免疫抑制治療を受ける腎同種移植受容体の尿から単 離されるヒトバボーバウィルスである。

ＢＫＶは幼年期においてヒトを感染し、そしていづれか重症の疾病を引き起こさ ない潜伏期を持続する。ＢＫＶは、免疫抑制された患者及び妊婦の尿から通常単 離される。分子的及び生化学的研究は、ＢＫＶがＳＶ４０に類似することを示し た。実際、ＳＶ４０とＬＰＶとの間の関係は類似し；Ｔ抗原ＶＰＩ、ＶＰ２．及 びＶＰ３（７）分子構成は同一であり；ＢＫＶ及びＳＶ４０は７３％のアミノ酸 同一性を共存する。配列における主要な差異は、ＤＮＡ複製の超厚近くに位置す る転写のエンハンサ−／プロモーター、及びゲノムの後期領域（ＶＰＩ）で生じ る。完全なりＫＶゲノムを含むトランスゲニックマウスにおいて、ＢＫＶ抗原は 腎臓及び肝臓に独占的に見出される。

たぶん、腎臓及び肝臓細胞のためのＢＫＶの組織向性は、ＶＰＩ及び転写エンハ ンサ−／プロモーターの結果である。

−次肝細胞癌のための治療剤を開発するためには、ＢＫＶのＶＰ１を含むパッケ ージング細胞が必要とされる。例Ｘ及びＸＩにおけるように、ＢＫＶのＶＰＩを 発現する新規のパッケージング細胞を、ＣＶ−１，ＶＥＲＯ又はＢＪＡ−Ｂ細胞 に構成する。Ａゴーｉ、Ｔ抗原、ＶＰ２．及びＶＰ３を、例Ｘに記載されるよう にＢＫＶ又はＳＶ４０から得ることができる。

肝臓細胞、特に肝臓癌細胞にＤＴ−Ａ毒素の発現をさらに制限するためには、Ｂ 型肝炎ウィルス表面抗原を制御するエンハンサ−／プロモーターが使用される。

Ｂ型肝炎ウィルスをクローン化し、そして配列決定した。Ｂ型肝炎ウィルスの大 きな表面タンパク質遺伝子を、肝癌細胞においてのみ機能するエンハンサ−／プ ロモーターにより制御する（Ｙｅｅ、　Ｓｃｉ肌鵠（１９８９）幻ｌ罎６５８〜 ６６１）。このプロモーター／エンハンサーは、Ｂ型肝炎ウィルス配列の９６６ 〜１４０２フラグメント内に含まれる。（Ｃｈａｎｇ、　Ｒｅ、、Ｍｏ１ｅｃ　 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９８９）９　：　５１８９〜５１９７）　、　Ｂ　Ｋ 　ＶジフテリアＡ毒素及びプロモーター／エンハンサ−挿入体は、第２０図に示 される。このエンハンサ−／プロモーター毒素挿入体は、生成ミニクロモソーム において毒素挿入体と置換する（第７図）。従って、ＤＴ−Ａは、肝癌細胞にお いてのみ発現されるであろう。

本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、あたかも個々の出版物又 は特許出願が引用により特別に及び個々に導入されているかのように、引用によ り本明細書に組込まれる。

前述の発明は、例示的且つ測的にいくらか詳細に記載されて来たが、いくらかの 変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかである。

ＦＩＧ、　１ Ｆｉｇｕｒｅ　４ Ｆｉｇｕｒｅ　５ ＦＩＧ、６Ｃ ＦＩＧ、　１０ ｙｉｇｕｒ・１１ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ ＰＯ１３’Ａ Ｃ８ 国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．標的細胞中にＫｉｌｌ遺伝子を導入することができる少なくとも実質的に複 製−欠陥性のビリオンを調製するための方法であって： パッケージング細胞中に少なくとも第１及び第２構造体を形質転換し、ここで前 記第１構造体は次の構造を有するプロウィルスを含んで成り： ５′ＬＴＲ−−Ｐ．Ｓ．−−（Ｖ．Ｇ．）０−２−−Ｇ．Ｉ．−−（Ｖ．Ｇ．） ｏ−２−−３′ＬＴＲ（ここで前記Ｐ．Ｓ．はウィルスパッケージング配列を意 図し、前記Ｖ．Ｇ．は新規ウィルス粒子の成熟のために必要とされるｔｒａｎｓ 作用ポリペプチドをコードする遺伝子の１つを（ｔｒａｎｓ遺伝子）意図し、そ して前記Ｇ．Ｉ．はＫｉｌｌ遺伝子を意図する）；そして前記第２構造体及び場 合によっては、第３及び第４構造体は次の構造を有し：（５′ＬＴＲ）ａ−−（ Ｐ）ｂ−−（Ｖ．Ｇ．）ｃ−−Ｔ．Ｒ． （ここでＰは５′ＬＴＲ以外のプロモーターを意図し、Ｔ．Ｒ．は転写終結領域 を意図し、ａ，ｂ及びｃは整数であり、ａ及びｂは０〜１であり、ここでａ＋ｂ の合計は少なくとも１であり、そしてｃは１〜３である）；ここで前記構造体は 、複数の前記ｔｒａｎｓ遺伝子を含んで成り；そして前記パッケージング細胞を 増殖する（それによって、前記遺伝子が発現され、そして前記ビリオンが得られ る）ことを含んで成る方法。
2. ２．前記ｔｒａｎｓ遺伝子がレトロウイルスｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を 含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記ｔｒａｎ３遺伝子の１つが、特異的結合対の１つのメンバーをコードす る核酸配列を含んで成る変性されたｅｎｖ遺伝子である請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．前記構造体が、前記個々のｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の少なくとも２ つのコピーを含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．前記ビリオンの細胞表面糖タンパク質に１種のメンバーの結合対（ｓｂｐｍ ）を非分散的に結合することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．少なくとも実質的に複製−欠陥性であり、そして標的細胞中にＫｉｌｌ遺伝 子の少なくとも１つのコピーを導入することができる、感染性として特徴付づけ られる移動性遺伝子要素を生成できる二元ベクターであって：新規ウィルス粒子 の成熟のために必要とされるｔｒａｎｓ作用性ポリペプチドをコードする個々の 遺伝子（ｔｒａｎｓ遺伝子）の少なくとも１つのコピーを含んで成るパッケージ ング細胞；及び ５′ＬＴＲ、ウィルスパッケージング配列、前記Ｋｉｌｌ遺伝子の少なくとも１ つのコピー及び３′ＬＴＲを含んで成る構造体を含んで成る二元ベクター。
7. ７．前記ｔｒａｎｓ遺伝子がレトロウイルスｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子で ある請求の範囲第６項記載の二元ベクター。
8. ８．前記Ｋｉｌｌ遺伝子がＨＳＶ−ｔＫ遺伝子である請求の範囲第６項記載の二 元ベクター。
9. ９．前記構造体が前記Ｋｉｌｌ遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る請 求の範囲第６項記載の二元ベクター。
10. １０．移動性遺伝子要素の宿主範囲を変えるための方法であって： パッケージング細胞中に少なくとも第１及び第２構造体を形質転換し、ここで前 記第１構造体は次の構造を有するプロウイルスを含んで成り： ５′ＬＴＲ−−Ｐ．Ｓ．−−（Ｖ．Ｇ．）０−２−−Ｇ．Ｉ．−−（Ｖ．Ｇ．） ０−２−−３′ＬＴＲ（ここで前記Ｐ．Ｓ．はウィルスパッケージング配列を意 図し、前記Ｖ．Ｇ．は新規ウィルス粒子の成熟のために必要とされるｔｒａｎｓ 作用ポリペプチドをコードする遺伝子の１つを（ｔｒａｎｓ遺伝子）意図し、そ して前記Ｇ．Ｉ．はＫｉＩＩ遺伝子を意図する）；そして前記第２構造体及び場 合によっては、第３及び第４構造体は次の構造を有し：（５′ＬＴＲ）ａ−−（ Ｐ）ｂ−−（Ｖ．Ｇ．）ｃ−−Ｔ．Ｒ． （ここでＰは５′ＬＴＲ以外のプロモーターを意図し、Ｔ．Ｒ．は転写終結領域 を意図し、ａ，ｂ及びｃは整数であり、ａ及びｂは０〜１であり、ここでａ＋ｂ の合計は少なくとも１であり、そしてｃは１〜３である）；ここで前記構造体は 、複数の前記ｔｒａｎｓ遺伝子を含んで成り；前記パッケージング細胞を増殖す る（それによって前記遺伝子が発現され、そして前記移動性遺伝子要素が得られ る）ことを含んで成り、前記移動性遺伝子要素の宿主範囲が、それが１種のメン バーの特異的結合対（ｓｂｐｍ）を含むように前記移動性遺伝子要素の細胞表面 糖タンパク質を変性することによって変更され、ここで前記変性が：ａ．前記増 殖の後、前記移動性遺伝子要素の前記糖タンパク質に前記ｓｂｐｍを非分散的に 結合し；又はｂ．結合のための官能成分を含んで成る変性された糖タンバク質が 生成されるように、前記糖タンパク質をコードするｔｒａｎｓ遺伝子を変更し； そして 前記増殖の後、前記ｓｂｐｍを前記官能成分に非分散的に結合し；又は ｃ．前記ｓｂｐｍを含んで成る変性された糖タンパク質が生成されるように、前 記糖タンパク質をコードするｔｒａｎｓ遺伝子を変更することを含んで成ること を特徴とする方法。
11. １１．前記ｓｂｐｍが、腫瘍特異的抗原又はウィルスタンパク質に対する受容体 リガンド又は抗体又はそのフラグメントである請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記ｓｂｐｍが、前記特異的結合対の第２メンバーに結合することができ るＣＤ４，ＨＢ表面抗原又はそのフラグメントである請求の範囲第４項記載の方 法。
13. １３．移動性遺伝子要素であって、少なくとも実質的に複製−欠陥の哺乳類ウィ ルスに由来し、そして特異的結合対（ｓｂｐｍ）の１つのメンバーを含んで成り 、それによって、それが前記特異的結合対の第２メンバーを含んで成る特定の標 的細胞を感染することができることを特徴とする移動性遺伝子要素。
14. １４．前記哺乳類ウィルスが、レトロウイルスである請求の範囲第１３項記載の 移動性遺伝子要素。
15. １５．前記標的細胞が特異的結合対の少なくとも２種の異なった第２メンバーを 含んで成る請求の範囲第１３項記載の移動性遺伝子要素。
16. １６．前記第２ｓｂｐｍが結腸癌又は胃癌に対して少なくとも実質的に特異的な 抗原である請求の範囲第１３項記載の移動性遺伝子要素。
17. １７．前記第２ｓｂｐｍがｇｐ１２０又はＨＢ表面抗原である請求の範囲第１３ 項記載の移動性遺伝子要素。
18. １８．前記第２ｓｂｐｍがペプチドホルモン受容体である請求の範囲第１３項記 載の移動性遺伝子要素。