JPH1160600A - 尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 - Google Patents
尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法Info
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- JPH1160600A JPH1160600A JP24200297A JP24200297A JPH1160600A JP H1160600 A JPH1160600 A JP H1160600A JP 24200297 A JP24200297 A JP 24200297A JP 24200297 A JP24200297 A JP 24200297A JP H1160600 A JPH1160600 A JP H1160600A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】低温保存のみならず、凍結融解をした場合であ
っても、尿中ミオグロビンの免疫学的測定値の低下を防
止することのできる尿中ミオグロビンの安定化方法を提
供すること。 【解決手段】尿試料中に炭酸水素塩化合物および必要に
応じてアジ化物を含有させることを特徴とする尿中ミオ
グロビンの安定化方法。
っても、尿中ミオグロビンの免疫学的測定値の低下を防
止することのできる尿中ミオグロビンの安定化方法を提
供すること。 【解決手段】尿試料中に炭酸水素塩化合物および必要に
応じてアジ化物を含有させることを特徴とする尿中ミオ
グロビンの安定化方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、尿中ミオグロビンの安
定化方法に関するもので、特に低温保存のみならず、凍
結融解をした場合であっても、尿中ミオグロビンの免疫
学的測定値の低下を防止することのできる尿中ミオグロ
ビンの安定化方法に関するものである。
定化方法に関するもので、特に低温保存のみならず、凍
結融解をした場合であっても、尿中ミオグロビンの免疫
学的測定値の低下を防止することのできる尿中ミオグロ
ビンの安定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ミオグロビンは、動物の骨格筋組織中に
存在するヘムタンパク質で酸素を貯蔵する役割を担って
いる。ヒトミオグロビンは、分子量約１７５００を持
ち、１５３アミノ酸残基で構成される１本のペプチド鎖
に１つのヘム分子を付加した構造を有する。心筋梗塞の
ような筋肉組織の損傷が生じると、数時間の内に血中や
尿中のミオグロビン濃度が顕著に上昇する。近年では、
筋肉組織の損傷に伴うミオグロビン濃度の上昇が腎障害
をもたらすことも指摘されている（Clin.Nephrol.,38,1
93-5；1992）。
存在するヘムタンパク質で酸素を貯蔵する役割を担って
いる。ヒトミオグロビンは、分子量約１７５００を持
ち、１５３アミノ酸残基で構成される１本のペプチド鎖
に１つのヘム分子を付加した構造を有する。心筋梗塞の
ような筋肉組織の損傷が生じると、数時間の内に血中や
尿中のミオグロビン濃度が顕著に上昇する。近年では、
筋肉組織の損傷に伴うミオグロビン濃度の上昇が腎障害
をもたらすことも指摘されている（Clin.Nephrol.,38,1
93-5；1992）。
【０００３】従って尿中のミオグロビン濃度を高い精度
で測定することは、心臓疾患や腎疾患を診断する上で極
めて重要な意義がある。
で測定することは、心臓疾患や腎疾患を診断する上で極
めて重要な意義がある。
【０００４】従来、尿中のミオグロビンは、尿試験紙に
より測定されていたが、この方法では、ミオグロビンの
ペルオキシダーゼ様活性を指標とした反応に基づいてい
るので、同じような触媒活性を持つヘモグロビンの干渉
を避けることができない。そのため、この方法を実施す
るに際しては、予めヘモグロビンを分離する操作が必要
とされていた。
より測定されていたが、この方法では、ミオグロビンの
ペルオキシダーゼ様活性を指標とした反応に基づいてい
るので、同じような触媒活性を持つヘモグロビンの干渉
を避けることができない。そのため、この方法を実施す
るに際しては、予めヘモグロビンを分離する操作が必要
とされていた。
【０００５】一方、血清試料については、ミオグロビン
の免疫学的測定方法が知られている（Clin.Chem.,36,16
75-8;1990）（Ann.Clin.Biochem.,28,474-9;1991）（Cl
in.Chim.Acta.,209,197-207;1992）。ヒトミオグロビン
に特異的な抗体を利用すれば、ヘモグロビンの干渉を受
けないので、繁雑な分離操作を行わずともミオグロビン
を特異的に測定することが可能である。
の免疫学的測定方法が知られている（Clin.Chem.,36,16
75-8;1990）（Ann.Clin.Biochem.,28,474-9;1991）（Cl
in.Chim.Acta.,209,197-207;1992）。ヒトミオグロビン
に特異的な抗体を利用すれば、ヘモグロビンの干渉を受
けないので、繁雑な分離操作を行わずともミオグロビン
を特異的に測定することが可能である。
【０００６】しかしながら、この血清試料の測定方法を
尿試料に応用する場合には、尿試料中のミオグロビンの
安定性が問題となる。一般に、血清中のミオグロビン
は、血清の凍結、または冷蔵保存により測定値の変動を
無視できる程度に抑えることが可能である。ところが尿
中のミオグロビンでは、たとえ尿を採取直後に凍結した
としてもミオグロビンの測定値が大きく低下する検体が
存在する。特に尿のｐＨが低い場合には、ミオグロビン
の測定値の低下が著しいことが知られている。
尿試料に応用する場合には、尿試料中のミオグロビンの
安定性が問題となる。一般に、血清中のミオグロビン
は、血清の凍結、または冷蔵保存により測定値の変動を
無視できる程度に抑えることが可能である。ところが尿
中のミオグロビンでは、たとえ尿を採取直後に凍結した
としてもミオグロビンの測定値が大きく低下する検体が
存在する。特に尿のｐＨが低い場合には、ミオグロビン
の測定値の低下が著しいことが知られている。
【０００７】尿中ミオグロビンの保存安定性がｐＨを
８．０〜９．５に調整することによって改善できること
を見出し、免疫学的な測定に応用した報告が有る（Cli
n.Chem.,40,796-802;1994）。この報告では、尿試料の
ｐＨをＮａＯＨでアルカリ性に調整し、冷蔵保存でも１
２日間に亘って安定した測定値が得られることを確認し
ている。
８．０〜９．５に調整することによって改善できること
を見出し、免疫学的な測定に応用した報告が有る（Cli
n.Chem.,40,796-802;1994）。この報告では、尿試料の
ｐＨをＮａＯＨでアルカリ性に調整し、冷蔵保存でも１
２日間に亘って安定した測定値が得られることを確認し
ている。
【０００８】しかしながら、本発明者のその後の研究に
よれば、尿試料をアルカリ性とする方法は、必ずしも全
ての尿試料において有効なわけではないことが明らかと
なった。すなわち試料によってはある程度ミオグロビン
の測定値を安定に維持できるが、まったく安定化効果を
期待できない試料も多く観察された。また、ＮａＯＨの
ようなアルカリ成分でｐＨを調整すると、沈殿を生じて
しまう検体がしばしば観察された。尿中の沈殿は均一な
試料の採取を妨害するので望ましい現象ではない。
よれば、尿試料をアルカリ性とする方法は、必ずしも全
ての尿試料において有効なわけではないことが明らかと
なった。すなわち試料によってはある程度ミオグロビン
の測定値を安定に維持できるが、まったく安定化効果を
期待できない試料も多く観察された。また、ＮａＯＨの
ようなアルカリ成分でｐＨを調整すると、沈殿を生じて
しまう検体がしばしば観察された。尿中の沈殿は均一な
試料の採取を妨害するので望ましい現象ではない。
【０００９】さらに、尿試料を凍結した場合には、凍結
融解操作のたびにミオグロビンの測定値が低下する現象
も確認された。凍結融解に伴う測定値の低下現象は、上
述のアルカリ処理では解消することができなかった。
融解操作のたびにミオグロビンの測定値が低下する現象
も確認された。凍結融解に伴う測定値の低下現象は、上
述のアルカリ処理では解消することができなかった。
【００１０】他方、尿試料を予めアルカリ処理してから
免疫学的な測定のための試料とする技術が提案され（特
開平８−１６６３８２号公報）、メタンフェタミンのよ
うな特定の分析対象成分を測定するに際し、反応を阻害
する成分の影響を抑制するためにアルカリ成分を利用し
ている。
免疫学的な測定のための試料とする技術が提案され（特
開平８−１６６３８２号公報）、メタンフェタミンのよ
うな特定の分析対象成分を測定するに際し、反応を阻害
する成分の影響を抑制するためにアルカリ成分を利用し
ている。
【００１１】さらに、５０mM前後の炭酸水素塩を尿に加
えて寒冷下で白濁する現象を防ぐ技術が提案され（特開
昭５３−１４１６９５号公報）、ＥＤＴＡとの併用によ
って白濁現象の防止効果を更に向上させている。
えて寒冷下で白濁する現象を防ぐ技術が提案され（特開
昭５３−１４１６９５号公報）、ＥＤＴＡとの併用によ
って白濁現象の防止効果を更に向上させている。
【００１２】しかしながら、上記公報では、いずれも尿
試料中におけるある種の分析対象成分を測定するに際し
て、反応を阻害する現象を防止する技術を開示している
に過ぎず、尿中ミオグロビンの保存安定性については全
く示唆されていない。
試料中におけるある種の分析対象成分を測定するに際し
て、反応を阻害する現象を防止する技術を開示している
に過ぎず、尿中ミオグロビンの保存安定性については全
く示唆されていない。
【００１３】この尿中ミオグロビンの保存安定性を改善
することを目的として、所定量のアジ化ナトリウムおよ
びEDTA・３Na を組み合わせた安定化剤が報告されてい
る（医学と薬学,37,1255-9;1997）。
することを目的として、所定量のアジ化ナトリウムおよ
びEDTA・３Na を組み合わせた安定化剤が報告されてい
る（医学と薬学,37,1255-9;1997）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この安
定化剤では、４℃で保存した場合に３週間に亘って尿中
のミオグロビンを安定化することができるが、その後の
本発明者の研究によれば、凍結融解に伴う測定値の低下
が著しいことが確認された。
定化剤では、４℃で保存した場合に３週間に亘って尿中
のミオグロビンを安定化することができるが、その後の
本発明者の研究によれば、凍結融解に伴う測定値の低下
が著しいことが確認された。
【００１５】従って本発明は、このような従来の課題に
着目してなされたものであって、低温で保存した場合の
みならず、凍結融解した場合であっても、長期間に亘っ
てより効果的に尿中ミオグロビンを安定化させる方法、
安定化剤およびこれを応用した尿中ミオグロビンの免疫
学的測定方法を提供することを目的とする。
着目してなされたものであって、低温で保存した場合の
みならず、凍結融解した場合であっても、長期間に亘っ
てより効果的に尿中ミオグロビンを安定化させる方法、
安定化剤およびこれを応用した尿中ミオグロビンの免疫
学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究した結果、尿試料中に炭酸水素塩化
合物および必要に応じてアジ化物を含有させることによ
り、低温で保存した場合のみならず、凍結融解した場合
であっても、尿中のミオグロビンを長期間に亘って安定
化できることを見出し、本発明に到達した。
解決すべく鋭意研究した結果、尿試料中に炭酸水素塩化
合物および必要に応じてアジ化物を含有させることによ
り、低温で保存した場合のみならず、凍結融解した場合
であっても、尿中のミオグロビンを長期間に亘って安定
化できることを見出し、本発明に到達した。
【００１７】本発明の上記の課題は、尿試料中に炭酸水
素塩化合物および必要に応じてアジ化物を含有させたこ
とを特徴とする尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化
剤およびこれを応用した免疫学的測定方法により達成さ
れた。
素塩化合物および必要に応じてアジ化物を含有させたこ
とを特徴とする尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化
剤およびこれを応用した免疫学的測定方法により達成さ
れた。
【００１８】以下、本発明について更に詳細に説明す
る。
る。
【００１９】本発明に使用する炭酸水素塩化合物は、公
知の炭酸水素塩化合物の中から適宜選択して使用するこ
とができる。その具体例としては、例えば炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウム
から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられ
る。本発明の尿中ミオグロビンの安定化方法は、尿試料
に炭酸水素ナトリウムを含有させるとアルカリ性とな
り、炭酸水素アンモニウムを含有させると中性となるた
め、アルカリ性である必要は全くない。
知の炭酸水素塩化合物の中から適宜選択して使用するこ
とができる。その具体例としては、例えば炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウム
から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられ
る。本発明の尿中ミオグロビンの安定化方法は、尿試料
に炭酸水素ナトリウムを含有させるとアルカリ性とな
り、炭酸水素アンモニウムを含有させると中性となるた
め、アルカリ性である必要は全くない。
【００２０】本発明においては、尿試料中に炭酸水素塩
化合物を６．２５〜２００mM、好ましくは１２．５〜１
００mM、より好ましくは１００mMとなるように含有させ
る。炭酸水素塩化合物の含有量が６．２５mM未満になる
と、尿検体によっては安定化効果が不十分な場合が生
じ、逆に２００mMを超えると、沈殿の原因となりやす
く、却って測定値が低下する。
化合物を６．２５〜２００mM、好ましくは１２．５〜１
００mM、より好ましくは１００mMとなるように含有させ
る。炭酸水素塩化合物の含有量が６．２５mM未満になる
と、尿検体によっては安定化効果が不十分な場合が生
じ、逆に２００mMを超えると、沈殿の原因となりやす
く、却って測定値が低下する。
【００２１】また、本発明においては、炭酸水素塩化合
物に加えてアジ化物を添加することにより、尿中ミオグ
ロビンの安定化効果をより一層向上させることができ
る。その具体例としては、例えば、アジ化ナトリウム、
アジ化カリウムおよびアジ化アンモニウムから成る群か
ら選択される少なくとも１種が挙げられる。
物に加えてアジ化物を添加することにより、尿中ミオグ
ロビンの安定化効果をより一層向上させることができ
る。その具体例としては、例えば、アジ化ナトリウム、
アジ化カリウムおよびアジ化アンモニウムから成る群か
ら選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２２】このアジ化物は、尿試料中に３．９〜５０
０mM、好ましくは７．８〜２５０mM、より好ましくは６
２．５mMとなるように含有させる。アジ化物の含有量が
３．９mM未満となると、安定化効果が不十分となり、逆
に５００mMを超えても、これ以上安定化効果を向上させ
ることができない。
０mM、好ましくは７．８〜２５０mM、より好ましくは６
２．５mMとなるように含有させる。アジ化物の含有量が
３．９mM未満となると、安定化効果が不十分となり、逆
に５００mMを超えても、これ以上安定化効果を向上させ
ることができない。
【００２３】上述したように、尿試料中に炭酸水素塩化
合物を添加することによって沈殿を生ずることがある。
また、この沈殿は、尿中に含まれている塩類の種類や濃
度、またはｐＨ等の要因によっても生成する。この沈殿
は、尿試料中にキレート剤を含有させることによって防
止することができ、これに伴って尿中ミオグロビンの安
定化効果をより一層向上させることができる。但し、こ
の沈殿は、炭酸水素塩化合物の添加および尿中の塩類や
ｐＨに起因して常に生成するのではないため、キレート
剤は必要に応じて適宜添加すれば良い。
合物を添加することによって沈殿を生ずることがある。
また、この沈殿は、尿中に含まれている塩類の種類や濃
度、またはｐＨ等の要因によっても生成する。この沈殿
は、尿試料中にキレート剤を含有させることによって防
止することができ、これに伴って尿中ミオグロビンの安
定化効果をより一層向上させることができる。但し、こ
の沈殿は、炭酸水素塩化合物の添加および尿中の塩類や
ｐＨに起因して常に生成するのではないため、キレート
剤は必要に応じて適宜添加すれば良い。
【００２４】キレート剤は、尿試料中に１．２５〜１６
０mM、好ましくは５〜８０mM、より好ましくは４０mMと
なるように含有させる。キレート剤の含有量が１．２５
mM未満になると、尿中におこる沈殿を効果的に防止でき
ないため、安定化効果が不十分となり、逆に１６０mMを
超えると、免疫反応が阻害され、却って測定値が低下す
る。
０mM、好ましくは５〜８０mM、より好ましくは４０mMと
なるように含有させる。キレート剤の含有量が１．２５
mM未満になると、尿中におこる沈殿を効果的に防止でき
ないため、安定化効果が不十分となり、逆に１６０mMを
超えると、免疫反応が阻害され、却って測定値が低下す
る。
【００２５】本発明に使用する沈殿防止作用を有するキ
レート剤は、公知のキレート剤の中から適宜選択して使
用することができる。このようなキレート剤としては、
例えばエチレンジアミン４酢酸（EDTA)、２−シクロヘ
キサンジアミン４酢酸、メチレンジアミン４酢酸、イミ
ノ２酢酸などが挙げられるが、特にEDTAまたはその塩が
好ましい。
レート剤は、公知のキレート剤の中から適宜選択して使
用することができる。このようなキレート剤としては、
例えばエチレンジアミン４酢酸（EDTA)、２−シクロヘ
キサンジアミン４酢酸、メチレンジアミン４酢酸、イミ
ノ２酢酸などが挙げられるが、特にEDTAまたはその塩が
好ましい。
【００２６】本発明においては、上記炭酸水素化合物
に、必要に応じてアジ化物およびキレート剤を含有させ
ることで、低温保存のみならず、凍結融解した場合であ
っても、十分な安定化効果が得られるが、検体によって
は、凍結融解に伴う測定値が低下する場合がある。この
場合、炭酸水素化合物、アジ化物およびキレート剤に加
えて、界面活性剤を添加することで、凍結融解した場合
であっても、高い安定化効果を維持することができる。
に、必要に応じてアジ化物およびキレート剤を含有させ
ることで、低温保存のみならず、凍結融解した場合であ
っても、十分な安定化効果が得られるが、検体によって
は、凍結融解に伴う測定値が低下する場合がある。この
場合、炭酸水素化合物、アジ化物およびキレート剤に加
えて、界面活性剤を添加することで、凍結融解した場合
であっても、高い安定化効果を維持することができる。
【００２７】本発明に使用する界面活性剤は、公知のも
のの中から適宜選択して使用することができる。この界
面活性剤の中でも、特に非イオン性界面活性剤が好まし
く、より好ましくはソルビタン脂肪酸エステルおよび／
またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルで
あり、更に好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステルである。
のの中から適宜選択して使用することができる。この界
面活性剤の中でも、特に非イオン性界面活性剤が好まし
く、より好ましくはソルビタン脂肪酸エステルおよび／
またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルで
あり、更に好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステルである。
【００２８】ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テルの具体例としては、以下に列挙した化合物またはそ
の誘導体から成る群から選択される少なくとも１種が挙
げられる。 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 20〕 ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 40） ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 60） ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 65） ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 80） ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 85）
テルの具体例としては、以下に列挙した化合物またはそ
の誘導体から成る群から選択される少なくとも１種が挙
げられる。 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 20〕 ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 40） ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 60） ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート〔花王
アトラス（株）製 商品名：Tween 65） ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 80） ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート〔花王ア
トラス（株）製 商品名：Tween 85）
【００２９】この界面活性剤は、０．０１〜０．２w／v
％、好ましくは０．０２５〜０．１w／v％となるように
含有させる。界面活性剤の含有量が０．０１w／v％未満
となると、凍結融解に伴う安定化効果が不十分な場合が
生じ、逆に０．２w／v％を超えると、免疫反応が阻害さ
れ、却って測定値が低下する。
％、好ましくは０．０２５〜０．１w／v％となるように
含有させる。界面活性剤の含有量が０．０１w／v％未満
となると、凍結融解に伴う安定化効果が不十分な場合が
生じ、逆に０．２w／v％を超えると、免疫反応が阻害さ
れ、却って測定値が低下する。
【００３０】本発明においては、特に必要とされない
が、公知のたんぱく質保護剤を必要に応じて加えること
によってミオグロビンの安定化効果をより高めることが
できる。このようなたんぱく保護剤としては、アルブミ
ンやゼラチンに代表される不活性たんぱく質等を挙げる
ことができる。
が、公知のたんぱく質保護剤を必要に応じて加えること
によってミオグロビンの安定化効果をより高めることが
できる。このようなたんぱく保護剤としては、アルブミ
ンやゼラチンに代表される不活性たんぱく質等を挙げる
ことができる。
【００３１】アルブミンは、任意のものを使用すること
ができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミン
が好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、ま
たは胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。こ
のアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物
も知られているが、本発明におけるアルブミンには、こ
のようなアルブミンから誘導される蛋白質をも含めるこ
とができる。
ができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミン
が好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、ま
たは胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。こ
のアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物
も知られているが、本発明におけるアルブミンには、こ
のようなアルブミンから誘導される蛋白質をも含めるこ
とができる。
【００３２】本発明においては、尿中ミオグロビンの安
定化因子として作用する炭酸水素塩化合物を含有させた
尿中ミオグロビンの安定化剤を提供することができる。
この場合、添加する炭酸水素塩化合物は、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび
炭酸水素アンモニウムから成る群から選ばれる少なくと
も１種から適宜選択して使用することができる。
定化因子として作用する炭酸水素塩化合物を含有させた
尿中ミオグロビンの安定化剤を提供することができる。
この場合、添加する炭酸水素塩化合物は、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび
炭酸水素アンモニウムから成る群から選ばれる少なくと
も１種から適宜選択して使用することができる。
【００３３】更に、本発明の安定化剤には、必要に応じ
てアジ化物、キレート剤および界面活性剤を含有させる
ことができる。アジ化物、キレート剤および界面活性剤
としては、上記したものの中から適宜選択して使用する
ことができる。
てアジ化物、キレート剤および界面活性剤を含有させる
ことができる。アジ化物、キレート剤および界面活性剤
としては、上記したものの中から適宜選択して使用する
ことができる。
【００３４】本発明によってミオグロビンを安定化した
尿試料は、そのまま公知の免疫学的測定方法に基づくミ
オグロビン濃度測定用試料となる。測定方法の具体例と
しては、サンドイッチ法、競合法の原理に基づくＲＩＡ
法やＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集反応法などの免疫学
的粒子凝集反応法および免疫比濁法から成る群から選択
されるものが挙げられる。
尿試料は、そのまま公知の免疫学的測定方法に基づくミ
オグロビン濃度測定用試料となる。測定方法の具体例と
しては、サンドイッチ法、競合法の原理に基づくＲＩＡ
法やＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集反応法などの免疫学
的粒子凝集反応法および免疫比濁法から成る群から選択
されるものが挙げられる。
【００３５】尿試料は、用いる試薬の測定可能範囲に応
じて適宜希釈して測定用のサンプルとする。希釈には、
免疫学的な反応に好適なｐＨや塩濃度を与える希釈溶液
を用いても良い。
じて適宜希釈して測定用のサンプルとする。希釈には、
免疫学的な反応に好適なｐＨや塩濃度を与える希釈溶液
を用いても良い。
【００３６】
【発明の効果】本発明は、低温保存のみならず、凍結融
解をした場合であっても、尿中ミオグロビンの免疫学的
測定値を長期間に亘って安定に維持することができる。
従って本発明に係る免疫学的測定方法によれば、心臓疾
患や腎疾患を高い精度で診断することができる。
解をした場合であっても、尿中ミオグロビンの免疫学的
測定値を長期間に亘って安定に維持することができる。
従って本発明に係る免疫学的測定方法によれば、心臓疾
患や腎疾患を高い精度で診断することができる。
【００３７】
【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。
【００３８】実施例１ 尿試料に、０、６．２５、１２．５、２５、５０、１０
０、２００、４００mMの炭酸水素ナトリウムを加えて４
℃に、それぞれ０、１、４、７日間保存してミオグロビ
ンの免疫学的な測定値に与える影響を調べた。
０、２００、４００mMの炭酸水素ナトリウムを加えて４
℃に、それぞれ０、１、４、７日間保存してミオグロビ
ンの免疫学的な測定値に与える影響を調べた。
【００３９】免疫学的な測定には、市販のミオグロビン
のＩＲＭＡ用測定キット「Ａｂビーズミオグロビン‘栄
研’」（栄研化学（株）製、商品名）を用いた。このキ
ットは125Ｉ標識抗ミオグロビン抗体を利用した固相サ
ンドイッチ法に基づくＩＲＭＡを行うためのものであ
る。測定操作は次のとおりである。
のＩＲＭＡ用測定キット「Ａｂビーズミオグロビン‘栄
研’」（栄研化学（株）製、商品名）を用いた。このキ
ットは125Ｉ標識抗ミオグロビン抗体を利用した固相サ
ンドイッチ法に基づくＩＲＭＡを行うためのものであ
る。測定操作は次のとおりである。
【００４０】５０μLの尿試料と２００μLのリン酸緩衝
液（１００mM、ｐＨ７．４）とを分注した試験管に抗ミ
オグロビン抗体固相化ビーズを投入し、室温で２時間振
とう（３０rpm）した。反応液を吸引し、１mLの精製水
で３回洗浄後に２００μLの12 5Ｉ標識抗ミオグロビン抗
体を加え、再び室温で２時間振とうした。反応液を吸引
し、１mLの精製水で３回洗浄後、ビーズに結合した125
Ｉ標識抗体の放射活性をカウントした。尿試料に代えて
標準試料を用いた測定値に基づいてミオグロビン濃度を
決定した。その結果を表１に示す。
液（１００mM、ｐＨ７．４）とを分注した試験管に抗ミ
オグロビン抗体固相化ビーズを投入し、室温で２時間振
とう（３０rpm）した。反応液を吸引し、１mLの精製水
で３回洗浄後に２００μLの12 5Ｉ標識抗ミオグロビン抗
体を加え、再び室温で２時間振とうした。反応液を吸引
し、１mLの精製水で３回洗浄後、ビーズに結合した125
Ｉ標識抗体の放射活性をカウントした。尿試料に代えて
標準試料を用いた測定値に基づいてミオグロビン濃度を
決定した。その結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】表１に示すように、６．２５、１２．５、
２５、５０、１００、２００mMの炭酸水素ナトリウムを
添加することにより、炭酸水素ナトリウム無添加の場合
と比較して４℃保存における尿中ミオグロビンの安定化
効果が確認された。また、表１から、４００mMの炭酸水
素ナトリウムを添加した場合が最も安定率が高いことが
判るが、測定値の低下が著しいため、１００mMの炭酸水
素ナトリウムを至適濃度とした。
２５、５０、１００、２００mMの炭酸水素ナトリウムを
添加することにより、炭酸水素ナトリウム無添加の場合
と比較して４℃保存における尿中ミオグロビンの安定化
効果が確認された。また、表１から、４００mMの炭酸水
素ナトリウムを添加した場合が最も安定率が高いことが
判るが、測定値の低下が著しいため、１００mMの炭酸水
素ナトリウムを至適濃度とした。
【００４３】実施例２ ４℃で 保存したことに代えて、０、１、２、３回の凍
結融解をした以外は、実施例１と全く同様な方法により
尿中ミオグロビンの安定化効果を調べた。その結果を表
２に示す。
結融解をした以外は、実施例１と全く同様な方法により
尿中ミオグロビンの安定化効果を調べた。その結果を表
２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】表２に示すように、凍結融解した場合も４
℃保存における場合と同様に尿中ミオグロビンの安定化
効果が確認された。この場合も、実施例１と同様に、４
００mMの炭酸水素ナトリウムを添加した場合が最も安定
率が高いことが判るが、測定値の低下が著しいため、１
００mMの炭酸水素ナトリウムを至適濃度とした。
℃保存における場合と同様に尿中ミオグロビンの安定化
効果が確認された。この場合も、実施例１と同様に、４
００mMの炭酸水素ナトリウムを添加した場合が最も安定
率が高いことが判るが、測定値の低下が著しいため、１
００mMの炭酸水素ナトリウムを至適濃度とした。
【００４６】実施例３ １００mMの炭酸水素ナトリウムを添加し、更に０、３．
９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５、
２５０、５００mMのアジ化ナトリウムを加えて４℃に、
それぞれ０、３、７日間保存した以外は、実施例１と全
く同様な方法により尿中ミオグロビンの安定化効果を調
べた。その結果を表３に示す。
９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５、
２５０、５００mMのアジ化ナトリウムを加えて４℃に、
それぞれ０、３、７日間保存した以外は、実施例１と全
く同様な方法により尿中ミオグロビンの安定化効果を調
べた。その結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】表３に示すように、アジ化ナトリウムを加
えることでアジ化ナトリウム無添加の場合と比較して更
に尿中ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認
された。また、１５．６〜２５０mMの範囲でアジ化ナト
リウムを添加することで高い安定化効果が認められた
め、その中間値である６２．５mMを至適濃度とした。
えることでアジ化ナトリウム無添加の場合と比較して更
に尿中ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認
された。また、１５．６〜２５０mMの範囲でアジ化ナト
リウムを添加することで高い安定化効果が認められた
め、その中間値である６２．５mMを至適濃度とした。
【００４９】実施例４ １００mMの炭酸水素ナトリウムを添加し、更に０、３．
９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５、
２５０、５００mMのアジ化ナトリウムを加えた以外は、
実施例２と全く同様な方法により尿中ミオグロビンの安
定化効果を調べた。その結果を表４に示す。
９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５、
２５０、５００mMのアジ化ナトリウムを加えた以外は、
実施例２と全く同様な方法により尿中ミオグロビンの安
定化効果を調べた。その結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】表４に示すように、アジ化ナトリウムを加
えることでアジ化ナトリウム無添加の場合と比較して更
に尿中ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認
された。また、１５．６〜１２５mMの範囲でアジ化ナト
リウムを添加することで高い安定化効果が認められた
め、その中間値である６２．５mMを至適濃度とした。
えることでアジ化ナトリウム無添加の場合と比較して更
に尿中ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認
された。また、１５．６〜１２５mMの範囲でアジ化ナト
リウムを添加することで高い安定化効果が認められた
め、その中間値である６２．５mMを至適濃度とした。
【００５２】実施例５ １００mMの炭酸水素ナトリウムおよび６２．５mMのアジ
化ナトリウムを添加し、更に０、１．２５、２．５、
５、１０、２０、４０、８０、１６０mMのEDTA・２Naを
加えて４℃に、それぞれ０、３、７日間保存した以外
は、実施例１と全く同様な方法により尿中ミオグロビン
の安定化効果を調べた。その結果を表５に示す。
化ナトリウムを添加し、更に０、１．２５、２．５、
５、１０、２０、４０、８０、１６０mMのEDTA・２Naを
加えて４℃に、それぞれ０、３、７日間保存した以外
は、実施例１と全く同様な方法により尿中ミオグロビン
の安定化効果を調べた。その結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】表５に示すように、EDTA・２Naを加えるこ
とでEDTA・２Na無添加の場合と比較して更に尿中ミオグ
ロビンの安定化効果が向上したことが確認された。ま
た、１０〜８０mMのEDTA・２Naを添加することで高い安
定化効果が認められため、その中間値である４０mMを至
適濃度とした。
とでEDTA・２Na無添加の場合と比較して更に尿中ミオグ
ロビンの安定化効果が向上したことが確認された。ま
た、１０〜８０mMのEDTA・２Naを添加することで高い安
定化効果が認められため、その中間値である４０mMを至
適濃度とした。
【００５５】実施例６ １００mMの炭酸水素ナトリウムおよび６２．５mMのアジ
化ナトリウムを添加し、更に０、１．２５、２．５、
５、１０、２０、４０、８０、１６０mMのEDTA・２Naを
加えた以外は、実施例２と全く同様な方法により尿中ミ
オグロビンの安定化効果を調べた。その結果を表６に示
す。
化ナトリウムを添加し、更に０、１．２５、２．５、
５、１０、２０、４０、８０、１６０mMのEDTA・２Naを
加えた以外は、実施例２と全く同様な方法により尿中ミ
オグロビンの安定化効果を調べた。その結果を表６に示
す。
【００５６】
【表６】
【００５７】表６に示すように、EDTA・２Naを加えるこ
とでEDTA・２Na無添加の場合と比較して更に尿中ミオグ
ロビンの安定化効果が向上したことが確認された。ま
た、１０〜８０mMのEDTA・２Naを添加することで高い安
定化効果が認められため、その中間値である４０mMを至
適濃度とした。
とでEDTA・２Na無添加の場合と比較して更に尿中ミオグ
ロビンの安定化効果が向上したことが確認された。ま
た、１０〜８０mMのEDTA・２Naを添加することで高い安
定化効果が認められため、その中間値である４０mMを至
適濃度とした。
【００５８】実施例７ １００mMの炭酸水素ナトリウム、６２．５mMのアジ化ナ
トリウムおよび４０mMのEDTA・２Naを添加し、更に０、
０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、
０．４、０．８、１．６w／v％のTween２０を加えて４
℃で 、それぞれ０、３、７日間保存した以外は、実施
例１と全く同様な方法により尿中ミオグロビンの安定化
効果を調べた。その結果を表７に示す。
トリウムおよび４０mMのEDTA・２Naを添加し、更に０、
０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、
０．４、０．８、１．６w／v％のTween２０を加えて４
℃で 、それぞれ０、３、７日間保存した以外は、実施
例１と全く同様な方法により尿中ミオグロビンの安定化
効果を調べた。その結果を表７に示す。
【００５９】
【表７】
【００６０】表７に示すように、Tween２０を加えても
尿中ミオグロビンの安定化効果が低下することなく安定
に維持されることが確認された。
尿中ミオグロビンの安定化効果が低下することなく安定
に維持されることが確認された。
【００６１】実施例８ １００mMの炭酸水素ナトリウム、６２．５mMのアジ化ナ
トリウムおよび４０mMのEDTA・２Naを添加し、更に０、
０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、
０．４、０．８、１．６w／v％のTween２０を加えた以
外は、実施例２と全く同様な方法により尿中ミオグロビ
ンの安定化効果を調べた。その結果を表８に示す。
トリウムおよび４０mMのEDTA・２Naを添加し、更に０、
０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、
０．４、０．８、１．６w／v％のTween２０を加えた以
外は、実施例２と全く同様な方法により尿中ミオグロビ
ンの安定化効果を調べた。その結果を表８に示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】表８に示すように、Tween２０を加えるこ
とにより、Tween２０無添加の場合と比較して更に尿中
ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認され
た。また、０．０１〜０．２w／v％のTween２０を添加
することで高い安定化効果が認められため、その中間値
である０．１w／v％を至適濃度とした。
とにより、Tween２０無添加の場合と比較して更に尿中
ミオグロビンの安定化効果が向上したことが確認され
た。また、０．０１〜０．２w／v％のTween２０を添加
することで高い安定化効果が認められため、その中間値
である０．１w／v％を至適濃度とした。
【００６４】比較例 １．５重量％のアジ化ナトリウムを添加し、更に０、
１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６
０mMのEDTA・３Naを加えた以外は、実施例２と全く同様
な方法により尿中ミオグロビンの安定化効果を調べた。
その結果を表９に示す。
１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６
０mMのEDTA・３Naを加えた以外は、実施例２と全く同様
な方法により尿中ミオグロビンの安定化効果を調べた。
その結果を表９に示す。
【００６５】
【表９】
【００６６】表９に示すように、アジ化ナトリウムおよ
びEDTA・３Naを組み合わせた安定化剤では、炭酸水素ナ
トリウム、アジ化ナトリウムおよびEDTA・２Naを加えた
本発明の実施例６で示した安定化剤と比較して凍結融解
に伴う尿中のミオグロビンの安定化効果が著しく低下す
ることが確認された。
びEDTA・３Naを組み合わせた安定化剤では、炭酸水素ナ
トリウム、アジ化ナトリウムおよびEDTA・２Naを加えた
本発明の実施例６で示した安定化剤と比較して凍結融解
に伴う尿中のミオグロビンの安定化効果が著しく低下す
ることが確認された。
Claims (28)
- 【請求項１】尿試料中に炭酸水素塩化合物を含有させる
ことを特徴とする尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項２】炭酸水素塩化合物の含有量が６．２５〜２
００mMの範囲である請求項１記載の尿中ミオグロビンの
安定化方法。 - 【請求項３】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウム、
炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムから成る
群から選択される少なくとも１種である請求項１または
２記載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項４】アジ化物を含有させる請求項１乃至３記載
の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項５】アジ化物の含有量が３．９〜５００mMの範
囲である請求項４記載の尿中ミオグロビンの安定化方
法。 - 【請求項６】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリ
ウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択され
る少なくとも１種である請求項４または５記載の尿中ミ
オグロビンの安定化方法。 - 【請求項７】キレート剤を含有させる請求項１乃至６記
載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項８】キレート剤の含有量が５〜１６０mMの範囲
である請求項７記載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項９】キレート剤がEDTAまたはその塩である請求
項７または８記載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項１０】界面活性剤を含有させる請求項１乃至９
記載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項１１】界面活性剤の含有量が０．０１〜０．２
w/v%の範囲である請求項１０記載の尿中ミオグロビンの
安定化方法。 - 【請求項１２】界面活性剤が非イオン性界面活性剤であ
る請求項１０または１１記載の尿中ミオグロビンの安定
化方法。 - 【請求項１３】非イオン性界面活性剤がソルビタン脂肪
酸エステルおよび／またはポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルである請求項１０乃至１２記載の尿中
ミオグロビンの安定化方法。 - 【請求項１４】ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステルが、以下に列挙した化合物またはその誘導体から
成る群から選択される少なくとも１種である請求項１０
乃至１３記載の尿中ミオグロビンの安定化方法。 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート - 【請求項１５】炭酸水素塩化合物を含有することを特徴
とする尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項１６】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムから
成る群から選択される少なくとも１種である請求項１５
記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項１７】アジ化物を含有する請求項１５または１
６記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項１８】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カ
リウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択さ
れる少なくとも１種である請求項１７記載の尿中ミオグ
ロビンの安定化剤。 - 【請求項１９】キレート剤を含有する請求項１５乃至１
８記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項２０】キレート剤がEDTAまたはその塩である請
求項１９記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項２１】界面活性剤を含有する請求項１５乃至２
０記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項２２】界面活性剤が非イオン性界面活性剤であ
る請求項２１記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項２３】非イオン性界面活性剤がソルビタン脂肪
酸エステルおよび／またはポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルである請求項２１または２２記載の尿
中ミオグロビンの安定化剤。 - 【請求項２４】ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステルが、以下に列挙した化合物またはその誘導体から
成る群から選択される少なくとも１種である請求項２１
乃至２３記載の尿中ミオグロビンの安定化剤。 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート - 【請求項２５】炭酸水素塩化合物を含む尿試料中のミオ
グロビンと抗ミオグロビン抗体とを反応させることを特
徴とする尿中ミオグロビンの免疫学的測定方法。 - 【請求項２６】アジ化物を含有させる請求項２５記載の
尿中ミオグロビンの免疫学的測定方法。 - 【請求項２７】キレート剤を含有させる請求項２５また
は２６記載の尿中ミオグロビンの免疫学的測定方法。 - 【請求項２８】界面活性剤を含有させる請求項２５乃至
２７記載の尿中ミオグロビンの免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24200297A JPH1160600A (ja) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | 尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24200297A JPH1160600A (ja) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | 尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1160600A true JPH1160600A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=17082803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24200297A Pending JPH1160600A (ja) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | 尿中ミオグロビンの安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1160600A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009258081A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-11-05 | Sanyo Chem Ind Ltd | ミオグロビン含有水溶液 |
| WO2011078307A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 協和メデックス株式会社 | 尿検体中のサブスタンスｐの測定方法 |
| JP2011195475A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Gunze Ltd | Ｄａｎｃｅタンパク質溶液 |
| WO2013022107A1 (ja) * | 2011-08-11 | 2013-02-14 | 大塚製薬株式会社 | タンパク質を含む生体試料の前処理方法 |
| CN118465285A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-08-09 | 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 | 肌红蛋白校准品缓冲液及校准品 |
-
1997
- 1997-08-22 JP JP24200297A patent/JPH1160600A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009258081A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-11-05 | Sanyo Chem Ind Ltd | ミオグロビン含有水溶液 |
| WO2011078307A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 協和メデックス株式会社 | 尿検体中のサブスタンスｐの測定方法 |
| JP2011195475A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Gunze Ltd | Ｄａｎｃｅタンパク質溶液 |
| WO2013022107A1 (ja) * | 2011-08-11 | 2013-02-14 | 大塚製薬株式会社 | タンパク質を含む生体試料の前処理方法 |
| CN103842820A (zh) * | 2011-08-11 | 2014-06-04 | 大塚制药株式会社 | 对含有蛋白的生物样品进行预处理的方法 |
| JPWO2013022107A1 (ja) * | 2011-08-11 | 2015-03-05 | 大塚製薬株式会社 | タンパク質を含む生体試料の前処理方法 |
| CN118465285A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-08-09 | 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 | 肌红蛋白校准品缓冲液及校准品 |
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