JP2003014768A

JP2003014768A - ヘムタンパク質の安定化方法および保存溶液

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Publication number: JP2003014768A
Application number: JP2001199224A
Authority: JP
Inventors: Tetsuji Yamaguchi; 哲司山口; Masahiro Takagi; 昌宏高木
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-15
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: JP4502352B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、ヘモグロビンに代表されるヘムタン
パク質の変性・分解作用に対して有効な、新規なヘムタ
ンパク質の安定化方法を提供することにある。特に変性
・分解作用の強い糞便成分と共存するヘモグロビンを効
果的に安定化する技術の提供すること。また本発明は、
新規なヘムタンパク質の安定化剤を利用したヘムタンパ
ク質の保存溶液を提供することにある。【解決手段】ヘムタンパク質を含有する試料中に、リン
ゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグ
ルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される
少なくとも１種、またはそれらの塩類を共存させること
を特徴とするヘムタンパク質の安定化方法および保存溶
液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヘムタンパク質の安定
化方法に関し、特に糞便、尿、血液試料中のヘムタンパ
ク質検査におけるヘムタンパク質の安定化方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来技術】近年、大腸癌などの消化器系の疾患を検査
する方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中
のヒトヘモグロビン（便潜血）の検出が広く行われてい
る。このヒトヘモグロビンの検出方法は、従来の化学的
な発色反応に基づく試験紙法に代わり、ヒトヘモグロビ
ンに特異的な抗体を利用した免疫学的手法であり、食事
制限を必要としない手軽な検査方法として定着してい
る。

【０００３】ヒトヘモグロビンの免疫学的検出法として
は、例えば寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検
試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元
免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテッ
クス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素
で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法
や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金
コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法等が挙げら
れる。

【０００４】しかしながら、ヒトヘモグロビンは、保存
温度等の保存条件によって変性が促進されたり、検体中
の細菌や酵素によって分解されてしまうことも多い。こ
のような変性・分解の結果、ヒトヘモグロビンの立体構
造が破壊されて抗原性の低下を招くことになる。このた
め、免疫学的なヒトヘモグロビンの測定方法において
は、ヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結果を生ず
る原因となる。

【０００５】一方、便潜血検査においては、被験者自身
が自宅などで採取した糞便を密閉容器内の便溶解液に溶
解して検査に供する場合が多い。この場合、糞便中のヒ
トヘモグロビンは、溶液中で数日間放置されたり、郵便
等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれる
ことも多い。また、検査機関で採便する場合において
も、他項目の検査を実施しているため、便潜血の検査ま
でに多くの時間を要することもある。このような状況下
では、前述したように、ヒトヘモグロビンの変性・分解
が生じるため、精度良く測定する際の妨げとなってい
た。

【０００６】このような溶液中でのヒトヘモグロビンの
変性・分解を防止するため、例えばチメロサールやクロ
ルヘキシジン等一般的抗菌剤を添加する方法（特開昭６
３−２７１１６０号公報）の他に、糖類を添加する方法
（特開昭６３−２４３７５６号公報）、ヒト以外の動物
ヘモグロビンの添加（特開平２−２９６１４９号公
報）、ヒト以外の動物血清の添加（特開平４−１４５３
６６号公報）、溶菌酵素の添加（特公平５−６９４６６
号公報）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平５−２
８１２２７号公報）等が提案されている。しかしなが
ら、これらの公報に記載されたヒトヘモグロビン安定化
技術では、糞便を含む被検液中のヒトヘモグロビンの変
性・分解を十分に抑制することができない。

【０００７】この他にも、エチレンジアミン４酢酸（以
下、ＥＤＴＡと省略する）を用いたヘモグロビン安定化
方法が提案されている（特開平５−９９９２３号公
報）。しかしながら、本発明者らによる追試の結果、Ｅ
ＤＴＡ単独では糞便中のヘモグロビンに対して十分な安
定化作用を期待できないことが確認された。このため、
本出願人は、ＥＤＴＡ単独よりも安定化効果の高い水溶
性遷移金属錯体を添加する方法を提案している（特開平
７−２２９９０２号公報）。更に、本出願人は、フェロ
シアン化合物と共存させたヘモグロビンの安定化方法
（特開平１１−１１８８０６号公報）、ヘモグロビンの
酵素分解産物を共存させたヘモグロビンの安定化方法
（特開平１１−２１８５３３号公報）、および遷移金属
類を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（特願２０
００−６０５９７号）を既に提案している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の課題
は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性・
分解作用に対して有効な、新規なヘムタンパク質の安定
化方法を提供することにある。特に変性・分解作用の強
い糞便成分と共存するヘモグロビンを効果的に安定化す
る技術の提供を目的とする。本発明の第二の課題は、新
規なヘムタンパク質の安定化剤を利用したヘムタンパク
質の保存溶液を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の第一の課題は、
ヘムタンパク質を含有する試料中に、リンゴ酸、コハク
酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およ
びイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１
種、またはそれらの塩類を共存させることを特徴とする
ヘムタンパク質の安定化方法により達成された。また、
本発明の第二の課題は、リンゴ酸、コハク酸、フマル
酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエ
ン酸から成る群から選択される少なくとも１種、または
それらの塩類を含有させることを特徴とするヘムタンパ
ク質の保存溶液により達成された。以下、本発明につい
て更に詳細に説明する。

【００１０】本発明においては、ヘムタンパク質含有試
料中に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール
酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群
から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を
０．１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍ、より好ま
しくは１Ｍとなるように共存させる。これらの物質の濃
度が０．１ｍＭ未満になると、安定化効果が不十分とな
り、逆に２Ｍを超えると、溶解しにくくなり、免疫反応
も阻害される。

【００１１】また、本発明においては、上記物質に加え
てアジ化物を添加することにより、試料中のヘムタンパ
ク質をより一層安定化させることができる。アジ化物の
具体例としては、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カ
リウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから
成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。

【００１２】このアジ化物は、ヘムタンパク質含有試料
中に０．０１〜０．２Ｗ/Ｖ%、好ましくは０．１Ｗ/Ｖ%
となるように含有させる。アジ化物の濃度が０．０１Ｗ
/Ｖ%未満となると、安定化効果が不十分となる。一方、
アジ化物のうち、アジ化ナトリウムは、劇毒物指定品
（政令第４０５号：毒物および劇物指定令の一部を改正
する政令）となっているため、０．２Ｗ/Ｖ%を超えて使
用することは好ましくない。

【００１３】本発明においては、特に必要とされない
が、公知のタンパク質保護剤を必要に応じて加えること
によってヘムタンパク質の安定化効果をより高めること
ができる。このようなタンパク質保護剤としては、アル
ブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質等を挙
げることができる。

【００１４】アルブミンは、任意のものを使用すること
ができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミン
が好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、ま
たは胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。こ
のアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物
も知られているが、本発明におけるアルブミンには、こ
のようなアルブミンから誘導されるタンパク質をも含め
ることができる。

【００１５】上記タンパク保護剤の他に、例えば微生物
の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤やヘムタンパク質の
保存に有利なｐＨを与える緩衝剤などこれまでに知られ
ている多くのヘムタンパク質保護成分の添加も有効であ
る。抗菌剤としては、溶菌酵素、安息香酸エチル、ペニ
シリン、ファンギソン、ストレプトマイシン、あるいは
セファマイシン他非ペニシリン系の一連の抗生物質等が
挙げられる。また、トリプシンインヒビターやα２マ
クログロブリンのようなプロテアーゼ抑制物質もヘムタ
ンパク質を安定化することが知られている。

【００１６】保存溶液のｐＨは、ヘムタンパク質を安定
に保持できる範囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件
下ではヘムタンパク質の安定性を損なう恐れがあり、中
性域のｐＨが望ましい。具体的には５〜１０、好ましく
は６〜８程度のｐＨとする。ｐＨの維持のためには適当
な緩衝剤を利用する。たとえば、ヒドロキシエチルピペ
ラジン−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳと省略す
る）やピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Ｐ
ＩＰＥＳと省略する）等のグッド緩衝剤は、ヘムタンパ
ク質の構造を最も安定化すると思われるｐＨ（６〜８）
を与えると同時に、免疫反応によってヘムタンパク質を
検出する時の反応用緩衝液としても利用されているもの
であり、特に好ましい緩衝剤として挙げられる。この
他、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホ
ウ酸緩衝液等を利用することもできる。

【００１７】本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、
糞便、尿、血液試料中のヘムタンパク質の検出に利用す
ることができる。ヘムタンパク質としては、ヘムを構成
成分とするタンパク質の中から適宜選択でき、例えばヘ
モグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、または
カタラーゼが挙げられる。特に抗原構造の保護が要求さ
れる免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質につい
て、その抗原性の維持に有用である。

【００１８】本発明においては、ヘムタンパク質の安定
化因子として作用するリンゴ酸、コハク酸、フマル酸、
グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸
から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれ
らの塩類を含有させたヘモクロビンの保存溶液を提供す
ることができる。

【００１９】更に、本発明の保存溶液には、必要に応じ
てアジ化物、タンパク質保護剤および緩衝剤を含有させ
ることができる。アジ化物、タンパク質保護剤および緩
衝剤としては、上記したものの中から適宜選択して使用
することができる。

【００２０】本発明は、前記ヘムタンパク質の安定化技
術を応用したヘムタンパク質の免疫学的測定方法を提供
することができる。免疫学的測定方法としては、例えば
ラテックス凝集反応法、金コロイド凝集反応法、イムノ
クロマトグラフ法、またはＥＬＩＳＡ法等を挙げること
ができる。いずれの測定方法においても、ヘムタンパク
質含有試料に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコ
ール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成
る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩
類を共存させることによって、保存中の抗原活性は保護
され測定値の低下が抑制される。

【００２１】

【発明の実施の態様】本発明のヘムタンパク質の安定化
方法は、生体試料中に存在する分析対象としてのヘムタ
ンパク質を安定化するために有用である。特にヘムタン
パク質を認識する抗体を用いた免疫学的手法によるヘム
タンパク質の測定方法において、測定対象となるヘムタ
ンパク質の抗原性を高度に安定化する。ヘムタンパク質
を検出すべき生体試料には、糞便、尿、血液が知られて
いる。特に糞便中のヘモグロビンは消化器における出血
の指標となり、尿中のヘモグロビンは、尿路における出
血の指標となる。

【００２２】本発明の安定化方法を、糞便試料に存在す
るヘモグロビンに応用する場合には、糞便を懸濁させる
保存溶液にリンゴ酸等の物質を添加しておくと良い。通
常の糞便中のヘモグロビンの検出にあたっては、糞便を
適当な保存溶液に懸濁させ必要に応じてろ過して免疫学
的な分析用試料とする。

【００２３】

【発明の効果】本発明のヘムタンパク質の安定化方法で
は、ヘムタンパク質に対して強い変性・分解作用を持つ
生体成分、特に糞便成分との共存下においても保護作用
を得ることができる。したがって、生体成分の分析、例
えば糞便潜血の検出を目的とする試料に含まれるヘモグ
ロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保護が要
求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質に
ついて、その抗原性の維持に貢献する。本発明によって
糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化され、ヘモ
グロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期待す
ることができる。

【００２４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。

【００２５】実施例１．各添加物質によるヘモグロビン
の安定化効果（１）リンゴ酸ナトリウム（１Ｍ）、（２）グリコール
酸ナトリウム（１Ｍ）、（３）コハク酸２ナトリウム
（１Ｍ）、（４）２−ケトグルタール酸２ナトリウム
（１０ｍＭ）、（５）イソクエン酸３ナトリウム（１０
０ｍＭ）、（６）フマル酸２ナトリウム（１Ｍ）を含有
する保存溶液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．
０、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｎａ
Ｎ_３）と各物質（１）〜（６）を添加しない保存溶液２
ｍｌに、正常便検体Ａ、Ｂ、Ｃ１０ｍｇとヒト溶血液と
を添加し、添加直後のヘモグロビン測定値と３７℃で１
７時間保存したときのヘモグロビン測定値を比較した。
測定は、ＯＣ−２７０Ｒ（栄研化学製）を用いてラテッ
クス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣヘモディ
アオートII:栄研化学製）で行った。その結果を表１〜
表３に示す。表に示すように、無添加のものに比べて、
各物質（１）〜（６）を添加したものは、３７℃で１７
時間保存後のヘモグロビンの安定化効果が著しく高いこ
とが確認された。

【００２６】

【表１】 ────────────────────── 便検体Ａ ────────────────────── ０時間３７℃／１７時間後 ng/ml ng/ml ％ ────────────────────── 無添加６５６４１７６３．６ ────────────────────── （１）６８６５７０８３．１（２）６６４５３６８０．７（３）６５７５２６８０．１（４）６３１４８５７６．９（５）６１８４３４７０．２（６）６５１４５６７０．１ ──────────────────────

【００２７】

【表２】 ────────────────────── 便検体Ｂ ────────────────────── ０時間３７℃／１７時間後 ng/ml ng/ml ％ ────────────────────── 無添加６２０３４３５５．３ ────────────────────── （１）６４１５１３８０．０（２）６４３４９８７７．５（３）６２３４６９７５．２（４）６１６４４１７１．７（５）５８８３７０６２．９（６）６０５３８１６３．０ ──────────────────────

【００２８】

【表３】 ────────────────────── 便検体Ｃ ────────────────────── ０時間３７℃／１７時間後 ng/ml ng/ml ％ ────────────────────── 無添加６６０４００６０．６ ────────────────────── （１）６２６５８２９３．０（２）６４４５３８８３．６（３）６０２５１９８６．３（４）６５０５０１７７．０（５）６１２４４０７１．９（６）６１６３７６６１．１ ──────────────────────

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘムタンパク質を含有する試料中に、リン
ゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグ
ルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される
少なくとも１種、またはそれらの塩類を共存させること
を特徴とするヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項２】リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコー
ル酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る
群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類
の濃度が０．１〜２０００ｍＭの範囲である請求項１記
載のヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項３】アジ化物を共存させる請求項１または２記
載のヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項４】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリ
ウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成
る群から選択される少なくとも１種である請求項３記載
のヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項５】ヘムタンパク質がヘモグロビン、ミオグロ
ビン、ペルオキシダーゼ、またはカタラーゼである請求
項１記載のヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項６】ヘムタンパク質を含有する試料が糞便、尿
または血液である請求項１記載のヘムタンパク質の安定
化方法。
【請求項７】リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコー
ル酸、2-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群
から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を
含有することを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液。
【請求項８】アジ化物を含有する請求項７記載のヘムタ
ンパク質の保存溶液。
【請求項９】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリ
ウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成
る群から選択される少なくとも１種である請求項８記載
のヘムタンパク質の保存溶液。