JPH1175863A - ２５−ヒドロキシビタミンＤ３−１α−水酸化酵素および該酵素をコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 活性型ビタミンＤ₃の低下により惹起される
骨粗鬆症等の成人病の予防、診断、治療等に有用な、ビ
タミンＤ₃活性化の最終段階を触媒する、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリ
ペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子を提
供する。 【解決手段】 本発明によれば、２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベ
クターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた
２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素の製
造法、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵
素活性を有するポリペプチドを用いた１α，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ₃の製造法および該ポリペプチドを
認識する抗体を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプ
チド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
ベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用い
た２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素の
製造法、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化
酵素活性を有するポリペプチドを用いた１α，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ₃の製造法および該ポリペプチド
を認識する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】活性型ビタミンＤ₃は、カルシウムの代
謝調節作用、細胞の分化誘導、免疫調節など多様な生理
作用を持つホルモンとして知られている。活性型ビタミ
ンＤ₃は、生理作用を有しないビタミンＤ₃が体内で代謝
され変換されることにより生成されることが知られてい
る。

【０００３】活性型ビタミンＤ₃の作用機構の一つとし
て、細胞質レセプターを介した作用機構が明らかになっ
ている。活性型ビタミンＤ₃の本体は、１α位と２５位
が水酸化された、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
₃であることが知られている。活性化にいたる代謝経路
として、２５位に水酸基が導入されて、２５-ヒドロキ
シビタミンＤ₃ができた後、１α位が水酸化され、活性
体である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃ができ
ることが知られている〔ビタミンＤ₃のすべて、尾形悦
郎、須田立雄、小椋陽介編、講談社サイエンティフィ
ク、(1993)〕。

【０００４】２５位に水酸基を導入する２５位水酸化酵
素遺伝子は、すでにラット肝臓由来のものがクローニン
グされ（特開平３―２３２４８９３）ている。また、活
性型ビタミンＤ₃の分解に関わる、ビタミンＤ₃・２４位
水酸化酵素もクローニングされ（特開平４―２０７１９
６）ている。ビタミンＤ₃の１α位を水酸化する酵素と
しては、ヒトのＣＹＰ２７が報告されているが〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 91, 10014(1994)〕、該酵素の
１α位を水酸化する活性は副次的な活性で、非常に弱
く、本来の活性ではない、また誘導のかかる活性でもな
い。

【０００５】ラットやニワトリをビタミンＤ₃欠乏食餌
で飼育すると、腎臓での２５−ヒドロキシビタミンＤ₃
−１α−水酸化酵素活性が誘導されることが分かってい
る〔Gerontology, 42(補遺1), 67-77 (1996)〕。現在ま
で、ビタミンＤ₃活性化の最終段階を触媒する、最も重
要な１α位を水酸化する酵素ポリペプチドおよび該ポリ
ペプチドをコードする遺伝子の単離の報告は、いずれの
動物種においてもない。

【０００６】１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃の
製造法として、ニワトリなどの動物の腎臓のホモジェネ
ートやミトコンドリア画分を用いる方法〔Nature, 230,
228(1971)、J. Biol. Chem., 247, 7528 (1972)、Bioc
hemistry, 25, 5512 (1986)〕が知られているが、該手
法においては、大量の動物の腎臓あるいは肝臓が必要で
あり、調製に手間がかかることより、非効率的で実用的
製造法とはいえない。また、１α及び２５位に直接水酸
基を導入する活性を持つ微生物が見出されているが（特
公平４−６４６７８）、活性は微弱で、基質特異性も低
く、生成物と副生成物との分離は困難である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、活性
型ビタミンＤ₃の低下により惹起される骨粗鬆症等の成
人病の予防、診断、治療等に有用な、ビタミンＤ₃活性
化の最終段階を触媒する、２５−ヒドロキシビタミンＤ
₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプチドおよび
該ポリペプチドをコードする遺伝子を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリ
ペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該
組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を
用いた２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵
素の製造法、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水
酸化酵素活性を有するポリペプチドを用いた１α，２５
−ジヒドロキシビタミンＤ₃の製造法および該ポリペプ
チドを認識する抗体に関する。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ポリペプチドとして、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−
１α−水酸化活性を有するポリペプチドであればいずれ
も用いることができ、例えば、配列番号１および２で表
わされるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、あるいは配列番号１および２で表わさ
れるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ２
５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化活性を有す
るペプチドをあげることができる。

【００１０】ポリペプチドの有するアミノ酸配列のうち
一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミ
ノ酸配列を有し、かつ２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−
１α−水酸化活性を有するポリペプチドは、Nucleic Ac
ids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 81,5662 (1984) 、Science, 224, 1431 (198
4)、PCT WO85／00817(1985) 、Nature, 316, 601 (198
5) 、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research,
13, 4431 (1985) 、カレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in
Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of Cloned
ＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の方法
に準じて調製することができる。

【００１１】本発明のＤＮＡとして、上記本発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡをあげることができ、例え
ば、配列番号１および２で表わされるアミノ酸配列から
選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、配列番号１、および２で代表されるアミノ酸
配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
したアミノ酸配列を有し、かつ２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ、配列番号３および４で表される塩基
配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、またはこれ
らＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡをあげることができる。

【００１２】該ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズ可能なＤＮＡとは、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃
−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイ
ゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あ
るいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等を
用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的に
は、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化し
たフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存
在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、
０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液
の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン
酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィル
ターを洗浄することによって同定できるＤＮＡをあげる
ことができる。

【００１３】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molec
ular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブ
ルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(M
aniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス (Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss)、１９８９年刊、以下、モレキュラー・クローニン
グ 第２版と略す〕等に記載されている方法に準じて行
うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、
例えば、配列番号１および２で表わされるアミノ酸配列
から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同
性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有
するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有
するＤＮＡをあげることができる。

【００１４】本発明の抗体は、上述のポリペプチドを認
識する抗体をあげることができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １）ラットの腎臓由来のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブ
ラリーの作製 ビタミンＤ₃欠乏食で飼育することにより２５−ヒドロ
キシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性の誘導を行っ
たラットの組織、例えば腎臓よりｍＲＮＡ〔ポリ（Ａ）
⁺ＲＮＡと呼ぶこともある〕を調製する。

【００１６】ｍＲＮＡを調製する方法としては、ラット
の組織より全ＲＮＡを調製し、全ＲＮＡからオリゴ（ｄ
Ｔ）固定化セルロースカラム法〔モレキュラー・クロー
ニング 第２版〕等を用いて、ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡとして
ｍＲＮＡを調製する方法、ファースト・トラック・ｍＲ
ＮＡ・アイソレーション・キット〔Fast Track mRNAIso
lation Kit；インビトロジェン（Invitrogen）社製〕、
クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション
・キット（Quick Prep mRNA Purification Kit；ファル
マシア社製）などのキットを用いてラットの組織より直
接ｍＲＮＡを調製する方法等をあげることができる。

【００１７】全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシ
アン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.),
154, 3 (1987)〕、ＡＧＰＣ法〔実験医学, 9, 1937 (1
991)〕等をあげることができる。上記と同様の方法で、
２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性
の誘導を行わなかったラットの組織より全ＲＮＡおよび
ｍＲＮＡを調製することができる。

【００１８】該ｍＲＮＡを用いて、常法によりｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製
方法として、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−
１α−水酸化酵素活性誘導を行ったラットから採取した
腎臓由来のｍＲＮＡより、Stratagene社製ＺＡＰ-ｃＤ
ＮＡ synthesis kit、GIBCO BRL社製のcＤＮＡ Synthes
is System等を用いｃＤＮＡを合成し、適切な制限酵素
で切断可能な部位を有するアダプターを連結し、該制限
酵素により切断したクローニングベクターλＺＡＰII
（Stratagene社製ＺＡＰII cloning Kit）の該切断部位
に挿入することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製す
る方法等をあげることができる。

【００１９】ｃＤＮＡライブラリーを作成するための、
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自
立増殖できるものであればいずれも用いることができ
る。該クローニングベクターとして、例えばファージベ
クター、プラスミッドベクター等をあげることができ、
好適には、上記λＺＡＰIIの他、ｐＵＣ１８、pBluescr
ipt（Stratagene社）等をあげることができる。

【００２０】宿主微生物としては、大腸菌に属する微生
物であれば、いずれも用いることができ、好適には、Es
cherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blu
e、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000等
をあげることができる。

【００２１】２）ビタミンＤ₃水酸化酵素に特徴的なア
ミノ酸配列の選定 ラットのビタミンＤ₃・２５位水酸化酵素（特開平３―
２３２４９３）および２４位水酸化酵素（開平４―２０
７１９６）の両酵素に共通に存在するアミノ酸配列を有
する領域を検索し、該領域に存在するアミノ酸配列をビ
タミンＤ₃水酸化酵素に特徴的なアミノ酸配列として選
定する。

【００２２】該配列を有する領域として、例えばアドレ
ノドキシン結合領域（以下、Ａ領域と略す）、ヘム結合
領域（以下、Ｈ領域と略す）等をあげることができる。

【００２３】３）２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素をコードするＤＮＡの部分断片の増幅 ２）において選定した領域のアミノ酸配列に基づき、ラ
ットのコドンを参考にして、２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ₃−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡのポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）
による増幅に適したセンスプライマーおよびアンチセン
スプライマーを設計、作製する。

【００２４】これらプライマーとして、例えば、配列番
号７、８および９に表された塩基配列から選ばれる塩基
配列を有するＤＮＡをあげることができる。１）で取得
したｍＲＮＡを用いて、逆転写酵素反応により、first
strand ＤＮＡを合成する。該ＤＮＡ合成は、Stratagen
e社製ｃＤＮＡsynthetic kitを用いて行うことができ
る。

【００２５】該first strand ＤＮＡをテンプレートと
して用い、上記で作製したセンスプライマーおよびアン
チセンスプライマーを利用し、ＲＴ（リバース・トラン
スクリプション：reverse-transcription）―ＰＣＲを
行い、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵
素をコードするＤＮＡの一部を含むＤＮＡ領域を増幅す
る。

【００２６】該ＲＴ―ＰＣＲ増幅断片およびＢＲＬ社製
３’ＲＡＣＥシステムキットを用い、ｍＲＮＡの３’末
端ポリＡ構造の間のＰＣＲ増幅を行うことで、より長
く、さらには３’側の非翻訳領域も含んだＰＣＲ増幅断
片を得ることができる。即ち、１）で取得したｍＲＮＡ
およびＢＲＬ社製３’ＲＡＣＥシステムキット中のOlig
o dT/AUAPプライマーを用いｃＤＮＡを合成し、該ＤＮ
Ａをテンプレートとして用い、ＢＲＬ社製３'ＲＡＣＥ
システムキット中のＡＵＡＰプライマーおよび上記ＲＴ
―ＰＣＲ増幅断片を利用して、ＰＣＲ増幅を行うことで
３'側の非翻訳領域も含んだＰＣＲ増幅断片を得ること
ができる。

【００２７】同様に５'-ＲＡＣＥ法を用いて、５'側の
領域を含んだＰＣＲ増幅断片を得ることができる。上記
増幅ＤＮＡ断片が２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素をコードするＤＮＡの部分断片であること
は以下の方法により確認することができる。

【００２８】上記１）において取得した、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性誘導を行った
ラットおよび非誘導ラット由来のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを
各々アガロース電気泳動にかけ、泳動されたポリ（Ａ）
⁺ＲＮＡをアガロースからメンブレンフィルターへ常法
によりトランスファーする。これらメンブレンフィルタ
ーを用い、上記増幅ＤＮＡ断片をプローブとしてノーザ
ンハイブリダイゼションを行う。

【００２９】上記増幅ＤＮＡ断片が、活性誘導を行った
ラット由来のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから作製したメンブレ
ンフィルターを用いたときのみ、ハイブリダイズするこ
とを確認することにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ
₃−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡの部分断片で
あることがわかる。上記増幅ＤＮＡ断片を、プラスミッ
ドに組み込み、塩基配列の解析や、発現の特異性の解析
に用いることができる。

【００３０】プラスミッドに組み込む方法としては、例
えば、上記増幅ＤＮＡ断片をアガロースよりＤＮＡ pur
ification kit（Bio Rad社製）を用いて抽出し、ｐＣＲ
ＩＩベクター（Invitrogen社製）に連結することによ
り、プラスミッドに組み込む方法をあげることができ
る。

【００３１】４）２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素をコードするＤＮＡを有するクローンの選
択 上記増幅ＤＮＡ断片を標識化し、常法によりコロニー、
あるいはプラークハイブリダイゼーションを行い、ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングする。上記増幅ＤＮ
Ａ断片の標識化は、例えば、ＤＩＧラベリングキット
（ベーリンガーマンハイム社製 ＃1 175 033）等を用い
て行うことができる。即ち、該キットを利用して、上記
増幅ＤＮＡ断片をテンプレートとして用い、ＰＣＲを行
うことにより、ＤＩＧラベル化した増幅ＤＮＡ断片を取
得することができる。

【００３２】プラークハイブリダイゼーション法として
は、例えば以下の方法をあげることができる。上記１）
で調製したｃＤＮＡライブラリー（ファージ）を１シャ
ーレ当たり、１から２万個のプラークが形成するように
寒天培地上に塗布し、培養する。ＨｙｂｏｎｄＮ⁺膜（A
mersham社製）をプラークが形成したシャーレ上に乗
せ、プラークＤＮＡを該膜に転写する。

【００３３】該転写膜を、アルカリ処理（例えば、１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸漬する）お
よびＳＤＳ処理（例えば、２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤ
Ｓ溶液に浸漬する）し、洗浄後、乾燥させ、プラークＤ
ＮＡが膜上に固定されたブロッティング膜としてハイブ
リダイズに用いる。該ブロッティング膜を６０℃のハイ
ブリ溶液〔５×ＳＳＣ、０．１％ Sarkosyl、０．０２
％ ＳＤＳ、１％ ハイブリ用ブロッキング試薬（ベーリ
ンガーマンハイム社製）〕に、５時間浸漬した後、上記
で調製した標識化増幅ＤＮＡ断片を熱処理したものを加
え、ハイブリダイズさせる 。

【００３４】ハイブリダイズ後、該膜を洗浄（例えば、
２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用い室温で５分間
の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ
を用い６０℃で１５分間の洗浄を２回実施する洗浄）、
ブロッキング〔例えば、１×ブロッキング溶液（ベーリ
ンガーマンハイム社製）、０．１Ｍマレイン酸、０．１
５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いたブロッキング〕した
後、標識化増幅ＤＮＡ断片の標識に応じた方法で標識化
増幅ＤＮＡを検出することにより、目的とするクローン
を選択することができる。

【００３５】例えば、ＤＩＧ標識化したＤＮＡ断片を用
いた場合には、ＡＰ標識した抗ＤＩＧ抗体との反応、ア
ルカリ処理〔例えば、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ９．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂溶液に浸漬〕を行い、ＤＩＧ発光検出キット（ベー
リンガーマンハイム社製 ＃ 1 363 514）を用いて、プ
ローブとハイブリダイズするプラークをＸ線フィルム上
でスクリーニングすることにより、２５−ヒドロキシビ
タミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡを有
するクローンを選択することができる。

【００３６】５）２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素をコードするＤＮＡの取得 上記４）に記載のスクリーニングによって取得されたク
ローンより、常法によってＤＮＡを単離することにより
２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコ
ードするＤＮＡを取得することができる。

【００３７】該ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩
基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキ
シ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (197
7)〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキ
ン・エルマー（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析
装置を用いて分析することにより行うことができる。こ
のようにして決定された２５−ヒドロキシビタミンＤ₃
−１α−水酸化酵素遺伝子配列として、例えば配列番号
３もしくは配列番号５で示された配列を有するＤＮＡを
あげることができる。

【００３８】上述の方法により決定されたＤＮＡの塩基
配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することによ
り目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合
成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作
所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用
したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ
３９２等をあげることができる。

【００３９】更に、上記で取得したラット由来の２５−
ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子を用
い、以下に示す方法により、他の動物、例えば、ヒト由
来の２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素
遺伝子を取得することができる。上記で取得した２５−
ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードす
るＤＮＡを例えばメガプライムＤＮＡラベリングキット
（Amersham社製）等を利用してα-³²Ｐ-ｄＣＴＰで標識
する。目的とする動物組織、例えば、ヒト腎臓等より上
述１）記載の方法と同様にｃＤＮＡライブラリーを作成
する。

【００４０】上記４）記載の標識ＤＮＡ断片をプローブ
として用い、コロニー、あるいはプラークハイブリダイ
ゼーションを行って、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングする。該スクリーニングより取得されたクロー
ンより、上記５）と同様の方法で目的とするＤＮＡを単
離し、塩基配列を決定する。

【００４１】該塩基配列がラット２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子の塩基配列と相同性
が高いものを、目的とする動物由来の２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡと
してあげることができる。該遺伝子としては、ヒト腎臓
に由来する配列番号４もしくは配列番号６に示された配
列を有するＤＮＡ等をあげることができる。

【００４２】６）２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素ポリペプチドの生産 上記５）で取得した２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１
α−水酸化酵素をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現
させるために、モレキュラー・クローニング第２版やカ
レント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオ
ロジー サプルメント１〜３４等に記載された方法等を
用いることができる。

【００４３】即ち、上記５）で取得したＤＮＡを、制限
酵素、あるいはＤＮＡ分解酵素で、２５−ヒドロキシビ
タミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡを含
む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中
のプロモーター下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入
した発現ベクターを発現ベクターに適合した宿主細胞中
に導入する。

【００４４】宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるもので
あればいずれも用いることができる。発現べクターとし
ては、上記宿主細胞において、自立複製可能ないしは、
染色体中への組み込みが可能で、２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子を転写できる位置
に、プロモーターを含有しているものが用いられる。

【００４５】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合には、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸
化酵素遺伝子発現ベクターを原核生物中で、自立複製が
可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素
をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成されている
ことが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含ま
れていてもよい。

【００４６】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社より市販）、ｐＳＥ２８０（Invitrog
en社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ
−８（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１
０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem.,48,
669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Chem., 53,
277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRATAGENE
社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐ
Ｔｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ
Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７
９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５
１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社
製）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社製）、ｐＥＴシステム（N
ovagen社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ
５、ｐＣ１９４等を例示することができる 。

【００４７】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、P_Lプロモーター、P_Rプロモーター、PletIプ
ロモーター、P_SEプロモーター等の、大腸菌やファージ
等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげる
ことができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモータ
ー（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーターのように人為的に
設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

【００４８】リボソーム結合配列としては、大腸菌等の
宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでも
よいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と
開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）
に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。本発
明の２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素
遺伝子の発現には、転写終結配列は必ずしも必要ではな
いが、好適には構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置
することが望ましい。

【００４９】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、
例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia co
li XL2-Blue 、Escherichia coli DH1、Escherichia co
li MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia co
li W1485 、Escherichia coli JM109 、Escherichia co
li HB101、Escherichiacoli No.49 、Escherichia coli
W3110 、Escherichia coli NY49、Bacillus subtili
s、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammm
oniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC1406
8、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevi
bacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofe
rmentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC
13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354 等をあげ
ることができる。

【００５０】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、Gene, 17, 10
7 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111(1
979)に記載の方法等をあげることができる。

【００５１】酵母菌株を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37
115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37
419）ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができ
る。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるも
のであればいかなるものでもよい。例えば、ＰＨＯ５プ
ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモータ
ー、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇ
ａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモ
ーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモータ
ー等のプロモーターをあげることができる。

【００５２】宿主細胞としては、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等をあげることができる。

【００５３】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. B
acteriol.）、153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75, 1929(1978)記載の方法等をあげることが
できる。

【００５４】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤＭ８
（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22
979；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 133,
(1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤ
Ｍ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４
（Invitrogen社製）ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 10
1, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することが
できる。

【００５５】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、
レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモ
ーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。
また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモ
ーターと共に用いてもよい。

【００５６】宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ
５６３７（特開昭６３―２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯ
Ｓ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。動物細
胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤ
ＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができる。
例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnolog
y, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２―
２２７０７５）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA, 84, 7413(1987)〕、virology, 52, 456
(1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転
換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公
報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されて
いる方法に準じて行なうことができる。

【００５７】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ，ア・ラボラトリー・マニュアル，ダブリュー・エイ
チ・フィリーマン・アンド・カンパニー，ニューヨーク
1992年（Baculovirus Expression Vectors, A Laborato
ry Manual,W.H.Freeman and Company, New York,199
2）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー
・バイオロジー ，サプルメント３８，２８，ユニット
１６．９，１６．１１，ジョン・ウィリー・アンド・サ
ン，ニューヨーク，1995年（Current Protocols in Mol
ecular Biology, Suppliment 38, 28, Unit16.9, 16.1
1, John Wiley and Sons, New York, 1995）、Bio/Tech
nology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、タ
ンパク質を発現することができる。

【００５８】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることが
できる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクター
としては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、
ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにInvitrogen社製）等をあ
げることができる。

【００５９】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s) などを用いることができる。昆虫細胞としては、Spo
doptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ，ア・ラボラトリー・マニュアル，ダブリュー・エイ
チ・フィリーマン・アンド・カンパニー，ニューヨーク
1992年（Baculovirus Expression Vectors, A Laborato
ry Manual,W.H.Freeman and Company, New York,199
2）〕、Trichoplusia ni の卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５
（Invitrogen社製）等を用いることができる。

【００６０】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を
行うことができる。

【００６１】酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現
させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプ
チドを得ることができる。以上のようにして得られる形
質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプ
チドを生成蓄積させ、該培養物から採取することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる。本
発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養
に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【００６２】大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類
等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭
素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、
グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有
する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭
水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、
プロパノールなどのアルコール類等を用いることができ
る。

【００６３】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。

【００６４】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時
間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０
〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
などを用いて行う。

【００６５】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクター
で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加し
てもよい。

【００６６】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０培地〔The Journal of the American Medica
l Association, 199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥ
Ｍ培地〔Science, 122, 501(1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔V
irology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding o
f the Society for the Biological Medicine, 73, 1
(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培
地等が用いられる。

【００６７】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主として
得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使
用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ph
armingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ
社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５
〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Bioscien
ces）社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,
ネイチャー(Nature), 195, 788 (1962)〕等を用いるこ
とができる。

【００６８】ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよ
く、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中
必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添
加してもよい。上記形質転換体の培養液から、上記方法
により発現させたポリペプチドを単離精製するために
は、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。

【００６９】例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内
に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠
心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕
機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザ
ー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を
得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られ
た上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出
法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿
法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロー
ス、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた
陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF
(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換ク
ロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセ
ファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ
ー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロ
マトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点
電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合
わせて用い、精製標品を得ることができる。

【００７０】また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を
形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、
遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常
の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチド
の不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化
液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプ
チド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希
薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正
常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法
により精製標品を得ることができる。

【００７１】本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾
体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清
に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を
回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の
遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分
を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法
を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【００７２】また、上記方法により発現させたポリペプ
チドを、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボ
ニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等
の化学合成法によっても製造することができる。また、
桑和貿易(米国AdvancedchemTech社製)、パーキンエルマ
ージャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイ
オテク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ
(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ
(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リ
ミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチ
ド合成機を利用し合成することもできる。

【００７３】７）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
₃の製造 上記６）に記載の方法により取得した２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプ
チドおよび２５−ヒドロキシビタミンＤ₃を水性媒体中
に存在させることにより、水性媒体中に１α，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ₃を生成させ、生成した１α，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を該水性媒体中より採取
することにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
₃を製造することができる。

【００７４】２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水
酸化酵素活性を有するポリペプチドとしては、上記６）
に記載の方法により精製したポリペプチドおよび上記
６）に記載の方法により取得した形質転換体の培養物、
菌体、菌体処理物等を用いることができる。菌体処理物
としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤また
は有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的
摩砕処理物、菌体の蛋白質分画（２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有する画分）、菌体
および菌体処理物の固定化物等をあげることができる。

【００７５】２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水
酸化酵素活性を有するポリペプチドの濃度は、微生物菌
体換算で０．０１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜
１０ｇ／ｌである。水性媒体としては、水、リン酸塩、
炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの
緩衝液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアル
コール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなど
のケトン類、アセトアミド等のアミド類などの有機溶媒
を含有した水性溶液があげられる。また必要に応じてト
リトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンＨ
Ｓ２０４（日本油脂社製）などの界面活性剤あるいはト
ルエンやキシレンのような有機溶媒を０．１〜２０ｇ／
ｌ程度添加してもよい。

【００７６】２５−ヒドロキシビタミンＤ₃の濃度は、
０．０１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは０．０１〜１０ｇ／
ｌである。水性媒体に、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃
−１α−水酸化酵素活性を有するポリペプチド、２５−
ヒドロキシビタミンＤ₃を上記濃度添加し、温度１５〜
８０℃、好ましくは２０〜４０℃、ｐＨ３〜１１、好ま
しくはｐＨ４〜９の条件下で、５分間〜９６時間反応さ
せ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を製造する
ことができる。

【００７７】８）２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素を認識する抗体の調製 上記６）に記載の方法により取得したポリペプチドの全
長または部分断片精製標品(抗原)を５０〜１００μg/匹
程、ウサギ、ヤギまたは３〜２０週令のラット、マウス
もしくはハムスターの皮下、静脈内または腹腔内に、適
当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバ
ント(Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アル
ミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに投与す
る。該抗原の投与は、1回目の投与の後１〜２週間おき
に３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢
より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応すること
を酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法(ELISA法):医学書院
刊 1976年、Antibodies-ALaboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1988〕などで確認する。

【００７８】免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な
抗体価を示したウサギ、ヤギ、マウス、ラットまたはハ
ムスターより血清を取得し、該血清より、４０〜５０％
飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿
法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カ
ラムあるいはゲルろ過カラム等を用いたクロマト法等の
常法を用いて精製抗体を取得することができる。

【００７９】また、上記方法により免疫した動物の脾細
胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリド
ーマを作製し、このハイブリドーマを培養するか、動物
に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水
を採取することにより本発明のポリペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を製造することができる。

【００８０】９）本発明のポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡまたは本発明のボリベプチドを認
識する抗体の利用 （１）本発明のポリペプチドは、活性型ビタミンＤ₃で
ある１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を製造する
ために利用することができる。 （２）本発明のポリペプチドの全長、あるいは部分断片
は、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素
を認識する抗体の抗原として利用することができる。

【００８１】（３）本発明の２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ₃−１α−水酸化酵素の全長または活性を持つ部分断
片を生体に投与することにより、該酵素タンパクの低下
が原因となる疾病、例えば骨粗鬆症の治療が可能とな
る。 （４）本発明のＤＮＡを用い、ノーザンハイブリダイゼ
ーション法(モレキュラー・クローニング 第２版）、
ＰＣＲ法［ＰＣＲブロトコールズ(PCR Protocols)、ア
カデミック・プレス(Academic Press)(1990)]、ＲＴ−
ＰＣＲ法等により、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１
α−水酸化酵素遺伝子のｍＲＮＡを検出することができ
る。

【００８２】該検出法を利用し、２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子のｍＲＮＡの発現量
を測定する診断法は、活性型ビタミンＤ₃量の低減によ
り起こる骨粗鬆症等の成人病の発症を抑制するうえで有
用であり、該２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水
酸化酵素遺伝子の先天的な欠損による遺伝子病の早期診
断に有効である。

【００８３】ｍＲＮＡの発現量は、ノーザン・ハイブリ
ダイゼーション法の場合は、ハイブリダイズしたプロー
ブの量をプローブの標識に応じて、例えば³²Ｐ標識の場
合は放射能量を、蛍光標識の場合は蛍光量を測定するこ
とにより測定できる。ＲＴ−ＰＣＲ法の場合は、例えば
増幅断片をエチジウムブロミドやサイバーグリーン１な
どのＤＮＡ特異的な蛍光染色剤で染色し、その蛍光量を
測定することにより測定できる。

【００８４】（５）本発明のＤＮＡをレトロウイルス、
アデノウイルス等のウイルスベクターや、その他のべク
ターに組み込み、遺伝子治療の方法により、治療に用い
ることができる。 （６） 本発明の抗２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素抗体を用いることにより、血液、臓器の一
部、細胞等のサンプルで、２５−ヒドロキシビタミンＤ
₃−１α−水酸化酵素の検出、定量を行うことが出来
る。具体的に好適な手法としてはマイクロタイタープレ
ートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブ
ロット法などが上げられ、また病理切片を用いた免疫組
織染色にも利用出来る。従って、該抗体はビタミンＤ₃
１α水酸化酵素発現の低下に伴う骨粗鬆症等の疾病やそ
の発症の診断や発症の可能性を早期に予知すること等に
有用である。同様に、該タンパクを対象とした研究にお
ける研究用試薬としても有用である。

【００８５】（７）本発明の抗体を用いて、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポ
リペプチドの免疫組織染色に利用でき、該抗体を含有す
る免疫組織染色剤を提供することができる。 （８）本発明のＤＮＡを用い、ゲノムＤＮＡとのハイブ
リダイゼーションによって、本遺伝子のプロモーター領
域のＤＮＡをクローニングすることができる。そのプロ
モーター領域のＤＮＡ断片を用いて、本遺伝子の発現調
節に関わる分子の探索、解析を行うことができる。

【００８６】以下に実施例を示し、本発明の詳細を説明
する。各操作でキットを使用した場合は、特に記載した
以外は、添付のプロトコールに従つて実験を進めた。基
本的な遺伝子操作技術は、モレキュラー・クローニング
第２版に従つた。

【００８７】

【実施例】

実施例１ ビタミンＤ₃欠乏食で飼育したラットからの
腎臓の調製 Ｓ.Ｄ.系ラットの雄４匹について、離乳後直ちにビタミ
ンＤ₃欠乏食を与え、３週間飼育する（６週令）。ビタ
ミンＤ₃欠乏食は、ＤＩＥＴ１１〔須田ら;J. Nutritio
n, 10O, 1049(197O)、Teklad社(Madison,WI, USA)よりP
urified diet for Ratとして販売〕を用いた。飼料中の
カルシウムは０．０３％、リン酸は０．６％のビタミン
Ｄ欠乏低カルシウム飼料となっている。

【００８８】ラットの水分補給にはイオン交換水を用い
た。屠殺４８時間前に、１α，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ₃（CALVIOCHEM社製、CA,USA）を１μｇ／ラット
静脈注射した。予定の期間飼育の後、ラットをエーテル
麻酔した。該ラットの腹大動脈より採血し、瀉血法で屠
殺した後、直ちに解剖して、腎臓を取り出した。

【００８９】該腎臓を、ＰＢＳ（１Ｌ中にＮａＣｌ ８
ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ２．
９ｇおよびＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇを含有する）で洗浄
後、液体窒素中で凍結した。対照として、通常の飼料
（Rat diet：１００ｇ中にカルシウム０．５ｇ、リン酸
０．６ｇおよびビタミンＤ₃を２００ＩＵ含有する）を
与えて同様に飼育したラットについても、上記と同様の
方法により腎臓を調製し、活性非誘導ラット由来の腎臓
として用いた。

【００９０】実施例２ ラット腎臓より、ｍＲＮＡの調
製 ビタミンＤ₃欠乏食で飼育したラットより調製した腎臓
０．７８ｇ、通常の飼料で飼育したラットより調製した
腎臓０．９４ｇをそれぞれＰＢＳで洗浄後、液体窒素中
で凍結した。該凍結腎臓は−８０℃で保存することがで
きる。該凍結腎臓を、ワーリングブレンダーで液体窒素
中で細断し、組織が砂状になったら、液体窒素を蒸発さ
せた。

【００９１】該砂状組織を、５．５Ｍ ＧＴＣ溶液（５
００ｍｌ中にグアニジンイソチオシアネート ３２４．
５ｇ、クエン酸ナトリウム ３．７ｇおよびザルコシー
ル（Sarkosyl） ３．３ｇを含有する）３５ｍｌおよび
２−メルカプトエタノール ４９２μｌを加え、氷冷し
ながらホモジェナイザー（Digital Homogenizer井内社
製）でホモゲナイズ後、５０ｍｌ容注射筒に１８ゲージ
の注射針を装着し、ホモゲナイズした懸濁液を４回通筒
する。

【００９２】該懸濁液を１５ｍｌ容遠心チューブに移
し、６０００回転、２０℃の条件下で１０分間遠心分離
を行い、上清を取得した。該上清を１６ｍｌずつ、Ｃｓ
ＴＦＡ調製液〔Pharmacia社製ＣｓＴＦＡ溶液 １００ｍ
ｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．０） ８２．０
６ｍｌ、Ｈ₂Ｏ２３．０９ｍｌを混合した溶液〕１７ｍ
ｌの入った４０ｍｌ容の超遠心用ポリアロマー製のチュ
ーブに重層した後、２５０００回転、１８℃の条件下で
２５時間超遠心分離を行った。

【００９３】上清を除き、チューブの下から１．５ｃｍ
ほどの位置から切断し、沈殿を４ＭＧＴＣ溶液（５．５
Ｍ ＧＴＣ溶液 ４ｍｌ、Ｈ₂Ｏ １．５ｍｌ、２−メルカ
プトエタノール ５６μｌを混合した溶液）０．６ｍｌ
に溶かした。該溶解液を１４０００回転で１５秒間遠心
分離し、上清を取得した。該上清に１Ｍ 酢酸ナトリウ
ムを１５μｌ、エタノールを０．４５ｍｌ加え懸濁後、
遠心分離し、沈澱を取得した。

【００９４】該沈殿を７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ
緩衝液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）〕１ｍｌに
懸濁し、１４０００回転で１５秒間遠心分離後、上清を
取得した。該上清に２．５倍容の７０％エタノールを加
え、遠心分離し、沈澱を取得した。

【００９５】該沈殿を７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ
緩衝液５００μｌに溶解した。該操作により、２６０ｎ
ｍの吸光度より計算して、活性誘導ラット由来の腎臓よ
り６３９μｇ、非誘導ラット由来の腎臓より９１８μｇ
の総ＲＮＡを取得した。活性誘導ラット由来の総ＲＮＡ
溶液１５０μｌを６５℃で５分間熱処理し、直ちに氷冷
した。

【００９６】該溶液に、５Ｍ ＮａＣｌを０．５ｍｌお
よびＴＥ／ＮａＣｌ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、ＮａＣｌ ５００ｍＭ〕で平衡化したオリ
ゴｄＴセルロース（Collaborative research社、type
3）を０．１５ｇ加え、該セルロースに総ＲＮＡを吸着
させた。該セルロースをカラムに充填し、ＴＥ／ＮａＣ
ｌ液を８ｍｌ通塔し、洗浄した後、０．５ｍｌのＴＥ液
でｍＲＮＡを溶出し、溶出液を２００μｌずつ分画採取
した。

【００９７】該分画液より２μｌずつサンプリングし、
該サンプリング液に１μｇ／ｍｌのエチジュウムブロマ
イドを２０μｌ添加後、紫外線照射により光るサンプリ
ング液を検出した。該サンプリング液に相当する分画液
にエタノールを添加し、沈殿を得た。該沈殿を８０％エ
タノールで洗浄後、ＴＥ緩衝液に懸濁した。

【００９８】上記操作により、活性誘導ラット由来の腎
臓より１４．３μｇのｍＲＮＡを取得した。

【００９９】実施例３ ｃＤＮＡライブラリーの構築 Stratagene社製ＺＡＰ-ｃＤＮＡ synthesis kit（#2004
00）を用い、添付の説明書に従ってｃＤＮＡライブラリ
ーを構築した。実施例２で調製した活性誘導ラット由来
のｍＲＮＡを４μｇ用い、逆転写酵素反応により、firs
t strand ＤＮＡを合成し、ＲＮＡ分解酵素反応後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩでsecond strandＤＮＡを合成し
た。

【０１００】高温条件下でＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ反
応を行い、該ｃＤＮＡの端を平滑末端化した。該ｃＤＮ
ＡにＥｃｏＲＩアダプター断片を連結し、リン酸化後、
ＸｈｏＩで切断し、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩの切断サイト
を両端に持つｃＤＮＡ断片とした。該ｃＤＮＡ断片を、
ラムダＺＡＰIIのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、
Giga pack Gold Pakaging Kit（Stratagene社製）を用
いたパッケージング、大腸菌宿主ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｍ
ＲＦ'株とヘルパーファージＶＣＳ２５７を用いた、感
染により、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。

【０１０１】実施例４ 活性誘導ラットの腎臓で特異的
に発現しているｍＲＮＡ分子の選択 既に報告のあるラット由来ビタミンＤ₃・２５位水酸化
酵素、および２４位水酸化酵素についてアミノ酸配列を
解析し、これらＰ４５０ファミリーに属するビタミンＤ
₃水酸化酵素に良く保存されている領域のうち、酵素活
性に必須なアドレノドキシン結合領域（Ａ領域）、およ
び、ヘム結合領域（Ｈ領域）の部分アミノ酸配列を選択
し、そのＤＮＡ配列から、その部分の遺伝子をＰＣＲ増
幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプラ
イマーを設計した。

【０１０２】具体的には、センスプライマーとしてＡ領
域に相当する配列番号７に示された塩基配列を有するＤ
ＮＡを、アンチセンスプライマーとしてＨ領域に相当す
る配列番号８に示された塩基配列を有するＤＮＡを用い
た。Stratagene社製ＺＡＰ-ｃＤＮＡ synthesis kit（#
200400）および実施例２で取得した活性誘導ラット由来
のｍＲＮＡを４μｇ用い 、random hexamerをプライマ
ーとして、first strand ＤＮＡを合成した。

【０１０３】該first strand ＤＮＡをテンプレートと
して、 配列番号７に示された塩基配列を有するＤＮＡ
をセンスプライマーとして、配列番号８に示された塩基
配列を有するＤＮＡをアンチセンスプライマーとして用
い、Stratagene社製ＲＴ−ＲＣＲ ｋｉｔを利用して、
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、PERKIN ELMER社製のDNA Th
ermal Cycler480を用い、９４℃で３０秒間、４２℃で
１分間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして、３
５サイクル行った。

【０１０４】反応物をアガロースゲル電気泳動で解析し
たところ、２５５ｂｐの増幅断片（ＡＨ断片）が認めら
れた。該断片をアガロースより、ＤＮＡ purification
kit（Bio Rad社製）を用いて抽出しｐＣＲＩＩベクター
（Invitrogen社製）に挿入した。実施例２で取得した、
２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性
誘導を行ったラットおよび非誘導ラット由来の全ＲＮＡ
からポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを調製し、各々アガロース電気
泳動にかけ、泳動されたｍＲＮＡをアガロースからメン
ブレンフィルターへ常法によりトランスファーした。

【０１０５】これらメンブレンフィルターを用い、上記
増幅ＡＨ断片をプローブとしてノーザンハイブリダイゼ
ションを行った。上記増幅ＡＨ断片は、活性誘導を行っ
たラット由来のｍＲＮＡから作製したメンブレンフィル
ターを用いたときのみ、ハイブリダイズした。該ＡＨ断
片はＡ領域およびＨ領域に相応する塩基配列を有してい
た。

【０１０６】該ＡＨ断片を用い、ＢＲＬ社製３'ＲＡＣ
Ｅシステムキットを利用して、以下の方法で２５−ヒド
ロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードするＤ
ＮＡの３'側の非翻訳領域も含んだＰＣＲ増幅断片を得
た。ＢＲＬ社製３'ＲＡＣＥシステムキットに付属のOli
goｄＴ／ＡＵＡＰプライマーおよび、実施例２で取得し
た活性誘導を行ったラット由来のｍＲＮＡを４μｇ用い
ｃＤＮＡを合成させた。

【０１０７】該ｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。
上記で増幅されたＡＨ断片の有する配列から、配列番号
９で示された塩基配列を有するＤＮＡを合成し、センス
プライマーとして用いた。ＢＲＬ社製３'ＲＡＣＥシス
テムキットに付属のＡＵＡＰプライマーをアンチセンス
プライマーとして用いた。

【０１０８】上記テンプレート、センスプライマーおよ
びアンチセンスプライマーを用い、ＰＣＲを、９４℃で
１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の工程を１サ
イクルとし、３５サイクル行った。反応物をアガロース
ゲル電気泳動で解析したところ、１．３ｋｂの増幅断片
（Ａ３断片）が認められた。該断片をアガロースより、
ＤＮＡ purification kit（Bio Rad社製）を用いて抽出
し、ｐＣＲＩＩベクターに挿入した。

【０１０９】Ａ３断片もＡＨ断片と同様に、活性誘導ラ
ット由来のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズした。該
Ａ３断片はＡＨ断片のほぼ全長を含んでいた。

【０１１０】実施例５ ２５−ヒドロキシビタミンＤ₃
−１α−水酸化酵素をコードするＤＮＡの取得 実施例２で調製したｃＤＮＡライブラリー（ファージ）
を１シャーレ当たり、１から２万個のプラークが形成す
るように寒天培地上に塗布し、培養した。Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ⁺膜（Amersham社製）をプラークが形成したシャーレ
上に乗せ、プラークＤＮＡを該膜に転写した。シャーレ
１枚に付いて、２枚ずつの転写膜を作成した。

【０１１１】該転写膜を、アルカリ処理（１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸漬）およびＳＤＳ
処理（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液に浸漬）し、
洗浄後、乾燥させ、プラークＤＮＡが膜上に固定された
ブロッティング膜として、後述のハイブリダイズに用い
た。ＤＩＧラベリングキット（ベーリンガーマンハイム
社製 ＃1 175 033）および、ＡＨ断片またはＡ３断片各
々２ｎｇをテンプレートとして用い、ＰＣＲを行い、Ｄ
ＩＧラベル化したＡＨ断片またはＡ３断片を取得した。

【０１１２】ＰＣＲは、９４℃で１分間、５０℃で１分
間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして、３０サ
イクルの条件で行った。得られたＤＩＧラベル化ＡＨ断
片およびＤＩＧラベル化Ａ３断片を後述のプローブとし
て用いた。上記で調製したブロッティング膜を６０℃の
ハイブリ溶液〔５×ＳＳＣ、０．１％ Sarkosyl、０．
０２％ ＳＤＳ、１％ ハイブリ用ブロッキング試薬（ベ
ーリンガーマンハイム社製）〕に、５時間浸漬した後、
熱処理したＤＩＧラベルプローブ（１０μｌ／１０ｍｌ
ハイブリ溶液）を加え、６５℃で一夜ハイブリダイズし
た。

【０１１３】ハイブリダイズ後、膜の洗浄（２×ＳＳＣ
および０．１％ ＳＤＳを用い室温で５分間の洗浄を２
回、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用い６０
℃で１５分間の洗浄を２回実施）、ブロッキング〔１×
ブロッキング溶液（ベーリンガーマンハイム社製）、
０．１Ｍマレイン酸、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５
を用いて実施〕、ＡＰ標識した抗ＤＩＧ抗体との反応
（ベーリンガーマンハイム社プロトコールに準じて実
施）、アルカリ処理〔０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ９．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂を用いて実施〕を行い、ＤＩＧ発光検出キット（ベ
ーリンガーマンハイム社製 ＃1 363 514）を用いて、
プローブとハイブリダイズするプラークをＸ線フィルム
上でスクリーニングした。

【０１１４】このとき、ＤＩＧラベルプローブとしてま
ずＤＩＧラベル化ＡＨ断片を用い、該断片とハイブリダ
イズするプラークを選択し、次にＤＩＧラベル化Ａ３断
片を用い、該プラークより、該断片とハイブリダイズす
るプラークを選択した。各段階で選択されたプラーク
は、再度シャーレに撒き、ハイブリダイズすることを確
認した。また、Ａ領域、ＡＵＡＰの両プライマーを用い
たＰＣＲにより、該プラークがＡ３断片の塩基配列を有
することを確認した。

【０１１５】総計３５枚のシャーレを探索し、最終的に
４つのプラークを（Ｎｏ．２２１、５２２、４１１、１
１１）選択した。各プラーククローンからＤＮＡを抽出
し、Rapid excision kit（Stratagene社製、#211204）
を用いて、pBluescriptベクターに繋ぎ換え、Ｍ１３プ
ライマーを用いクローン中に挿入されたＤＮＡの塩基配
列を解析した。

【０１１６】Ｎｏ．２２１クローンによる解析により、
配列番号５に示された、２４６９ｂｐの塩基配列を有す
るＤＮＡが認められた。該ＤＮＡには、５０１アミノ酸
をコードするオープンリーディングフレーム（以下、Ｏ
ＲＦと略す）が認められ、Ｐ４５０ファミリータンパク
に共通するヘム結合領域、アドレノドキシン結合領域と
思われるアミノ酸配列が存在していた。

【０１１７】実施例６ 分離した２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子の動物細胞系での発
現 実施例５で記載したＮｏ．２２１クロ−ンより、プラス
ミッドを調製し、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断し
た。動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３（invitrogen
社製）を同様にＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断し
た。

【０１１８】上記で得られた切断断片、各々をアガロー
ス電気泳動にかけ、各々の断片を分離抽出した。得られ
たベクター側ＤＮＡ断片および挿入遺伝子断片をＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結し、連
結プラスミッドを取得した。該プラスミッドを用い大腸
菌ＤＨ５α株を形質転換し、アンピシリン耐性株を選択
し、公知の方法に準じてプラスミッドを抽出した。

【０１１９】該プラスミッドの制限酵素切断による解析
から、該プラスミッドが目的の遺伝子をが組み込んでい
ることを確認し、ｐＣＭＤ３Ｒと命名した。ｐＣＭＤ３
Ｒをエレクトロポーレイション法〔Potterら、Proc. Na
tl. Acad.Sci. USA., 81, 716(1984)〕により、動物細
胞に導入し、以下のように発現させた。 ＣＯＳ７細胞
を１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加したＤＭＥＭ培
地（GibcoBRL社製）を用い、ディッシュ中で２日間培養
した。

【０１２０】培養後、トリプシン処理によって、ディッ
シュから細胞を剥離させ、該細胞をＰＢＳを用いて洗浄
し、２〜６．０ｘ１０⁶／ｍｌになるように細胞をＫＰ
ＢＳ（１３７ｍＭ ＫＣｌ、２．７ｍＭ ＮａＣｌ、８．
１ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、４ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂）０．５ｍｌに懸濁した。該懸濁液および
ｐＣＭＤ３Ｒプラスミド １５μｇを溝幅０．４ｃｍのp
ulsercuvette（BIO-RAD社製）に加え、混合した後、エ
レクトロポーレイション装置Gene pulser（BIO-RAD社
製）を用い、９６０μＦ、０．２２ｋＶの条件で、パル
ス印加を行い、ＤＮＡを導入した。

【０１２１】該ＤＮＡ導入細胞を１０％ ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し、５％ＣＯ２インキュベ
ーター中、３７℃で４８〜７２時間培養した。ディッシ
ュの培養液を除いてＰＢＳで２回洗浄し、スクレーパー
で細胞をかきとり、遠心して細胞を集めた。

【０１２２】実施例７ ヒト由来２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ₃−１α−水酸化酵素遺伝子の取得 ヒト腎ガンより摘出した組織１．２ｇより、実施例２に
記載の方法に準じ、総ＲＮＡ７５０μｇを取得し、該総
ＲＮＡより９．５μｇのｍＲＮＡを取得した。該ｍＲＮ
Ａ ５μｇを用いて、実施例３に記載の方法に準じ、ヒ
トｃＤＮＡライブラリーを構築した。

【０１２３】実施例５に記載の方法に準じ、ヒト由来の
２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコ
ードするＤＮＡを取得した。実施例５において分離され
た２４６９ｂｐのラットビタミンＤ₃水酸化酵素遺伝子
の全長を、実施例５に記載の方法でＤＩＧラベル化した
ものをプローブとして用いた。

【０１２４】ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド
を４０％含むハイブリ溶液を用い、一晩、４２℃の条件
で行った。該ハイブリダイゼーションにより４つのクロ
−ンを選択した。実施例５に記載の方法に準じ、これら
クローンよりＤＮＡを抽出し、クローン中に挿入された
ＤＮＡの塩基配列を解析した。

【０１２５】該ＤＮＡは配列番号６に示された塩基配列
を有していた。該ＤＮＡ断片には、５０８アミノ酸のペ
プチドがコードされているＯＲＦが認められた。該ペプ
チドは、ラット由来の２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−
１α−水酸化酵と４１３アミノ酸残基ほど同じ配列を有
し、Ｐ４５０ファミリータンパクに共通する、ヘム結合
領域、アデレノドキシン結合領域と思われるアミノ酸配
列を有していた。

【０１２６】また、該ＤＮＡ配列は、ラット由来のもの
と１７２４残基同じ配列を有し、高い相同性が認められ
た。

【０１２７】実施例８ ラット由来ビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素遺伝子の発現と活性測定 実施例６の方法に準じエレクトロポーレイション法で、
ラット由来ビタミンＤ ₃−１α−水酸化酵素遺伝子を含
む遺伝子発現プラスミッドｐＣＭＤ３ＲをＣＯＳ-７細
胞へ導入した。該遺伝子導入細胞５×１０⁵を１０％Ｆ
ＣＳを含むＤＭＥＭ培地１０ｍｌ中で２４時間培養後、
培地を１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地８ｍｌに交換し、
［２６，２７−³Ｈ］−２５−ヒドロキシビタミンＤ
₃（Amersham社製）を２０００Ｂｑ／３μｌメタノール
溶液を加え、２４時間培養した。

【０１２８】培養後、該培養上清および細胞より、Blig
h＆Dyerの方法〔Can. J. Biochem.,37, 911 (1959)〕で
ビタミンＤ₃代謝産物を抽出した。即ち、５０ｍｌ用の
スクリューキャップ付きの遠心管に該培養液を移し、残
ったシャーレに１０ｍｌのメタノールを加え、スクレー
パーで細胞を掻きとり該遠心管に移した。再度該シャー
レにメタノール１０ｍｌを添加し、シャーレに残ってい
た細胞を懸濁後、該懸濁液を全て該遠心管に移した。

【０１２９】該遠心管にクロロホルム１０ｍｌを加えよ
く混合し、さらに、１０ｍｌのクロロホルムを加え、再
びよく混合後、静置し、クロロホルム層と水層とに分離
させた。分離されたクロロホルム層のクロロホルム抽出
液を別の遠心管に取り、残った水層に再びクロロホルム
１０ｍｌを加え、同様に混合抽出を行い、得られたクロ
ロホルム抽出液を、先に取得したクロロホルム抽出液と
合わせた。

【０１３０】該クロロホルム抽出液に、蒸留水を全容が
６０ｍｌになるまで加え、飽和食塩水を２滴添加後、充
分に混合した。該混合液を遠心分離し、クロロホルム層
と水層とに分離させた。得られたクロロホルム層の画分
を窒素ガス気流下で、濃縮し残滓を取得した。該残滓を
iso-プロパノール／メタノール／n-へキサン＝６：６：
８８の混合溶液４００μｌに溶解した。

【０１３１】ＪＡＳＣＯ社製ＨＰＬＣシステム８８０Ｐ
Ｕを用い、ＴＳＫsilicagel１５０カラム（４．６×２
５０ｍｍ、tosoh社製）を装着し、iso-プロパノール／
メタノール／n-へキサン＝６：６：８８の混合溶液を移
動相として、流速１ｍｌ／分の条件で分析した。標準物
質の流出時間との対比によって、ビタミンＤ₃代謝物の
同定を行った。

【０１３２】同様に、本遺伝子を含まないベクターｐｃ
ＤＮＡ３を用いてビタミンＤ₃代謝物の同定を行った。
結果を図１に示した。ＡがｐｃＭＤ３Ｒを導入した細胞
による代謝産物、ＢがｐｃＤＮＡ３を導入した細胞によ
る代謝産物の分析結果である。本発明の遺伝子を含むｐ
ｃＭＤ３Ｒを導入した細胞のみ、１α，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ₃が検出されたことより、この細胞のみ
が２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活
性を持つことが示され、本発明の遺伝子が２５−ヒドロ
キシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素をコードしている
ことが分かった。

【０１３３】

【発明の効果】本発明により、活性型ビタミンＤ₃の低
下により惹起される骨粗鬆症等の成人病の予防、診断、
治療等に有用な、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α
−水酸化酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込ん
で得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有す
る形質転換体、該形質転換体を用いた２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素の製造法、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポ
リペプチドを用いた１α，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃の製造法および該ポリペプチドを認識する抗体を提
供することができる。

【０１３４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５０１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ラット 組織の種類：腎臓 配列 Met Thr Gln Ala Val Lys Leu Ala Ser Arg Val Phe His Arg Val Gln 1 5 10 15 Leu Pro Ser Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Leu Arg Ser Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe Leu Ala Glu Leu Phe Cys Lys 35 40 45 Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu Gln Val His Gly Ala Ala Arg 50 55 60 Tyr Gly Pro Ile Trp Ser Gly Ser Phe Gly Thr Leu Arg Thr Val Tyr 65 70 75 80 Val Ala Asp Pro Ala Leu Val Glu Gln Leu Leu Arg Gln Glu Ser His 85 90 95 Cys Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Ser Trp Ser Glu His Arg Arg Arg 100 105 110 His Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr Ala Asp Gly Glu Glu Trp Gln 115 120 125 Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Arg Pro Gln Ala Ala 130 135 140 Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Asp Ser Val Val Ser Asp Leu Val Arg 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly Ser Gly Leu Pro Asp Leu Val 165 170 175 Leu Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys Phe Gly Leu Glu Gly Ile Gly 180 185 190 Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly Cys Leu Glu Ala Glu Val Pro 195 200 205 Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Glu Ala Val Gly Ser Val Phe Val Ser 210 215 220 Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro Ser Trp Leu His Arg Leu Ile Pro 225 230 235 240 Gly Pro Trp Ala Arg Leu Cys Arg Asp Trp Asp Gln Met Phe Ala Phe 245 250 255 Ala Gln Lys His Val Glu Gln Arg Glu Gly Glu Ala Ala Val Arg Asn 260 265 270 Gln Gly Lys Pro Glu Glu Asp Leu Pro Thr Gly His His Leu Thr His 275 280 285 Phe Leu Phe Arg Glu Lys Val Ser Val Gln Ser Ile Val Gly Asn Val 290 295 300 Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp Thr Val Ser Asn Thr Leu Ser 305 310 315 320 Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His Pro Glu Val Gln Ser Ala Leu 325 330 335 His Ser Glu Ile Thr Gly Ala Val Asn Pro Gly Ser Tyr Ala His Leu 340 345 350 Gln Ala Thr Ala Leu Ser Gln Leu Pro Leu Leu Lys Ala Val Ile Lys 355 360 365 Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val Pro Gly Asn Ser Arg Val Pro 370 375 380 Asp Arg Asp Ile Cys Val Gly Asn Tyr Val Ile Pro Gln Asp Thr Leu 385 390 395 400 Val Ser Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser Arg Asp Pro Ala Gln Phe Arg 405 410 415 Glu Pro Asn Ser Phe Asn Pro Ala Arg Trp Leu Gly Glu Gly Pro Ala 420 425 430 Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe Gly Phe Gly Lys Arg Ser Cys 435 440 445 Ile Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu Leu Gln Met Ala Leu Ala Gln 450 455 460 Ile Leu Thr His Phe Glu Val Leu Pro Glu Pro Gly Ala Leu Pro Val 465 470 475 480 Lys Pro Met Thr Arg Thr Val Leu Val Pro Glu Arg Ser Ile His Leu 485 490 495 Gln Phe Val Asp Arg 500

【０１３５】配列番号：２ 配列の長さ：５０８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：腎臓 配列： Met Thr Gln Thr Leu Lys Tyr Ala Ser Arg Val Phe His Arg Val Arg 1 5 10 15 Trp Ala Pro Glu Leu Gly Ala Ser Leu Gly Tyr Arg Glu Tyr His Ser 20 25 30 Ala Arg Arg Ser Leu Ala Asp Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe 35 40 45 Leu Ala Glu Leu Phe Cys Lys Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu 50 55 60 Gln Val Gln Gly Ala Ala His Phe Gly Pro Val Trp Leu Ala Ser Phe 65 70 75 80 Gly Thr Val Arg Thr Val Tyr Val Ala Ala Pro Ala Leu Val Glu Glu 85 90 95 Leu Leu Arg Gln Glu Gly Pro Arg Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Pro 100 105 110 Trp Thr Glu His Arg Arg Cys Arg Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr 115 120 125 Ala Glu Gly Glu Glu Trp Gln Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu 130 135 140 Leu Leu Arg Pro Gln Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Gly Thr Leu Asn Asn 145 150 155 160 Val Val Cys Asp Leu Val Arg Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly 165 170 175 Thr Gly Pro Pro Ala Leu Val Arg Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys 180 185 190 Phe Gly Leu Glu Gly Ile Ala Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly 195 200 205 Cys Leu Glu Ala Gln Val Pro Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Arg Ala 210 215 220 Val Gly Ser Val Phe Val Ser Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro His 225 230 235 240 Trp Leu Arg His Leu Val Pro Gly Pro Trp Gly Arg Leu Cys Arg Asp 245 250 255 Trp Asp Gln Met Phe Ala Phe Ala Gln Arg His Val Glu Arg Arg Glu 260 265 270 Ala Glu Ala Ala Met Arg Asn Gly Gly Gln Pro Glu Lys Asp Leu Glu 275 280 285 Ser Gly Ala His Leu Thr His Phe Leu Phe Arg Glu Glu Leu Pro Ala 290 295 300 Gln Ser Ile Leu Gly Asn Val Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp 305 310 315 320 Thr Val Ser Asn Thr Leu Ser Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His 325 330 335 Pro Glu Val Gln Thr Ala Leu His Ser Glu Ile Thr Ala Ala Leu Ser 340 345 350 Pro Gly Ser Ser Ala Tyr Pro Ser Ala Thr Val Leu Ser Gln Leu Pro 355 360 365 Leu Leu Lys Ala Val Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val 370 375 380 Pro Gly Asn Ser Arg Val Pro Asp Lys Asp Ile His Val Gly Asp Tyr 385 390 395 400 Ile Ile Pro Lys Asn Thr Leu Val Thr Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser 405 410 415 Arg Asp Pro Ala Gln Phe Pro Glu Pro Asn Ser Phe Arg Pro Ala Arg 420 425 430 Trp Leu Gly Glu Gly Pro Thr Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe 435 440 445 Gly Phe Gly Lys Arg Ser Cys Met Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu 450 455 460 Leu Gln Met Ala Leu Ala Gln Ile Leu Thr His Phe Glu Val Gln Pro 465 470 475 480 Glu Pro Gly Ala Ala Pro Val Arg Pro Lys Thr Arg Thr Val Leu Val 485 490 495 Pro Glu Arg Ser Ile Asn Leu Gln Phe Leu Asp Arg 500 505

【０１３６】配列番号：３ 配列の長さ：１５０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 組織の種類：腎臓 配列 ATG ACC CAG GCA GTC AAG CTC GCC TCC AGA GTC TTC CAT CGA GTC CAA 48 Met Thr Gln Ala Val Lys Leu Ala Ser Arg Val Phe His Arg Val Gln 1 5 10 15 CTG CCT TCT CAG CTG GGC AGT GAC TCG GTT CTC CGG AGT TTA TCT GAT 96 Leu Pro Ser Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Leu Arg Ser Leu Ser Asp 20 25 30 ATC CCT GGG CCC TCT ACA CCT AGC TTC CTG GCT GAA CTC TTC TGC AAA 144 Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe Leu Ala Glu Leu Phe Cys Lys 35 40 45 GGG GGG CTG TCC AGG CTA CAT GAA CTG CAG GTG CAT GGC GCT GCG CGG 192 Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu Gln Val His Gly Ala Ala Arg 50 55 60 TAC GGG CCA ATA TGG TCC GGC AGC TTC GGG ACA CTT CGC ACA GTT TAT 240 Tyr Gly Pro Ile Trp Ser Gly Ser Phe Gly Thr Leu Arg Thr Val Tyr 65 70 75 80 GTG GCC GAC CCT GCA CTT GTA GAG CAG CTC CTG CGA CAA GAA AGT CAT 288 Val Ala Asp Pro Ala Leu Val Glu Gln Leu Leu Arg Gln Glu Ser His 85 90 95 TGT CCA GAG CGC TGT AGT TTC TCA TCT TGG TCA GAG CAC CGT CGC CGC 336 Cys Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Ser Trp Ser Glu His Arg Arg Arg 100 105 110 CAC CAG CGG GCT TGC GGG TTG CTA ACG GCG GAT GGT GAA GAA TGG CAG 384 His Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr Ala Asp Gly Glu Glu Trp Gln 115 120 125 AGG CTC CGA AGT CTC CTG GCC CCG CTA CTC CTC CGA CCT CAA GCA GCC 432 Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Arg Pro Gln Ala Ala 130 135 140 GCC GGC TAT GCT GGA ACT CTG GAC AGC GTG GTC AGT GAC CTC GTG CGA 480 Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Asp Ser Val Val Ser Asp Leu Val Arg 145 150 155 160 CGA CTA AGG CGC CAG CGG GGA CGT GGC TCT GGG CTA CCG GAC CTA GTT 528 Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly Ser Gly Leu Pro Asp Leu Val 165 170 175 CTG GAC GTG GCG GGA GAG TTT TAC AAA TTT GGC CTA GAA GGC ATA GGC 576 Leu Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys Phe Gly Leu Glu Gly Ile Gly 180 185 190 GCG GTG CTG CTG GGA TCG CGC CTG GGC TGC CTG GAG GCT GAA GTT CCT 624 Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly Cys Leu Glu Ala Glu Val Pro 195 200 205 CCC GAC ACA GAA ACC TTC ATT GAG GCC GTG GGC TCG GTG TTT GTG TCT 672 Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Glu Ala Val Gly Ser Val Phe Val Ser 210 215 220 ACA CTC TTG ACC ATG GCA ATG CCC AGT TGG CTG CAC CGC CTT ATA CCC 720 Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro Ser Trp Leu His Arg Leu Ile Pro 225 230 235 240 GGA CCC TGG GCC CGC CTC TGC AGA GAC TGG GAT CAG ATG TTT GCC TTT 768 Gly Pro Trp Ala Arg Leu Cys Arg Asp Trp Asp Gln Met Phe Ala Phe 245 250 255 GCC CAG AAG CAC GTG GAG CAG CGC GAA GGC GAA GCT GCC GTG AGG AAC 816 Ala Gln Lys His Val Glu Gln Arg Glu Gly Glu Ala Ala Val Arg Asn 260 265 270 CAG GGA AAG CCT GAG GAG GAT TTG CCA ACG GGG CAT CAC TTA ACC CAC 864 Gln Gly Lys Pro Glu Glu Asp Leu Pro Thr Gly His His Leu Thr His 275 280 285 TTC CTT TTT CGG GAA AAG GTG TCT GTC CAG TCC ATA GTG GGA AAT GTG 912 Phe Leu Phe Arg Glu Lys Val Ser Val Gln Ser Ile Val Gly Asn Val 290 295 300 ACA GAG CTA CTA CTG GCT GGA GTG GAC ACG GTA TCC AAT ACG CTC TCC 960 Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp Thr Val Ser Asn Thr Leu Ser 305 310 315 320 TGG GCA CTC TAT GAG CTC TCC CGG CAC CCG GAA GTC CAG TCT GCA CTC 1008 Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His Pro Glu Val Gln Ser Ala Leu 325 330 335 CAC TCT GAG ATC ACA GGC GCT GTG AAC CCT GGC TCC TAT GCC CAC CTC 1056 His Ser Glu Ile Thr Gly Ala Val Asn Pro Gly Ser Tyr Ala His Leu 340 345 350 CAA GCC ACT GCT CTG TCC CAG CTA CCC CTG CTA AAG GCT GTG ATC AAA 1104 Gln Ala Thr Ala Leu Ser Gln Leu Pro Leu Leu Lys Ala Val Ile Lys 355 360 365 GAA GTG TTG AGA TTG TAC CCT GTG GTA CCT GGG AAC TCC CGT GTC CCA 1152 Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val Pro Gly Asn Ser Arg Val Pro 370 375 380 GAC AGA GAC ATC TGT GTA GGA AAC TAT GTT ATT CCC CAA GAT ACA CTG 1200 Asp Arg Asp Ile Cys Val Gly Asn Tyr Val Ile Pro Gln Asp Thr Leu 385 390 395 400 GTT TCC CTC TGT CAC TAT GCC ACT TCA AGG GAC CCC GCC CAG TTT CGG 1248 Val Ser Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser Arg Asp Pro Ala Gln Phe Arg 405 410 415 GAA CCC AAC TCT TTT AAT CCA GCT CGA TGG CTT GGA GAG GGT CCA GCC 1296 Glu Pro Asn Ser Phe Asn Pro Ala Arg Trp Leu Gly Glu Gly Pro Ala 420 425 430 CCC CAC CCA TTT GCA TCT CTT CCT TTT GGC TTT GGC AAA CGA AGT TGC 1344 Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe Gly Phe Gly Lys Arg Ser Cys 435 440 445 ATA GGG AGA CGC TTG GCA GAG CTC GAG CTA CAA ATG GCG TTG GCC CAG 1392 Ile Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu Leu Gln Met Ala Leu Ala Gln 450 455 460 ATC TTG ACC CAT TTT GAG GTG CTG CCT GAG CCA GGT GCT CTT CCA GTC 1440 Ile Leu Thr His Phe Glu Val Leu Pro Glu Pro Gly Ala Leu Pro Val 465 470 475 480 AAA CCC ATG ACC CGG ACT GTC CTG GTA CCT GAG AGG AGC ATC CAT CTC 1488 Lys Pro Met Thr Arg Thr Val Leu Val Pro Glu Arg Ser Ile His Leu 485 490 495 CAG TTT GTA GAC AGA 1503 Gln Phe Val Asp Arg 500

【０１３７】配列番号：４ 配列の長さ：2469 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：腎臓 配列 ATG ACC CAG ACC CTC AAG TAC GCC TCC AGA GTG TTC CAT CGC GTC CGC 48 Met Thr Gln Thr Leu Lys Tyr Ala Ser Arg Val Phe His Arg Val Arg 1 5 10 15 TGG GCG CCC GAG TTG GGC GCC TCC CTA GGC TAC CGA GAG TAC CAC TCA 96 Trp Ala Pro Glu Leu Gly Ala Ser Leu Gly Tyr Arg Glu Tyr His Ser 20 25 30 GCA CGC CGG AGC TTG GCA GAC ATC CCA GGC CCC TCT ACG CCC AGC TTT 144 Ala Arg Arg Ser Leu Ala Asp Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe 35 40 45 CTG GCC GAA CTT TTC TGC AAG GGG GGG CTG TCG AGG CTA CAC GAG CTG 192 Leu Ala Glu Leu Phe Cys Lys Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu 50 55 60 CAG GTG CAG GGC GCC GCG CAC TTC GGG CCG GTG TGG CTA GCC AGC TTT 240 Gln Val Gln Gly Ala Ala His Phe Gly Pro Val Trp Leu Ala Ser Phe 65 70 75 80 GGG ACA GTG CGC ACC GTG TAC GTG GCT GCC CCT GCA CTC GTC GAG GAG 288 Gly Thr Val Arg Thr Val Tyr Val Ala Ala Pro Ala Leu Val Glu Glu 85 90 95 CTG CTG CGA CAG GAG GGA CCC CGG CCC GAG CGC TGC AGC TTC TCG CCC 336 Leu Leu Arg Gln Glu Gly Pro Arg Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Pro 100 105 110 TGG ACG GAG CAC CGC CGC TGC CGC CAG CGG GCT TGC GGA CTG CTC ACT 384 Trp Thr Glu His Arg Arg Cys Arg Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr 115 120 125 GCG GAA GGC GAA GAA TGG CAA AGG CTC CGC AGT CTC CTG GCC CCG CTC 432 Ala Glu Gly Glu Glu Trp Gln Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu 130 135 140 CTC CTC CGG CCT CAA GCG GCC GCC CGC TAC GCC GGA ACC CTG AAC AAC 480 Leu Leu Arg Pro Gln Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Gly Thr Leu Asn Asn 145 150 155 160 GTA GTC TGC GAC CTT GTG CGG CGT CTG AGG CGC CAG CGG GGA CGT GGC 528 Val Val Cys Asp Leu Val Arg Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly 165 170 175 ACG GGG CCG CCC GCC CTG GTT CGG GAC GTG GCG GGG GAA TTT TAC AAG 576 Thr Gly Pro Pro Ala Leu Val Arg Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys 180 185 190 TTC GGA CTG GAA GGC ATC GCC GCG GTT CTG CTC GGC TCG CGC TTG GGC 624 Phe Gly Leu Glu Gly Ile Ala Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly 195 200 205 TGC CTG GAG GCT CAA GTG CCA CCC GAC ACG GAG ACC TTC ATC CGC GCT 672 Cys Leu Glu Ala Gln Val Pro Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Arg Ala 210 215 220 GTG GGC TCG GTG TTT GTG TCC ACG CTG TTG ACC ATG GCG ATG CCC CAC 720 Val Gly Ser Val Phe Val Ser Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro His 225 230 235 240 TGG CTG CGC CAC CTT GTG CCT GGG CCC TGG GGC CGC CTC TGC CGA GAC 768 Trp Leu Arg His Leu Val Pro Gly Pro Trp Gly Arg Leu Cys Arg Asp 245 250 255 TGG GAC CAG ATG TTT GCA TTT GCT CAG AGG CAC GTG GAG CGG CGA GAG 816 Trp Asp Gln Met Phe Ala Phe Ala Gln Arg His Val Glu Arg Arg Glu 260 265 270 GCA GAG GCA GCC ATG AGG AAC GGA GGA CAG CCC GAG AAG GAC CTG GAG 864 Ala Glu Ala Ala Met Arg Asn Gly Gly Gln Pro Glu Lys Asp Leu Glu 275 280 285 TCT GGG GCG CAC CTG ACC CAC TTC CTG TTC CGG GAA GAG TTG CCT GCC 912 Ser Gly Ala His Leu Thr His Phe Leu Phe Arg Glu Glu Leu Pro Ala 290 295 300 CAG TCC ATC CTG GGA AAT GTG ACA GAG TTG CTA TTG GCG GGA GTG GAC 960 Gln Ser Ile Leu Gly Asn Val Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp 305 310 315 320 ACG GTG TCC AAC ACG CTC TCT TGG GCT CTG TAT GAG CTC TCC CGG CAC 1008 Thr Val Ser Asn Thr Leu Ser Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His 325 330 335 CCC GAA GTC CAG ACA GCA CTC CAC TCA GAG ATC ACA GCT GCC CTG AGC 1056 Pro Glu Val Gln Thr Ala Leu His Ser Glu Ile Thr Ala Ala Leu Ser 340 345 350 CCT GGC TCC AGT GCC TAC CCC TCA GCC ACT GTT CTG TCC CAG CTG CCC 1104 Pro Gly Ser Ser Ala Tyr Pro Ser Ala Thr Val Leu Ser Gln Leu Pro 355 360 365 CTG CTG AAG GCG GTG GTC AAG GAA GTG CTA AGA CTG TAC CCT GTG GTA 1152 Leu Leu Lys Ala Val Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val 370 375 380 CCT GGA AAT TCT CGT GTC CCA GAC AAA GAC ATT CAT GTG GGT GAC TAT 1200 Pro Gly Asn Ser Arg Val Pro Asp Lys Asp Ile His Val Gly Asp Tyr 385 390 395 400 ATT ATC CCC AAA AAT ACG CTG GTC ACT CTG TGT CAC TAT GCC ACT TCA 1248 Ile Ile Pro Lys Asn Thr Leu Val Thr Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser 405 410 415 AGG GAC CCT GCC CAG TTC CCA GAG CCA AAT TCT TTT CGT CCA GCT CGC 1296 Arg Asp Pro Ala Gln Phe Pro Glu Pro Asn Ser Phe Arg Pro Ala Arg 420 425 430 TGG CTG GGG GAG GGT CCC ACC CCC CAC CCA TTT GCA TCT CTT CCC TTT 1344 Trp Leu Gly Glu Gly Pro Thr Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe 435 440 445 GGC TTT GGC AAG CGC AGC TGT ATG GGG AGA CGC CTG GCA GAG CTT GAA 1392 Gly Phe Gly Lys Arg Ser Cys Met Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu 450 455 460 TTG CAA ATG GCT TTG GCC CAG ATC CTA ACA CAT TTT GAG GTG CAG CCT 1440 Leu Gln Met Ala Leu Ala Gln Ile Leu Thr His Phe Glu Val Gln Pro 465 470 475 480 GAG CCA GGT GCG GCC CCA GTT AGA CCC AAG ACC CGG ACT GTC CTG GTA 1488 Glu Pro Gly Ala Ala Pro Val Arg Pro Lys Thr Arg Thr Val Leu Val 485 490 495 CCT GAA AGG AGC ATC AAC CTA CAG TTT TTG GAC AGA 1524 Pro Glu Arg Ser Ile Asn Leu Gln Phe Leu Asp Arg 500 505

【０１３８】配列番号：５ 配列の長さ：２４６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 組織の種類：腎臓 配列 GAGCAGACTC CTCAAACACA AAC ATG ACC CAG GCA GTC AAG CTC GCC TCC AGA 53 Met Thr Gln Ala Val Lys Leu Ala Ser Arg 1 5 10 GTC TTC CAT CGA GTC CAA CTG CCT TCT CAG CTG GGC AGT GAC TCG GTT 101 Val Phe His Arg Val Gln Leu Pro Ser Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val 15 20 25 CTC CGG AGT TTA TCT GAT ATC CCT GGG CCC TCT ACA CCT AGC TTC CTG 149 Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe Leu 30 35 40 GCT GAA CTC TTC TGC AAA GGG GGG CTG TCC AGG CTA CAT GAA CTG CAG 197 Ala Glu Leu Phe Cys Lys Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu Gln 45 50 55 GTG CAT GGC GCT GCG CGG TAC GGG CCA ATA TGG TCC GGC AGC TTC GGG 245 Val His Gly Ala Ala Arg Tyr Gly Pro Ile Trp Ser Gly Ser Phe Gly 60 65 70 ACA CTT CGC ACA GTT TAT GTG GCC GAC CCT GCA CTT GTA GAG CAG CTC 293 Thr Leu Arg Thr Val Tyr Val Ala Asp Pro Ala Leu Val Glu Gln Leu 75 80 85 90 CTG CGA CAA GAA AGT CAT TGT CCA GAG CGC TGT AGT TTC TCA TCT TGG 341 Leu Arg Gln Glu Ser His Cys Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Ser Trp 95 100 105 TCA GAG CAC CGT CGC CGC CAC CAG CGG GCT TGC GGG TTG CTA ACG GCG 389 Ser Glu His Arg Arg Arg His Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr Ala 110 115 120 GAT GGT GAA GAA TGG CAG AGG CTC CGA AGT CTC CTG GCC CCG CTA CTC 437 Asp Gly Glu Glu Trp Gln Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu Leu 125 130 135 CTC CGA CCT CAA GCA GCC GCC GGC TAT GCT GGA ACT CTG GAC AGC GTG 485 Leu Arg Pro Gln Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Asp Ser Val 140 145 150 GTC AGT GAC CTC GTG CGA CGA CTA AGG CGC CAG CGG GGA CGT GGC TCT 533 Val Ser Asp Leu Val Arg Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly Ser 155 160 165 170 GGG CTA CCG GAC CTA GTT CTG GAC GTG GCG GGA GAG TTT TAC AAA TTT 581 Gly Leu Pro Asp Leu Val Leu Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys Phe 175 180 185 GGC CTA GAA GGC ATA GGC GCG GTG CTG CTG GGA TCG CGC CTG GGC TGC 629 Gly Leu Glu Gly Ile Gly Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly Cys 190 195 200 CTG GAG GCT GAA GTT CCT CCC GAC ACA GAA ACC TTC ATT GAG GCC GTG 677 Leu Glu Ala Glu Val Pro Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Glu Ala Val 205 210 215 GGC TCG GTG TTT GTG TCT ACA CTC TTG ACC ATG GCA ATG CCC AGT TGG 725 Gly Ser Val Phe Val Ser Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro Ser Trp 220 225 230 CTG CAC CGC CTT ATA CCC GGA CCC TGG GCC CGC CTC TGC AGA GAC TGG 773 Leu His Arg Leu Ile Pro Gly Pro Trp Ala Arg Leu Cys Arg Asp Trp 235 240 245 250 GAT CAG ATG TTT GCC TTT GCC CAG AAG CAC GTG GAG CAG CGC GAA GGC 821 Asp Gln Met Phe Ala Phe Ala Gln Lys His Val Glu Gln Arg Glu Gly 255 260 265 GAA GCT GCC GTG AGG AAC CAG GGA AAG CCT GAG GAG GAT TTG CCA ACG 869 Glu Ala Ala Val Arg Asn Gln Gly Lys Pro Glu Glu Asp Leu Pro Thr 270 275 280 GGG CAT CAC TTA ACC CAC TTC CTT TTT CGG GAA AAG GTG TCT GTC CAG 917 Gly His His Leu Thr His Phe Leu Phe Arg Glu Lys Val Ser Val Gln 285 290 295 TCC ATA GTG GGA AAT GTG ACA GAG CTA CTA CTG GCT GGA GTG GAC ACG 965 Ser Ile Val Gly Asn Val Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp Thr 300 305 310 GTA TCC AAT ACG CTC TCC TGG GCA CTC TAT GAG CTC TCC CGG CAC CCG 1013 Val Ser Asn Thr Leu Ser Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His Pro 315 320 325 330 GAA GTC CAG TCT GCA CTC CAC TCT GAG ATC ACA GGC GCT GTG AAC CCT 1061 Glu Val Gln Ser Ala Leu His Ser Glu Ile Thr Gly Ala Val Asn Pro 335 340 345 GGC TCC TAT GCC CAC CTC CAA GCC ACT GCT CTG TCC CAG CTA CCC CTG 1109 Gly Ser Tyr Ala His Leu Gln Ala Thr Ala Leu Ser Gln Leu Pro Leu 350 355 360 CTA AAG GCT GTG ATC AAA GAA GTG TTG AGA TTG TAC CCT GTG GTA CCT 1157 Leu Lys Ala Val Ile Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val Pro 365 370 375 GGG AAC TCC CGT GTC CCA GAC AGA GAC ATC TGT GTA GGA AAC TAT GTT 1205 Gly Asn Ser Arg Val Pro Asp Arg Asp Ile Cys Val Gly Asn Tyr Val 380 385 390 ATT CCC CAA GAT ACA CTG GTT TCC CTC TGT CAC TAT GCC ACT TCA AGG 1253 Ile Pro Gln Asp Thr Leu Val Ser Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser Arg 395 400 405 410 GAC CCC GCC CAG TTT CGG GAA CCC AAC TCT TTT AAT CCA GCT CGA TGG 1301 Asp Pro Ala Gln Phe Arg Glu Pro Asn Ser Phe Asn Pro Ala Arg Trp 415 420 425 CTT GGA GAG GGT CCA GCC CCC CAC CCA TTT GCA TCT CTT CCT TTT GGC 1349 Leu Gly Glu Gly Pro Ala Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe Gly 430 435 440 TTT GGC AAA CGA AGT TGC ATA GGG AGA CGC TTG GCA GAG CTC GAG CTA 1397 Phe Gly Lys Arg Ser Cys Ile Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu Leu 445 450 455 CAA ATG GCG TTG GCC CAG ATC TTG ACC CAT TTT GAG GTG CTG CCT GAG 1445 Gln Met Ala Leu Ala Gln Ile Leu Thr His Phe Glu Val Leu Pro Glu 460 465 470 CCA GGT GCT CTT CCA GTC AAA CCC ATG ACC CGG ACT GTC CTG GTA CCT 1493 Pro Gly Ala Leu Pro Val Lys Pro Met Thr Arg Thr Val Leu Val Pro 475 480 485 490 GAG AGG AGC ATC CAT CTC CAG TTT GTA GAC AGA TAGTCCTGTG GAAGGCAGCT 1546 Glu Arg Ser Ile His Leu Gln Phe Val Asp Arg 495 500 GTCATCATCT CTCTCCAGAC TGGATTTTTC TTACTATGCA CAAGAGGCAC ACTCTCCCTC 1606 GAGGCCTGTC TGTCTGAGCA AACTTCAGGA AGCAGGCCCG GGCCTATCTG TGCTTGACCT 1666 GACTCAGCAG GTACCACAGA ACCAGGATCC TTTCTCCTGC TCAGTACCTC TCCTGATCAT 1726 TCCTCAAGAT CCAAAGCCTT CAGATTTTAA CACATCCTTA AAGGGCCAAC TCGGGGGTTA 1786 ACTAACAGCC CCAGGCAGCC TGGGCAGGGA TCCCCCACTG ATCCTTCCAT GCTTACAGTG 1846 TTCACTGACA GCTGTCTAAG CATCCATTGC AGCACAAACT AAGTGACTGT GCACCTGGTC 1906 TGCACCTGGT CTGCACCTGG TTGCGTCTCT GCCTGACCAT GTGAGCTCTT TGAGAAGAGT 1966 GATGACTACT GGGCTTTTAG CTCTTTTCCT TTTTGGGACA CAGTCTTGCT ATTGTACTCC 2026 ATGCTGTCCT TGAACCCACA AGCCCTCACC TCACCTTCCC AAGTGTTGGG TTACGGACAT 2086 TAGCTATGGC TTCCAGCTTT ATTAGTCTTT CTATCTCCTG CCATGGTCTA TCCCCGGCTA 2146 TTTGATACTA TATATTCTCA GATTGAATCT GGACCATGTG GTAGAAGGGA TGACCACTCA 2206 CCAGGCTCTA CCCACCACTT TATCTTAATC TTTTCTCTAG GAAAGTGAAT CTCTCCTTGC 2266 CTTACAGCAT TTTAAAGCTC CCCTTGGCTG TTCTGCTCTT TAGCCACTCT AAAGTGGATC 2326 CACTCTACTT CTCACCACCC ATCTTTCTGC ACCCCAGCCT GTCTTTTTAT ATTTAAAAAA 2386 TTGTATTTAT TATGTTTTCA AATAAAATGT TTACTCCTTG AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2446 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2469

【０１３９】配列番号：６ 配列の長さ：2469 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：腎臓 配列 AGGAGGGATT GGCTGAGGAG CTTGGAGAGG GGGCGTCATC ACCTCACCCA AAGGTTAAAT 60 AGGGGTTGAG ATATGATGCT CAGGAGAAGC GCTTTCTTTC GCGAGCACCC TGAACCAGAC 120 C ATG ACC CAG ACC CTC AAG TAC GCC TCC AGA GTG TTC CAT CGC GTC CGC 169 Met Thr Gln Thr Leu Lys Tyr Ala Ser Arg Val Phe His Arg Val Arg 1 5 10 15 TGG GCG CCC GAG TTG GGC GCC TCC CTA GGC TAC CGA GAG TAC CAC TCA 217 Trp Ala Pro Glu Leu Gly Ala Ser Leu Gly Tyr Arg Glu Tyr His Ser 20 25 30 GCA CGC CGG AGC TTG GCA GAC ATC CCA GGC CCC TCT ACG CCC AGC TTT 265 Ala Arg Arg Ser Leu Ala Asp Ile Pro Gly Pro Ser Thr Pro Ser Phe 35 40 45 CTG GCC GAA CTT TTC TGC AAG GGG GGG CTG TCG AGG CTA CAC GAG CTG 313 Leu Ala Glu Leu Phe Cys Lys Gly Gly Leu Ser Arg Leu His Glu Leu 50 55 60 CAG GTG CAG GGC GCC GCG CAC TTC GGG CCG GTG TGG CTA GCC AGC TTT 361 Gln Val Gln Gly Ala Ala His Phe Gly Pro Val Trp Leu Ala Ser Phe 65 70 75 80 GGG ACA GTG CGC ACC GTG TAC GTG GCT GCC CCT GCA CTC GTC GAG GAG 409 Gly Thr Val Arg Thr Val Tyr Val Ala Ala Pro Ala Leu Val Glu Glu 85 90 95 CTG CTG CGA CAG GAG GGA CCC CGG CCC GAG CGC TGC AGC TTC TCG CCC 457 Leu Leu Arg Gln Glu Gly Pro Arg Pro Glu Arg Cys Ser Phe Ser Pro 100 105 110 TGG ACG GAG CAC CGC CGC TGC CGC CAG CGG GCT TGC GGA CTG CTC ACT 505 Trp Thr Glu His Arg Arg Cys Arg Gln Arg Ala Cys Gly Leu Leu Thr 115 120 125 GCG GAA GGC GAA GAA TGG CAA AGG CTC CGC AGT CTC CTG GCC CCG CTC 553 Ala Glu Gly Glu Glu Trp Gln Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ala Pro Leu 130 135 140 CTC CTC CGG CCT CAA GCG GCC GCC CGC TAC GCC GGA ACC CTG AAC AAC 601 Leu Leu Arg Pro Gln Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Gly Thr Leu Asn Asn 145 150 155 160 GTA GTC TGC GAC CTT GTG CGG CGT CTG AGG CGC CAG CGG GGA CGT GGC 649 Val Val Cys Asp Leu Val Arg Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Arg Gly 165 170 175 ACG GGG CCG CCC GCC CTG GTT CGG GAC GTG GCG GGG GAA TTT TAC AAG 697 Thr Gly Pro Pro Ala Leu Val Arg Asp Val Ala Gly Glu Phe Tyr Lys 180 185 190 TTC GGA CTG GAA GGC ATC GCC GCG GTT CTG CTC GGC TCG CGC TTG GGC 745 Phe Gly Leu Glu Gly Ile Ala Ala Val Leu Leu Gly Ser Arg Leu Gly 195 200 205 TGC CTG GAG GCT CAA GTG CCA CCC GAC ACG GAG ACC TTC ATC CGC GCT 793 Cys Leu Glu Ala Gln Val Pro Pro Asp Thr Glu Thr Phe Ile Arg Ala 210 215 220 GTG GGC TCG GTG TTT GTG TCC ACG CTG TTG ACC ATG GCG ATG CCC CAC 841 Val Gly Ser Val Phe Val Ser Thr Leu Leu Thr Met Ala Met Pro His 225 230 235 240 TGG CTG CGC CAC CTT GTG CCT GGG CCC TGG GGC CGC CTC TGC CGA GAC 889 Trp Leu Arg His Leu Val Pro Gly Pro Trp Gly Arg Leu Cys Arg Asp 245 250 255 TGG GAC CAG ATG TTT GCA TTT GCT CAG AGG CAC GTG GAG CGG CGA GAG 937 Trp Asp Gln Met Phe Ala Phe Ala Gln Arg His Val Glu Arg Arg Glu 260 265 270 GCA GAG GCA GCC ATG AGG AAC GGA GGA CAG CCC GAG AAG GAC CTG GAG 985 Ala Glu Ala Ala Met Arg Asn Gly Gly Gln Pro Glu Lys Asp Leu Glu 275 280 285 TCT GGG GCG CAC CTG ACC CAC TTC CTG TTC CGG GAA GAG TTG CCT GCC 1033 Ser Gly Ala His Leu Thr His Phe Leu Phe Arg Glu Glu Leu Pro Ala 290 295 300 CAG TCC ATC CTG GGA AAT GTG ACA GAG TTG CTA TTG GCG GGA GTG GAC 1081 Gln Ser Ile Leu Gly Asn Val Thr Glu Leu Leu Leu Ala Gly Val Asp 305 310 315 320 ACG GTG TCC AAC ACG CTC TCT TGG GCT CTG TAT GAG CTC TCC CGG CAC 1129 Thr Val Ser Asn Thr Leu Ser Trp Ala Leu Tyr Glu Leu Ser Arg His 325 330 335 CCC GAA GTC CAG ACA GCA CTC CAC TCA GAG ATC ACA GCT GCC CTG AGC 1177 Pro Glu Val Gln Thr Ala Leu His Ser Glu Ile Thr Ala Ala Leu Ser 340 345 350 CCT GGC TCC AGT GCC TAC CCC TCA GCC ACT GTT CTG TCC CAG CTG CCC 1225 Pro Gly Ser Ser Ala Tyr Pro Ser Ala Thr Val Leu Ser Gln Leu Pro 355 360 365 CTG CTG AAG GCG GTG GTC AAG GAA GTG CTA AGA CTG TAC CCT GTG GTA 1273 Leu Leu Lys Ala Val Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Val Val 370 375 380 CCT GGA AAT TCT CGT GTC CCA GAC AAA GAC ATT CAT GTG GGT GAC TAT 1321 Pro Gly Asn Ser Arg Val Pro Asp Lys Asp Ile His Val Gly Asp Tyr 385 390 395 400 ATT ATC CCC AAA AAT ACG CTG GTC ACT CTG TGT CAC TAT GCC ACT TCA 1369 Ile Ile Pro Lys Asn Thr Leu Val Thr Leu Cys His Tyr Ala Thr Ser 405 410 415 AGG GAC CCT GCC CAG TTC CCA GAG CCA AAT TCT TTT CGT CCA GCT CGC 1417 Arg Asp Pro Ala Gln Phe Pro Glu Pro Asn Ser Phe Arg Pro Ala Arg 420 425 430 TGG CTG GGG GAG GGT CCC ACC CCC CAC CCA TTT GCA TCT CTT CCC TTT 1465 Trp Leu Gly Glu Gly Pro Thr Pro His Pro Phe Ala Ser Leu Pro Phe 435 440 445 GGC TTT GGC AAG CGC AGC TGT ATG GGG AGA CGC CTG GCA GAG CTT GAA 1513 Gly Phe Gly Lys Arg Ser Cys Met Gly Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu 450 455 460 TTG CAA ATG GCT TTG GCC CAG ATC CTA ACA CAT TTT GAG GTG CAG CCT 1561 Leu Gln Met Ala Leu Ala Gln Ile Leu Thr His Phe Glu Val Gln Pro 465 470 475 480 GAG CCA GGT GCG GCC CCA GTT AGA CCC AAG ACC CGG ACT GTC CTG GTA 1609 Glu Pro Gly Ala Ala Pro Val Arg Pro Lys Thr Arg Thr Val Leu Val 485 490 495 CCT GAA AGG AGC ATC AAC CTA CAG TTT TTG GAC AGA TAGTCCCATG GAAAGAG 1662 Pro Glu Arg Ser Ile Asn Leu Gln Phe Leu Asp Arg 500 505 ACTGTCATCA TCACCCTTTC ATTCATCATA GGGATAAGAT TTTTTGTAGG CACAAGACCA 1722 AGGTATACAT CTTCCCCTAA TGCCTATCTG ACCAAACTGG ATAGAACCAC CATAGTGAAG 1782 TGTGAGGCGG CCCTGACCAA TGTGTGAAGT ATGCACTTGG CCTGACTCAG GAAGCCAGGT 1842 GAGAAAACCA TGGTCTCTCT GCTTGCTTGG CCCTTCTGAT CATGTATGCA TCCCCCAAGG 1902 ATGAAATCAG ATTTTAACTA ATAATGCTGG ATGGCCTGAG GAAAGATTCA ACTGCCTCTC 1962 TTTTTGGGCT TTCATAGTGT TCATTGATGC TGCTGGCTAA GCATTTATCA AAGCATAAGC 2022 TCAGTAACTG TGCATCTGGT CTGTACCTGG TTGGTCCTTC GTCTTTGCAT GTAAGCTCTT 2082 TGAGAGGAAG GGTGAAGCCT TATTTGTTTT TTATGTCCCC TGCCAGGGCC TGTCTCTGAC 2142 TAGGTGTCAC CATACACATT CTTAGATTGA ATCTGAACCA TGTGGCAGAA GGGATAAGCA 2202 GCTTACTTAG TAGGCTCTGT CTACCCCCTT CCTTCTTTGT CTTGCCCCTA GGAAGGTGAA 2262 TCTGCCCTAG CCTGGTTTAC GGTTTCTTAT AACTCTCCTT TGCTCTCTGG CCACTATTAA 2322 GTGGGTTTGC CCCATCACTT AGTTCTCAGG CAGAGACATC TTTGGGCCTG TCCCTGCCCA 2382 GGCCTCTGGC TTTTTATATT GAAAATTTTT AAATATTCAC AAATTTTAGA ATAAATCAAA 2442 TATTCCATTA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2469

【０１４０】配列番号：７ 配列の長さ： 23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CTSCTSAARG CHGTSATYAA RGA 23

【０１４１】配列番号：８ 配列の長さ： 22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CKCTTBCCRA ABCCRAARGG VA 22

【０１４２】配列番号：９ 配列の長さ： 25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 AAGGCAGTGA TTAAGGAAGT GTTGA 25

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐｃＭＤ３Ｒを導入した細胞またはｐｃＤＮＡ
３を導入した細胞によるビタミンＤ₃代謝物の同定をＨ
ＰＬＣを用いて行った結果を示した図である。

【符号の説明】

Ａ：ｐｃＭＤ３Ｒを導入した細胞によるビタミンＤ₃代
謝物の同定結果 Ｂ：ｐｃＤＮＡ３を導入した細胞によるビタミンＤ₃代
謝物の同定結果 (1)：２５−ヒドロキシビタミンＤ₃ (2)：２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃ (3)：10-oxo-19-nor-２５−ヒドロキシビタミンＤ₃ (4)：α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 33/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 猿田 享男 東京都大田区上池台３−28−２ (72)発明者 石村 ▲巽▼ 東京都三鷹市下連雀７−７−14 (72)発明者 林 松彦 東京都渋谷区神宮前４−15−９ (72)発明者 脇野 修 東京都練馬区石神井台７−12−14 (72)発明者 門川 俊明 東京都中野区中野１−21−10 (72)発明者 吉田 理 東京都目黒区緑ヶ丘３−10−24 (72)発明者 鈴木 洋通 東京都板橋区中丸町36−10

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１および２で表わされるアミノ
   酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ド、または配列番号１および２で表わされるアミノ酸配
   列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのア
   ミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしく
   は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ２５−ヒドロキ
   シビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素活性を有するポリペ
   プチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ＤＮＡが、配列番号３および４で表わさ
   れる塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡであ
   る、請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または３記載のＤＮＡをベクタ
   ーに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡを保有す
   る形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
   し、培養物中に２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−
   水酸化酵素を生成蓄積させ、該培養物より該２５−ヒド
   ロキシビタミンＤ₃−１α−水酸化酵素を採取すること
   を特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−１α−水
   酸化酵素の製造法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドおよび２５
   −ヒドロキシビタミンＤ₃を水性媒体中に存在させるこ
   とにより、水性媒体中に１α，２５−ジヒドロキシビタ
   ミンＤ₃を生成させ、生成した１α，２５−ジヒドロキ
   シビタミンＤ₃を該水性媒体中より採取することを特徴
   とする、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃の製造
   法。
8. 【請求項８】 請求項１記載のポリペプチドを認識する
   抗体。
9. 【請求項９】 請求項８記載の抗体を用いる、２５−ヒ
   ドロキシビタミンＤ ₃−１α−水酸化酵素活性を有する
   ポリペプチドの免疫学的検出法。
10. 【請求項１０】 請求項８記載の抗体を用いる、免疫組
    織染色法。
11. 【請求項１１】 請求項８記載の抗体を含有する、免疫
    組織染色剤。