DE69122016T2

DE69122016T2 - Mitochondriales P450

Info

Publication number: DE69122016T2
Application number: DE69122016T
Authority: DE
Inventors: Megumi Akiyoshi; Hideo Ohkawa; Toshiyuki Sakaki; Yoshiyasu Yabusaki
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1990-09-26
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: DE69122016D1; EP0477961A2; EP0477961A3; US5668000A; EP0477961B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression des Mitochondrien- Proteins P450 in Hefe. Das Mitochondrien-Protein P450 umfaßt ein chimäres P450-Protein, bei dem die am N-Terminus eines mitochondrialen Säuger-P450- Proteins vorhandene Signalsequenz durch die Signalsequenz eines mitochondrialen Hefe-Proteins ersetzt worden ist, sowie ein chimäres P450- Protein, bei dem letztere Signalsequenz weiter durch eine Signalsequenz für den Protein-Transport zu Mikrosomen ersetzt worden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Gene, die den Vorläufer des mitochondrialen Ratten-Leber-Proteins P450c25 codieren, bzw. ein chimäres P450-Protein, bei dem das reife P450c25-Protein mit 29 Aminosäure-Resten verbunden ist, wobei man annimmt, daß diese die Signalsequenz der Untereinheit IV der Hefe- Cytochrom-c-Oxidase (COXIV) für den Transport dieses Proteins zu Mitochondrien bilden, bzw. ein chimäres P450-Protein, bei dem sich ein reifes P450c25-Protein an eine Signalsequenz anschließt, die 15 N-terminale Aminosäue-Reste des Rinder-Nebennieren-Proteins P45017α umfaßt, wobei man annimmt, daß es sich um die Signalsequenz für den Protein-Transport zu Mikrosomen handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Expressionsplasmid zur Produktion des Enzyms in großem Umfang, einen das Expressionsplasmid enthaltenden rekombinanten Hefe-Stamm, ein Verfahren zur Enzym- Produktion unter Verwendung des rekombinanten Hefe-Stamms sowie ein Verfahren zur Produktion von 5β-Cholestan-3α,7α,12α,27-Tetrol (nachstehend als TeHC bezeichnet), 25-Hydroxyvitamin D&sub3; und 1α, 25-Dihydroxyvitamin D&sub3;.
Der in der vorliegenden Patentbeschreibung verwendete Begriff "chimäres P450-Protein" bedeutet ein P450-Protein, das am N-Terminus eine Fremd- Signalsequenz zum Protein-Transport und am C-Terminus ein reifes mitochondriales P450-Protein umfaßt.
P450 ist ein Hämoprotein, das in biologischen Systemen von Mikroorganismen bis Säugetieren weit verbreitet ist und als letztes Enzym von Elektronentransportketten bei verschiedenen lipophilen als Substrat dienenden Verbindungen eine Monooxidation katalysiert.
Als letztes Enzym von Eiektronentransportketten besitzt P450 verschiedene molekulare Formen, die unterschiedliche Substratspezifitäten besitzen und daher die Hydroxylierung verschiedenster lipophiler Verbindungen katalysieren können. P450-abhängige Elektronentransportketten in Säugetieren werden in zwei Gruppen eingeteilt, nämlich in den mikrosomalen und den mitochondrialen Typ.
In Mikrosomen überträgt NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase (Reduktase), die im Molekül Flavin-adenin-dinucleotid und Flavin-mononucleotid als Cofaktoren enthält, Elektronen von NADPH auf P450. In Mitochondrien übertragen NADPH-Ferredoxin-Reduktase, die im Molekül Flavin-adenindinucleotid als Cofaktor enthält, und Ferredoxin, das im Molekül Nichthäm- Eisen als Cofäktor enthält, Elektronen von NADPH auf P450.
Durch die Produktion verschiedener mikrosomaler P450-Proteine und -Reduktasen in Hefe und die Verwendung der entsprechenden rekombinanten Hefe-Stämme sind den Erfindern der vorliegenden Erfindung bereits industriell anwendbare Hydroxylierungen gelungen.
D.h., durch die Isolierung von Genen für das Ratten-Leber-Protein P450c sowie die Rinder-Nebennieren-Proteine P45017α bzw. P450c21, die Herstellung von Expressionsplasmiden, die die jeweiligen Gene enthielten, und die Transformation von Hefe mit den Expressionsplasmiden (Japanische Patente Kokai (Offenlegung) 56072/1986, 47380/1989 und 31680/1990) sind Hefe-Stämme erhalten worden, die die Enzyme produzieren.
Diese Hefe-Stämme zeigen je nach den darin produzierten molekularen P450-Formen Monooxygenase-Aktivität.
Durch Isolierung des Gens für Ratten-Leber-Reduktase bzw. des Gens für Hefe-Reduktase (Japanische Patente Kokai (Offenlegung) 19085/1987 und 51525/1990) ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung auch die Expression von Enzymen mit P450-Reduktase-Fähigkeit in Hefe gelungen.
Überdies ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung auch die Erzeugung eines Hefe-Stammes gelungen, der sowohl das P450-Protein als auch die Reduktase (Japanisches Patent Kokai (Offenlegung) 104582/1987) als auch neuartige Monooxygenasen produziert, die die Funktionen beider Enzyme aufweisen (Japanische Patente Kokai (Offenlegung) 44888/1988 und 23870/1990 sowie die Japanische Patentanmeldung 71250/1989).
Mittels dieser Verfahren haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung mit diesen P450-produzierenden Hefe-Stämmen erfolgreich Acetaminophen oder Zwischenprodukte von Steroidhormonen hergestellt, die sich als Arzneimittel verwenden lassen.
Andererseits ist das mitochondriale P450-Protein an vielen biologischen Reaktionen beteiligt, bei denen physiologisch wichtige Verbindungen, wie z.B. aktives Vitamin D&sub3; und Steroidhormone, synthetisiert werden. Deshalb hat die Erzeugung eines Hefe-Stammes, der die mitochondriale Molekülform von P450 produziert, große industrielle Anwendungsmöglichkeiten.
Bisher ist jedoch die Expression eines aktiven mitochondrialen P450- Proteins in Hefe noch nicht beschrieben worden.
Zur Expression einer aktiven mitochondrialen P450-abhängigen Monooxygenase sind neben P450 außerdem zwei weitere Enzyme erforderlich, nämlich Ferredoxin und Ferredoxin-Reduktase.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher den Versuch unternommen, zur Expression des mitochondrialen P450-Proteins und der aktiven mitochondrialen P450-abhängigen Monooxygenase in Hefe einen Bioreaktor zu erzeugen.
Das Ratten-Leber-Protein P450c25, das ein mitochondriales P450-Protein ist, wird als 533 Aminosäuren umfassender Vorläufer im Cytoplasma synthetisiert und dann zu den Mitochondrien transportiert. Während dieser Prozesse werden am Amino-Terminus 32 Aminosäuren entfernt, die als Signalsequenz für den Protein-Transport zu den Mitochondrien wirken, wobei an der Mitochondrien- Membran ein 501 Aminosäuren umfassendes reifes P450c25-Protein (Molekulargewicht 57 KD) erhalten wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits festgestellt, daß bei Expression eines mitochondrialen Rinder-Nebennieren-Proteins in Hefe der Austausch seines Signalpeptid-Teils gegen das Signalpeptid der Unterheit IV der Hefe-Cytochrom c-Oxidase (nachstehend als COXIV bezeichnet) die exprimierte Proteinmenge deutlich steigert (Japanische Patentanmeldung 136496/1990).
Zur Konstruktion eines Expressionsplasmids wurde das Gen für das Ratten- Leber-Protein P450c25 oder ein Gen, das ein chimäres P450-Protein (COX-C25) codiert, wobei die eigene Signalsequenz gegen die COXIV-Signalsequenz ausgetauscht worden war, mit der stromabwärts vom Promotor eines Hefe- Alkoholdehydrogenase (ADH)-Gens gelegenen Sequenz verbunden. Mit diesen Expressionsplasmiden transformierte Hefe-Stämme produzierten Häm enthaltende P450-Proteine.
Es stellte sich auch heraus, daß das so produzierte P450c25-Protein bzw. chimäre P450-Protein (COX-C25) in die Hefe-Mitochondrien transportiert und dort zu seinen reifen Formen prozessiert wurde. In Kombination mit Rinder- Nebennieren-Adrenodoxin (nachstehend als ADX bezeichnet) und Rinder- Nebennieren-NADPH-Adrenodoxinreduktase (nachstehend als ADR bezeichnet) gelang es außerdem, mittels des aus den transformierten Hefe-Stämmen partiell aufgereinigten P450c25-Proteins bzw. chimären P450-Proteins (COX-C25) aus THC TeHC oder aus 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; 1α, 25-Dihydroxyvitamin D&sub3; zu produzieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem ein Plasmid zur Expression des chimären P450 (17α-c25)-Proteins konstruiert, bei dem die Signalsequenz für den Protein-Transport zu Mitochondrien durch die 15 N- terminalen Aminosäuren des Rinder-Nebennieren-Proteins P45017α ersetzt wurde, wobei man annimmt, daß diese die Signalsequenz des P45017α-Proteins für den Transport des Proteins zu Mikrosomen bildet, um die Produktion des per se in Mitochondrien vorhandenen Enzyms durch Verlagerung seiner Position in Mikrosomen zu erhöhen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch ein Plasmid zur gleichzeitigen Expression des chimären P450 (17α-c25)-Proteins, des reifen ADX-Proteins und des reifen ADR-Proteins konstruiert, wodurch eine neuartige Elektronentransportkette konstruiert wird, wobei sich das chimäre P450 (17α- c25)-Protein auf der mikrosomalen Membran und ADX sowie ADR im Cytoplasma befinden, und Monooxygenase-Aktivität erhalten wird. Dabei werden die drei Enzyme mit unterschiedlichen Promotoren und Terminatoren exprimiert, da die Verwendung des gleichen Promotors und des gleichen Terminators während der Züchtung der rekombinanten Hefe eine Rekombination im Plasmid bewirken würde.
Es stellte sich heraus, daß alle erfindungsgemäß in Hefe exprimierten Proteine, d.h. P450c25, chimäres P450 (COX-c25) und chimäres P450 (17α-c25), gegenüber THC, Vitamin D&sub3; und 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; Hydroxylierungsaktivität zeigten und deshalb aktive Formen darstellten. Das Hefe- Expressionssystem läßt sich daher zur Expression von mitochondrialem P450- Protein einsetzen.
Insbesondere das Gen für das chimäre P450 (17α-c25)-Protein produziert eine große Menge an Enzym und besitzt hohe Aktivität.
Während das P450c25-Protein und das chimäre P450 (COX-c25)-Protein in Hefe-Mitochondrien exprimiert wurden, befand sich das gesamte exprimierte chimäre P450 (17α-c25)-Protein in der mikrosomalen Fraktion. Die aus dem P45017α-Protein stammenden 15 N-terminalen Aminosäure-Reste erfüllten daher die Funktion einer Signalsequenz für den Transport des chimären P450 (17α-c25)-Proteins in die Mikrosomen-Membranen der Hefe und das P450c25- Protein, das per se ein Mitochondrien-Membranprotein ist, wurde erfolgreich in Hefe-Mikrosomen exprimiert.
Die produzierte Menge an chimärem P450 (17α-c25)-Protein betrug etwa 2 x 10&sup5; Moleküle/Zelle. Durch den Austausch der Signalsequenz gelang es, die produzierte Proteinmenge etwa 4-fach zu erhöhen. Bei Zugabe von ADX und ADR zur Fraktion zeigte die Mikrosomen-Fraktion außerdem gegenüber THC, Vitamin D&sub3; und 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; eine hohe Hydroxylierungsaktivität.
Insbesondere die Hydroxylierungsaktivität des in der Mikrosomen-Fraktion befindlichen chimären P450 (17α-c25)-Proteins gegenüber 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; war weit höher als die Aktivität des ursprünglich in der Mitochondrien- Fraktion vorhandenen reifen P450c25-Proteins, das 501 Aminosäuren umfaßt.
Den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelang auch die Konstruktion einer neuartigen Elektronentransportkette auf Hefe-Mikrosomenmembranen von NADPH zum chimären P450 (17α-c25)-Protein über ADX und ADR, da der Stamm zur gleichzeitigen Expression von chimärem P450 (17α-c25)-Protein, ADX und ADR Monooxygenase-Aktivität zeigte.
Der Stamm kann daher als einfacher Bioreaktor verwendet werden, wobei die Hydroxylierung von Steroid-Verbindungen oder aktivem Vitamin D&sub3; in einem Schritt durchgeführt wird.
Insbesondere lassen sich mit diesem Stamm Reaktionsprodukte leicht gewinnen, indem der Mikroorganismen-Kultur ein Substrat zugegeben und nach einer bestimmten Zeitspanne eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel oder einem ähnlichen Lösungsmittel durchgeführt wird, so daß sich der Stamm als Bioreaktor verwenden läßt.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsplasmids pAC25.
Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte von pAC25.
Figur 3 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsplasmids pAC253, wobei die Restriktionsstellen wie folgt dargestellt sind: Ec = EcoRI, Nc = NcoI, Sc = SacI, Hd = HindIII, Nt = NotI, Ps = PstI. In der Figur stellt den codierenden Bereich des Gens für das Ratten-Leber-Protein P450c25 dar, den codierenden Bereich des Gens für die Untereinheit IV der Hefe-Cytochrom c-Oxidase und P sowie T bedeuten den ADH-Promotor bzw. -Terminator.
Figur 4 ist eine Restriktionskarte von pACC253.
Figur 5 ist eine graphische Darstellung, die das Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsplasmids pAMS25 veranschaulicht, wobei die Spaltstellen von Restriktionsenzymen wie folgt dargestellt sind: E = EcoRI, Nc = NcoI, S = SacI, H = HindIII, P = PstI, N = NotI; und
Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die das Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsplasmids pRXMS25 veranschaulicht, wobei die Spaltstellen der Restriktionsenzyme wie folgt dargestellt sind: H = HindIII und N = NotI.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer erläutert.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete cDNA, die das Ratten-Leber- Protein P450c25 codiert, ist wohlbekannt und kann mittels üblicher Verfahren isoliert werden. Der Signalsequenz-Teil für den Protein-Transport in Mitochondrien kann durch eine Signalsequenz eines anderen Mitochondrien- Proteins, wie z.B. von COXIV oder einem ähnlichen Protein, ersetzt werden. In diesem Fall wird das P450-Protein in die Mitochondrien transportiert. Wenn diese Signalsequenz andererseits durch ein Signal für den Transport zu Mikrosomen ersetzt wird, wird P450 in Mikrosome transportiert. Als Signal für den Transport zu Mikrosomen kann nicht nur die Signalsequenz des Rinder- Nebennieren-Proteins P45017α verwendet werden, sondern auch das Transport-Signal anderer mikrosomaler P450-Proteine.
Als reifes mitochondriales P450-Protein, das am C-Terminus des erfindungsgemäßen chimären P450-Proteins vorhanden ist, kann außerdem nicht nur das Ratten-Leber-Protein P450c25 verwendet werden, sondern es können auch andere mitochondriale P450-Proteine eingesetzt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten cDNAs, die das COXIV- Protein bzw. Rinder-Nebennieren-Protein P45017α codieren, sind wohlbekannt und können mit Hilfe üblicher Verfahren isoliert werden.
Das Expressionsplasmid zur Expression des chimären P450 (17a-c25)- Proteins kann beispielsweise konstruiert werden, indem man die der N- terminalen Aminosäuresequenz des Rinder-Nebennieren-Proteins P45017α entsprechende cDNA synthetisiert, diese mit dem das reife Ratten-Leber- Protein P450c25 codierenden cDNA-Bereich verbindet und das Gen in den Hefe- Expressionsvektor pAAH5 insertiert, der den Promotor und Terminator des Hefe-Alkoholdehydrogenase I-Gens (nachstehend als ADH bezeichnet) enthält (vgl. Methods in Enzymology 101, Teil C, 192-201).
Das Plasmid zur gleichzeitigen Expression der drei Enzyme kann konstruiert werden, indem man die Expressionseinheiten des reifen ADR-Proteins und reifen ADX-Proteins in das Plasmid zur Expression von chimärem P450 (17α- c25)-Protein insertiert. Promotor und Terminator sind nicht auf ADH beschränkt, sondern können Promotoren und Terminatoren sein, die in Hefe wirksam funktionieren. Zur gleichzeitigen Expression der drei Enzyme werden nicht der gleiche Promotor bzw. Terminator verwendet, sondern vorzugsweise unterschiedliche Promotoren bzw. Terminatoren, da dann nach Züchtung die Wahrscheinlichkeit einer Plasmid-Rekombination sehr gering ist. Die Position oder Orientierung der drei in die Expressionseinheit zu insertierenden Enzym- Gene hat kaum Einfluß auf die Menge der exprimierten Enzyme.
Als Wirt wird Hefe verwendet, wobei der Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae AH22 bevorzugt ist.
Die Transformation von Hefe als Wirt durch das Expressionsplasmid kann mittels wohlbekannter Verfahren durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung eines Alkali-Metalls (LiCl) oder von Protoplasten. Die erfindungsgemäß erhaltene transformierte Hefe kann mit Hilfe üblicher Verfahren in einem normalen Kulturmedium gezüchtet werden, das Glucose, Stickstoff-Quellen oder dergleichen enthält. Durch Züchtung der so erhaltenen transformierten Hefe-Stämme können dann das P450c25-Protein und das chimäre P450-Protein produziert werden.
In den Beispielen wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben, ohne daß besonders erwähnt werden muß, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1 Konstruktion des Expressionsplasmides pAC25

In den folgenden Beispielen wurden Reaktionen, wie die Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, die Dephosphorylierung von DNA mit alkalischer Phosphatase und die Ligierung von DNAs mit DNA-Ligase, im allgemeinen in einem Reaktionsvolumen von 20 µl- 200 µl unter den Reaktionsbedingungen durchgeführt, die, soweit nicht anders angegeben, in den den jeweiligen Enzym-Produkten beigefügten Anweisungen der Hersteller (z.B. Takara Shuzo Co., Ltd.) beschrieben sind. Das Plasmid zur Expression des Ratten-Leber- Proteins P450c25 wurde mittels des in Figur 1 gezeigten Verfahrens konstruiert.
Das Plasmid pLMT25, das das Gen für das Ratten-Leber-Protein P450c25 enthält (Usui et al., FEBS Lett. 262 (1990), 135-138) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI doppelt gespalten. Das ca. 320 bp große EcoRI-SacI-Fragment, das den Amino-terminalen Bereich des P450c25-Proteins codierte, und das ca. 1580 bp große SacI-EcoRI-Fragment, das den Carboxyterminalen Bereich codierte, wurden mittels Elektrophorese auf einem Gel mit bei niedriger Temperatur erstarrender Agarose gewonnen. Diese Fragmente wurden in die EcoRI- und SacI-Spaltstellen des im Handel erhältlichen Plasmidvektors pUC19 subcloniert, wobei die Plasmide pUC25N bzw. pUC25C erhalten wurden. Ein etwa 2880 bp großes Fragment, das durch Doppelspaltung von pUC25N mit EcoRI und NcoI erhalten worden war, und der synthetische Linker LC252:
der an den rechten und linken Enden EcoRI- und NcoI-Erkennungsstellen und zwischen den beiden Enden eine HindIII-Erkennungsstelle aufweist, wurden ligiert und damit wurde der E. coli-Stamm HB101 transformiert.
Zur Gewinnung des gewünschten Plasmids, in das der synthetische Linker insertiert worden war, wurde aus den so erhaltenen Transformanten Plasmid- DNA mit Hilfe des Verfahrens von Birnboim und Doly isoliert und durch Spaltung mit Restriktionsenzymen analysiert. Ferner wurde die Sequenz des synthetischen Linker-Teils durch Bestimmung der Basensequenz bestätigt. Das so erhaltene Plasmid wurde als pUC25NH bezeichnet.
Das den Carboxy-terminalen Bereich von P450c25 codierende Plasmid pUC25C wurde mit NcoI gespalten, die überhängenden Enden wurden mit einem im Handel erhältlichen HindIII-Linke aufgefüllt und ligiert und anschließend wurde damit der E. coli-Stamm HB101 transformiert. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA isoliert. Ein Plasmid, bei dem im nicht-codierenden 3q Bereich von P450c25 eine HindIII-Restriktionsstelle erzeugt worden war, wurde als pUC25CH bezeichnet.
Fragmente von etwa 270 bp und 1370 bp, die durch Doppelspaltung von pUC25NH bzw. pUC25CH mit HindIII und SacI erhalten worden waren, wurden mit dem im Handel erhältlichen Plasmidvektor PUC 18 ligiert, der mit HindIII gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Damit wurde dann der E.coli-Stamm HB101 transformiert. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA isoliert. Ein Plasmid, das die beiden aus pUC25NH und pUC25CH stammenden DNA-Fragmente enthielt, wurde als pUC25H bezeichnet. pUC25H wurde mit HindIII gespalten und danach wurde ein cDNA-Fragment von ca. 1640 bp isoliert, das den Vorltoufer des Ratten-Leber-Proteins P450c25 codierte. Nach Ligierung dieses Fragmentes mit dem Hefe-Expressionsvektor pAAH5N, der mit HindIII gespalten und danach mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (Japanische Patentanmeldung 202785/1988), wurde der E.coli- Stamm HB101 transformiert. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA isoliert und die DNA-Struktur wurde mittels Restriktionsenzym-Spaltung bestätigt. Das Plasmid, bei dem das Gen für das Ratten-Leber-Protein P450c25 in der richtigen Orientierung zwischen ADH-Promotor und -Terminator insertiert worden war, wurde als pAC25 bezeichnet.

Beispiel 2 Konstruktion des Expressionplasmides pACC253

Es wird auf Figur 3 verwiesen.
Das Plasmid pUC25N, das das den Amino-terminalen Bereich des Ratten- Leber-Proteins P450c25 codierende Gen enthält, wurde mit PstI und SacI doppelt gespalten, wobei ein Fragment von etwa 150 bp gewonnen wurde. Dieses Fragment, der synthetische Linker LC253:
der am rechten bzw. linken Ende HindIII- und PstI-Erkennungsstellen aufweist, und das HindIII-SacI-Fragment des im Handel erhältlichen Vektors pUC19 wurden ligiert und damit wurde der E. coli-Stamm HB101 transformiert. Aus den so erhaltenen Transformanten wurde Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsenzym-Spaltung analysiert, wobei das gewünschte Plasmid erhalten wurde, in das das Fragment und der synthetische Linker insertiert worden waren. Weiterhin wurde die Sequenz des synthetischen Linker-Teils durch Bestimmung der Basensequenz bestätigt. Das so erhaltene Plasmid wurde als pBSCC253 bezeichnet. Das Plasmid und das vorstehend erwähnte Plasmid pUC25CH wurden mit HindIII und SacI doppelt gespalten. Ein das Signalpeptid von COXIV und den Amino-terminalen Teil des P450c25-Proteins codierendes DNA-Fragment (ca. 260 bp) und ein den Carboxy-terminalen Teil des P450c25- Proteins codierendes DNA-Fragment (ca. 1370 bp) wurden getrennt gewonnen. Mit diesen Fragmenten und dem HindIII-Fragment des im Handel erhältlichen Plasmidvektors pUC18 wurde eine Dreifach-Ligierung durchgeführt und anschließend wurde der E. coli-Stamm HB101 transformiert. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA isoliert und mittels Restriktionsenzym- Spaltung analysiert, wobei das Plasmid pUCC253H erhalten wurde, in das die Fragmente insertiert worden waren. Zur Herstellung eines modifizierten cDNA-Fragmentes (ca. 1630 bp) des Ratten-Leber-P450c25-Gens wurde pUCC253H mit HindIII gespalten. Das Fragment wurde mit dem Hefe- Expressionsvektor pAAH5N ligiert, der mit HindIII gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (Japanische Patentanmeldung 202785/1988). Damit wurde dann der E. coli-Stamm HB101 transformiert. Die Struktur der aus Transformanten isolierten Plasmid-DNA wurde bestätigt. Das Plasmid, in dem das modifizierte Gen für das Ratten-Leber-Protein P450c25 in der richtigen Orientierung zwischen ADH-Promotor und -Terminator insertiert worden war, wurde als pACC253 bezeichnet.

Beispiel 3 Konstruktion des Expressionsplasmides pAMS25 und des zur gleichzeitigen Expression von Proteinen dienenden Plasmides pRXMS25

Das Plasmid pAMS25 zur Expression des chimären P450 (17α-c25)-Proteins wurde entsprechend Figur 5 konstruiert.
Das Plasmid pUC25N, das für das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pAC25 zur Expression des Ratten-Leber-Proteins P450c25 verwendet worden war, wurde mit PstI partiell und danach mit EcoRI vollständig gespalten. In das erhaltene DNA-Fragment wurde ein synthetischer Linker mit der Sequenz:
insertiert. Aus dem so erhaltenen Plasmid wurde ein HindIII-SacI-Fragment isoliert. Aus pUC25CH wurde auch ein SacI-HindIII-Fragment isoliert und doppelt in die HindIII-Restriktionsstelle von pUC19 insertiert, wobei das Plasmid pUMS25 erhalten wurde.
Anschließend wurde das Expressionsplasmid pAMS25 konstruiert, indem das aus PUMS25 erhaltene HindIII-Fragment in die HindIII-Restriktionsstelle des Vektors pAAH5N insertiert wurde.
Durch Insertion eines das reife ADX-Protein (in der japanischen Patentanmeldung 136496/1990 beschrieben) codierenden HindIII-Fragmentes zwischen den PGK-Promotor und -Terminator des Vektors pGAHN (der anstelle des ADH-Promotors und -Terminators von Vektor pAAH5N den PGK-Promotor und -Terminator enthält; beschrieben in der Japanischen Patentanmeldung 136496/1990) wurde das Expressionsplasmid pGX erhalten. Durch Insertion eines HindIII-Fragmentes, das das reife ADR-Protein (in dem Japanischen Patent Kokai 112986/1988 beschrieben) codiert, zwischen den GAP-Promotor und -Terminator des Vektors pPAHN (der anstelle des ADH-Promotors und -Terminators von Vektor pAAH5N den GAP-Promotor und -Terminator enthält; Japanisches Patent Kokai (Offenlegung) 112986/1988) wurde auch pPR erhalten. Das Plasmid pRX5 zur gleichzeitigen Expression von ADR und ADX wurde erhalten, indem ein durch partielle NotI-Spaltung von pPR erhaltenes DNA-Fragment mit dem von pGX erhaltenen NotI-Fragment ligiert wurde. Danach wurde pRX5 mit NotI partiell gespalten und mit einem von pAMS25 erhaltenen NotI-Fragment (3,7 kb) ligiert, wobei das Plasmid pRXMS25 zur gleichzeitigen Expression des chimären P450c25-Proteins und von ADX und ADR erhalten wurde (vgl. Figur 6).

Beispiel 4 Transformation von Hefe mit Expressionsplasmiden

Saccharomyces cerevisiae AH22 (ATCC 38626) wurde in 5 ml YPD- Kulturmedium (1% Hefe-Extrakt, 2% Polypepton, 2% Glucose) 18 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Dann wurden Hefezellen durch Zentrifugation von 1 ml Kultur gesammelt. Die Hefezellen wurden mit 1 ml einer 0,2 M LiCl-Lösung gewaschen und danach in 20 µl einer 1 M LiCl-Lösung suspendiert.
Zu dieser Suspension wurden 30 µl einer 70%-igen Polyethylenglykol 4000- Lösung und 10 µl einer das entsprechende Expressionsplasmid (etwa 1 µg DNA) enthaltenden Lösung gegeben. Das Gemisch wurde gut gerührt und 1 h bei 30ºC inkubiert. Danach wurden dem Gemisch 140 µl Wasser zugegeben. Mit dem erhaltenen Gemisch wurden Platten mit dem synthetischen SD-Kulturmedium (2% Glucose, 0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 µg/ml Histidin, 2% Agar) beimpft. Anschließend erfolgte eine 3-tägige Inkubation bei 30ºC, wobei Transformanten erhalten wurden, die das Plasmid enthielten.

Beispiel 5 Produktion des P450c25-Proteins und des chimären P450c25- Proteins

Die in Beispiel 4 erhaltenen Stämme AH22/pAC25, AH22/pACC253, AH22/pAMS25 und AH22/pRXMS25 wurden in 300 ml synthetischem Kulturmedium (8% Glucose, 5,4% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 160 µg/ml Histidin) bis zu einer Dichte von etwa 2 x 10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die rekombinanten Hefezellen gesammelt, mit 100 mM Kaliurnphosphat (pH 7,0) gewaschen und in 2 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert. Eine 1 ml-Portion der Suspension wurde jeweils auf zwei Küvetten verteilt, in die die Proben enthaltenden Küvetten wurde Kohlenmonoxid eingeblasen und danach wurden 5 mg - 10 mg Dithionit in jede Küvette gegeben. Nach ausgiebigem Rühren der Gemische wurden die unterschiedlichen Spektren bei Wellenlängen von 400 nm - 500 nm gemessen. Auf der Basis von Δ&epsi; (450 nm - 490 nm) = 91 mM&supmin;¹ cm&supmin;¹ wurde die Menge des Häm-enthaltenden P450-Proteins berechnet.
Dabei stellte sich heraus, daß die Stämme AH22/pAC25, AH22/pACC253, AH22/pAMS25 und AH22/pRXMS25 Häm-haltige P450-Proteine in Mengen von 5 x 10&sup4; Molekülen pro Zelle, 3 x 10&sup4; Molekülen pro Zelle, 2 x 10&sup5; Molekülen pro Zelle bzw. 1 x 10&sup5; Molekülen pro Zelle produzierten. Andererseits wurde im Kontrollstamm AH22/PAAH5 keine Produktion von Häm-haltigem P450-Protein festgestellt.

Beispiel 6 Bestimmung der Hydroxylierungsaktivitäten an Position 25 von 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; und an Position 27 von THC

Zur Bestimmung der Hydroxylierungsaktivitäten wurden eine aus dem Stamm AH22/pAC25 hergestellte Mitochondrien-Fraktion und eine aus dem Stamm AH22/pAMS25 hergestellte Mikrosomen-Fraktion verwendet. Aus einem transformierten Hefe-Stamm wurden nach dem folgenden Verfahren subzelluläre Fraktionen hergestellt. Zur Herstellung von Sphäroblasten wurden aus einer etwa 2 x 10&sup7; Zellen/ml enthaltenden Kultur etwa 4 x 10¹&sup0; Zellen gesammelt, in einer Zymolyase enthaltenden Lösung [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,0 M Sorbit, 0,1 mM Dithiothreit, 0,1 mM EDTA, 0,3 mg/ml Zymolyase 100T] suspendiert und 1 Stunde bei 30ºC inkubiert. Zum Aufschluß der Zellen wurden die Sphäroblasten in einem Ultraschallbehandlungs-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,65 M Sorbit, 0,1 mM Dithiotreit, 0,1 mM EDTA, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin) suspendiert und mit einer Teflon- Homogenisierungsvorrichtung homogenisiert.
Durch 5-minütige Zentrifugation bei 3000 x g wurde ein Präzipitat 1 entfernt, wobei ein Überstand 1' erhalten wurde. Das Präzipitat 1 wurde in einem Ultraschallbehandlungs-Puffer resuspendiert, erneut homogenisiert und 5 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert, wobei das Präzipitat 1 (nichtaufgeschlossene Zellen und Kern-Fraktionen) und der Überstand 1" erhalten wurden. Der die Überstände 1' und 1" umfassende Überstand 1 wurde 20 Minuten bei 10 000 x g weiter zentrifugiert, wobei das Präzipitat 2 (Mitochondrien-Fraktion) und der Überstand 2 erhalten wurde. Der Überstand 2 wurde 70 Minuten bei 120 000 x g weiter zentrifugiert, wobei das Präzipitat 3 (Mikrosomen-Fraktion) und der Überstand 3 (lösliche Fraktion) erhalten wurden.
Die im folgenden gezeigten Reaktionssysteme (2 ml) wurden bis auf NADPH gemischt und 5 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von NADPH eingeleitet. Nach 5 Minuten und 10 Minuten wurden den jeweiligen Reaktionsiösungen Aliquots von 0,5 ml entnommen. Den entnommenen Proben wurden 5 ml Benzol zugegeben. Die durch Zentrifugation erhaltene Benzol-Phase wurde vollständig getrocknet und mittels HPLC unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen untersucht.

[Reaktionssystem]

1. Mitochondrien-Fraktion: Stamm AH22/pAC25 (enthält 0,1 nMol P450c25- Protein),
Mikrosomen-Fraktion: Stamm AH22/pAMS25 (enthält 0,8 nMol chimäres P450 (17a-c25)-Protein),
2. Rinder-Nebennieren-Adrenodoxinreduktase 0,8 nMol,
3. Rinder-Nebennieren-Adrenodoxin 8,0 nMol,
4. Substrat Endkonzentration 200 µM,
5. NADPH Endkonzentration 1,0-2,0 mM,
6. Tris-HCl (pH 7,8) 100,0 mM,
7. EDTA 0,5- 1,0 mM.

[HPLC-Analysebedingungen]

Säule: µBondapak C18 ( 4 x 300 mm),
Nachweis: A265 (1α-Hydroxyvitamin D&sub3;), Radioaktives Nachweismittel (³H-THC),
Durchflußgeschwindigkeit: 1,0 ml/min,
Temperatur: 50ºC,
Elutionsbedingungen
0-5 min: Lösung aus 80% Acetonitril und 20% Wasser
5 - 15 min: linearer Acetonitril-Gradient in Konzentrationen von 80% - 100%
15 - 25 min: 100% Acetonitril
Bei Verwendung von 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; als Substrat wurde das 25- hydroxylierte Produkt in der Mitochondrien-Fraktion des Stammes AH22/pAC25 und in der Mikrosomen-Fraktion des Stammes AH22/pAMS25 festgestellt. Andererseits wurden bei dem Kontrollstamm AH22/pAAH5 keine 25- hydroxylierten Produkte festgestellt. Das deutet darauf hin, daß die Hydroxylierungs-Aktivitäten von dem P450c25-Protein und dem chimären P450 (17α-c25)-Protein abhängig sind.
Außerdem wurde bei Abwesenheit sowohl von NADPH, ADX als auch ADR keinerlei Aktivität nachgewiesen, so daß man annehmen kann, daß sich die Hydroxylierungs-Aktivitäten erst mit dem Zusammenbau der Elektronentransportkette NADPH T ADR T P450c25-Protein oder chimäres P450 (17α-c25)-Protein, die sich nach Zugabe von NADPH, ADX und ADR bildete, zeigten.
In der Mikrosomen-Fraktion des Stammes AH22/pAMS25 betrug die berechnete Wechselzahl 7,4 mol/mol P450/min. Dabei stellte sich heraus, daß die Geschwindigkeit etwa 50-mal höher war als die berechnete Wechselzahl für die Mitochondrien-Fraktion des Stammes AH22/pAC25, die 0,14 mol/mol P450/min betrug. Bei Verwendung von [³H]-THC als Substrat wurde in der Mitochondrien-Fraktion des Stammes AH22/pAC25 und in der Mikrosomen- Fraktion des Stammes AH22/pAMS25 eine Umwandlung von THC in das 27- hydroxylierte Produkt (TeHC) festgestellt. Im Kontrollstamm AH22/pAAH5 konnte keine Aktivität festgestellt werden. Das deutete darauf hin, daß die Aktivität von dem P450c25-Protein und dem chimären P450 (17α-c25)-Protein abhing. Die für die Mitochondrien-Fraktion des Stammes AH22/pAC25 und die Mikrosomen-Fraktion des Stammes AH22/pAMS25 berechneten Wechselzahlen betrugen 20 mol/mol P450/min bzw. 23 mol/mol P450/min.

Beispiel 7 Bestimmung der 27-Hydroxylierungsaktivität des Stammes AH22/ pRXMS25, der gleichzeitig drei Enzyme exprimiert, gegenüber THC

Einer Kultur des Stammes AH22/ pRXMS25 (1,6 x 10&sup7; Zellen/ml) wurde [³H]- THC bis zu einer Endkonzentration von 10 µM zugegeben. Dann wurde die Inkubation fortgesetzt. Nach 14-stündiger Züchtung wurde der Kultur eine 1 ml-Portion entnommen und mit 2 ml Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wurde bis zur Trockene eingedampft und in 80 µl Acetonitril gelöst, wobei 50 µl davon mittels HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 beschrieben, analysiert wurden. Dabei stellte sich heraus, daß 19% des zugegebenen THC-Substrats in TeHC umgewandelt worden waren. Eine solche Umwandlung konnte im Kontrollstamm AH22/pAAH5 nicht festgestellt werden, was zeigte, daß das chimäre P450c25- Protein, ADX und ADR eine Elektronentransportkette bildeten und im Stamm AH22/pRXMS25 Monooxygenase-Aktivität zeigten.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte transformierte Hefe produzierte das das Häm im Molekül enthaltende P450c25-Protein und das chimäre P450c25- Protein.
Nach Zugabe der Rinder-Nebennieren-Proteine ADX und ADR zeigten das P450c25-Protein und das chimäre P450c25-Protein gegenüber Vitamin D&sub3; und 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; 25-Hydroxylierungsaktivität und gegenüber THC 27- Hydroxylierungsaktivität.
Obwohl P450c25 ein Protein ist, das per se in der Innenmembran von Mitochondrien vorhanden ist, gelang in Hefe-Zellen seine Verlagerung aus Mitochondrien in Mikrosomen, indem das Signal für den Transport zu Mitochondrien entfernt und 15 N-terminale Aminosäure-Reste angelagert wurden, die aus dem mikrosomalen P45017α-Protein stammten, welches als Signal zum Transport in die Mikrosomen-Membran wirkt. Eine solche Verlagerung eines Membran-Enzyms ist in der Literatur bisher noch nicht beschrieben worden. Obwohl die 15 Aminosäure-Reste am N-Terminus des P45017α-Proteins stark hydrophob sind und man davon ausgeht, daß sie als Signalsequenz für den Proteintransport in die Mikrosomen-Membran wirken, besitzen sie als Signalsequenz keine Spezifität und können durch die Signalsequenz anderer Mikrosomen-Membranproteine ersetzt werden.
Durch die Verlagerung des Mernbranenzyms aus Mitochondrien in Mikrosomen auf der Basis des Signalsequenz-Austausches konnte die produzierte Menge an P450c25-Protein pro Hefe-Zelle um etwa das 4-fache und die 25-Hydroxylierungsaktivität gegenüber 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; pro P450- Molekül um etwa das 50-fache erhöht werden. Man kann daher annehmen, daß sich die Fähigkeit zur 25-Hydroxylierung von 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; pro Zelle um etwa das 200-fache erhöhte. Es ist möglich, 1α,25-Hydroxyvitamin D&sub3; zu produzieren, das bei der Regulation des Calcium-Stoffwechsels, der Stimulation der Zell-Differenzierung und der Kontrolle des Zell-Immunsystems eine Rolle spielt und sich unter Verwendung von P450c25 oder chimärem P450c25 als Bioreaktor zur Behandlung von Osteoporose, chronischer Niereninsuffienz, Vitamin D-resistenter Rachitis oder dergleichen verwenden läßt.
Die Verwendung von Zellen des Stammes, der gleichzeitig chimäres P450c25-Protein, ADX und ADR exprimiert, als Bioreaktor ist außerdem ein nützliches Mittel, um das derzeit verwendete komplizierte Verfahren zur chemischen Synthese von aktivem Vitamin D&sub3; zu vereinfachen.
Ferner kann das in Hefe produzierte P450c25-Protein einfach aufgereinigt werden. Ein gegen P450c25 gerichteter Antikörper läßt sich als Mittel zur Diagnose von cerebrotendinöser Xanthomatose verwenden. Es hat sich eindeutig gezeigt, daß bei Patienten mit cerebrotendinöser Xanthomatose ein angeborener Mangel an dem Enzym vorliegt. Die Krankheit ist durch eine Xanthomatose oder ein Animus-Nervenleiden gekennzeichnet, wobei die Xanthomatose an der Achillessehne, in der Lunge und im Gehirn des Patienten erzeugt wird und zu schweren Symptomen, wie Linsentrübung, verminderter Intelligenz oder ähnlichen Symptomen führt. Bekanntlich ist der Cholestanol- Spiegel im Serum von Patienten gegenüber dem Normalspiegel 10 - 100fach höher. Derzeit werden Diagnoseverfahren, die dieses pHänomen nutzen, oder Verfahren verwendet, die unter Verwendung von radioaktiv markiertem THC die Aktivität des Enzyms messen. Durch die Züchtung eines erfindungsgemäßen transformierten Hefe-Stammes ist die P450c25-Produktion in großem Umfang möglich geworden, so daß die Herstellung eines gegen das isolierte und aufgereinigte Enzym gerichteten Antikörpers den Nachweis des P450c25- Proteins mit hoher Sensitivität ermöglicht, wobei man davon ausgeht, daß sich ein solcher Antikörper zur Diagnose von cerebrotendinöser Xanthomatose einsetzen läßt. SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

1. Plasmid zur funktionellen Expression von mitochondrialem P450c25 in Hefe-Mikrosomen, worin ein mitochondriales Targeting-Signal an einem N-Terminus von P450c25 ersetzt ist durch ein Mikrosomen-Targeting-Signal, das von microsomalem p45017α stammt.

2. Plasmid nach Anspruch 1, wobei das mitochondriale P450c25 Rattenleber-P450c25 ist.

3. Expressionsplasmid pAMS25 nach Anspruch 1 und dargestellt in Figur 5.

4. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2 zur gleichzeitigen Expression von mitochondrialem P450c25 mit Ferredoxin und NADPH-Ferredoxinreduktase in Hefe.

5. Plasmid nach Anspruch 4, wobei P450c25 Rattenleber- P450c25 ist, Ferredoxin adrenales Adrenodoxin aus Rind 25 ist, und NADPH-Ferredoxinreduktase adrenale NADPH- Adrenodoxinreductase aus Rind ist.

6. Plasmid nach Anspruch 5, wobei Ratten-P450c25 in Hefe- Mikrosomen exprimiert wird, und sowohl Rinder-Adrenodoxin als auch NADPH-Adrenodoxinreduktase im Hefecytoplasma exprimiert werden.

7. Plasmid pRXMS25 nach Anspruch 6 und dargestellt in Figur 6.

8. Transformierter Hefestamm, der ein Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 trägt.

9. Transformierter Hefestamm nach Anspruch 8, wobei der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae ist.

10. Verfahren zur Herstellung von 5β-Cholestan-3α,7α,12α,27- Tetrol, 25-Hydroxyvitamin D3 und 1α,25-Dihydroxyvitamin D3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Position 27 von 5β-Cholestan-3α,7α,12α-Triol und in der Position 25 von Vitamin D3 und 1α-Hydroxyvitamin D3 durch Inkubation dieser Substanzen mit einem transformierten Hefestamm nach Anspruch 8 oder 9 oder einem davon hergestellten zelifreien Extrakt eine Hydroxylgruppe eingeführt wird.