JPH1180113A - 光学活性β−シアノイソ酪酸類及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 光学活性医薬品や光学活性農薬などの有効な
製造中間体である光学活性β−シアノイソ酪酸類と、そ
の製造方法を提供することにある。 【解決手段】 一般式（１）：ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（Ｃ
Ｈ₃）ＣＯＯＲ¹ （式中、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜
６のアルキル基を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭
素原子である。）で表される光学活性β−シアノイソ酪
酸類。一般式（２）：ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯ
Ｒ² （式中、Ｒ²は炭素原子数１〜６のアルキル基を示
す。）で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステル
を、エステル不斉加水分解酵素、又は該酵素生産能を有
する微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物エステル
不斉加水分解酵素の存在下で不斉加水分解することを特
徴とする、上記一般式（１）で表される光学活性β−シ
アノイソ酪酸類の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学活性医薬品、
光学活性農薬などの製造中間体として有用な、新規光学
活性β−シアノイソ酪酸類及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの
製造方法としては、米国特許第３，６４４，４６７号公
報，米国特許第３，６４４，４６８号公報、米国特許第
２，８１０，７４２号公報、英国特許第８０８，８３５
号公報、特開平８−２９１１５８公報、特開平９−６７
３３０号公報等に記載される方法が公知である。しかし
ながら、これらの光学活性体及びその製造方法について
は知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、光学
活性医薬品や光学活性農薬などの有効な製造中間体であ
る光学活性β−シアノイソ酪酸類と、その製造方法を提
供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラセミ体β−シア
ノイソ酪酸エステルを、光学選択的に加水分解する能力
のある酵素及び該酵素生産能を有する微生物を見い出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、一般式
（１）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ¹ （１） （式中、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキル基
を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子であ
る。）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸類であ
る。

【０００５】また、本発明は、一般式（２）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ² （２） （式中、Ｒ²は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す。
＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）で表さ
れるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを、エステル
不斉加水分解酵素、又は該酵素生産能を有する微生物の
培養物、菌体もしくは菌体処理物の存在下で不斉加水分
解することを特徴とする、一般式（３）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ² （３） （式中、Ｒ²は前記のとおりである。＊が付された炭素
原子は不斉炭素原子である。）で表される光学活性β−
シアノイソ酪酸エステル及び／又はその対掌体である式
（４）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＨ （４） （式中、＊が付された炭素原子は不斉炭素原子であ
る。）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸の製造方
法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
一般式（１）〜（３）において、Ｒ¹又はＲ²で表される
炭素原子数１〜６のアルキル基は、それぞれ直鎖状及び
分岐状のいずれの構造でもよい。具体的には、メチル、
エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブ
チル、tert−ブチル、イソブチル、n-ペンチル等が例示
される。

【０００７】本発明の上記一般式（１）の光学活性化合
物は以下の方法で製造することができる。原料として
は、上記一般式（２）で表されるラセミ体β−シアノイ
ソ酪酸エステルを用いる。このラセミ体β−シアノイソ
酪酸エステルは、従来公知の一般的な方法で製造するこ
とができる。例えば、ラセミ体β−シアノイソ酪酸メチ
ルは、メチルメタクリレートと青酸をアルカリ性触媒存
在下で反応させることにより製造することができる（英
国特許第８０８，８３５号公報、米国特許第２，８１
０，米国特許第３，６４４，４６７号公報，特開平８−
２９１１５８公報、特開平９−６７３３０号公報）。

【０００８】本発明において使用する酵素は、一般式
（２）で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステル
のエステル結合を不斉加水分解する活性を有するもので
あれば酵素の種類、その製造源を問わない。そのような
酵素には、リパーゼ、エステラーゼ及びプロテアーゼ類
が含まれる。酵素としては、例えば、エステル不斉加水
分解酵素生産能を有する微生物由来の酵素を用いること
ができる。エステル不斉加水分解能を有する微生物の代
表的なものとしては、シュードモナス(Pseudomonas)
属、及びエシェリキア(Escherichia)属に属する微生物
が挙げられる。具体的には、シュードモナス・プチダ(P
seudomonas putida)FERM BP-3846、エシェリキア・コリ
(Escherichia coli)FERM BP-3835等が挙げられる。尚、
エシェリキア・コリ FERM BP-3835 は、シュードモナス
・プチダ FERM BP-3846 由来のエステラーゼをコードす
る遺伝子によって形質転換された株である。

【０００９】上記微生物の培養は、液体培地でも固体培
地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常
資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの
成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分
解能を向上させるため、培地にエステルを少量添加する
ことも可能である。培養は、微生物が生育可能である温
度、pHで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行
えばよい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を
行ってもよい。

【００１０】また、本発明においては、精製酵素はもち
ろんのこと、上記のエステル不斉加水分解酵素生産能を
有する微生物を培地中で培養して得られる培養物をその
ままか、又は該培養物から遠心分離等の集菌操作によっ
て得られる菌体若しくはその菌体処理物を用いることも
できる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で
処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、無細胞抽出
物、無細胞抽出物からゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフィー等の分離操作により得られる粗酵素等が挙げら
れる。微生物菌体又は酵素は、架橋したアクリルアミド
ゲルなどに包括固定化したり、イオン交換樹脂、ケーソ
ー土等の固体担体に物理的、化学的に固定化して用いる
ことができる。これにより反応を行った後に回収再利用
することが容易になる。

【００１１】エステル不斉加水分解酵素としては市販品
を用いることができる。具体的には、リパーゼＯＦ（商
品名、名糖産業社製、キャンディダ由来）、デュラザイ
ム（商品名、ＮＯＶＯ社製、バシラス属由来）、サビナ
ーゼ（商品名、ＮＯＶＯ社製、バシラス属由来）、Flav
ourzyme MG（商品名、ＮＯＶＯ社製、アスペルギルス属
由来）、リパーゼA-6 （商品名、天野製薬製、アスペル
ギルス属由来）、リパーゼＭ（商品名、天野製薬製、ム
コール属由来）、ニューラーゼＦ（商品名、天野製薬
製、リゾプス属由来）、Lipase type VII （商品名、Ｓ
ＩＧＭＡ社製、キャンディダ属由来）、Acylase I （商
品名、ＳＩＧＭＡ社製、アスペルギルス属由来）、Trip
sin type II （商品名、ＳＩＧＭＡ社製、ブタ膵臓由
来）、Protease type XVI （商品名、ＳＩＧＭＡ製、バ
シルス属由来）、Palatase（商品名、ＮＯＶＯ社製等を
用いることができる。

【００１２】一般式（２）で表されるラセミ体β−シア
ノイソ酪酸エステルの光学選択的な加水分解は、以下の
ようにして行うことができる。すなわち、反応媒体に基
質であるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを添加し
て溶解乃至懸濁し、触媒である酵素又は微生物の培養物
等を加える。ただし、この触媒は、基質を反応媒体に添
加する前に加えてもよい。そして、反応温度及び必要に
より反応液のpHを制御しながらラセミ体β−シアノイソ
酪酸エステルの加水分解反応を行う。この加水分解反応
は半量程度が反応するまで行うが、場合によっては、基
質の半量未満で反応を終了したり、基質の半量を越えて
過剰に反応させることもある。

【００１３】反応媒体としては、例えばイオン交換水、
緩衝液等が用いられる。反応液中の基質濃度は０．１〜
７０重量％の範囲であれば特に制限はないが、基質とな
るラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの溶解度、反応
性などを考慮すると５〜４０重量％の範囲であるのが好
ましい。反応温度は、好ましくは５〜７０℃であり、よ
り好ましくは２０〜６０℃である。

【００１４】反応液のpHは用いる酵素又は微生物の不斉
加水分解能の至適pHに依存するが、一般的にはpH６〜８
の範囲内で実施すると化学的加水分解反応による光学純
度の低下を抑えることができるので好ましい。反応が進
行するに従って、生成したカルボン酸により反応液のpH
が低下してくるので、適当な中和剤で最適pHに維持しな
がら反応を行うことが望ましい。なお、以上のような基
質濃度、媒体、温度、ｐＨ及びその反応条件は、反応収
率、光学収量を考慮して目的とする光学活性化合物が有
利に得られる条件を適宜選択することが望ましい。

【００１５】このような不斉加水分解反応により、上記
式（４）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸が生成
する。また、未反応の残存基質は、生成した光学活性β
シアノイソ酪酸の対掌体を主成分とする上記一般式
（３）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸エステル
となる。

【００１６】反応終了後、反応液から、ヘキサン、酢酸
エチルなどの溶剤で抽出することにより、本発明の化合
物である未反応の光学活性β−シアノイソ酪酸エステル
を分離することができる。その際、予め、触媒として使
用した微生物菌体、酵素等を遠心分離、濾過などの操作
により除去し、その後に溶剤抽出を行うことで抽出操作
をより容易に行うことができる。一方、抽出残液を硫
酸、塩酸などの酸でpH１〜２とした後に、ヘキサン、酢
酸エチルなどの溶剤で抽出することによりその対掌体で
ある光学活性β−シアノイソ酪酸を得ることができる。
抽出された生成物と溶媒は、蒸留等の公知の方法により
容易に分離できる。

【００１７】さらに、得られた光学活性β−シアノイソ
酪酸エステルは、通常の方法で加水分解することにより
光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸にすること
ができる。また、光学活性β−シアノイソ酪酸は、通常
の方法でエステル化することにより光学活性を維持した
ままβ−シアノイソ酪酸エステルにすることができる。
従って、任意の立体配置のβ−シアノイソ酪酸を取得す
ることができる。

【００１８】

〔実施例１〕

光学活性−β−シアノイソ酪酸類の合成 エシェリキア・コリ(Escherichia coli) FERM BP 3835
を、アンピシリン５０μg/mlを含むＬＢ培地（１％ポリ
ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％NaCl）５０ml
に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体を採取した。得られた菌
体の全量をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、５０mMリ
ン酸緩衝液（pH７．０)５０mlに懸濁した。この菌体懸
濁液にラセミ体β−シアノイソ酪酸メチルエステルを５
ｇ添加し、３０℃で２０時間反応させた。この間、反応
液のpHを、１ＮのNaOH水溶液を用いて７．０に調整し
た。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応の
β−シアノイソ酪酸メチルを酢酸エチルで抽出した。有
機相に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発
留去した。このようにして、１.2ｇの光学活性β−シア
ノイソ酪酸メチルエステルを得た。

【００１９】得られた光学活性β−シアノイソ酪酸メチ
ルエステルについて、高速液体クロマトグラフィー（カ
ラム：Chiralcel OD（ダイセル社製）、移動層：ヘキサ
ン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、
流速：０．５ml/min）で光学純度を測定したところ、
（Ｓ）体９７．５％e.e.であった。

【００２０】上記の酢酸エチル抽出における抽出残液で
ある水相に２Ｎ塩酸を添加してpHを２．０に調整し、反
応生成物である光学活性β−シアノイソ酪酸を酢酸エチ
ルで抽出した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加えて脱
水し、溶媒を蒸発留去した。このようにして、２．５ｇ
の光学活性β−シアノイソ酪酸を得た。得られた光学活
性β−シアノイソ酪酸について上記と同様にして光学純
度を測定したところ、（Ｒ）体３１％e.e.であった。

【００２１】以下、（Ｓ）−β−シアノイソ酪酸メチル
エステルの物性値を示す。 （¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１）） 溶媒：CDCl₃、内部標準：TMS δ_H １．２３〜１．２６（３Ｈ，ｄ，−ＣＨ₃ ） δ_H ２．７０〜２．７３（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂ −） δ_H ２．８４〜２．９２（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ−） δ_H ３．６７ （３Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃ ）

【００２２】（¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図２）） 溶媒：CDCl₃、内部標準：TMS δ_C １６．２４ （−ＣＨ₃ ） δ_C ２０．４８ （−ＣＨ₂ −） δ_C ３５．５７ （−ＣＨ−） δ_C １１８．７９ （−ＣＮ） δ_C １７３．７０ （−ＣＯＯＣＨ₃ ）

【００２３】（光学純度） （Ｓ）体 ９７．５％e.e. （比旋光度） [α]_D ²⁵＝−９．９７(neat)

【００２４】以下、（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸の物性
値を示す。 （¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３）） 溶媒：CDCl₃、内部標準：TMS δ_H １．２１〜１．２４（３Ｈ，ｄ，−ＣＨ₃ ） δ_H ２．６３〜２．６６（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂ −） δ_H ２．７１〜２．７９（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ−） δ_H １０．４７ （１Ｈ，ｓ，−ＯＨ）

【００２５】（¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４）） 溶媒：CDCl₃、内部標準：TMS δ_C １６．２９ （−ＣＨ₃ ） δ_C ２０．４０ （−ＣＨ₂ −） δ_C ３５．５０ （−ＣＨ−） δ_C １１９．０３ （−ＣＮ） δ_C １７４．８３ （−ＣＯＯＨ）

【００２６】（光学純度） （Ｒ）体 ３１％e.e.

【００２７】〔実施例２〕 光学活性（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸誘導体の合成 ５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）５０mlに１ｇのリパー
ゼＯＦ（商品名、名糖産業社製、キャンディダ属由来）
を溶解した。この溶液にラセミ体β−シアノイソ酪酸メ
チルエステルを２．５ｇ添加し、３０℃で２０時間反応
させた。この間、反応液のpHを、１ＮのNaOH水溶液を用
いて７．０に調整した。反応終了後、未反応のβ−シア
ノイソ酪酸メチルを酢酸エチルで抽出した。有機相に無
水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去し
た。このようにして、０．４ｇの光学活性β−シアノイ
ソ酪酸メチルエステルを得た。

【００２８】さらに、得られた光学活性β−シアノイソ
酪酸メチルエステルは、通常の方法で加水分解すること
により光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸にす
ることができる。また、光学活性β−シアノイソ酪酸
は、通常の方法でエステル化することにより光学活性を
維持したままβ−シアノイソ酪酸エステルにすることが
できる。従って、任意の立体配置を取得することができ
る。

【００２９】得られた光学活性β−シアノイソ酪酸メチ
ルエステルについて、高速液体クロマトグラフィー（カ
ラム：Chiralpak AS（ダイセル社製）、移動層：ヘキサ
ン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、
流速：０．５ml/min）で光学純度を測定したところ、
（Ｒ）体９２．３％e.e.であった。

【００３０】〔実施例３〜１３〕ラセミ体β−シアノイ
ソ酪酸メチルエステルを２％溶解した５０mMリン酸緩衝
液（pH７．０）１mlに、表１に示す酵素０．０２〜０．
０５ｇを加えた後、３０℃で２０時間反応させた。反応
液に酢酸エチル１mlを加えて十分に攪拌した後、有機相
を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Chiralpak AS
（ダイセル社製）、移動層：ヘキサン／イソプロパノー
ル／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、流速：０．５ml/mi
n）にかけて生成した光学活性β−シアノイソ酪酸メチ
ルエステルの光学純度を測定した。その結果を表１に示
す。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、光学活性医薬品や光学
活性農薬等の有効な製造中間体である新規光学活性β−
カルボキシアミノイソ酪酸類が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた（Ｓ）−β−シアノイソ酪
酸メチルエステルの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。

【図２】実施例１で得られた（Ｓ）−β−シアノイソ酪
酸メチルエステルの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。

【図３】実施例１で得られた（Ｒ）−β−シアノイソ酪
酸の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図４】実施例１で得られた（Ｒ）−β−シアノイソ酪
酸の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ¹ （１） （式中、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキル基
   を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子であ
   る。）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸類。
2. 【請求項２】 一般式（２）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ² （２） （式中、Ｒ²は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す。
   ＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）で表さ
   れるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを、エステル
   不斉加水分解酵素、又は該酵素生産能を有する微生物の
   培養物、菌体もしくは菌体処理物の存在下で不斉加水分
   解することを特徴とする、一般式（３）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＲ² （３） （式中、Ｒ²は前記のとおりである。＊が付された炭素
   原子は不斉炭素原子である。）で表される光学活性β−
   シアノイソ酪酸エステル及び／又はその対掌体である式
   （４）： ＮＣＣＨ₂Ｃ^*Ｈ（ＣＨ₃）ＣＯＯＨ （４） （式中、＊が付された炭素原子は不斉炭素原子であ
   る。）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸の製造方
   法。