JPH1192499A - ヒト成長ホルモン変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血液中でのプロテアーゼに分解されにくいｈＧ
Ｈ変異体を提供する。 【解決手段】天然型ｈＧＨ配列１３４位Ａｒｇ、１３５
位ＴｈｒをそれぞれＡｓｐ、Ｐｒｏに置換したｈＧＨ変
異体は、スロンビンに極めて分解されにくく、血中で安
定である。かつ天然型ｈＧＨと同様の生理活性を示す。
さらに、１４０位ＬｙｓをＡｌａに変換したｈＧＨ（１
３４Ａｓｐ／１３５Ｐｒｏ／１４０Ａｌａ）は、プラス
ミンにも耐性を示し、実質上、血中では分解されない優
れたｈＧＨ変異体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、対分解酵素耐性を
高められた、ヒト成長ホルモン（以下、ｈＧＨ）の変異
体、より詳しくは、血液中のプロテアーゼである、トロ
ンビンまたはプラスミンによる分解を受けにくいｈＧＨ
変異体に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、小人症治療などに用いられている
ｈＧＨ医薬製剤は、主に組換え製法〔日本特許２５２１
４１３号など〕によるものであり、アミノ酸１９１個、
分子量約２２ｋＤの天然ｈＧＨと同一のアミノ酸配列を
有する。このような組換えｈＧＨは、臨床応用された組
換えタンパクとして最も成功したもののひとつである
が、近年、ｈＧＨのアミノ酸を一部改変して、ｈＧＨタ
ンパク製剤の体内動態をさらに好ましいものにする技術
が試みられている。

【０００３】即ち、元々の生理活性を保ちつつ、安定性
などの面で好ましい特性を示すｈＧＨの改変体が種々特
許出願されている。代表的なものを下記に列挙する。 （１）１４９位ＡｓｎをＡｓｐに置換したもの〔特開平
１−２７５５９９〕。 （２）成長ホルモン中のシステイン残基の改変体〔特開
平３−４７９７〕。 （３）αヘリックス３領域の改変体〔特開平５−７０４
９７〕。 （４）αヘリックス１領域の改変体〔特開平５−１０５
６３４〕。 （５）１４０位Ｌｙｓのアミノ酸置換改変体〔特開平５
−１９９８８０〕。 （６）１３４位ＡｒｇをＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｈ
ｅ、Ｐｒｏ又はＨｉｓに置換したもの〔特開平５−３１
０７９４〕。 特に、（６）特開平５−３１０７９４では、１３４位Ａ
ｒｇを別の中性あるいは弱塩基性のアミノ酸に置換し
て、天然型ｈＧＨとほぼ同等の活性を示す組換えｈＧＨ
変異体を得ている。１３４位、１３５位の間のファクタ
ーＸａによる分解を防ぐとされている。また、（５）特
開平５−１９９８８０には、１４０位ＬｙｓをＡｓｎに
置換したものが開示されている。

【０００４】しかしながら、（６）のｈＧＨ変異体が耐
性を示すとされるファクターＸａは、血液由来のプロテ
アーゼとしては主要なものではない。この変異体が、プ
ラスミンやスロンビンのような血液中により多く存在す
るプロテアーゼに対して、耐性を示すかどうか、また、
血液中で安定かどうかは、同出願に開示されていない。
（５）に開示された変異体も、プラスミンやスロンビン
に対して安定であるということは示唆されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
型ｈＧＨとほぼ同等の活性を示し、かつ生体への投与
時、血液中での安定性を高められた改変タンパク質を提
供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のｈ
ＧＨアミノ酸配列改変体を作成し、その対プロテアーゼ
安定性を評価した。その結果、プラスミンによる分解箇
所１３４位ＡｒｇをＡｓｐに、１３５位ＴｈｒをＰｒｏ
に、更には１４０位ＬｙｓをＡｌａに変換したｈＧＨ
が、ｈＧＨ活性を損なうことなく、血液中での高い安定
性を示すことを見いだし、本発明を完成した。特に、１
３４位の変換は、強塩基性残基Ａｒｇから酸性残基Ａｓ
ｐに変えるという、従前知られている置換より激しいも
のであったが、驚くべきことに生理活性は殆ど低下しな
かった。

【０００７】すなわち、本発明は、下記の医薬に関する
ものである。 （１）天然型ヒト２２ｋＤａ成長ホルモン（ｈＧＨ）の
アミノ酸配列１−１９１位において、１３４位アルギニ
ン（Ａｒｇ）および１３５位スレオニン（Ｔｈｒ）が、
それぞれアスパラギン酸（Ａｓｐ）およびプロリン（Ｐ
ｒｏ）に、置換されており、スロンビンによる分解に耐
性を有することを特徴とするヒト成長ホルモン変異体。 （２）１４０位リジン（Ｌｙｓ）が、アラニン（Ａｌ
ａ）に置換されていることを特徴とする（１）のヒト成
長ホルモン変異体。 （３）天然型ヒト２２ｋＤａ成長ホルモン（ｈＧＨ）の
アミノ酸配列において、１３４位アルギニン（Ａｒ
ｇ）、１３５位スレオニン（Ｔｈｒ）および１４０位リ
ジン（Ｌｙｓ）が、それぞれアスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、およびアラニン（Ａｌａ）
に置換されており、スロンビンおよびプラスミンによる
分解に耐性を有するヒト成長ホルモン変異体。 （４）（１）〜（３）のヒト成長ホルモン変異体を有効
成分として含有する医薬製剤。

【０００８】以下、詳細に本発明を説明する。本明細書
において、「天然型ヒト２２ｋＤａ成長ホルモンのアミ
ノ酸配列」とは、日本特許２５２１４１３号、第２０
頁、図８に記載されたアミノ酸配列１−１９１（配列番
号１）を意味する。本発明のヒト成長ホルモン変異体
は、上記のアミノ酸配列における１３４位Ａｒｇ→Ａｓ
ｐ、１３５位Ｔｈｒ→Ｐｒｏおよび／または１４０位Ｌ
ｙｓ→Ａｌａ置換がなされたｈＧＨ活性を有するタンパ
ク質を言い、抗スロンビン、抗プラスミンあるいは、血
漿中で分解されにくいという特性を有する限り、その他
の位置のアミノ酸配列が置換、除去、付加等されていて
も、本発明の技術範囲に入るものとする。なお、ｈＧＨ
活性とは、主として成長期にある、ヒトの脳を除く全組
織（特に骨）を成長させる総合的な成長促進活性を意味
する。すなわち、（１）ソマトメジン（ＩＧＦ−Ｉ）誘
導を介した骨や軟骨の増殖促進作用、（２）アミノ酸の
細胞への取り込みとタンパク合成の促進、タンパク分解
の抑制作用、（３）中性脂肪代謝促進作用、（４）糖代
謝促進作用、（５）Ｎａ、Ｋ等、電解質貯留促進作用、
など公知のｈＧＨ生理活性の全部または一部を意味する
ものである。

【０００９】「スロンビンによる分解に耐性を示す」と
は、ｈＧＨ変異体の１０分の１量（重量比）のスロンビ
ンと３７℃２４時間反応させたときに、実質的にｈＧＨ
変異体タンパクが分解されないことを言い、具体的に
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で反応液からｈＧＨ（分子
量：約２２ｋＤ）より分子量の小さいフラグメントが検
出されないことを意味する。

【００１０】「プラスミンによる分解に耐性を示す」と
は、ｈＧＨ変異体の２０分の１量（重量比）のプラスミ
ンと３７℃２４時間反応させたときに、実質的にｈＧＨ
変異体タンパクが分解されないことを言い、具体的に
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で反応液からｈＧＨ（分子
量：約２２ｋＤ）より分子量の小さいフラグメントが検
出されないことを意味する。

【００１１】（製造方法）本発明のｈＧＨ変異体の生産
方法としては、主に大腸菌を宿主に用いた組換え技術が
用いられる。天然型ｈＧＨのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列を含む公知のベクターを用い、１３４、１３
５、および１４０位の改変を部位特異的突然変異法な
ど、自体公知の方法で行う。ｈＧＨ変異体をコードする
ベクターを取得後、大腸菌などの宿主で、ｈＧＨ変異体
を発現させ、製造することができる。

【００１２】（ｈＧＨ変異体遺伝子の取得）配列番号１
で示されるｈＧＨ・ＤＮＡ配列を含むベクターを用い
て、本発明のｈＧＨ変異体の発現ベクターを構築する。
原料となるベクターは、公知のｈＧＨ遺伝子含有ベクタ
ーであれば、特に制限されないが、代表的なものとし
て、ｐＫＫｈＧＨ１〔Ｙａｍａｋａｗａ，Ｍ．ｅｔａ
ｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ Ａｃｔａ １００９巻、１５６−１６０頁、（１
９８９）〕が挙げられる。１３４、１３５および１４０
位の置換には、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的
突然変異法が便利である。オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、特に制限されないが、配列番号２〜配列番号５の
プライマーが好適である。

【００１３】（発現ベクターの構築）発現ベクターに
は、適当な大腸菌、枯草菌、酵母、動物昆虫細胞等の宿
主内で増殖できるプラスミドやファージが選ばれるが、
例えば、大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
〔Ｇｅｎｅ、４巻１２１頁（１９７８）〕、ｐＵＣ１
８、枯草菌由来ｐＵＢ１１０〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２巻，６７８頁
（１９８３）〕、ＣＯＳ細胞に好適なｐＣＤＭ８等が挙
げられる。ｃＤＮＡをプラスミドに組み込む方法として
は、常法が、マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）
他、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールドスプリング ハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂａｒ
ｌａｂ．）２３９頁（１９８２）に記載されている。

【００１４】（宿主）宿主は、特に限定されないが、大
腸菌が大量生産に便利である。その他、細菌としては、
枯草菌（バチルス類）等、酵母としては、サッカロマイ
セス属、トルラ属、ピキア属等、動物細胞としては、Ｃ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞等が代表例である。
培養昆虫細胞、真菌、植物細胞、単細胞系だけでなく、
目的蛋白質遺伝子を組み込まれた昆虫や哺乳類、植物も
宿主の範疇に入る。

【００１５】（活性測定）形質転換体から、公知の方
法、例えば、コロニー・ハイブリダイゼイション法〔Ｇ
ｅｎｅ，１０巻 ６３頁（１９８０）〕およびＤＮＡ塩
基配列決定法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４巻５６０頁（１９７７）〕を用い、所
望のクローンを選出する。また、ＣＯＳ細胞にて一過性
に発現させ、培養上清の生理活性を評価してクローン選
択することも可能である。発現されたｈＧＨ変異体蛋白
の生理活性は、Ｎｂ２細胞などの培養細胞の増殖促進作
用を測定することにより評価できる〔Ｇｏｕｔ，Ｐ．
Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第
４０巻、２４３３−２４３６頁（１９８０）〕。

【００１６】（精製）組換え技術により生産されたｈＧ
Ｈ変異体蛋白は、生化学の分野で常用される精製方法に
て精製が可能である。イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ、硫安沈澱、限外濾過、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥなどが適宜組み合わせて用いられる。ｈＧＨ
に対する特異的抗体を用いた抗体カラムクロマトグラフ
ィーなども大量精製に好適である。ｈＧＨ変異体蛋白に
対する抗体は、ポリクローナル、モノクローナル共に、
自体公知の方法で作製し得る。ｈＧＨ特異的抗体は抗体
カラムに使用出来るだけでなく、ＥＬＩＳＡ等の免疫化
学的定量法に使用できる。

【００１７】（製剤）製剤としては、注射剤、経口剤、
液剤、凍結乾燥品いずれも用いることが出来るが、特に
皮下投与用注射製剤が好ましい。これら非経口投与製剤
には、当該分野にて公知の安定化剤、担体を用いること
ができ、使用時に等張溶液として用いるのが好ましい。
医薬担体としては、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋
白、グリシン等のアミノ酸、マンニトール等の糖を用い
ることができ、通常、皮下あるいは筋肉内投与用凍結乾
燥製剤に用いられる。また、水溶製剤、凍結乾燥製剤と
して使用する場合、凝集を防ぐためにＴｗｅｅｎ８０な
どの界面活性剤を添加するのが好ましい。長期の薬効を
要する場合は、公知のタンパク徐放性製剤用担体（コラ
ーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、シリコンなど）
を用いて製剤する事もできる。

【００１８】（使用方法および毒性）本発明のｈＧＨ変
異体製剤は、公知のｈＧＨ製剤と同様に使用しうる。ｈ
ＧＨ変異体製剤の投与方法は、皮下投与、静脈投与、筋
肉内投与、いずれも可能であるが、皮下投与が通常用い
られる。ｈＧＨの投与量および投与回数は、患者の状態
や年令性別等により、適宜増減すべきものではあるが、
下垂体性小人症治療には、一般的には、体重ｋｇ当た
り、０．５ＩＵを２〜４回／週投与する。ｈＧＨは過去
１０年以上、臨床で使用された実績があり、本発明の変
異体もｈＧＨと同様の生理活性を示すことから毒性は低
いと考えられる。

【００１９】

【発明の効果】本発明のｈＧＨ変異体は、天然型ｈＧＨ
とほぼ同等の活性を示し、かつ血液あるいは体液中で優
れた安定性を示す。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例にて説明する。 実施例１ ベクターの構築 ・ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）をコードするＤＮ
Ａ ヒトｈＧＨ変異体の構造遺伝子に相当するＤＮＡ断片
（配列番号１）を担持するプラスミドｐＫＫｈＧＨ１
と、大腸菌発現ベクターであるｐＵＣ１８（ファルマシ
ア＆アップジョン社）をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切
断し、つなぎ合わせて、ｐＵＣ１８ｈＧＨを得る。この
プラスミドと、プライマー１（配列番号２）とプライマ
ー２（配列番号３）を用いたＰＣＲにより、１３４位に
Ａｓｐ、１３５位にＰｒｏをコードするＤＮＡ配列を導
入、ｈＧＨ変異体ＤＮＡ断片を増幅した（図１）。その
後、ｐＣＲＴＭＩＩ（インビトロゲン社）にて当該ＤＮ
Ａ断片をクローニングし、これとｐＫＫｈＧＨ１をＸｂ
ａＩとＢｇｌＩＩでつないで、プラスミドｐＫＫｈＧＨ
５を得た。このプラスミドは、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ
１３５Ｐ）の遺伝子を担持する（図２）。 ・ｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）をコードするＤＮＡ 前記プラスミドｐＵＣ１８ｈＧＨと、プライマー３（配
列番号４）とプライマー４（配列番号５）を用いたＰＣ
Ｒにより、１４０位にＡｌａコドンを導入、ｈＧＨ変異
体ＤＮＡ断片を増幅した（図１）。その後、これとｐＫ
ＫｈＧＨ１をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩでつないで、
プラスミドｐＫＫｈＧＨ６を得た。このプラスミドは、
ｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）の遺伝子を担持する（図２）。 ・ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）をコ
ードするＤＮＡ 前記プラスミドｐＫＫｈＧＨ５とｐＫＫｈＧＨ６をＨｉ
ｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩでつないで、プラスミドｐＫＫ
ｈＧＨ７を得た。このプラスミドは、ｈＧＨ（Ｒ１３４
Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）の遺伝子を担持する（図
２）。

【００２１】実施例２ 発現 実施例１で得られたｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５
Ｐ）、ｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ
１３５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）をコードするＤＮＡ配列を、ｔ
ａｃプロモーターを有するプラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア＆アップジョン社）〔Ｄｅ Ｂｅｒｒ，
Ｈ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、２１−２５頁（１９８
３）〕に導入し、それぞれの発現ベクターを得た。そし
て、常法に従って、大腸菌（ＪＭ１０３株）を形質転換
し、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）、ｈＧＨ（Ｋ１
４０Ａ）およびｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１
４０Ａ）発現株を培養して、ヒトｈＧＨ変異体の発現と
生産を行った。培養条件は、下記の通りである。なお、
対照として、ｐＫＫｈＧＨ１由来の天然型ｈＧＨ遺伝子
も同じ条件で発現させた。ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３
５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）の全アミノ酸配列は、配列番号６に
示される。

【００２２】各ｈＧＨ変異体発現ベクターで形質転換さ
れたＪＭ１０３株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよ
びＩＰＴＧ１ｍＭを含むＬＢ培地５００ｍｌ：４本に植
え込み、３７℃で３６時間振とう培養した。ＩＰＴＧを
培養の最初から系に添加することにより、良い発現効率
が得られた。

【００２３】実施例３ 抽出精製 培地から回収した菌体を遠心分離で集め、破砕後、不溶
性画分より、デタージェント処理にてｈＧＨ変異体を可
溶化し回収した。粗抽出液は（１）ミクロフィルター濾
過、（２）セファクリル Ｓ−２００ゲル濾過、（３）
ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂイオン交換クロマトグ
ラフィーを行い、精製した。ｈＧＨ変異体は、いずれも
上記の処理でほぼ均一にまで精製された（図３、図
４）。

【００２４】実施例４ ｈＧＨ活性 精製されたｈＧＨ変異体を用いて、Ｇｏｕｔらの方法
〔Ｇｏｕｔ，Ｐ．Ｗ．ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、第４０巻、２４３３−２４３６頁（１９８
０）（前出）〕に従って、細胞増殖活性を評価した。即
ち、１ｘ１０⁵個のＮｂ細胞をシャーレに播種し、各ｈ
ＧＨ変異体と陽性対照として天然型ｈＧＨとプロラクチ
ン１０ｎｇ／ｍｌを添加して（各３連）、２４時間ごと
の細胞数を３日目までカウントした。ｈＧＨ変異体はす
べて陽性対照と同じ活性を示した（図５）。

【００２５】実施例５ 対スロンビン耐性 精製されたｈＧＨ変異体を用いて、スロンビン分解に対
する耐性を検討した。即ち、各ｈＧＨ変異体と対照とし
て天然型ｈＧＨ、各５μｇを１／１０量（重量比）のス
ロンビンと、０．１５ＭＮａＣｌ存在下、ｐＨ７．４の
トリス塩酸緩衝液中で３７℃２４時間インキュベート
し、培養液をＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。天然型ｈＧＨとｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）は、ほぼ１
００％分解され、分解産物Ｆ−ＩとＦ−ＩＩになった
が、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）およびｈＧＨ
（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）は全く変化し
なかった（図６）。

【００２６】実施例６ 対プラスミン耐性 精製されたｈＧＨ変異体を用いて、プラスミン分解に対
する耐性を検討した。即ち、各ｈＧＨ変異体と対照とし
て天然型ｈＧＨ、各５μｇを１／２０量（重量比）のプ
ラスミンと、０．１５ＭＮａＣｌ存在下、ｐＨ７．４の
トリス塩酸緩衝液中で３７℃２４時間インキュベート
し、培養液をＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。天然型ｈＧＨとｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）は、ほぼ１
００％分解され、分解産物Ｆ−ＩａとＦ−ＩＩになっ
た。また、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）は、分解
されて、分解産物Ｆ−ＩｂとＦ−ＩＩとして検出され
た。しかし、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４
０Ａ）は全く分解されなかった（図７）。

【００２７】実施例７ 血漿中安定性 精製されたｈＧＨ変異体を用いて、血漿中での安定性を
検討した。即ち、ｈＧＨ変異体と対照として天然型ｈＧ
Ｈ、各５μｇを２５μｌのヒト血漿を含む１００μｌＰ
ＢＳと３７℃でインキュベートした。１日および７日後
の反応液をウェスタンブロットで分析した。天然型ｈＧ
ＨとｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）は、１日目でかなり分解され
たが、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）では、分解産
物は認められなかった。さらに、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／
Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４０Ａ）では１日目、７日目を通し
て、殆ど全く分解産物は認められなかった（図８）。

【００２８】実施例８ 製剤例１ 本発明のｈＧＨ変異体製剤のうち、代表的なものである
皮下投与用凍結乾燥あるいは水性製剤は、以下のように
製造することができる。 （１）精製組換えｈＧＨ変異体１ｍｇに対し、グリシン
０．３４ｍｇ、マンニトール９ｍｇ、非イオン性界面活
性剤：ポリソルベート８０、０．２ｍｇを加え、燐酸緩
衝液１ｍｌ（ｐＨ７．４、５ｍＭ）に溶解させ、ｈＧＨ
変異体水溶液を得る。無菌的にバイアル充填し、常法に
従って凍結乾燥して、ｈＧＨ変異体凍結乾燥製剤を得
る。（２）１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリ
ソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）でｈＧＨ変異体を５ｍｇ／ｍｌになるように
調製し、ｈＧＨ変異体水溶液を得る。

【００２９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヒト 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：１９ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GGAAACAGCT ATGACCATG

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：３０ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GAAGATCTGC CCTGGATCGG GGCTGCCATC

【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：３０ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAGATCTTCG CTCAGACCTA CAGCAAGTTC

【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２０ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAAGCTTGGC TGCAGGTCGA

【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：１９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヒト 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Asp Pro Gly Gln Ile Phe Ala Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＧＨ変異体を構築するためのプライマー。Ａ
は、プライマーの位置、Ｂは、プライマーのＤＮＡ配列
を示す。

【図２】ｈＧＨ変異体発現ベクターの構築図。

【図３】ｈＧＨ変異体遺伝子発現産物のゲル濾過による
精製。図は、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）発現物
をセファクリル Ｓ−２００カラムにかけ、溶出液をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したものである。レーンＢはクロ
マトグラフィー以前のサンプル、レーン１〜９は各フラ
クションを示す。クロマトグラフィーの条件は、カラ
ム：２．５ｘ７０ｃｍ、溶出液：１０ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールと０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：４０ｍｌ／ｍｉｎ、
フラクション体積：各６ｍｌ。

【図４】ｈＧＨ変異体遺伝子発現産物のイオン交換クロ
マトグラフィーによる精製。図は、ｈＧＨ変異体発現産
物の再生、透析後の画分をＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂにかけ、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したもの
である。レーン１は天然型ｈＧＨ、レーン２はｈＧＨ
（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）、レーン３はｈＧＨ（Ｋ１
４０Ａ）、レーン４はｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ
／Ｋ１４０Ａ）を示す。クロマトグラフィーの条件は、
カラム：２．２ｘ２６ｃｍ、担持／溶出用緩衝液：０．
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０、０〜１ＭのＮａＣｌグラジエント溶出）、流
速：２ｍｌ／ｍｉｎ、フラクション：各６ｍｌ。

【図５】ｈＧＨ変異体の細胞増殖活性の評価。縦軸はＮ
ｂ２細胞の数、横軸は、培養時間を表す。

【図６】スロンビン分解に対する耐性の評価。図は、ス
ロンビン処理した各ｈＧＨ変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析したものである。レーン１はスロンビン、レーン２
は天然型ｈＧＨ（未処理）、レーン３、４、５、６は
は、それぞれ、１／１０量のスロンビンと３７℃２４時
間処理された、天然型ｈＧＨ：レーン３、ｈＧＨ（Ｒ１
３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）：レーン４、ｈＧＨ（Ｋ１４０
Ａ）：レーン５、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ
１４０Ａ）：レーン６を示す。

【図７】プラスミン分解に対する耐性の評価。図は、プ
ラスミン処理した各ｈＧＨ変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析したものである。レーン１はプラスミン、レーン２
は天然型ｈＧＨ（未処理）、レーン３、４、５、６は
は、それぞれ、１／２０量のプラスミンと３７℃２４時
間処理された、天然型ｈＧＨ：レーン３、ｈＧＨ（Ｒ１
３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ）：レーン４、ｈＧＨ（Ｋ１４０
Ａ）：レーン５、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ
１４０Ａ）：レーン６を示す。

【図８】血漿中安定性の評価。図は、血漿とインキュベ
ートした各ｈＧＨ変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した
もの。レーン１はスロンビン、レーン２は天然型ｈＧＨ
（未処理）、レーン１、２、３、４は、それぞれ、血漿
を含む燐酸緩衝生理食塩水と３７℃でインキュベートさ
れた、天然型ｈＧＨ：レーン１、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／
Ｔ１３５Ｐ）：レーン２、ｈＧＨ（Ｋ１４０Ａ）：レー
ン３、ｈＧＨ（Ｒ１３４Ｄ／Ｔ１３５Ｐ／Ｋ１４０
Ａ）：レーン４を示す。Ａは１日目、Ｂは７日目の分析
結果である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】天然型ヒト２２ｋＤａ成長ホルモン（ｈＧ
   Ｈ）のアミノ酸配列１−１９１位において、１３４位ア
   ルギニン（Ａｒｇ）および１３５位スレオニン（Ｔｈ
   ｒ）が、それぞれアスパラギン酸（Ａｓｐ）およびプロ
   リン（Ｐｒｏ）に、置換されており、スロンビンによる
   分解に耐性を有することを特徴とするヒト成長ホルモン
   変異体。
2. 【請求項２】１４０位リジン（Ｌｙｓ）が、アラニン
   （Ａｌａ）に置換されていることを特徴とする請求項１
   記載のヒト成長ホルモン変異体。
3. 【請求項３】天然型ヒト２２ｋＤａ成長ホルモン（ｈＧ
   Ｈ）のアミノ酸配列において、１３４位アルギニン（Ａ
   ｒｇ）、１３５位スレオニン（Ｔｈｒ）および１４０位
   リジン（Ｌｙｓ）が、それぞれアスパラギン酸（Ａｓ
   ｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、およびアラニン（Ａｌａ）
   に置換されており、スロンビンおよびプラスミンによる
   分解に耐性を有するヒト成長ホルモン変異体。
4. 【請求項４】請求項１〜３のヒト成長ホルモン変異体を
   有効成分として含有する医薬製剤。