JPH119296A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ
−グルタミン酸生産菌野生株を自然界より見出し、安価
かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげ
る。 【解決手段】コリネバクテリウム・ストリアタムに属
し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、培地中
で培養し、生成したＬ−グルタミン酸を培養液から得る
Ｌ−グルタミン酸の製造法を提供する。このとき、培地
に脂肪酸エステル系界面活性剤または抗生物質を添加す
ることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、
食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネホルム型Ｌ−グル
タミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法に
より製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センタ
ー、１９５〜２１５貢、１９８６年）。コリネホルム型
Ｌ−グルタミン酸生産菌野生株の具体例としてはコリネ
バクテリウム属に属するされる菌株としてコリネバクテ
リウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１
３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５
９９０、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９
９１、コリネバクテリウム・メラセコラＡＴＣＣ１７９
６５、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３
８６８、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡ
ＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタ
ミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アル
カノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウ
ム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０等が、ブレビバクテリ
ウム属に属する菌株としてはブレビバクテリウム・ディ
バリカタムＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１
３８６９、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１３
８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・サ
ッカロリティカムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリ
ウム・チオゲンタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバク
テリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテ
リウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２、ブレビバクテリ
ウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバ
クテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５等が、ミクロ
バクテリウム属に属するとされる菌株としてはミクロバ
クテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４等
が知られている。

【０００３】しかしながらこれら報告されているコリネ
ホルム型Ｌ−グルタミン酸生産菌野生株は脂肪酸組成の
比較や、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼイション、およ
び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析等、化学分類技
術や分子生物学的解析手法を取り入れた分類学の進展と
ともに、これらの菌株が属するとされていた属種の見直
しがなされ、現在ではその多くがコリネバクテリウム・
グルタミカムに属するとされている（インターナショナ
ル ジャーナル オブ システマティック バクテリオ
ロジー、４１巻、２５５〜２６０頁、１９９１年、イン
ターナショナルジャーナル オブ システマティック
バクテリオロジー、４５巻、７２４〜７２８頁、１９９
５年）。

【０００４】コリネバクテリウム属には現在２３の正式
種名が報告されている。このうちコリネバクテリウム・
グルタミカムとコリネバクテリウム・カルナエに属する
菌株の中にＬ−グルタミン酸を生産する菌株が存在する
ことは知られているが（インターナショナル ジャーナ
ル オブ システマティック バクテリオロジー、４５
巻、７２４〜７２８頁、１９９５年）、その他の種に属
する菌株がＬ−グルタミン酸を生産したという報告を発
明者等は知らない。また、上述のコリネホルム型Ｌ−グ
ルタミン酸生産菌として報告された中にはコリネバクテ
リウム・ストリアタムに属する微生物は見いだせず、さ
らにはコリネバクテリウム・ストリアタムに属する微生
物が多量のグルタミン酸を蓄積したという報告もない。

【０００５】上述のコリネホルム型Ｌ−グルタミン酸生
産菌野生株からＬ−グルタミン酸収率の向上した変異株
が育種され、また効率良い生産プロセスが開発され、高
い生産性が得られているが、今後のＬ−グルタミン酸需
要の拡大に応えるには、さらに安価かつ効率的なＬ−グ
ルタミン酸の製造法の開発が求められている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高い
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン
酸生産菌野生株を自然界より見出し、安価かつ効率的な
Ｌ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は従来
の微生物とは異なった微生物であって、かつＬ−グルタ
ミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した結
果、コリネバクテリウム・ストリアタムに属する微生物
が高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見いだ
し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は以下の通りである。 （発明１）コリネバクテリウム・ストリアタムに属し、
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、培地中で培
養し、生成したＬ−グルタミン酸を培養液から得るＬ−
グルタミン酸の製造法。 （発明２）培地に脂肪酸エステル系界面活性剤または抗
生物質を添加することを特徴とする発明１記載のＬ−グ
ルタミン酸の製造法。 （発明３）脂肪酸エステル系界面活性剤がポリオキシエ
チレンソルビタンモノパルミテイトであることを特徴と
する発明２記載のＬ−グルタミン酸の製造法。 （発明４）抗生物質がペニシリンであることを特徴とす
る発明２記載のＬ−グルタミン酸の製造法。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明で使用される微生物はコリ
ネバクテリウム・ストリアタムに属し、Ｌ−グルタミン
酸生産能を有する微生物である。そのような微生物とし
ては、北海道登別で採取した枯葉から分離されたコリネ
バクテリウム・ストリアタムに属するＡＪ１３３５０が
挙げられる。その他、コリネバクテリウム・ストリアタ
ムに属する微生物は、例えばＡＴＣＣから分譲を受ける
ことができ、ＡＴＣＣ６９４０、４３７３５、４３７５
１等を挙げることができ、これら微生物がＬ−グルタミ
ン酸生産能を有することを確認する手段は、特公昭６１
−４３０３８号公報の実施例に示されたフラスコ培養法
や本願実施例に示された方法を用いることができる。

【００１０】ＡＪ１３３５０は採取した枯葉を粉砕し、
水に懸濁。懸濁液をＡＬ寒天培地（蒸留水１ｌ当たり４
０％乳酸ナトリウム ６ｍｌ、塩化アンモニウム１．５
ｇ、リン酸２水素カリウム０．８ｇ、硫酸マグネシウム
・７水塩０．１ｇ、塩化第二鉄水和物０．０２ｇ、寒天
１５ｇを含み、ｐＨ６．８に調製後１２０℃で１５分間
殺菌）に塗布し、３０℃で１日培養する方法で分離され
た。

【００１１】ＡＪ１３３５０は下記の通りの菌学的性質
を有する。尚、形態、培養的性質はベネット（Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ）寒天培地（蒸留水１ｌ当たり酵母エキストラク
ト１ｇ、ビーフエキストラクト１ｇ、ＮＺアミンＡ２
ｇ、グルコース１０ｇ、寒天１５ｇを含み、ｐＨ７．３
に調製後、１２０℃で１５分間殺菌）で３０℃、４８時
間培養後観察した結果である。 Ａ．形態 （１）細胞の形 桿菌。多形態性で、こぶ状、あるいは
三角型状の細胞が認められる。Ｖ型の分裂細胞が認めら
れる （２）大きさ ０．２５−０．５Ｘ２−３μｍ （３）運動性 なし （４）胞子 なし （５）グラム染色性 陽性 Ｂ．培養的性質 ベネット寒天培地でのコロニー形態 円形、表面は平
滑、半透明、黄色、なめらか、隆起状、光沢有り Ｃ．生理学的性質 （１）カタラーゼ ポジティブ （２）オキシダーゼ ネガティブ （３）グルコースＯＦテスト 発酵能ネガティブ（但し
嫌気的条件下、微弱な酸生成は見られる） （４）生育ｐＨ ｐＨ４．５生育不良、ｐＨ５〜７生育
良好 （５）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、３
７℃生育可、４５℃生育不可

【００１２】これらの菌学的性質からＡＪ１３３５０は
コリネホルム桿菌と判定された。

【００１３】コリネホルム桿菌を分類する上で脂肪酸組
成の解析は優れた方法とされていることからトリプトン
ソーヤ寒天培地（蒸留水１ｌ当たりトリプトン１５
ｇ、ソーヤペプトン５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１
５ｇを含み、ｐＨ７．３に調製後、１２１℃、１５分間
殺菌）で２５℃、２４時間培養したＡＪ１３３５０から
脂肪酸を抽出し、ＭＩＤＩ微生物同定システム（ＭＩ
Ｓ）（ＭｉｃｒｏｂｉａＩＩＤ Ｎｅｔｗｏｒｋ ＵＳ
Ａ）により脂肪酸組成を解析した。その結果、ＡＪ１３
３５０には主要な２種の脂肪酸、ヘキサデカノイック酸
（Ｃ１６：０；４７．８％）とオクタデセノイック酸
（Ｃ１８：１；４７．７％）が見られた。ＡＪ１３３５
０に存在するその他の脂肪酸の存在比を含め、得られた
脂肪酸組成のプロファイルをデータベースに登録されて
いる各種微生物（コリネバクテリウム属に属する１９種
を含む）の脂肪酸酸組成プロファイルと比較したとこ
ろ、表１に示すようにコリネバクテリウム・ストリアタ
ムの脂肪酸組成と極めて高い類似性を示したことからＡ
Ｊ１３３５０はコリネバクテリウム・ストリアタムに属
する菌株であると判明された（表１に示したｓｉｍｉｌ
ａｒｉｔｙ ｉｎｄｅｘの値は比較する両者の脂肪酸組
成プロファイルが完全に一致した場合に１．０となり、
通常０．５を越えると両者の類似性は高いと判断され
る。表１には高い類似性が見られた結果のみを示し
た）。

【００１４】

【表１】

【００１５】コリネバクテリウム・ストリアタムに属す
る菌株を用いてＬ−グルタミン酸を生産させるには、炭
素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養
培地を用いて常法により行うことができる。合成培地ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用さ
れる炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なも
のならばよい。

【００１６】炭素源としてはグルコース、シュークロー
ス、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用される。
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩等
が用いられる。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
さらにペニシリン等の抗生物質、脂肪酸エステル系界面
活性剤の添加は良好な結果をもたらす。

【００１７】培養方法は、発酵温度２０ないし４０℃、
ｐＨを５ないし８に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には炭酸カルシウムを加えるか、ア
ンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時
間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量
のＬ−グルタミン酸が蓄積される。

【００１８】培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グ
ルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃
縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィ
ー等によって単離することができる。

【００１９】

【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに説明す
る。

【００２０】実施例１ グルコース８０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水塩１ｇ／
ｌ、リン酸２水素カリウム１ｇ／ｌ、大豆加水分解濃縮
液（全窒素として）０．４８ｇ／ｌ、硫酸第一鉄７水塩
０．０１ｇ／ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０１ｇ／ｌ、
ビタミンＢ１２ｍｇ／ｌ、ビオチン ２μｇ／ｌを含有
する培地３００ｍｌを１ｌ容ジャーファーメンターに張
り込み、１２０℃で１２分間殺菌後、３０℃で２４時
間、前培養培地（蒸留水１ｌ当たりバクトトリプトン１
０ｇ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ、塩化ナト
リウム０．２ｇ、寒天２０ｇを含み、ｐＨは６．０に調
製）にて培養したコリネバクテリウム・ストリアタムＡ
Ｊ１３３５０を接種し、３０℃で通気攪拌培養した。通
気量は０．２５ｖｖｍ、攪拌速度は７５０ｒｐｍに設定
した。培養ｐＨはアンモニアガスでｐＨ６あるいはｐＨ
７に定値制御した。培養開始後、培養液の２６倍希釈液
の５６２ｎｍにおける吸光度が０．４上昇した時にポリ
オキシエチレンソルビタンモノパルミテイト（ツイーン
４０）を添加し、糖が枯渇するまで培養を継続した。表
２、表３に培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタ
ミン酸と２−オキソグルタル酸を測定した結果を示し
た。

【００２１】

【表２】

【００２２】

【表３】

【００２３】実施例２ ペニシリンの添加効果を実施例１と同様の培地、培養方
法を用いて検討した。培養ｐＨは６．０にアンモニアガ
スで定値制御した。培養開始後、培養液の２６倍希釈液
の５６２ｎｍにおける吸光度が０．４上昇した時にペニ
シリンＧを最終１０ユニット／ｍｌになるように添加
し、糖が枯渇するまで培養を継続したところ、４．９ｇ
／ｌのＬ−グルタミン酸が蓄積した。

【００２４】ＡＪ１３３５０株は、平成９年６月２６日
に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２８８として寄託されている。

【００２５】

【発明の効果】野生株である本発明の菌株は高いＬ−グ
ルタミン酸生産能を有することから、コリネホルム型Ｌ
−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を
用いてさらに高い生産能を付与できると考えられ、また
培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グル
タミン酸製造法の開発につながるものと期待される。コ
リネバクテリウム・ストリアタムはｐＨ６付近において
Ｌ−グルタミン酸をもっとも効率よく生産する。このた
め、ｐＨ７．５付近でＬ−グルタミン酸をよく生産する
他のコリネバクテリウム属に属するＬ−グルタミン酸生
産菌と比較して、培養開始時に培地に添加されるアンモ
ニア等のアルカリの量が少量ですむ。さらに、培養終了
時にＬ−グルタミン酸を晶析するために必要な塩酸等の
酸の量が少量ですむ。アルカリと酸の軽減は、発酵原料
のコストダウンにつながる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネバクテリウム・ストリアタムに属
   し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、培地中
   で培養し、生成したＬ−グルタミン酸を培養液から得る
   Ｌ−グルタミン酸の製造法
2. 【請求項２】 培地に脂肪酸エステル系界面活性剤また
   は抗生物質を添加することを特徴とする請求項１記載の
   Ｌ−グルタミン酸の製造法
3. 【請求項３】脂肪酸エステル系界面活性剤がポリオキシ
   エチレンソルビタンモノパルミテイトであることを特徴
   とする請求項２記載のＬ−グルタミン酸の製造法
4. 【請求項４】抗生物質がペニシリンであることを特徴と
   する請求項２記載のＬ−グルタミン酸の製造法