JPS58124721A - 脳下垂体前葉ホルモンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質の精製（＝関する。さら４：靜し
くは、本発明は、脳下垂体前葉ホにモン、六とえは、生
長ホルモン１六はプロラクチンの精製４：関する。

脳１垂体前葉ホルモンは、を椎動物の脳下垂体の前葉、
すなわち、脳）垂体線部、から得らする。

ζ１らのホルモンはすべてタンパク質であり、（して生
物学的研究Ｃ：基づいて性腺刺激ホルモン１六は代謝ホ
ルモンとして分類）ることができる。

こｎらのホルモンには、生長ホルモンとプロラクチンが
包含８する。

生長ホルモンは、を椎動物の脳）垂体前ｆｉ（：、！つ
て生産さする同化タンパク質である。（ｎらの分子量は
ほぼ２２．０００ダルトンである。ζ１らのホルモンは
、組織の生長を促進し、（してタンパク質の代謝ならび
４：脂肪、炭水化物お１び無８１ｍ質の代謝め他の相の
軸輪に参加する。異なる種の動物中で生産さする生長ホ
ルモンは、誘！！さする抗原、等電点、Ｎ−末端および
Ｃ−末端アミノ酸残基、お１びアミノ酸＆ｇ成が質化す
る。生長ホルモンは６般６二ｓ％異性があり、すなわち
、１つの種からの生長ホルモンは他の種（＝おいて不活
性である。

種々の障害は、動物４：おける生長ホルモンの欠乏（二
帰因することがある。ヒトにおけるζｎらの障害のうち
第１のものは、）垂体性％ＩＩＪ−発育症である。生長
ホルモンの投与は％下垂体の欠乏を克服できる。さら檻
：、生長ホルモンは、胃腸管内の出血の処置、骨折の治
ゆの促進および挫傷や他の創傷の治ゆの加速≦二おいて
有用である。１次、生長ホルモンは、飼料の消費を増加
しないで肉および乳の生産を促進ブるため食物補助物質
として使用ノると角、家畜類を飼育することにおいて価
価がある。

生長ホルモンは、切除した脳）垂体組織から単＃ｌｌ！
！することに１す、得ることができる。たとえば。

Ｃ，Ｈ，Ｌｉ、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、２１１．５５
（１９５４）参照。１次、生長ホルモンは、生長ホルモ
ンの生産を特定する組換えＤＮＡを含有する遺伝工学的
（＝得もｎｑ微生物から得ることができる。Ｐ、Ｈ。

８ａｅｂｕｒｇ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ　２７６
＋７９５−７９８（１９７８）：Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒ
ｇ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ＋２７０．４８６−４
９４（１９７８）：Ｊ、Ａ、Ｍａｒｔｉｍｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、２０５．６０２−６０７（１９７９）
参照。

ζ１らの方法の両省は、脳下垂体のホモジエネー計１次
は生物学的汚染物質を含有する発酵培地からの生水ホル
モンの分離を必要とブるりζ１らの汚染物質は、生長ホ
ルモンの特異的な生物′学的活性を減少ブる傾向があり
、また望ましくたい副作用、六とえは、不都合な免疫学
的応答を起こフことがある。

プロラクチンは、催乳ホルモンとしても知ら１ており、
ヒツジおよびオワリの脳”Ｆ画体から単離さ１てきた。

プロラクチンは、Ｎ−末端４：スレオ二ンをもつ単一の
ポリベグテド拳から成ゐタンパク質である。Ｃ−末端は
半分のシスチン要事で満たさ１ていて、分子の残部とジ
ャルンアイド結合を介してループを形成している。プロ
ラクチンは、哺乳動物における分娩−の乳汁分泌の誘発
、哺乳動物の腺の増殖、およびレウチン（ｌｅｕｔｉｎ
　）細胞からのプロゲヌテロンの解放において役立つ。

本発明は、脳Ｊ垂体ホモジェネート１六は脳下垂体前葉
ホルモン生産微生物を含有する発酵培地から、汚染物質
を実質的（：含１ない、脳）垂体前葉ホルモン、ｆｃと
えは、生長ホルモン１六はプロラクチンを回収する方法
（二関する。ζ１は、ホルモン含有混合物をイオン交換
カラムに通ｉ！４させ。

おして溶出液１等！集中カラムで分別すること仁１つて
遅成さｎる。溶出液の２ラクシヨンを、等蒐集中カラム
から１問題の特定のホルモンの等電ｐＨまた＃′ｉ（の
付近において集める。たとえば。

ヒトの生長ホルモンは等蒐集中カラムからｐＨ４，９（
＝おいて集めらｊ、こｎに対してヒツジの生長ホルモン
は６．８の千の等電点じおいて集めらするであろう１等
電的に集中さｆ′Ｉたフラグジョンは、有利≦：、集め
、無菌水１：対して透析し、次いで得らｒ＋＋透析生成
物を凍結乾燥することができる。凍結乾燥し次生成物は
、ドテシル硫酸ナトリクムのゲル上の１気泳動分析、オ
ークテルロニー平板上の免疫拡散、１斤は両名によって
向足さｎる・実質的Ｉ：純粋た脳）垂体１１１：ＩＮホ
ルモンは、を椎動物の脳）垂体前葉から、塩を含有ブる
緩衝溶液中で脳）垂体なホモジエナイザーでブリつぶす
ととじ１つて、得ることかできる。

ホモジエナイザ−Ｉ：↓るすりつぶしは１組敗。

ｐＩ（お工びイオン強度がホルモンに悪影響をかほさな
い、イオン化性塩含有緩ｗｉ液中て実施する。

緩衝液は、好１しくに、汚染性タンパク質を塩析するこ
とじエリ荒い分別を実施するために十分な堪を含有する
か、所望のホルモンを沈殿させるのに不十分な塩を含有
する。このような緩＠液の組ｂ！ｉ、Ｆｉ、広く案化す
ることができる。一般に、緩衝液は約７〜９の帥囲のｐ
Ｈと、０．１−１モルのＮ　ａ　Ｃｔ＋！ｌ沿に等しい
イオン強度を１１１する。六とえば、　Ｗａｌｌｉｍ　
＠ｔ　ａｌ、Ｊｉｏｅｈ＠ｍ、Ｊ、＋　１００　：５９
３−５９９（１９６６）参照。

脳）垂体前葉をホモジエナイザーでブリつぶし穴径、得
らするホモジエネートを緩衝溶液に対して透析する。こ
の緩衝溶液は、前述の緩衝液に類似するが、高度にイオ
ン化性の塩を含有しない。

この透析は、ホモジエネートのイオン強度を低）させる
なめＣ：笑施フる。イオノの除去は、引き続いて接触ブ
るイオン交換クロマトグラフィーの物質へのイオンの妨
害を紡ぎ、（して高いイオン強度の溶液とホルモンとの
接触から生ずる悪影響を回避ブる。

透析が完結し次とき、生長ホルモンを含有する透析し六
２ラクションを、イオン交換グロ！トグラ２イー（：エ
リさらに精製する。普通の１１１４製法は、不純物のホ
ルモン含有溶液がカラムＣ二結合ブるＣと４：頼る＠　
Ｍ＠ｔｈｏｄｌ　　ｉｎ　Ｅｎｚ７ｍｏ　乃ｌＬ二ち１
・ＸＸＩＩ＋Ｓ＠ｅｔｉｏｎ４．Ｅｄ、Ｗ、Ｂ、　Ｊａ
ｋｏｂ）’、Ａｅａｄ＠ｒｎｉｅＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、
（１９７１）参照。溶液の不純物は。

カラＪ−管通過し、ヤして溶出液中に集めらｎる。

カラＡを失活し、ヤシて結合し六ホルモンを集める追加
の工程を一般６二必要とする。たいていのホルモンと異
なり、脳１垂体前葉ホルモン、たとえは、生長ホルモン
１六はグロラクテンは結合しないで隙イオン交換カラＪ
−を通過ブることが、今や発見ａｒ六、この性質のため
、脳）垂体前葉ホルモン含有混合物を隙イオン交換カラ
ムで連続的にｎｍ−することができる。所望のホルモン
はカラム管通遍し、−力不純物の実質的部分は後（二残
り。

カフ五内ζ：捕捉さする。この１うな手順は、カラムの
一定の失活および（ｎからのホルモンの取り出しを必要
としない、七の代わり、陰イオン交換精製は妨害さｎな
い状塾を続けることかでき、カラムの不純物を＆持する
各量Ｃ二１ってのみ制限さｊる。この容量Ｃ：到遇した
とき、カラムを失活し、不純物を溶−シ、（シて手ｌ１
ｉｌｔ−再び更新ブることかできる。

陰イオン交換物質、六とえは、ジエテルアイノ七ルロー
ヌ（六とえば、　Ｗｈａｔｍａｎ　ＣｈｅｍｉａａｌＳ
＠ｐａｒａｔｉｏｎｓ、　Ｉｎｅ、＋　Ｃ１１ｆｔｏｎ
、Ｎ、Ｊ、かも入手できるＤＥ−５２）は、本発明の方
法４：おいて適当であゐことがわかつ六。陰イオン交換
カラムを通して透析Ｐ１１を溶離ブる六めに使用ノる緩
ｌ１ｉｉ液は、ボモジエナイザーの緩衝液（ニ一般ｃ二
類傷ｔＬが、塩分は好１しくは実質的に減少姑ｒている
―ホ毫ジエネートの透析Ｗｉを活性化陰イオン交接カラ
ムに通過させ、ヤして脳１重体小Ａモンを溶出液中４：
集める。次いで、この溶出ｐＩＩｌを１分子量のカット
オフが約１０，０００である限外濾過膜を用いる限外ｐ
通ｇ：エリ、濃ｍ′する。

陳外ｐ過の手順は脳１垂体前集ホルモン含儒泗叡のイオ
ン強度を増加するので、５ａｓａｎたＦ沿を無菌水（ニ
ガして透析して、イオン強度を減少ブる。

得ら１六ホルモン含有透析生成物は２等電集中ｂ　Ｃ１
ｓｏｅ、１ｅｅｔｒｉｅ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｐｒｏｅ
ｅｓｓ）　　（：１すａらＣ二組！１！する。この方法
において、電気化学的にｎ発しｆＣｐＨの勾配を、一定
温度５：おいて。

垂ｌカラＬ内の陽極と陰極との間ζ：発生させる。

この１うな勾配は１両性電解質として知らｎ７’ｔ、種
々の電荷とｐＩ（をもつアミノ酸の低分子量ポリオ−に
よって構成さｊる。このポリマーは、陽極と陰極との間
の電位差（：応答して、ｐＨの勾配を確立する。種々の
ｐＨｌ１！囲の両性電解質混合物は商業的に入手ブるこ
とができ（六とえは、ＬＫＢ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）、そして用いる特定の
ｐＨの岬囲は問題のタンパク質の等電点（二依存する。

ｐＨの勾配は、有利にはスクロースの密度の勾配の１ｉ
１１ｉ！ｆｌ内で安定化する。カラムへ加えらｆ′Ｉｆ
ｃタンパク質の混合物は、ヤ１らの等電もしくは１集中
１の点のｐＨに到達ブる１で、陽極１には陰極に向かっ
て移動）る。Ｏ，０１ｐＥ単位程度６：ｌトさく異なる
タンパク質の分離を、この技術により過酸できる。本発
明の方法は、ＬＫＢ　４４０＋ｄ分離用等電集中カラＪ
−（ＬＫＢ　、　Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、ＭＤから入
手できる）を利用で色る。

タンパク質成分がカラムから溶離さｎるとき。

−ｔ　ｒｒらの成分の吸収を紫外分光分析Ａ　　　（２
８０８０ ｎｒｎ）　（：　Ｌり測定ブる。ｐＨは溶出沿の連続す
る１、０−のフラクシヨンについて測定する１次いで、
問題の特定の脳１垂体前葉ホルモンの等電点の約０．３
ｐＨ単位内、好１しくは約０．１ｐＨ卑位内のフラクシ
冒ン含プールして、活性フラクシ四ンｔ′形成する。種
々の脳）垂体ホルモンの等電点ｔｌｌＩに記載する。

等電点的に集中させた物質は種々の不純物、六とえは、
両性電解質、スクロースおｔび尿素を含有することがあ
るので、プールし六フラクシ冒ンは好１しくは無菌水に
刻して透析し、ヤして乾燥して、六とえは、凍結乾燥し
て、精製さｎ次脳下垂体ホルモン物質を得る。

別法として、プールし大フラクションは、分子量が１０
．０００以上の化合物を保持する竜ファデクス（Ｓ＠ｐ
ｈａｄ＠ｘ　）カラムｃ：１り精製ブることができる。

次いで、カラム＆：保搗さ１六物質は、取り出し、乾燥
することができる。精製さｎ７をタンパク質の同一性は
、ドデシル硫酸ナトリフ１のゲル上の試薬の電気泳動（
Ｗｅｈ＠ｒ＋　Ｋ、　、ｓｔ　ａｌ、　ｅＪ−Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、２２４．４４０６（１９６Ｂ）参Ｒ）なら
びζ：オークブルロニー平板（Ｇａｒマ・ｙ＋Ｊ−８−
・ｔａｌ−＋　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇ）’　　Ｖｏｌ−ＩＩＬＷ、Ａ、Ｉ３ｅｎｊ
ａｍｉｎ、Ｉｎｃ、＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓ＠ｔｔｓ（１
９７７）　Ｐｐ、３１３−３２１　）参照）Ｃ：１って
確認することができる。

本発明の方法は、微生物（：よって生産−ａｎる脳１重
体罰葉ホルモンを精製する六め（：用いること４できる
。生重さｆ１六ホルモンが細胞内（二ととする以外、！
Ｉ！質的≦：同じ手順に従う。この１うな場合Ｉ：おい
て、ホモジエナイザ−（：ぶるブリつぶしの間、細胞を
溶解して、ホルモンを解放することができる。

次の寮施例に１す、本発明をさら４：説明する。

東　　施　　例　　工 脳１垂体から得らｆ１７’ｔクシの 生長ホルモンの精製 ５０のウシの脳下垂体、１さ１０１　ｆ、を、ホウ酸塩
−ＨＣｊ午の０．２５モルのＮａＣＡ、ｐＨ８，７、ｌ
１１１１ＷｌｌＤ２００ｍ１ｃ用いてビｈテス（Ｖｉｒ
ｔｉｓ）４５ホモジエナイザ−６：１すすりつぶした１
次いで、このホモジエネートを水浴中で３−関か！１ぜ
六。引き続いて、このホモジエネートをプールい（８゜
１，１、■）＊ゎ分、器ア、。ＯＯｒｐ。、２おいて１
５分間遍ＩｃＪ分離し、上澄み液をデカントした。

デカントした上澄み液を、ＮａＣＡ　を含有しない、ホ
ウ酸塩−ＨＣｊ含儒含有溶涼、ｐ　Ｈ８，７４二対して
透析し良、りいで、透析生成物をＤＥＡＥ−５２カラム
（３０ｍＸ７個）６：通し次。ＤＥＡＥ力■ ラムを通過するＢＧ）ｌを集め、アミコン（Ａｍｉｅｏ
ｎ　）装置で限外濾過して濃縮し、次いで分離用等電集
中カラ１（ｐＨ＃凱　６．０−８．０　）　４二人１大
、４０鮪間後、カラムからの溶離を開始し、ｐＨ６８４
ｍおいて２ラクシヨンを集め、プールし、無１ｉ　Ｈ，
０≦二対して透析し虎。このＢＧＨ含＊＊Ｗを、アミ■ コン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　＠雪で再び限外−過しな、純
粋なりＧＨの収量は、はぼ８５１１Ｆで６つな。

精製子扉の各１穆（二おいて、ＳＤＳゲル電気泳動、オ
ークチｈロニー免疫測定およびパイオーラド（Ｂｉｏ　
−Ｒａｄ）タンパク質分析を１！施して、得らする生成
物の純度を監穎した。

実　　施　　例　　ＩＩ 遺伝的じ質性し六Ｅ、Ｃｏ１１から 得らｆ′ｌ六ヒトの生長ホルモンの精製ヒトの生長ホル
モンを生産できる遺伝的に変性し７ｔＥ、Ｃｏ１１　　
細胞を、欧州特許公開ｇ１００２，０１４１′ｋＪ（Ｂ
ａｘｔｅｒ　ｅｔａｌ）　４二記１１１！８ｆ′Ｉてい
る方法１：従ってつくる。Ｅ、Ｃｏ１１　　細胞を発酵
培地中で培養し、セシてリゾチームで細胞を溶解するこ
とに１リヒ［の生長ホルモンを解ｍ″する。次いで得ら
ｎ次混台物を、ホウ酸塩−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩衝溶
沿中の０．２５モルのＮａＣｔの２００−で緩ＩＩブる
。

得らｆ′ｌ六混合物を、水浴中で３町間かき１ぜる。

ホモジエネートを引龜統いてンルバル（５ｏｒｖａＦ’
）遠心分離器で５００　Ｏｒｐｍにおいて１５分間遠、
ＣＪ分離し、上澄液をデカントする。

デカントし穴上澄み沿を、Ｎ轟Ｃｔを含１ないホウ酸塩
−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩ａ液を含ＴＩする緩衝Ｗ！Ｊ
沿に対して透析する。久いで、透析生成物をＤＥＪＥ−
５２カラム（３０ｍｘ）ｃＩＩＩ）　Ｃ通−ｊ、Ｄ次い
で分離用等電集中カラム（ｐｕｌ！囲、６０〜Ｂ、０）
に入ｊる。４０１ｊ＋間後、カラムからの溶離を開始し
、ｐ　Ｈ４，９ζ：おける２ラクシ目ンを集め、プール
し、無菌）１２０４：対して透析する。生長ホ■ ルモン含有溶液をアミコン（Ａｍ１ｅｏｎ　）ｌｉｆｌ
で再び鐵外テ遇して、純粋なヒトの生畏ホルモンを得る
。

精製手響の各工程シニおいて、８０Ｓ−ゲル電気泳動、
オークテルロ−免疫測定お１びバイオ−ラド（Ｂｌｏ−
Ｒａｄ）　タンパク質分析を５ｊｉ！施して、得らする
生成物の純度を監視する。

表　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１脳１垂体前葉ホｈ毫ン含有混合物を陰イオン交換
   カラムにおいて緩衝ｍｔｅｉで溶離し％溶出液を等蒐集
   中カラムにおいて分離し、ヤして脳）垂体前葉ホルモン
   の等電点１７’ｔｔｌｊヤの付近（：おいて集めらｎた
   フラクションｖｔ４１１持することからなる。 脳１垂体前葉ホルモンの精製法。 （２１脳１垂体前葉ホルモンの等電点１次は（の付近に
   おいて集めら１次フラクションを、無菌水で透析し１次
   いで凍結乾燥する４ＩｉＦ許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ＋ｓ＋　ｎ　Ｉｆ　Ｌ　次脳下垂体ホルモンは生長ホル
   モンである特許請求の範囲第１１ｆｔは２項記戦の方法
   。 （４）精製した生長ホルモンはクシ、ヒト、ブタ、ヒツ
   ジ、ラット１ｆｔ＃′ｉオ９シからの生長ホルモンであ
   る肴許ｆｌ求の範囲第１１六は２項記載の方法。 （５１精製した脳１垂体前葉ホルモン社ウシ、ヒト、ブ
   タ、ヒツジ、ラット１穴はオウレからＯプロラクチンで
   ある特許請求の範囲ｍｌ’！六は２項記載の方法。 （６）脳ｔｍ体前葉ホル毫ン含有混合物は、約７〜９の
   ｌ１１１２ｔｌのｐＨお１び０．１〜１モルのＮａＣＡ
   溶液に等しいイオン強度を有する緩＠ｆｌｊｆＩＩ中で
   脳）重体をホモジエナイザーですりつぶすこと６二よっ
   て得る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７）緩衝液はホウ酸塩−ＨＣｌ　中の０．２５モルの
   ＮａＣｊであり、（シて約８．７のｐＩ（を＊’する特
   許請求の爬囲第５項記載の方法。 ｔｅｌ　ｐ　Ｈ７〜９を有するホウ酸塩−ＨＣ２緩衝溶
   液を使用して、陰イオン交換カラムにおいて脳１垂体前
   葉小ルモンさ１混合物を溶離ブる特許請求のＳＳ第１項
   記載の方法。 （９）緩ＩＩ溶沿の溶離液はｐＨ約８．７會有ブる特許
   請求のＳＳ第８項記載の方法。 ＩＱホルモン含有ホモジエネートのイオン強度を透析（
   ：１り低１し、透析生成物を陰イオン交換クロ１トゲラ
   フのカラムに通ブこと６：１つて楕製し。 溶出液を約１０，０００　　の分子量のカットオフの限
   外濾過膜で限外枦遇すること（二より濃縮し、限外Ｐ遇
   沿を無菌水に刻して透析することによって（のイオン強
   度を低重し、透析した限外−過液を分離し、ヤして等電
   点１ｆｆｔｉ−１の付近において集めらｒ＋六フラクシ
   ョンを保持する、ことからなる脳″Ｆｆ１体前葉ホル毫
   ンの精製法。