JPS58142257A - 試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異結合分析技術の発展Ｆｉ、液体媒体中に極めて低仏
員度で存在する１診断、医学、環境及び工業に重要な１
種々の有機物質を＃ｊ定する極めて有用な分析法を提供
した。特異結合分析は。

測定すべき物質（本明細書に被分析物と記す）とその結
合対手との間の特異反応に基づく、被分析物及びその結
合対手の一方が抗体であり。

他方が対応するハプテンまえは抗原である場合。

この分析は免疫分析として知られている。被分析物と結
合対手との他の結合反応は、ホルモン。

ビタミン、代謝産物及び薬剤とそれぞれの受容体及び結
合物質との間の結合反応を含めて、結合分析の基礎とな
る。

常用の特異結合分析用ＩＩにおいて１分析すべき試験試
料を種々の組成の試薬系と液体反応混合物中で混合する
。このような試薬系は通常、（１）被分析物まえはその
特異結合アナローブと標識物質との複合体である標識複
合体及び（暑）被分析物に対する結合対手の限定量から
成る。反応混合物中で、試料中の被分析物及び標識複合
体は、結合対手への結合に’１４シて澗合し　Ｓｔ識複
合体の結合対手−結金種及び遊ｓｕ＋ｉが形成する。

遊一種と対比して結合種を生ずる標識複合体の相対量ｋ
ｉ、試験試験試料中介被分析物１１（會えは量）の函数
である。こうして遊ｓＩＩ中Ｏ榔識物質を調定し、ｉ＊
定され大量を試料中の被分析物の存在または量と相関さ
せることがで龜る。

結合種中の標識複合体を遊１ｍ１１１１［ＫＩＩ識複合
体が存在する場４１−に、　ＩＩ識の監視に使用する手
段によっては本質的に区別できない場合１分析を完結す
るに＃ｉ結合種及び遊離種を物層的に分離しなければな
らない。この種の分析は１文献に「不均一系」と言われ
ている。標識複合体の結合穏及び遊離種が相互−存在し
ていても１区別できる場合には、「均−ＪＩＩＫｕえが
うことができ１分離工場を省くことが、できる。

本発明＃ｉ１発光性＊ｇｍ、例えば化学発光物質及び螢
光物質を使用することを含む、試験試料中の被分析物の
定量及び定性用の、均−及び不均一系特異結合分析法及
び試薬系に関する。殊に、本発明は均−系のそのような
方法及び試薬系、特に螢光性＃隼基質−活性標識を使用
する方法及び試薬系に関する６本発明は更に、このよう
な分析法及び試薬系に使用される発光性−及び発光団−
標識複合体に関する。

見い出されるべく、見い出された最初の高感度特異結合
分析は、標識として放射性同位元素を使用する款射免疫
分析であった。このような分析は、標識の監視しうる特
性が遊離種及び結合種間で定性上便化しないので、必ら
ず不均一型によらなければならない、放射性物質を取り
扱う不便さ及び困難のため、補因子、酵素基質。

酵素調節剤、例えば活性剤及び抑制剤、閉婁試薬、スピ
ンラジカル、酵素、バクテリオファージ、金属及び有機
金属錯体、有機及び無機触＊。

補欠分子団、イヒ学−光性試薬及び螢光分子を含めて、
放射性同位元票以外の物質を標識成分として使用する分
析系が工夫された。

このような特異結合分析技術Ｋｔｊ、発光性標識、％に
化学発光物質及び螢光物質を使用する技術がある。この
よう彦分析法では、標識複合体の遊離種は、適当な手段
により励起すると発光しうる発光団に結合した被分析物
またはそのアナローブから成る被分析物−発光団壷合体
を生じる。このような分析法の感度は１発光団標識を発
光によＯ＃［定する能力に左右され、複合体の被分析物
またはアナローブ部分から妨害されることがない、複合
体中の被分析物またはそのアナローブが１発光団に近づ
くと１発光団標識の発光性を著しく減少しうる−のであ
る場合Ｋｉｄ、このような被分析物の分析法の感度は著
しく墨化する。

本発明の目的は、ある特異結合分析、譬に均一系分析に
使用される発光性標識の、このような被分析物で誘発さ
れる消光を軽減する手段を提供する仁とである。

均−系発光性酵素一基質一標識脣異結金分析法は、バー
ド（Ｂｕｒｄ　）ら著、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ
。

７７　Ｓ　５６（１９７７）及びドイツ連邦共和Ｉｉｌ
特許出願公開第２，６１８，５１１号明細書及び１９７
６年３月１８日に出願され、　　＊ｉｉｉ受人に―受ら
ねた米国特許出願第６６７　、９９６号明細書に対応す
る英国特許第１　、５５２　、６０７号明細書に記載さ
れている。改良技術はハートら着、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ
ｍ、　２３　：　１４０２（１９７７）及び米国特−許
第４．２７９，９９２号明細書に記載されている。この
ような技術のキニジンの分析への適用については、シス
ザ　Ｌ　Ｃｓ１ｓｚａｒ）ら著、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ
ｍ、　２７　：　１０８７　（１９８１）に記載されて
いる。

発光性標識を使用する、文献記載の他の均一系特異結合
分析法は、下記の現象に基づくものを含む：螢光偏光（
ＭｃＧｒｅｇｏｒら著、（：ｌ　ｉｎ、　Ｃｈｉｍ。

Ａｅｔａｇ３：１６１（１９７Ｂ）　）　、螢光消光Ｃ
Ｓｈａｗら著。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、３０　：　５２６　
（１９７７）　）−螢光増強（Ｓｍ１ｔｈ、　ＦＥＢＳ
　Ｌ＠ｔｔｅｒｓ　７７　：　２５　（１９７７））　
−エネルギー移動（’ｊＪｌ１ｍａｎら著ｈ　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５１　：　４１７２　（１９７８）及び米国特許第３
，９９６，３４５号明細書〕、化学的に励起される螢光
〔米国特許第４．２３８，１９５号明細書〕及び螢光保
論（ｚｕｋら着、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、２５　：　
１５５４　（１９７９）及び米国特許纂３，９３５，０
７４号及び同第３，９９８，９４３号明細書〕６ 発光性標識を使用する不均−％異結合分析法は、米国特
許第３．７２０，７６０−ｊ）、同第３，９４０，４７
５号。

同第３，９９２，６３１号、４１許第４，０５８，７３
２号、同第４，１３３．６３９号、同第４．１４４，４
５２号、同第４，１７１，３１１号及び同第４，２０１
，７６３号明細書に記載されている。

螢光免疫分析法の概！！はヴアイサー（■１ｓｏｒ　）
ら著、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、Ｓｃｉ、　７０　：　４６
９（１９８１）　Ｋ記載されている。

本発明に補動的に間係するものとしては、ウニバー（Ｗ
ｅｂ＠ｒ）着、フラビンス・アンド・フラボプ四ティｙ
　（１Ｐｌａｖｉｎｓ　ａｎｄ　）’ｌａｖｏｐｒｏｔ
ｅｉｎｍ　）〔スラター（８１ａｔｔｅｒ　）　、　ｘ
　＃　スビーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）アムステルダム１
９６６　）　１５：〜２１頁及び分子内、づ：。

衝突及びエネルギー移動の現象に関するフォルスＩ　　
（Ｆｏｒｓｔｅｒ　）著、　Ａｎｎ、　Ｐｂｙｔ　２　
：　５５（１９４８）；静的消光の現象に関するラコウ
イッ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）ら著、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　
１２　：　４１６１（１９７３）：フラビンアデニンジ
ヌクレオチドの分子内錯体における重なりのない立体配
座及び重なりのある立体配座の相対割合を調べる際に螢
光の発生量及び寿命を使用する。スペンサー（５ｐｅｎ
ｃｅｒ　）ら著、ストラフチャー・アンド・ファンクシ
ョン・オプ・オキシディジョン・リダクション・エンザ
イムス（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　０ｘｉｄａｔｉｏｎＲｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｉ
ｎ＋ｃ）ｒｍｅｓ　）　（アクン：ｙ　（Ａｋｅｇｏｎ
　）ら編集、パージャモン会プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ
　Ｐｒｅｓｓ　）にューヨーク、　　１９７２）３９３
〜３９９頁；ヨーロッパ特許出ｌｉ第１５，６９５号明
細書及び免疫分析に非特異性蛋白結合による螢光妨害を
減少するため硬質高分子支持体に被分析物−螢光物質を
複合させる、ウルマン−（Ｕｌ　１ｍａｎ）ら著「ホモ
ジイニアス・・フルオレッセンス・イムノアッセイ（［
ｏｍｏｇ＠ｎ＠ｏｕｍ　Ｆｌｕｏｒ＠５ｃｅｎｃｅ　ｉ
■ｕｎｏａｓｍａｙａ）Ｊ。

イムノアツセイズ：クリニカル・ラボラトリイ・テクニ
ークス・フォア□・ザ１９８０ス（Ｉｍｍｕｎｏ−ａｓ
ｓａｙａ　：　Ｃ１１ｎｉｅａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒｔｈｅ　１９８０８
）　（ナカムラら編集、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉｅｓにニ
ーヨーク１９８０　）　）　１３〜４３頁がある。

本発明＃ｉ、分析の関に使用したか％または生成し友被
分析物−発光団複合体からの発光を消光する能力を有す
る被分析物の測定に発光性標識を使用する特異結合分析
法を改良しえものである。この改良は、被分析物または
そのアナローブが１発色団と１分析の際に発光を測定す
る被分析物−発色団複合体の被分析物まえはアナローブ
部分との消光配列を実質的に妨害する（即ち１着しく阻
止する）結合基によって発光性標識に結合されえ標識複
合体を使用することによって達成される１本発明Ｆｉ、
消光する被分析物またはそのアナローブに化学的に接合
した発光団％特に螢光物質からの発光を測定するととに
よって１分析を監視する、即ち検出しうる信号が試験試
料中の被分析物と相関する、均−系ま九は不均一系の任
意の特異結合分析、特に均一系免疫分析に適用しうる０
発光を測定する被分析物−発光団複合体は、分析試薬と
して試験試料と混合される発光性標識複合体と同一であ
るか、またはこのような発光性標識複合体試薬の関与す
る化学反応の生成物１例えば発光性標識複合体の酵素変
性生成物であってもよい。

発光性特異結合分析の感度Ｆｉ、結合基が複合体におけ
る未複合発光団の発光度の１０−％更に好ましくは１５
９ｂ、最龜好ましく＃′１２０ｓを観察するのに充分に
複合体の発色団部分と被分析物部分との間の消光態を妨
害する場合に、著しく改良される。被分析物で誘発され
る消光の低減Ｉｆｉ、結合基中に被分析物と発光団との
間の自由回転度を著しく制限するのに充分な剛性の部分
を含む仁とによって達成′される。

本明細書において、下記の用語は特に記載しない限り下
記のよう表意味を表わす： 被分析物−試験試料中の存在または量を測定する物質を
大は関連物質類。

被分析物の結合対応部−被分析物に対して。

′　通常可逆的な、特異結合親和性を 有する任意の物質または物質類。

被分析物の特異結合アナローグー被分析物の結合対応部
による結合ＫＩＩして被 分析物と同様に挙動する任意の物 質または物質類。

試薬系一本発明の分析の実施に使用する組成物、試験具
、試験キットまたは 他の物理的配列１手段または試薬 の組合せ。

被分析物 本発明の分析は１発光性特異結合分析法によって検出さ
れ、測定される被分析物−発光団−複合体において発光
団の不所望な消光を示す被分析物に適用することができ
る。特定の発光団を消光する。被分析物の性質はステル
ンーフォルｗ　−（９ｔ＠ｒｎ　−ＶＯｌｍｅｒ　）　
（Ｄ研究〔ステルン及ヒフ　＊　Ｊｌ／−ｖ−著、　ｚ
、ｐｈｙｓ、　２０　：　１８３　（１９１９）及びバ
アージア７　（Ｖａｕｇｈａｎ　）及びウニバー（Ｗｅ
ｂ＠ｒ）著、　Ｂｔｏｅｈｅｍ、　９　：　４６４　（
１９７０）　）、−このような研究でＦｉ、一定嬢度の
未複合発光団に増加するＳ度の潜在的消光物質を加え、
螢光に対する作用を監視する。被分析物轄通常、ペプチ
ド、ポリペプチド、蛋白、炭水化物、糖蛋白、ステロイ
ド、または特異結合対応部が生物学的糸に存在するか、
または合成されうる他の有機分子である。被分析物は１
機能的に１通常抗原とその抗体；ハプテンとその抗体；
及びホルモン、ビタミン、代謝産物及び薬剤及びこれら
の結合対応部から成る群から選択される０通常、被分析
物は１通常約１，０００〜約１０，０００，０００の分
子量を有する免疫活性ポリペプチドまた＃ｉ蛋白、例え
ば抗体ま九は抗原性ポリペプチドまたは蛋白。

または少なぐとも約１００．通常的１　、５００未満の
分子量を有するハプテンである。

代表的ポリペプチド被分析物ｉ１ｔ、アンギオテンシ：
／Ｉ及ＵＴ１．Ｃ−ペプチド、オキシトシン。

バソプレッシン、二二一ロフィシン、、／／ｘ）リン、
セクレチン、プラジキニン、及びグルカゴンである。

代表的蛋白分析物Ｆｉ、プロタミン、ムコ蛋白。

糖蛋白、グロブリン、アルブミン、スクレロ蛋白、燐蛋
白、ヒストン、リポ蛋白、りｐモ蛋白及び核蛋白である
。特定の蛋白は例えば、グレアルブミン、α１−リポ蛋
白、ヒト血清アルブミン、α１−酸糖蛋白、α１−抗ト
リプシン、α１−糖蛋白、トランスコルチン、チロキシ
ン結合グロブリン、ヘパトゲロブリン、ヘモグロビン、
ミオグロビン、セルロプラスミン、α２−リボ蛋白、α
意−マクログロブリン、β−リボ蛋白、エリスロボエチ
ン、トランスフェリン、ヘモベキシン。

フィブリノーゲン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、　
ＩｆＭ、　ＩｇＡ、　ＩｇＤ及びＩｇＥ、並びにこれら
の断片１例えばｌｉ’ｃ及びｉ’ａｂ、補体因子、プロ
ラクチン、血液凝固因子１例えばフィブリノーゲン、ト
ロンビン等、インシュリン、メラノトロピン、ソマトト
ロピン、テロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホ
ルモン、ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性
ラクトゲン。

内因子、トランスコバラミン、血清−Ｓ、例えばアルカ
リホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナ−ぞ、アミラーゼ
、リパーゼ、ホスファターゼ。

コリンエステラーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トラン
スアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ、及びウロペプシン、エンドルフィン、エンケファ
リン、プロタミン。

組織抗原、細菌抗原、及びウィルス抗原、例えば肝炎関
連抗原（例えばｓ　ＨＢａＡｇ、　ＨＢｃＡｇ及びＨＢ
ａＡｇ　）である、一 本発明は、例えば約１５００より小さい分子量を有する
ハプテン被分析物の分析に特に有用である。代表的Ｉ・
ブテン被分析物は、薬剤、代謝産物、ホルモン、ビタミ
ン及び同様の有機化合物の一般的種類を含む。ノ・ブテ
ン性ホルモンＦｉ、ヨードサイロニン、例えばチロキシ
ン及びトリヨードサイロニンである。ビタミン類はビタ
ミンＡ、Ｂ、例えばＢｕｓｈ　Ｃｓ　Ｄｈ　Ｅ及びに、
ｉｋｉ！Ｉｉ！及びチアミンを含む。薬剤は抗生物質１
例えばアミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、トブ
ラマイシン、アミカシン、シソマイシン、カナマイシン
及びネチルマイシン、ペニシリン。

テトラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、
及びアクチノマイセチン；ヌクレオシド及びヌクレオチ
ド、例えばアテノシンジホス７エー）　（ＡＤＰ）、ア
デノシントリホス７エー）（ＡＴＰ）、フラビンモノヌ
クレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチ
ド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）及びそのホスフェート誘導体（ＮＡＤＰ）、
？ミジン及びアデノシン；プロスタグランジンミステロ
イド、例えばエストロゲン、例えばエストリオール及び
エストラジオール、ステロゲン、アンドロゲン、ジゴキ
シン、ジギトキシン、及び副腎皮質ステロイド；及びそ
の他の薬剤１例えばフエノバルビタール、フェニトイン
、ヒリミドン、エトスクシミド、カルバムアゼビン、パ
ルプロエート、テオフィリン、カフェイン、プ薗プツノ
ロール、キニジン、アはトリブチリン、コルチゾール、
デシプラミン、ジソビランド。

ドキセビン、ドキソルビイン、ノルトリブチリン、メト
トレキセート、″イミプラミン、リドカイン、プロカイ
ンアミド、Ｎ−アセチルプロヵインアミド、アンフェタ
ミン、カテコールアミン、及び抗ヒスタミン剤管含む。

消光作用 本発明は、測定される被分析物−発光団複合体中の発光
団の発光性、即ち励起される発光する能力が複合体の被
分析物またはアナローブ部分によって消光されるのを妨
害、即ち分析的に著しく防止する結合基を使用すること
に基づく。

被分析物で誘発される消光作用Ｆｉ１発光団と被分析物
部分との間の物理的、化学的まｆｃ＃ｉ電気的反応に基
づくものであり、通常１分子内転位、特に本質的に直接
分子内衝突または共鳴エネルギー移動による転位に基づ
く０発光団と被分析物部分との間の反応により、被分析
部分が発光団と近似消光配列になる場合に発光団の消光
が起る。

１、直接分子内衝突 この消光現キーおいて１発光団の発光性の変調は静的ま
た・は動的工程から起りうる。発光団の励起前に発光団
と消光物質が反応する場合にＦｉ、静的消光が起るが、
励起された発光団と反応する場合には動的消光が起り、
これによって消光メカニズムは励起状態の減少について
発光と割合する。動的及び静的消光は発光団と消光物質
との短い範囲の衝突または接触反応を必要とする。

直接分子内衝突による消光のｗ、ｍ＃ｉ、文献〔バーシ
ャンら著、　Ｂｉｏｅｈ＠ｍ、　９　：　４６４（１９
７０））ｋ記載されており、分析化学〔ギルボールド（
Ｇｕｉｌｂａａｌｔ）著、フルオレッセンス、インスト
ラメンテイション・アンド・プラクテイス（Ｆｌ−ｕｏ
ｒ＠５ｃｅｎｃ＠％　　Ｉｎｓｔｒｕｍ＠ｎｔａｔｉｏ
ｎ　　ａｎｄ　　Ｐｒａｅｔｉｃｅ）、デツカ−（Ｄａ
ｃｋｅｒ　）　（＝　ｚ−ヨーク１９６７　）　３４９
頁〕、膜蛋白質の研究〔シニツキイ（５ｈｉｎｉｔｚｋ
ｙ）ら著、　　１３ｉｏｅｈ＠ｍ、　１６　：　９８２
（１９７７））−リポソーム−細胞反応の研究（ワイン
スタイン（Ｗ＠１ｎａｔ−ｅｉｎ）ら著、サイ：ｃ　ン
ｘ　（５ｃｉｅｎｃｅ　）　１９５　：　４８９（１９
７７）　）　、及び酵素分析〔ヤａ　ン（Ｙ＆ｒＯｎ　
）ら著、ムｍａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９５　：　２
２８　（１９７９）　）　　Ｋ適用された０発光団との
衝突が高頻度に起るように、　ＩＩＩ鐵複合体中に消光
性被分析物まえはアナローブを結合させると、直接分子
内衝突による消光を示す系が生じる。複合体の対向発光
団及び被分析物部分の移動を制限する結合基を選択する
と、＊突の傾度が減少し、このメカニズムにより発光団
の消光が低減される。

直接分子内衝突による消光は特に１複合体の発光団と被
分析物部分とが共に芳香族性である場合１両者の間で起
りやすい。恐らく、強い環−環反応が起り、その結果、
消光を促進する分子積み重ね構造が生じる。更に、被分
析物が重い原子を含む場合ＫＦｉ、螢光減衰と競合する
三重現状態への系間交差の割合が増加して、消光を起し
うる。

２、共鳴エネルギー移動 このメカニズムにおいて、エネルギーは発光団から消光
物質へ６０Ａ程度、好ましくは２５Ａ未満の分子内で長
い距離にわた′つて移動する。

共鳴エネルギーの移動の理論はフォルスター（Ｆｏｒｓ
ｔｅｒ）Ｋよって確立された（　Ａｎｎ、　Ｐｈｙｓ、
　２　：５５（１９４８）　）、直接分子内消光とは異
なり、共鳴エネルギー移動による消光の効果は消光物質
の吸収スペクトルと発光団の発光スペクトルとのスペク
トルのオーバーラツプに左右される。

この消光現象は酵素分析〔ヤロン（Ｍａｒｏｎ　）ら著
。

λｍｍ１．　Ｂｌｏｅｈ＠ｍ、　９５　：　２２Ｂ　（
１９７０）　）及び免疫分析〔ウルマン（’（Ｊｌ　１
ｍａｎ　）ら著、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ２５１　
：　４１７２（１９７６）及び米国特許第３，９９６，
３４５号明細書〕に適用された。複合体の対向発光団及
び被分析物部分が共鳴エネルギー移動が起るのに充分に
接近する能力を制限する結合基を選択すると、このメカ
ニズムによる発光団の消光が顕著に壜る。

従って、用語「消光配列」は、直接分子内衡突及び共鳴
エネルギーの消光メカニズムに畳通の意味で使用する。

発光性標識複合体 檄識豪合体は、試験試料及び他の分析試薬と結合される
試薬本体であり、その複合体は被分析物、またはその特
異結合アナローブから成る。

発光性標識とは、自体発光体である物質、即ち励起され
ると発光しうる物質、または発光体の前駆物質、即ち化
学反応により変性されて発光体を生成する基である。従
って、発光性標ｗＩｔ複合体試薬は、分析を完了するた
め発光度を測定する発光団−被分析物複合体と同一であ
るか。

またはその前駆物質であってよい。前駆物質である場合
ＫＦｉ、標識複合体Ｆｉ１通常、酵素で触媒される化学
反応を受け、この反応により発光性＊＊部分が変化し、
発光団となる０例えば。

化学反応により螢光性螢光団−被分析物複合体が生成す
る場合、被分析物またはアナローブに結合した非螢光性
螢光物質誘導体は螢光性標識複合体として作用する。

測定される被分析物−発光団複合体中の発光団は、物理
的、化学的または電気的な励起手段にさらす、例えば光
で照射または化学反応にさらすことによって刺激されて
発光しうる分子であってよい０発光団の主なカテゴリイ
＃ｉ、螢光物質、燐光物質及び化学発光物質である。螢
光物質及び燐光物質Ｆｉ、所定の第一の波長の光で照射
すると、第二の、それより長い波最の光を発する分子で
ある。化学発光物質Ｆｉ、化学反応により発光し、その
反応は酵素で触媒されて本。

されなくてもよい。

有用な螢光物質は例えば、ウンベリフェロン（７−ヒド
ロキシクマリン）、フルオレツセイン、インドール、β
−ナフトール、３−ビリドール、レゾルフィン、リサミ
ンローダミンＢ。

ローダミンＢ、アントラセン、３．１０−ジフェニルア
ントラセン、ペリレン、ルプレン、ピレン、トリプトフ
ァン、フラビン、アクリジン、ナフタリン、α−ナフチ
ルアミン、５−ジメチルアミノ−１−す７タリンスルホ
ネート（ダンシル）、Ｎ−（Ｐ−（２−ベンズオキサゾ
イル）フェニルコマレイミド、チオクローム、アニリノ
スルホン酸及びこれらの種々の螢光性誘導体である。燐
光物質＃ｉ１例えばキノリン、１−ブロモナフタリン、
インドール、トリプトファン、チロシン。

及びこれらの樵々の燐光性誘導体である。マイ’ｒ　−
ｘ　（Ｍｅｙｓｒｓ）ら著、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、
　５１　：　１６０９（１９７９）参照、有用な化学発
光物質は、例えばルミノール、イソルミノール、ルシフ
ェリン。

２．３−ジヒドロ・ベンゾ（９）フタラジン−１，４一
ジオン％　２，３−ジヒドロフタラジン−１，４−ジオ
ン、及びこれらの種々の化学発光性誘導体である。

結合基 常用の標識複合体の場合と同様に、発光性標識及び被分
析物またはそのアナローブは、水素を除いて、１〜５０
個の原子、更に一般にＦｉ１〜３０個１通常１〜２０個
の原子、主として炭素並びＫ１１ｌ酸３Ｉ、燐及び硫黄
から選択されたへテロ原子を含む連鎖によって共有結合
される。常用の結合基は１文献に詳細に記載されている
。例えば、米国特許第４，２３０，７９７号、同第４　
、２７９　、９９２号、開館３，８１７，８３７号、同
第３．９３５，０７４号及び同第３．９９６，３４５号
明細書参照。本発明＃ｉ。

発光団と被分析物部分との間の消光反応を著しく減少す
るのに充分な剛性を与えるため、そのような常用な結合
基中に挿入するため、比較的硬い基または部分的にしか
フレキシブルでない基を選択する点で従来とは異なる。

従来の潜在的消光の問題に対して本発明によって与えら
れる解決を知れば、当業者は従来の結合基に所望の剛性
を与えるため多数の化韓基から選択することができる。

このような基の例を以下に示す：結合手の型　　　　　
　　　構造の例 ビシクロ（２，２，２，）オクタン 他の系は、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、
　ＵｓＡ　５８ニア１９（１９６７）（ポリーＬ−プロ
リン）　、　ＪＡＣ８９１：　１２９３（１９６９）　
（飽和ステロイド〕、ＪＡＣ８８７：９９５（１９６５
）　Ｃデカ環式ビステロイド系）、ＪＡＣ８９０１８９
７（１９６ｇ）　（飽和縮合環網状構造）。

Ｈｅ１ｖ、ＣｈｅｎｚＡｅｔａ　５８：３９７（１９７
５）（双環式炭化水素フレーム）、　　ＪＡＣ８９０：
６４２５（１９６８）、ＪＡＣ８９１：４７８６（１９
６９）；及びＪＡＣ８９１：４１６９（１９６９）Ｋ記
載されている。

結合基内の剛性部分の両側に、通常、鱗及び被分析物部
分に結合する常用の結合構造がそれぞれ存在する。

分析技術 本発明は、広義に１発光性標識及び被分析物を九はその
アナローブから成る標識複合体を使用する均−系または
不均一系特異結合分析技術に適用することができる。こ
のような技術において、被分析物が発光性標識を消光し
うる種類の４のである場合１分析において測定される被
分析物−発光団複合体からの総潜在シグナルが対応して
減少し、これにより分析の感度、即ち再現性をもって検
出しうる被分析物の濃度の下限を低下する。

Ａ、均−系 一般に、本発明の分析法は、α）試験試料を。

被分析物に対する結合対手及び本明細書に記載した標識
複合体を含む試薬系と混合し、標識複合体の結合対手−
緒金種及び遊離種（即ち、結合対手によって結合されて
いない）の反応混合物を形成させ、その際遊離種は被分
析物−発光団複合体（標１１１穢合体自体として、また
＃１４１Ｉ繊複合体からの反応生成物として）を生成さ
せ、（２）発光団を適切な手段により励起させ、試料中
の被分析物の函数として放出される光ｔ−ＩＩ定する。

次に本発明を適用する特定の均一系分析技術の例を記載
するが、これらの例に限定されるものではない。

１、　　ＩＩＩ！基質−標識技術 この系でｔＬ標標識会合体被分析物またはアナローブ及
び発光性標識１例えば螢光性標識、酵素基質−活性標識
から成り、このような標識は酵素による作用を受けて、
被分析物−発光団複合体を生成することができる。標識
複合体に作用して、検出される被分析物−発光団複合体
を生成させる酵素の能力は、被分析物を認識する結合対
手（一般に抗体またはそのフラグメント）と標識複合体
を結合させることによって低減する。この種の分析系Ｆ
１．　１９７８年４月１０日出願された米国特許第８９
４　、８３６号明細書（英国特許第１，５５２，６０７
号明細書に対応）に記載されている原理に含まれる。

このような酵素基質−標識技術において、標識複合体１
例えば基質−被分析物複合体は、酵素により開ｌＩ！ま
斥は変形作用を受けて複合体から区別される。検出可能
の性質を有する生成物を生じうる性質を有する。例えば
、複合体は、分析条件下で非螢光性であってよいが、＃
素と反応すると、螢光性被分析物−螢光物質生成物を生
じる。

このような技術に使用する種々の螢光性基質−標識複合
体は明らかである０例えば、標識複合体は式： ％式％ 〔式中Ｇは解裂可能の基１例えばホスフェート基、カル
ボキシレート基またはグリコン基であ・・・　ｊ：′： す％ＤｔｉＧを除去すると螢光性生成物を生ずる螢光性
染料基１例えばウンベリフェロン、フルオレツセイン、
ローダミン及びその誘導体を表わし、Ｒ１ｊ重合基を表
わし、Ｌｒｌ１被分析物またはそのアナローブを表わす
〕を有するものである。標識複合体の酵素分解（例えば
ホスファターゼ、カルボキシラーゼ、グリコシダーゼ等
）ｉｌｌ、例えば抗体によって複合体の被分析物り部分
に結合させることによって行なわれる。米国特許第４　
、２７９　、９９２号明細書参照。特に好ましい基質標
識分析法は１式： 〔式中Ｒ及びＬは前記の本のを表わす〕の標識複合体を
使用シ、これにより、螢光により識別される生成物を生
ずる複合体を解裂する、＃索β−ガラクトシダーゼの能
力は、抗体と複合体との結合によって抑１制される。

本発明の目的で結合基Ｒ中に挿入される剛性部分の例は
、一般式： 〔式中８１及びＲ”ｄ適当な架橋要素である〕の複合体
を生ずるパラ−フェニレンである。この一般式の複合体
は、構造式（４） （４） 〔式中Ｒ１は適当な架橋要素、例えば結合ま九は水素を
除く原子数１〜２０個の連鎖であり、ＬＪＩｉ前記のも
のを表わす〕で表わされる。この種の複合体は、下記の
反応式ＡＫ示したようにして製造される。７−β−ガラ
クトシルクマリン−カルボン１ｔ（１）（バード（Ｂｕ
ｒｄ　）ら著Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｓｍ、　２３　：　１４０２　（１９７７）　）を
ＤＭＦ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロ
へキシルカルボジイミドと室温で２時間反応させること
によって活性化ニスデル儲）に変換させることができる
〔アンダーツｙ　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　）ら著Ｊ、　Ａ
ｍ−ｅｒ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、　８６　：　１８３９
（１９６４）　）。次に活性化エステル（２）を適当な
溶剤、例えばＤＭＦ中でトリエチルアミンの存在でノ（
ラーアミノ安息香酸と混合し、室温で２４時間反応させ
る８次に、反応混合物を濾過して副、生成物であるジシ
クロヘキシル尿素を除去し、溶剤を高度真空中で蒸発さ
せ、その残渣から純粋なＮ−（〕（ラーカルボキシフェ
ニル）−７−β−ガラクトシルクマリン−３−カルボキ
シアミドＧ）を、例えば珪酸でクロマトグラフィーし、
エタノールと酢酸エチルとの混合物で溶離することＫよ
って得ることができる。

反応式−Ａ （４） 標ａｌｌ（３）を適当なアミド及びペプチド結合形成反
応〔１ベプタイヅ（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）”グツドマン（
Ｇｏｏｃｌｍａｎ　）及びマイエンホーファー（Ｍｅｉ
−ｅｎｈｏｆｅｒ）　　＠集、ジ曹−ン・ウィリイ参ア
ンド・ソング（Ｊｏｈｎ　Ｗ目ｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）
　（＝ニーヨーク１９７７）、６〜１３頁及びそこに引
用されている文献参照〕によりアミノ−変性またはアミ
ノ−含有リガンドに結合することができる。

本発明の目的で結合基Ｒ中に挿入する剛性部は前記のも
のを表わす〕の複合体である。この種の複合体は、下記
の実験の部分に特に例示する。

２　蛍光の消光または増加 この系における標識−合体は、その標識部分で、標識複
合体が抗体に結合されたときに、測定可能な程度で蛍光
が消光または増加する蛍光物質を含む。蛍光性標識は通
常、直接測定され、その蛍光が検出可能のシグナルであ
る。この種の分析系は米国特許第３．９４０．４７５号
、同第４゜１５０．９４９号、同第４，１６０．０１６
号、同第４，１６０゜８１８号及び同第４．２７２．５
０５号明細書、英国特許第１．５８３．８６９号明細書
、及びＪ、Ｃｌ１ｎ。

Ｐａｔｈ、３０：５２６（１９７７）、並びに前記の他
の文献に記載されている。

１　蛍光偏光 この系における標識は蛍光物・質でもあるが、作用特性
は抗体による標識複合体の結合による蛍光の偏光である
。この種の分析系は、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１２２：１０２９（１９７５）及び前記文献に
記載されている。

４、　エネルギー移動 この系では、標識はエネルギー移動供与体−受容体対の
一員であり、抗体はこのような対の他方と複合する。従
って、標識複合体が抗体によって結合されると、対の供
与体成分のエネルギー出現が、受容体成分への移動によ
って変化する。通常、供与体は蛍光物質であり、受容体
はその消光物質であり、この消光物質は同様に蛍光物質
であっても、蛍光物質でなくてもよい。

このような実施態様では、検出可能のシグナルは蛍光で
あるが、他の検出系であってもよい。

このような分析系は、米国特許第３．９９６．３４５号
、同第４．１７４．３８４号及び同第４．１９９．５５
９号明細書並びに英国特許第２．０１８．４２４号明細
書並びに前記文献に記載されている。

５、化学的に励起さｉる蛍光 この系では１．標識は再び蛍光物質であるが、蛍光を発
するエネルギー状態に化学的に励起される、蛍光物質標
識の能力は、抗体と標識複合体との結合によって影響さ
れる。標識の化学励起は、通常、蛍光物質標識をその場
で形成した高エネルギー化合物に曝すことによって達成
される。この種の分析系は米国特許第４．２３８．１９
５号明細書に記載されている。

６　二重抗体立体障害 更に、米国特許第３．９３５．０７４号及び同第３、９
９８．９４３号明細書に記載されている二重抗体免疫分
析系がある。標識複合体は２種のエピトープから成り、
その一方はリガンド及びリガンド抗体との免疫反応に関
与し、他方は第二の抗体によって結合されうるちのであ
り、２種の抗体は同時に標識複合体に結合するのを妨害
される。第二のエピトープは第二の抗体結合によって蛍
光が消光される蛍光物質であるか、又は第二の抗体への
結合に対する第二のエピトープの標識形との補助的競合
結合反応に関与することができる。このような系には前
記特許に記載されているように、種々の検出系が可能で
ある。

関連分析系は米国特許第４．１３０．４６２号及び同第
４．１６１．５１５号明細書及び英国特許第１．５６０
゜８５２号明細書並びに前記の他の文献に記載されてい
る。

Ｂ、不均一系 本発明の分析法は、標識複合体の結合種及び遊離種を分
離し、一方又は他方の標識成分を測定する常用の不均一
系分析技術にも適用することができる。このような不均
一系分析を実施する試薬手段は多数の異なる形を取るこ
とができる。一般に、このような手段は、３種の基本成
分から成り、これらの成分は（１）検出すべき被分析物
、（２）被分析物の結合対手及び（３）標識複合体であ
る。結合成分を同時に又は順次混合し、適当な静置時間
を置くと、標識複合体は、結合の程度、即ち、結合対手
に結合した標−複合体（結合種）の量と未結合の標識複
合体（遊離種）の量との比が存在する比分折物の量の関
数であるように、対応する結合対手性結合している。

結合種及び遊離種を物理的に分離し、その一方に存在す
る標識の量を適当な手段により発光団を励起し、生ずる
発光を測定することによって測定する。測定された発光
を熱性対照又は標準の結果、例えば標準曲線と比較する
。分離工程を実施する手段及び結合反応系を形成する手
段は文献に多数記載されている。分離は、固相抗体又は
抗原、第二抗体、又は同相第二抗体として一般に知られ
ている物質に関する技術又は免疫寮合体沈殿剤、吸着剤
等を使用する技術のような常用の技術によって達成する
ことができる。

追跡しうる結合反応系は、いわゆる競合結合法、連続飽
和法、「サンドウィッチ」法等である。

種々の公知不均一系に関する詳細については、更に文献
、例えば米国特許第３．７２０．７６０号、同第３．９
４０．４７５号、同第３．９９２．６３１号、同第４．
０５８．７３２号、同第４．１３３．６３９号、同第４
、１４４．４５２号、同第４．１７１．３１１号、同第
４゜２０１、７６３号及び同第４．２３０．７９７号明
細書及びＪ、Ｐｈａｒｍ、８ｃｉ、７０：４６９（１９
８１）及び前記文献から容易に得られる。

均−系及び不均一系特異結合分析を実施するため、他の
添加順序及び他の結合反応法を含む操作法は、本発明思
想を逸脱することなく工夫できるものである。

反応混合物及び条件 分析すべき試験試料は、比分折物を含むと思われる天然
に生ずるか又は人工的に作った液体であってよく、通常
、生物学的液体又はその希釈物である。分析しうる生物
学的液体は、血清、血秦、尿、唾液、乳、及び羊水及び
脳を髄液を含む。

結合反応は、緩和な条件下で進行する。反応混合物は一
般に少量の所望の有機補助溶剤を含む水性媒体である。

反応温度は、静電期間及び測定工程の間中通常の状況で
一定の水準に保持する。温度は一般に５〜５０℃、更に
普通には２０〜４０℃である。反応は室温で進行する。

反応混合物のｐＨは５〜１０、更に普通には６〜９であ
る。種々の試薬の濃度は試験媒体に予想される被分析物
の濃度に左右され、このような濃度は通常１０−’−１
０”−”Ｍである。前記の反応パラメータの場合に、選
択は、結局常法で分析を実施する技術者の選択及び必要
に対して考慮した、実験で求めた最適条件に第一に基づ
く、従って、パラメータはいづれも本発明には限定的な
ものではなく、むしろ当業者に通常なしうることである
。

試薬系 本発明の試薬系、即ち試薬の組合せ又は手段は、本発明
の所望の分析法を実施するのに必要なすべての必須化学
成分を含む。試薬系は工業的に包装された形で組成物又
は混合物として提供され、この場合試薬の相溶性により
試験具又は試験キットとして、即ち必要な試薬を入れる
１個以上の容器の組合せ包装物が可能である。

試薬系には所望の結合反応系に適切な試薬が含まれ、常
に標識複合体及び前記の被分析物結合対手を必要とする
。このような結合反応試薬は標識複合体及び被分析物に
対する結合対手の外に、特定の分析法を実施するため他
の必要な、又は任意成分の試薬、例えば酵素基質−標識
法を使用する場合に必要な酵素を含むことができる。勿
論、試薬系は文献に公知の他の試薬を含んでいてよく、
これらの試薬は工業的観点及び使用者の観点から望まし
い物、例えば緩衝剤、希釈剤、標準品等であってよい。

試薬系及びこれと結合する固体担持物質から成る試験具
が好ましい。このような試験具の種々の形４１１９８０
年１０月３０日に出願された米国特許第２０２゜３７８
号明細書に記載されているので、これを参考文献として
本明細書に含める。

次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。

例　　１ この例では、蛍光物質標識としてウンベリフェロン誘導
体、及び消光性被分析物としてキニジン（６′−メトキ
シシンコニン）から成る二発色団系における分子積み重
ねを妨害するため、剛性Ｎ、　Ｎ／−ビペラジニレン部
分を含む水溶性結合基を使用する。これらの２個の芳香
族基を長さの興なる７レキシプルなアルキル連鎖、即ち
、４個及び１２個のメチレン基を介して結合させた（式
Ｉ及び■）。結合基にある程度の剛性を加えるため、結
合基が剛性ビペラジニレン基を含む振合体も製造したＣ
弐■及び■）。

ム＊合体の製造 ！−ガラクＦシルーウンベリフェロン−キニジン（１）
この化合物の構造は前記の式（１）で示される。

ａ６ｆ（２１ｍｍｏｌ　）ノロ’−ヒトａ＋シシ＞ｗ＝
＞　（ス％−ル（Ｓｍａｌｌ　）ら着Ｊ、　Ｍａｄ、　
Ｃｈｅｍ。

！２：　１０１４（１９７９））、７Ｆ（２５ｍｍｏｌ
）のＮ−（４−プ四モブチル）フタリジン〔ウィスコン
シン州ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル社（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｏ、　）　）、＆
４５ｆ（２５ｍｍｏｌ　）の炭酸カリウム［：　Ｋ、Ｃ
０Ｂ）　、１００１１ＰｌＦ）１８−クラウン−６−（
１，４，７，１０，１３，１６−ヘキ賃オキサシクロオ
クタデカン）（アルドリッチ社）及び１５０−のア七Ｆ
ンの混合物をアルゴン下に１６時間還流した。シリカゲ
ルでりｐマ）グラフィー処理し、メタノールから再結晶
して後処理すると、３．１Ｆの６’−（４−フタルイ文
ドプトキシ）シンコニンが融点２２８℃の白色結晶とし
て得られた。

この７タルイミド誘導体３ｆ（５，９ｍｍ・１）、ヒド
ラジン５　ｍｌ及びメタノール１００−を１時間加熱し
、次に冷却し、溶剤を除去する。固体残渣を１００ｓｌ
のＩＮ塩酸と共に攪拌し、濾過してフタルヒドラジドを
除去した。−液を水酸化ナトリウムで中和し、生じた沈
澱を水性メタノールから再結晶すると、１．６Ｆの６′
−イ４−アミノプトキシ）シンコエンが融点１２６〜１
２８℃の白色針状晶として得られた。

分析：Ｃｌ−１穐へとして ＣＨＮ 計算値　　’１５１　　　＆１９　　１１０１実測値　
　７２．９７　　　＆３３　　１０７７乾燥ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）２０ｇＪ中の７−β−ガツクトシ
ルクマリンー３−カルｉン酸〔バードら着Ｃｌ１ｎ、　
Ｃｈｅｍ、　２３　：　１４０２（１９７７））４３４
１１１１Ｆの溶液を一１０℃に冷却し、トリエチルアミ
ン１２０Ｗ（１，２ｍｍｏｌ）及びクロ冑ギ酸イソブチ
ル１６０■（１，２ｍｍｏｌ）と混合した。１０分後、
トリエチルアミン塩酸塩の白色沈澱を濾過により除来し
、６’−（４−アミノブトキシ）シンコニン４５０１１
Ｐ（１，２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間攪拌した
後、溶剤を除去し、残渣をシリカゲルでクロマトグラフ
ィー処理した。カラムを酢酸エチＡ／：エタ／−４の：
３　：　ｚ′ｖ／ｖｓ合物ｒ溶ｓｔ、、１５１１／スつ
の７ラクシ曹ンを集めた。フラクシｌン４４〜８０をプ
ールし、蒸発した。２−ブーパノールから再結晶すると
、式（Ｉ）の化合物が融点１９１〜１９３℃の微細な白
色粉末として得られた。

分析：！ス・スペクトル（電場脱離）：ｍ／６７１３（
Ｍ　マイナスＨａｄ）：５５１（Ｍ　　ＹイナスＨ，Ｏ
、マイナスＣ５ＨａｓＯｓ　）β−ガツクトシルーウン
ペリ７エロンーキニン（ＩＩ）この化合物の構造は前記
の式（１）に示したとおりである。

７．７６Ｆ（２５ｍｍｏｌ）の６′−ヒト！キシシンコ
ニン、１１．８３９　（３０，ｍｍｏｌ　）のＮ−（１
２−プルモトデシル）７’？ルイ主ド（アルドリッチ社
）、４１４ｆのＫｓＣＯｓ及び７５ｗ１１の乾燥アセシ
ンの混合物をアルゴン下に還流器を付けて１６時間攪拌
した。反応混合物を冷却し、前記と同様に後処理すると
、融点２３２〜２３４℃（分解）のオフホロイト色固体
として７ｆの６’−（１２−フタルイ之トドデシルオキ
シ）シンコニンが得られた。

メタノール５０−中の上記７タルイミド１５７ｆ　（２
５ｍｍｏｌ　）及びヒドラジン２１３１の溶液を１時間
還流した。回転蒸発器で揮発性物質を除去し、固体残渣
を一夜高度真空下に乾燥した。これにより６’−（１２
−アミ／ドデシルオキシ）シンコニンが灰色固体として
得られたが、これをそれ以上特性決定をしなかった。１
　ｒｒｍｏｌを７β−ガラクトシルクマリン−３−カル
ボン酸と前記の例と同様の方法で反応させた。反応生成
物をシリカゲルでクロマトグラフィ処理及びエタノール
からの再結晶によって精製すると、７０１１ｖの式１）
の化合物が融点１１８℃の黄褐色結晶として得られた。

分析：　ＣａｙＨｓｔＮｍＯｉｓ　　としてＣＨＮ 計算値　　６６．８８　　７．２９　　４．９８実測値
　　６６．７５　　７．３１　　　４６３この化合物の
構造は前記の式（ＩＩＩ）に示したとおりである。

１−（２−アミノエチル）ピペラジン（アルドリッチ社
）をトリフルオル酢酸エチルで処理してＮ−トリフルオ
ルアセトアミド誘導体に変えた。トルエンから再結晶す
ると、融点９２〜９３℃の白色針状晶が得られた。

分析：ＣａＨｕＦｓ″Ｎ、　Ｏとして ＣＨＮ 計算値　　　４！６６　　６．２５　　　　ＨＬ６６実
測値　　　４！６８　　５．８５　　１９．１２この物
質１０ｆ（４４ｍｍｏｌ）をエチＬ／ンオキシド２９を
及び氷酢酸１−を含むメタノール５０−中で１６時間放
置した。溶剤を除去し、トルエンから再結晶すると、１
０．１ｆの１−（２−ヒト田キシエチル）−４−（２−
）リフルオロアセトアミドエチル）ピペラジン（ヒドロ
キシ誘導体）が融点８４℃の白色針状晶として得られた
。

分析：　ＣｍｅＨ＊ａＦｍＮｓＯｍとしてＣＨＮ 計算値　　４４．６１　　６．７４　　１５．６１実測
値　　４５．２４　　　ａ７２　　１五５９ヒドロキシ
誘導体（３ｆ、　　１１ｍｍ０ｔ　）及びトリエチルア
ミン１，３りｆ　（１３ｍｍｏｌ　）を塩化メチレン５
０−に溶かし、アルゴン下に攪拌しながら５℃に冷却し
た。これにメタンスルホエルク胃リド１当量加え、１時
間後に６′−ヒトａキシシンｗ＝ン３．４　ｆ　（１１
−ｍｍｏｌ　）及び無水ＫｓＣＯｓ　４．５　ｆ　（２
４，５ｍｍｏｌ　）を加えた。反応混合物を室温に加温
し、１７時間攪拌した。濾過し、蒸発し、残渣をメタノ
ール性水酸化カリウム中で４時間加熱して、Ｆリフルオ
ロアセチル基を除去した。生成物をシリカゲル上でクロ
マトグラフィー処理し、４　：　４　二１　Ｖ／Ｖ／α
のクロルホルム；メタノール：ｍ水酸化７ンモニウムで
溶離すると、２．４ｆの６’−（（２−（４−（２−ア
ミノエチル）ピペラジニル−１）エトキシ〕〕シンコニ
ンが褐色無定形固体として得られ、この固体は薄層クロ
マトグラフィーで均一であり、ニンヒドリン−陽性であ
った。このアミノをそれ以上特性決定しなかった。この
アミン１ｍｍｏｌを前記の例と同様の方法で７−β−ガ
ラクトシルクマリン−３−カルダン酸（前記）と反応さ
せた。反応生成物をシリカゲルでり胃マドグラフィー処
理し、４：ＩＶ／Ｖエタノール：ＩＭ水性重炭酔トリエ
チルアンモニウムで溶離し、次にセファデックスＬＨ−
２０でクリ！トゲラフイー処理し、メタノールで溶離し
た。式（１）の化合物３４３１９が黄褐色固体として得
られた。

分析：　ＣａｍＨｓｓＮｓＯｓｘ　・２ＨａＯＨＮ 計算値　　６０６２　　　＆７４　　　＆２２実測値　
　５ｇ、４３　　６．９９　　７．９９β−ガラクトシ
ル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−キニジン複合体
（Ｉｌｌ）の前記合成操作を変更して、１−（２−ヒト
ルキシエチル）−４−（２−トリフルオロアセトアミド
エチル）ピペラジンを下記の反応５ｃ１の一般式Ｃで示
した適当な合成中間体（式中Ｇは適当なアミン保護基を
表わす）で代えることによって、ｍ及びｎがそれぞれ２
〜９である複合体を製造することができる。Ｃのような
中間体を得るため、ピペラジンを適当に保護されたβ−
アミノアルデヒド人人当当量還元によりアルキル化する
ことができる。生成するモノ置換ピペラジンＢを普通の
有機鎖−彰成反応により中間体に変換することができる
。

反応式１ 例えば、Ｂを種Ｘ−（Ｃ八）ｎ−Ｙ（式中Ｘは脱離基、
例えば臭素、塩素、ｐ−トルエンスルホニル基、メタン
スルホニル基を表わし、Ｙは自体脱離基であるか、また
は１以上の工程で脱離基に変換しうる官能基、例えばと
ド田キシル基またはアセトキシ基を表わす）でアルキル
化することができる。二官能性中間体、例えばＸ−（Ｃ
Ｈ，）、−Ｙは有機化学において周知であり、α。

・−ジヒドロキシアルカンまたはα、―−ハｐヒドリン
の類から単純な化学変換によって得られる（　＠Ｃｈｅ
ｍ、８ｏｕｒｃｅｓｓ　ＵＳＡ”１９７９年、ニュージ
ャージ州フレミントンのディレクトリイース・パブリジ
ング社（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｉｅｓ　Ｐｗｂｌ−轟ｓｈｉ
ｎｇ　Ｃｏ、）参照〕 一般に、モノ置換ピペラジンＢを、Ｘ及びＹが脱離基を
表わす反応体Ｘ−（ＣＨｓ）　ｎ”Ｙでアルキル化する
のは、ピペラジン環の過アルキル化を避けるため反応条
件を均密に制御する必要があるので、あまり好ましくな
い。

ＢをＣに変換する反応は、Ｂをω−置換アルデヒドＹ　
−（ＣＨａ　）　ｎ−１−ＣＨＯ（ポーチ（Ｂｏｒｃｈ
　）ら着−％Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、８ｏｃ、９３：
２８９７（１９７１））（式中Ｙは前記のような脱離基
または１以上の工程で脱離基に変換しうる官能基、例え
ばヒドロキシ基またはアセトキシ基である）で還元アル
キル化することによって達成することもできる。Ｙ−（
ＣＨ，）　、１−ＣＨＯのような反応体はω−とドルキ
シアルデヒド類から得られる（ハード（Ｈｕｒｄ　）及
びソーンダー（５ａｕｎｄｅｒｓ。

Ｊｒ、　）著Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、
　７４　：　５３２４（１９５２）参照〕。

オメガ−アミノアルデヒドＮＨ意−（ＣＨ鵞）ｍ−１−
ＣＨＯ（式中ｍ＝２〜５）は公知化合物である〔１ケミ
ストリイ・オブ・カーボン・フンパウンド（Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）
’ロッド（Ｒｏｄｄ　）著、１巻、ニューミークのＥｌ
ｓｅｖｉｅｒ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、　１９５１年、７０６
頁参照〕。還元アルキル化反応〔ポーチらの前掲文献〕
の間、アミノ基は反応条件下では安定であるが、分子に
有害でない条件下で＃Ｃ大しりる基Ｇで保護する。酸性
または塩基性条件下に接触水素添加または特殊な試薬で
の処理によって脱離しうる多数の保護基Ｇが知られてい
る〔１ブロテクテイブ・グループ・イン・オーガニック
・ケ之ストリイ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ
　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）”、二
ニー冒−りのジョーン・ウイリイ・アンドーソンズ社、
１９８１年２１８〜２８７頁参照〕。前記のものよりｍ
が大きい（ｍ＝６〜９）ものは、前記のω−とドロキシ
アルデヒドＨＯ−（Ｃ’ｓ）ｍ−１−ＣＨＯの公知変換
によって保護された形で製造することができる。これら
の物質は前記ハード及びソーンダースの文献に記載され
ているようにアセタールＨＯ−（ＣＨ鵞）ｍ−０−ＣＨ
（ＯＣ＊Ｈａ　）ｓに変換することができ、ヒト田キシ
官能基を１以上の工程でアミノ官能基または保護された
アミノ官能基に変えることができる〔ミツツク（Ｍｉｔ
ｓｕｎｏｋ−・・−１ ｗ）らＪ、　ＡｍＣ′ｒ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　９４
　：　６７９　（１９７２）参照〕。

キニジン（■） この化合物の構造は前記の式（ＩＶ）で示される。

５．８　ｆ　（１９ｍｍｏｌ　）ノロ’−ヒドロキシシ
ンコニン３．８７９　（１９ｍｍｏｌ　）のエチル５−
ブロモペンタノエート、１．８７　ｒのＫｇ　ＣＯｍ　
、１００１ｖの１８−クラウン−６及び１５０ｄのアセ
トンの混合物をアルゴン下に１６時間還流した。溶剤を
除去し、残分を塩化メチレンと希水酸化ナトリウム（Ｎ
ａＯＨ）との間に分配させた。有機相を分離し、乾燥し
、蒸発すると、２．６９のエチルエステルが橙色固体が
得られた。これを１、２５　ｆのに、　Ｃｏｓを含むメ
タノール１２５ｉＥ／中で一夜還流した。メタノールを
除去し、残分をＨ，Ｏに溶解した。希塩酸（ＨＣｔ）で
ｐＨを７に調節すると、沈澱が生じた。水性エタノール
から再結晶すると、６′−（４−カルボキシブトキシ）
シンコニン（ＩＩ）ｘ、ｓｒが融点１４８〜１５３℃の
オフ・ホワイトの固体として得られた。

分析：Ｃ鵞４Ｈ１＠凡０４・八〇としてＣＨＮ 計算値　　６７．２７　　７．５３　　６．５４実測値
　　６７．４２　　７．５９　　６．５９キニジン（ｍ
Ｖ） この化合物の構造は前記の式（Ｐ／）で示されｆ　（１
９ｍｍｏｌ　）のエチル５−ブロモペンタノエート、１
８７ｔのに、Ｃｏｓ、　１０１１Ｆの１８−クラウン−
６、及び１５０−のアセトンの混合物をアルゴン下に１
６時間還流した。溶剤を除去し、残渣を塩化メチレンと
希水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）との間で分配させた。

有機相を分離し、乾燥し、蒸発させると、エチルエステ
ル！６１が橙色固体として得られた。これを１．２５　
ｆのＫｓＣＯｓを含むメタノール１２５ｔＪ中で一夜還
流した。メタノールを除去し、残渣を水に溶かした。希
塩＃（ＨＯ２）でｐＨを７に調節すると、沈澱が生じた
。水性エタノールから再結晶させると、１．６ｆの６’
−（４−カルボキシブトキシ）シンコニン（酸）がｌｋ
点ｘ４ｓ〜１５３℃のオアーホワイトの固体として得ら
れた。

分析：　Ｃ＊ａＨｓ＊Ｎ５Ｏ４４（ａ　Ｏとして、ＨＮ 計算値　　６７．２７　　７．５３　　６．５４実測値
　　６７．４２　　７．５９　　６．５９乾燥ジオキサ
ン４００＋Ｉｊ中の１０Ｏｆ１００ｆ（０４２の重ｅｒ
ｔ−ブチル−８−（４，６−シメチルピリミジンー２−
イル）チオールカーボネート（アルドリッチ）を室温で
、ジオキサン３６〇−中の１，４−ビス−（３−アミノ
プロピル）ピペラジン１８２ｔ（０，９１ｍｏｌ）の溶
液に６時間にわたって滴下した。−夜攪拌後、反応混合
物を濾過し、蒸発すると、油性残分が得られた。これを
２ｔの蒸溜水に溶ぶし、アンバーライトＩＲＣ−５０イ
オン交換樹脂（ＮＩ（４形）（ペンシルバニア州フイラ
デルフイアのローム・アンド・ハース社）の５ｃｍＸ９
０ｃｍのカラムに施した。カラムを５００ｄの水で洗浄
し、２Ｌの水〜２ｔの０．ｓ％水酸化アンモニウムを線
勾配にして用いて溶離した。所望のフックシ冒ンを合し
、蒸発して、６５２の１−（３−アミノプロピル）　、
　４　＋　（３−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルア
ミノプロビル）ピペラジン（−級ア叱ン）が淡黄色油と
して得られた。

分析：マススペｊｐ＞ｋ（Ｔｏｅ、Ｖ、）：ｍ／ｅ３０
１（ＭＵ＋）；　２０１　（ＭＨ＋マイナスｃｏｏｃ−
（ＣＨｓ）ｓ　） 乾燥ＤＭＦ２５ｄ中の前記の酸（２，０５９，＋５ｍｍ
ｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．６５？（
１０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃でアルゴン下に攪拌しなが
ら冷却し、ジシクロへキシルカルｌジイミド１．１３　
ｆイ５．５　ｍｍｏ　１　）を加えた。冷却浴を除去し
、反応混合物を室温で３時間攪拌し、その後前記の第一
アミン１．５　ｆ　（５ｍｍｏｌ　）を加えた。室温で
一□夜攪拌した後、溶剤を除来し、残渣をシリカゲルで
クロマトグツフィー処理し、７　：　ｓ　ｖ／マのエタ
ノール：ＩＭ水性重炭酸トリエチルアンモニウムで溶離
した。

こうして１５Ｆの生成物が黄褐色ガラス状固体として得
られた。

分析：　Ｃｓ５ＨｎＮｓＯｉ　・Ｈ＊０として、ＣＨＮ 計算値　　６ａ８Ｂ　　　＆７９　　１１．８２実測値
　　６　＆３２　　　＆８３　　１１１８この物質（１
，５ｆ、、　１２ｍｍｏｌ　）をトリフルオル酢醗中で
一１０℃で３時間攪拌して、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカ
ルボニル保護基を除去した。生成する第二アミンをそれ
以上精製しなかった。

これを５０ｗＪの水に取り濃ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．
０に調節した。

７−β−ガラクトシルクマリン−３−カルボン酸（前記
）　８００１１Ｆ（２，２ｍｍｏｌ　）及びＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド５００１１ｇ（５゜３ｍｍｏｌ）を
ＤＭＦ　１０ｓＬｌに溶かすことによって第二の溶液を
製造した。この溶液をアルゴン下に攪拌しながら０℃に
冷却し、ジシクロへキシルカルｌジイミド４８９Ｍｇ（
！４ｍｍｏｌ）を添加した。

冷却浴を除去し、反応混合物を室温に加温し、２時間攪
拌して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを生成
させた。

第二アミンのｐＨ８の水溶液を０℃に冷却し、これに活
性エステルのＤＭＰ溶液を５分にわたって滴加し、更に
１０−のＤＭＦを加えるが、その間温度を５℃より低く
保持した。最終溶液のｐＨを水酸化ナシリウムで７．０
に調節し、反応混合物を室温で４時間攪拌した。粗生成
物を１８ｏｆの珪酸でりｔ２マドグラフィー処理し、２
ｔのエタノール〜２ｔの７　＝　３　ｖ／ｖのエタノ−
ｈ　：　Ｉ　Ｍ重１ｉ１ＷＩＩＩ　）リエチルアンモニ
ウムを線状勾配で用いて溶離した。こうして９００ＩＩ
Ｐの所望の生成物がガラス状固体として得られな。

この生成物３００”ｆをセファデックスＬＨ−２０の９
０ａｓＸ！５ｍのカラムでクロマトグツフィー処理し、
メタノールで溶離した。式（■）の化合物１６０１１Ｆ
が淡黄褐色ガラス状固体として得られた。

分析＝Ｃ膠・−６Ｎ・Ｏ凰３として、 ＨＮ 計算値　　６１６８　　７．６５　　８．９１実測値　
　６３．５３　　６．８２　　　＆６５β−ガラクトシ
ル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−キニジン複合体
（Ｆ／）の前記の合成操作を羨更し、■の合成に使用し
たエチル５−プロモプチレートを適当なエチルω−クロ
ａ　−又はブリモアルカノエートＸ　−（ＯＨ，）、　
−Ｃｏ。

Ｃ，Ｈ，で代えることによってｒ＝１〜９の複合体を製
造するこ、とができる。ｒ＝１〜４の例は市販されてお
り、ｒ＝５〜９の例はバーシャー（Ｉ３ａｒｇｅｒ　）
ら著、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９３７　：　７１４、
サル％ンーリガグナー（８ｔ１ｍｏｎ−Ｌｅｇａｇｎｅ
ｕｒ　）着、Ｂｕｌ　ｌ、　８ｏｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｆ
ｒａｎｃｅ　１９５６　：４１１及びリネル（Ｌ五ｎｎ
ｅｌｌ）及びボラ（Ｖｏｒａ）著、Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、
　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　４　：　５５　（１９５２）
に記載されている。

■の合成に使用した１−（３−アミノプロピル）　−４
−（３−ｔｅｒｔ−プチルオキシ力ルポニルアミノーブ
ｐビＡ／）ビイラジンを適当な１４ジ置換ピペラジンＧ
（反応式２参照）で代えることによってｎ　＝　２〜９
、ｍ＋＝２〜９の複合体を製造することができた。

反応式２ ％式％ Ｇのような中間体は、１当量の適当に保護されたーーア
ミノアルデヒドＡでピペラジンを還元アルキル化するこ
とによって得られる。′生成するモノー奮換ピペラジン
Ｄを次に、保−された第二のω−アミノアルデヒドＥで
アルキル化することによって１．４−ジ置換体Ｆに変え
ることができる。ｍ　＝　ｎの場谷＼Ｇ及びＧ／は同一
であってよい。ｍ〜ｎの場合、保護基Ｇ及びＧ′は、中
間体Ｆを生成するため、一方が他方の存在で選択的に除
去されるように選択しなければならない。陵性または塩
基性条件下に接触水素添加または弗素イオン、ヒドラジ
ン略のような特殊な試薬によって除去される多数の保護
基が知られている〔グリーン（Ｇｒｅｅｎｓ　）の前掲
文献参照〕。

Ｂ、相対的蛍光強度及び蛍光の寿命の研究４０５　ａｍ
に設定した励起波長及び４４５　ｎｍに設定した発光波
長を用いて８ＬＭ８０００分光−蛍光計（イリノイ州つ
ルバナのＳＬＭインストラメンツ社（８ＬＭ　　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　Ｉｎｃ、　）テ相対的蛍光強度
を測定した。蛍光の寿命は、スペンサー（８ｐｅｎｃｅ
ｒ　）及びウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ）、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ
、Ａｃａｄ、８ｃｉ、　１５８：３６１　（１９６９）
に記載されている交差相関位＠　（Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒ
ｒｅ　−１ａｔ！ｏｎ　ｐｈａｓｅ　）及び変調蛍光針
によって測定した。

多数の蛍光分□・子の蛍光は、（１）励起前の基底状態
における分子反応による静的消光及び（２）励起された
一重項の寿命の間の反応による励起−重環状態の動的消
光によって影響される。消光物質の存在及び不存在で寿
命及び蛍光を測定すると、ｒ＝（τ０／τ）／ＦＯ／Ｐ
″）（式中τ。及びＦ。ｉｆ消光瞼質の不存在における
寿命及び蛍光であり、Ｔ及びＦは消光物質の存在におけ
る寿命及び蛍光である）であるから、励起時の非蛍光性
複合体の解離度ｒが得られる。

蛍光団が励起状鯵にある場合に消光対抗物（ｅｎｃｏｕ
ｎｔｅｒ　）に対する二分子速度定数（ｒａｔｅｃｏｎ
ｓｔａｎｔ　）である動的ステールンーフオルマ−（Ｓ
ｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）速度定数に：はｈ：＝ｃＬ／
ｒ−１／τ。−一１で得られ、基底状態での複合体形成
に関する平衡解離定数に、はに、＝（１／γ−１）で得
られる。〔スペンサー及びウェーバ−蕾ストラクチャー
・アンド・ファンクシラン・オプーオキシデイション・
リダクション・エンザイム　（８ｔｒｕｃｔｎｒｅ　　
ａｎｄ　　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　０ｘｉｄａｌ
ｉｏｎＲｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）　、ア
クソン（Ａｋｅｓｏａ　）ら編集、パージャモン・プレ
ｆｉ　（Ｐｅｒｇａｍｏｓ　Ｐｒｅａｓ　）　にニー１
−り１９７２）３９３〜３９９頁〕。

結果を表Ａに示す。４種の標−複合体（１−ＩＶ）のβ
−ガラクトシダーゼ分解の蛍光ウンベリフエ四ンー平ニ
シン生成物及び被分析物に接合していない蛍光性ウンベ
リフェロン誘導体（［ＲＡ８ｊと記す）に関して、蛍光
データを集めた。

表　　　　　Ａ ・物　　　　　　　結　　合　　手　　　　　　　相対
的蛍光　　寿命（ナノ５ｅ）（（１）　　なし　　　　
　　　　　　　　　　１００％　　　　１□＋Ｇい「５
．２％　　　　　ｚ３ ４−　ｃＨ，）ｒ３　　　　　　　　　　　　　　　　
　４．３　％　　　　　　２．６−＋ａｘ、ｙｒ１−ｃ
ｃＨｓ九　　　　　４２．４１　　　１３℃−ノ Ｎ−（２−ヒト四キシエチル）−７−ヒトロキシクマリ
ンー３−カルボキシアミ（米国特許第４．２７３．７１
５号明細書Ｉ９３　　　　１３．０５　　　１．２ｘｌ
Ｏ’５ＩＩｅ−’９５　　　　１＆４３　　　０．６ｘ
１０１戴−１４２０，７１１，２ｘｌＯ藤５ｌＩＩｅ−
１５８１，３５１，２１１０’５ｓｅ−１ド ウンベリフェロン誘導体及び４種のウンベリ７エーンー
キニジン化合物におけるウンベリフェロン蛍光に関する
相対的量子効率は、ウンベリフェロン−キニジン化合物
におけるウンベリフェロン蛍光が種々の程度で消光され
る（表Ａ）を示す。化合物■及び■は、予想されるウン
ベリフェロン蛍光のそれぞれ５．２％及び４３％１゜か
示さないが、化合物■及び■はそれぞれ４２．４襲及び
３１２％を示す。ウンベリフェロン誘導体及び４種のウ
ンベリフエｐンーキニジン化合物におけるウンベリフェ
ロン蛍光の寿命も表Ａに示す。

更に、計算した力学的パラメータ及び平衡パラメータを
挙げた表Ａのデータは下記のことを示す： （１）　ｐ）Ｉａｓのビシン緩衝液中には２６℃で、４
及び１２個のメチレン基のアルキル連鎖を有するウンペ
リ７工腎ンーキニジン化合物は主として（Ｉ及び■にお
いてそれぞれ９３％及び９５襲）内部で積み重ねられた
形として存在する。剛性ピペラジン結合手を導入すると
、積み重ねた形はそれぞれ４個及び１０個のメチレン基
を有する■及び■において４２襲及び５８％に減少する
。

（ｂ）　　ウンベリフェロンとキニジンとの間の分子内
反応は、結合がフレキシブルであζ場合に強い（■では
Ｋａ＝０．７及び■では１４）。剛性ピペラジン結合手
を導入した場合、ウンベリフェロンとキニジンとの平衡
解離定数の１４及び１９倍の減少は剛性子の膜安定化効
果によると結論される。

（ｃ）　　０．６　Ｘ　１０纂〜１．２　Ｘ　１０’　
５ｃ−１に及ぶ４種のウンペリ７工四ンーキニジン化合
物の動的速度定数は低いが、動的消光は単なる拡散現象
であるので、これらは予想どおりほぼ同一である。

Ｃ，キニジン免疫分析 キニジンに関する基質標識蛍光免疫分析（ＳＬＰＩＡ）
を下記のようにして実施した。

（１）試薬 Ａ、抗体／酵素試薬−β−ガラクトシダーゼ５単位／ｌ
を含むｐＨ＆５の５０ｍＭビシン緩衝液〔カルホルニア
州うジョラのカルパイ、オケムーベーリング（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒ！ｎｇ　）　）　、抗血清の不
存在での蛍光の２０％に蛍光を減少させるに充分な、キ
ニジン免疫原に対する抗血清及び１５．４ｍＭナトリウ
ムアジド。

Ｂ、複合体試薬−０，９２ｍＭβ−ｆラクトシル−ｆｌ
ンベリ７エロンーキニジン（ｍＶ　）　ヲ含ｔ？ｐＨ３
，５の５　ｍＭギ酸塩緩衝液、００１％ツイーン２０〔
アトラス−ケミカル社（ＡｔｌａｓＣｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、及び１５．４ｍＭナトリウムアジド。

Ｃ，キニジン標準品−５０ｍＭビシン緩衝液で５１倍に
希釈し、１５．４ｍＭナトリウムアジドを含む、正常ヒ
ト血清に加えたＵ８Ｐ−ＮＦ標準キニジングルコネート
ら （２）分析法 キュベツト中の抗体／酵素試薬３ｄに希釈した＋＝ジン
標準品１００　ｓｔを加えた。反応を開始させるため、
複合体試薬１００μｔを各キュベツトに混合しながら加
えた。２０分後、各キュベツトにおける蛍光強度を測定
した（励起４００ｎｍ、発光４５０ｆｌｆｆｌ）。

（３）結果 分析を実施して下記の結果を得た。

０　　　　　２９．２ ２．５　　　　　４２．Ｏ ＮＯ６１，０ ７，５７７，６ １００９（１０ 例　　２ この例では、剛性を変えた標識複合体中の結合基を使用
して別の二発色団系を研究した。この系は蛍光標識とし
てのウンベリフェロン誘導体及び消光性被分哲：、物と
してのチロキシンから成る。蛍光物質及び被分析物を７
レキシブルな基（式ｖ■及び■）及び剛性基（式■及び
■）を介して結合させた。

Ａ、ｌ１合体の製造 ！−ガラクトシルーウンベリフェロンーチｐキシン（Ｖ
）この化合物の構造は前記の式（Ｖ）で示される。

１７．７４Ｆ（０，１ｍｏｌ　）の４−ア之ノプチルア
ルデヒドジェチルア七タール（アルドリッチ）、２Ｌ１
１Ｌｌ（０，１６ｍｏｌ）のトリエチルアミン及び１０
０ｇＬｌの乾燥エタノールから成る０℃の混合物に、２
１．３Ｆ（０１６ｍｏｌ）のエチルトリフルオルアセテ
ートを１５分にわたって加えた。

反応混合物を室温に加湿し、−夜攪拌した。

溶剤を減圧下に除去し、残渣をエーテルに取り、食塩水
で洗浄した。有機相を乾燥し、濾過し、蒸発し、ａｌｌ
Ｉする褐色油を分留により精製すると、２４．６　Ｆの
４−（トリフルオ曽アセドア叱ド）ブチルアルデヒドジ
エチルアセタールが沸点１０４〜１０５℃（０，０１ｍ
５＋Ｈｇ）ｆ）無色の′１１ 油として得られた。

分析：　”ＨＮＭＲＸヘク）＃　（ＣＤＣｔｓ）　：　
１．２（ｔ　、　Ｊ　−７Ｈｚ、６８）　：　４．３　
（ｍ、　４）１）；　　１２〜４．０　（ｍ、　　６Ｈ
）　；　４．５　（ｔ　、　　Ｊ＝　５　Ｈｚ、ＩＨ）
；　６．３　（ｓ、ＩＨ）、赤外線スペクトル（ニー）
）：１７０５Ｂ　　（ＣＯ）。

テトラヒト賞フラン（ＴＨ１？）：酢酸：Ｈ，０（１：
ｔ：ｔ）３ｏ−中の前記アセタール３．１ｆ　（１２ｍ
ｍｏｌ　）の溶液をアルゴン下で室温で４８時間攪拌し
た。蒸発して得られた油を１０１？　（１２ｍｍｏｌ　
）のチロキシンエチルエステル〔クレイトン（Ｃ１ａｙ
ｔｏｎ　）及びヘムス（Ｈｅｍｓ）、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓ
ｏｃ、１９５０：８４０）及び２７５−の無水エタノー
ルと合せた。シアノ水素化硼素ナトリウム（４２２４，
５１ｇ　ｍｍｏｌ　）を加え、混合物を室温で２４時間
攪拌した。反応混合物を濾過し、減圧下に蒸発し、残分
を塩化メチレン：酢酸エチルから再結晶すると、４．３
２９のＮ−（４−トリフルオロアセトアミドブチル）チ
ロキシンエチルエステルが融点２０２〜２０４℃の白色
粉末として得られた。

分析：　Ｃ雪ｓＨｆ＊ｍＬＦｓＮ寓Ｏｓ　・２ＨｓＯと
してＣＨＮ 計算値　　２７．４０　　　！７０　　１７８実測値　
　２７．３６　　２．４５　　２，７７無水エタノール
１０〇−中のＮ−（４−トリフルオロアセトアミドブチ
ル）チロキシンエチルエステル２−５　ｆ　（Ｚ６ｍｍ
ｏｌ　）の溶液を加熱還流し、塩化水素で７時間処理し
た。反応混合物を冷却し、減圧下に濃縮し、残分をエタ
ノール−エーテルから２回沈酸させると、２．１ｆのＮ
−（４−アミノブチル）チロキシンエチルエステル２塩
酸塩がオアーホワイトの粉末として得られた。これをビ
スエタルレートとして分析した。

分析：　Ｃ＊ｔＨｚｓ　ｌ４ＣＩ４Ｎ＊０４・２（Ｃ雪
へ〇）：ｃ　　　　ＨＮ 計算値　　２１１Ｌ８４　　３．６７　　２．６９実測
値　　２９．３２　　　＆２８　　２．９１０℃の乾燥
ＤＭＦ３ｄ中の前記７−β−ガラクトシルクマリン−３
−カルボン酸１８４Ｎｇ（０、５ｍｍｏｌ　）　及びＮ
−ヒドロキシスクシンイミド６４１１９（０，５５ｍｍ
ｏｌ　）にジシｐ　ｇ　ヘ４　シにカルボジイミド１０
８２？　（０，５ｍｍｏｌ　）及びＤＭＦｏ、７５ｍ／
を加えた。反応混合物を室温に加温し、９０分攪拌し、
次にトリエチルアミン０．３５０１１１ｊ（５当量）を
含むジメチルスルホキシド（ＤＭ８０）５−に前記の２
塩酸塩５２１■（０，５ｍｍｏｌ　）を溶解して製造し
た第二の溶液と混合した。室温で２４時間攪拌した後、
溶剤を除去し、珪酸７０ｆでクロマドグラフイー処理し
、酢酸エチル〜１　：　１　ｖ／ｖの酢酸エチル：エタ
ノールを線状勾配で用いて溶離した。エタノールから再
結晶すると、３１８１１９のＮ−（４−（７−β−ガラ
クトシルクマリン−３−カルｌキシアミド）ブチル〕チ
ロキシンのエチルエステルが融点１１８℃の白色粉末と
して得られたＯ 分析：　Ｃ５ｖＨｓｓＩａＮ＊ＯｘｍとしてＣＨＮ 計算値　　３６．２４　　１１２　　１．９６実測値　
　３６０２　　　Ｚ９７　　１．９０前記のエチルエス
テル５６９１１Ｐ（０，５ｍｍｏｌ　）に水性メタノー
ル中の７　％　ＫＩＣＯｓ　１１液２３ｍを加えた。室
温で２４時間攪拌した後、澄明な溶液が得られた。Ｈ，
０で６０−に希釈し、希酢酸でｐＨｔｔ６．Ｏに調節し
た。こうして得られた沈澱を熱メタノールで洗浄すると
、４８９１９のＮ−〔４−（７−β−ガラクトシル−ク
マリン−３−カルｌキシ７尖ド）ブチル〕チロキシン（
ｖ）が融点１８６℃の白色固体として得られた。

分析：ＣＫ八、Ｉ４Ｎ諺０凰＄として ＨＮ 計算値　　３１０８　　２８６　　　Ｚ３４実測値　　
３４６８　　　Ｉ９４　　　Ｉ９１この化合物の構造は
式（Ｗ）で示される。

ＤＭＦ２０＋ｗｊ中の前記７−β−ガラクトシル−クマ
リン−３−カルｌン１１３６６１１９　（Ｉｙｌｎｏｌ
）、Ｎ−ヒトルキシスクシンイミド１１５１９（１ｍｍ
ｏｌ　）及びジシク田へキシルカルボシイ鷹ト２０６１
ｊｐ（１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間攪拌した。こ
れにチロキシンエチルエステル８０５”Ｆ　（１ｍｍｏ
ｌ　）を加え、反応混合物を一夜攪拌した。溶剤を除去
し、粗生成物をシリカゲル２５０ｔでりＶマドグラフィ
ー処理し、酢酸エチル：エタノールで溶離した。エタノ
ールから再結晶すると、式（Ｍ）の化合物３４０１９が
融点１８７〜１８８℃の白色固体として得られた。

分析：　Ｃｓ５Ｈ＊ｅＩ４ＮＯ＊ｓとしてＨＮ 計算値　　３４．３１　　２．５３　　１．２１実測値
　　３４．７７　　　’１８７　　１．１７β−ガラク
トシル−ウンベリフェロン−チロキシンエチルエステル
（■） この化金物の構造は前記の式（■）で示されるＯ ＤＭＦｌ　０ｏｍ中の前記７−β−ガラクトシルクマリ
ン−３−カルボン酸：ｌＬ６７Ｆ（１０ｍｍｏｌ　）　
、Ｎ−ヒトルキシスクシンイミド１．０５ｆ　（１０ｍ
ｍｏｌ　）及びジシクνへキシルカルボシイ主ド２−０
６　ｆ　（１０ｍｍｏｌ　）の溶液を室温で２時間攪拌
した。この溶液を濾過し、濾液を水１００ｄ中の６一ア
文ノへキサン酸１．４５　？（１０ｍｍｏｌ　）及びト
リエチルアミン２．．０２ｆ（２０ａｌｍｏｌ　）の０
℃の溶液に１５分間にわたって製部した。２時間後、溶
剤を除去し、残留する油を珪酸でクロマトグラフィー処
理し、酢酸エチル：エタノール混合物で溶離した。エタ
ノールから再結晶すると、２ｔのＮ−（５−カルボキシ
ペンチル）−７−β−ガラクトシルクマリン−３−カル
ボキシアミドが融点１７０℃の淡黄色結晶として得られ
た。

分析’　ｃａｔ八丁へ０１１として ＣＨＮ 計算値　　５４，８８　　５，６５　　２．９１実測値
　　５４．２７　　　Ｆｋ、６５　　１９１この１１４
８１　Ｗ　（１ｍｍｏｌ　）、トリエチルアミン１０１
”％’（１ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ　１０ｔ／の混合物を
アルゴン下に攪拌しながら一１θ℃に冷却した。この混
合物に１３６ＩｌｖのりＵロギ酸イソブチルを加え、１
５分後８８５　Ｗ　（１，１ｍｍｏｌ）のチロキシンエ
チルエステルを加えた。反応混合物を一１θ℃で１時間
攪拌し、室温に一夜加温した。溶剤を除去し、残渣なシ
リカゲルでクロマトグラフィー処理し、酢酸エチル−エ
タノール混合物で溶離した。メタノールから再結晶する
と、４００■の式（■）の化合物が融点１４８℃の白色
固体として得られた。

分析８Ｃｓ−也・Ｉ４Ｎ鵞Ｏ！意としてＣＨＮ 計算値　　３６，９３　　３．１８　　２−２１実個値
　　３７．６１　　　１５５　　２．．１３この化合物
の構造は前記の式（■）で示される。

ＤＭＦ２５０１Ｅ１１？中で１−（２−）リフルオロア
セトアミドエチル）ピペラジン（５６２，０２５ｍ０１
）、トリエチルアミン３７．５ｍ及びエチルクｔｗｏア
セテート３０．３９　（０，２７ｍｏｌ）を混合した。

温度を５分間で７０℃に上昇させた。反応混合物を室温
で一夜攪拌し、次に濾過してトリエチルアンモニウム塩
酸塩を除去した。

溶剤を除去し、残留する油状残分を２５０Ｗｌｌのクロ
ロホルムに取り毎回３００１１Ｌｌの水で２回洗浄した
。有機相を乾燥し、蒸発すると、５１ｆの４−（２−ト
リフルオロアセドアミドエチル）ピペラジン−１−酢酸
エチルが黄褐色の固体として得られた。この固体をそれ
以上特性決定しないで、４：ｌのメタノール：水２５０
ＷＬｔ中の水酸化カリウム２０Ｆと共に６時間攪拌した
。

生成物をシリカゲル１４００Ｆでクロマトグラフィー処
理し、４　’　４　：　Ｉ　Ｖ／Ｖ／Ｖのり００ホルム
、メタノール、濃水酸化アンモニウムで溶離した。メタ
ノールから再結晶すると、２Ｌ５ｆｆ）４−（２−アミ
ノエチル）ピペラジン−１−酢酸が融点２２５℃（分解
）の白色結晶として得られた。

ＤＭＦ４０＋ｗＪ中の前記７−β−ガラクトシルクマリ
ン−３−カルダン酸２．６　ｆ　（ａ　５　ｍｍ＃１）
１Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７３０１１９（６゜５
ｍｍｏｌ）及びジシクロへキシルカルボジイミド１．３
Ｆ（６，３ｍｍｏｌ　）の溶液を室温で３６時間攪拌し
た。この溶液を濾過して沈澱したジシクロヘキシル尿素
を除去し、濾液を水４０ｄ中の４−（２−アミノエチル
）ピペラジン−１−酢酸１．２ｆ（６，４ｍｍｏｌ　）
の冷溶液に製部した。

これに５２０８９（６，２ｍｍｏｌ　）のＮａＨＣＯｓ
を加え、反応混合物を一夜室温に加温した。生成した沈
澱を水：２−プロパツールから再結晶すると、２＝２９
の４−（２−（７−β−ガラクトシルクマリン−３−カ
ルボキシアミド）エチルコピペラジン−１−酢酸（標識
酸誘導体）が白色固体として得られた。２５０■の試料
を水：メタノールから再結晶すると、融点１８７〜１９
２℃の白色結晶１８０１１Ｆが得られた。

分析：Ｃ篇、ＨａＩＯ，１−Ｈ，０としてＣＨＮ 計算値　　５１．８９　　　ｍ９８　　７．４６実測値
　　５１．８７　　　ｍ９０　　７．９０１１１記のＮ
−（４−トリフルオロアセドア宅ドブチル）チロキシン
エチルエステル（！Ｏｆ。

１ｍ　１　ｍｍｏ　ｌ　）を２０ｍのテトラヒトｔ２ヤ
フンに溶かしＮ　４１ｄの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液と
混合した。混合物を一夜アルゴン下に５０℃で攪拌した
。溶剤を蒸発し、残渣１ｌｒ５ｔの珪酸でクロマトグラ
フィー処理した。カラムをクロルホルム：メタノール：
濃水酸化アンモニウムの２：１：１及び１１１：ＩＶ／
マ／Ｖ混合物の下相のそれぞれ３ｔで順次溶離した。得
られたオアーホワイトの粉末を２Ｎ水酸化ナトリウム５
１１Ｌｌを含むエタノールに溶かし、木炭で処理し、濾
過し、酢酸で沈澱させると、Ｎ−（４−アミノブチル）
チロキシン１．５　ｆが融点１６６℃（分解）の白色粉
末として得られた。

分析：　ＣｍｓＨｓ＊　Ｉ４　Ｎ５Ｏｓ　−１％０とし
てＣＨＮ 計算値　　２６．８５　　１６１　　３．３０実測値　
　２６．．４７　　２，５１　　３．２９メタノール３
〇−中のＮ−（４−アミノブチル）チロキシン１．３５
　ｆ　（１，６ｍｍｏｌ　）の懸濁液をＨＣＩ　ガスで
２分処理し、次に４８時間還流した。蒸発し、メタノー
ルから再結晶すると、Ｎ−（４−アミノブチル）チロキ
シンメチルエステルの２塩酸塩１．３５　ｆが得られた
。

分析：　ＣｍｏＨ＊ｓ　ＩａＮｍＯｍ　・２　ＨＣ１と
してＣＨＮ 計算値　　２６．１４　　１６３　　３．０５実測値　
　２５．１６　　　ｍ６６　　３．０９ＤＭＦＢｄ中の
標識酸誘導体２６９ｗｇ（０５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド５１ｗ９（０，５５ｍｍｏｌ　）
（Ｆ）溶液をθ℃ｋｍ［ｌ、ＤＭＦＺｄ中のジシクロへ
キシルカルボジイミド１１２１１Ｆ（’０．５４ｍｍｏ
ｌ　）の溶液と混合した。

反応混合物を室温に加温し、４８時間攪拌した。

濾過し、濾液を下記のようにして製造した第二の溶液に
加えた。

ＤＭＦｌ　０ｄ中の前記２塩酸塩メチルエステル４７７
ＷＮ（０，５ｍｍｏｌ　）に固体重炭酸ナトリウムｉ　
２　ｓａｇ（１，５ｍｍｏｌ　）を加えた０１０分間攪
拌した後、標識酸誘導体のＮ−ヒトルキシスクシンイミ
ドエステルを含む濾液を加えた。

鏝終溶液を２０時間攪拌し、更に重炭酸ナトリウム４２
１１Ｆ（０，５ｍｍｏｌ　）を加え１、攪拌を更に２０
時間続けた。反応混合物を濾過し、溶剤を除まし、残渣
な珪酸１００ｆでクロマトグラフィー処理した。カラム
を１ｔのエタノール〜１ｔの４　：　１　ｖ／ｖエタノ
ール：ＩＭ重炭讃トリエチルアンモニウム水溶液を線状
勾配で用いて溶離した。こうして得た粗生成物をセファ
デックスＬＨ−２０で再度クロマトグラフィー処理し、
メタノールで溶離した。メタノール−酢酸エチルから再
結晶すると、式（■）のメチルエステル１９１１１１Ｐ
が融点１２５℃のオフ−ホライトの粉末として得られた
。

分析：　ＣａａＨａ＊　ｌ４ＮＩＯ１４としてＣＨ′・
・・　　Ｎ 計算値　　３１Ｌ２５　　３．７２　　　［０７実測値
　　３７．９２　　４．０１　　４９９前記エステル２
３０岬（１６６ｘｍｏｌ）及び７０襲水性メ、タノール
中の７％炭酸カリウム溶液＆５３ｄの混合物を２４時間
攪拌し、水で２２−の総量に希釈した。希酢酸でｐＨを
６．０に調節した。生成した沈澱を濾過し、乾燥すると
、１Ｂ１１９の黄褐色の粉末が得られた。この試料１３
０■を熱ＤＭＦ　２＋ｗｊに溶かし、濾過し、無水エタ
ノール４．７ｄで希釈した。冷却すると、式（■）の化
合物９８岬が融点２０３℃（分解、１８０℃から暗色に
なる）の淡ベージュ色粉末として得られた。

分析：　Ｃａ５Ｈｎ　ｌ４ＮＩＯ１４としてＨＮ 計算値　　３７．７６　　３，６１　　　５．１２実測
値　　３５．５０　　３，４３　　４．３５β−ガラク
トシル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−チロキシン
資金体（■）の前記合成法を変簀して、ｎ　＝　２〜９
、ｍ　＝　２〜９、ｐ＝１、ｒ：＝：２〜９であり、β
！及びβ雪がそれぞれＨまたはＩである複合体を下記の
ようにして製造することができる。

式（■）の合成において４−（２−ア之ノエチル）ピペ
ラジン−１−酢酸を適当な４−（ω−アミノアルキル）
ピペラジン−１−アルカン酸りで代えることによりｎ　
＝　２〜９　、ＩＢ　＝ｅ　２〜９の豪合体を製造する
ことができる〔反応式３参照〕。Ｌのような中間体は、
ピペラジンを１当量のＸ　４−ＣＢ、　罎Ｃ００Ｃ：ｎ
　Ｈｌ　（式中Ｘは前記のような脱離基を褒わす）と反
応させてモノ−アルキル体Ｈとすることによって製造す
ることができる。これを・−ヒト四キシアルデヒド（ハ
ード及びポーチの前記文献参照〕で還元アルキル化して
化合物Ｊにすることができ、そのアルコール基は１以上
の工程で脱離基（Ｋ）に変換することができる。後者の
中間体は、モノー置換ピペラジンＨを前記の二官能性反
応体Ｘ　＋　ＣＨＩ）−１Ｙでアルキル化することによ
っても得られる。ＫからＬへの変換は、脱離基Ｘを適当
な溶剤中でアタルイミドカリウムで置換することによっ
て達成することができる。ＪからＬへの変換は前記の主
ツノ力の文献に記載されている方法で達成することがで
きる。中間体りを、エステル官能基の段階的除去（酸ま
たは塩基で緩和な処理）及び７タルイ主ド官能基の段階
的除去（ヒドラジンまたは強酸）によりＭに変換するこ
とができる。

■の合成において４−アミノブチルアルデヒドジエチル
７セタールを・−アミノアルデヒドジエチルアセタール
Ｑで代えることによって、ｒが２〜９である複合体を製
造することができる〔反応式４参照〕。

゛　反応式４ このようなアセタールは前記のω−ヒトｐキシアルデヒ
ドアセタールＮ（ハードの前掲文献）から得られる。こ
れらのヒドロキシア七タールは、直接、前記攬ツノクの
操作によって、または間接的にヒドロキシ基を脱離基に
変え１種０）、次にＸを７タルイミドカリウムで置換す
ることによってΦ−７タルイミドアルデヒドアセタール
Ｐに変えることができる。中間体Ｐをヒドラジンで処理
すると、ω−ア叱ノアルデヒドアセタールＱが生成する
。

β−ガラクトシルーウンペリ７工ｐンービペラジ品ルー
チロキシン（ＩＫ） この化合物の構造は前記の式（Ｋ）で示される。

１１．１　Ｆ（０，０５ｍｏｌ）の１−（２−トリフル
オロ子七ドア之ドエチル）ピペラジン（アルドリッチ）
、９．９１１Ｌｌの３−クロロブ讐ピオンアルデヒドジ
エチルアセタール（アルドリッチ）、２．６Ｆの重炭酸
ナトリウム及び５０ｓＪのＤＭ８０の混合物を室温で３
日間攪拌した。更に９ｄの前記クロルアセタールを加え
、反応混合物を８５℃で９０分間加熱した。溶剤を除来
し、残渣をりｏｐホルムに取り、水で３回洗浄し、乾燥
し、蒸発した。粗生成物を３００ｆのシリカゲルでクロ
マトグラフィー処理し、１６０：１０：　１　ｖ／ｖ／
ｖのクロロホルム、メタノール、濃水酸化アンモニウム
で溶離した。こうして３．５ｔの１−（３−ジエシキシ
プｐビル）−４−（２−トリプルオロアセトアミドエチ
ル）ピペラジン（以下ジエチルアセタールと記す）が黄
色前として得られた。

分析：マススペクトル（７０ｅ、Ｖ、）：ｍ／ｅ３５５
（Ｍ　　）；２３８（Ｍ　　マイナスＣＨ雪ＣＨ（ＯＣ
Ｉ）ＩＩ　）ｓ　）　：２９９　（Ｍ　　マイナスＣＦ
、ＣＯＮｎｃｍ−）。

ジエチルア七タール（５００１１ｖ、　１．４　ｒｒｔ
ｎｏｊ）を濃塩酸０４−を含むテトラヒドロフラン２〇
−中で室温で４時間攪拌した。溶剤を蒸発し、３−（４
−（２−）リアルオロアセトアミドエチル）ピペラジニ
ル−１〕ブνビオンアルデヒド（以下アルデヒドと記す
）から成る残液を高度真空下に３０分間乾燥した。チリ
キシンエチルエステルｍａｌｌ　（１ｆ　、　１．２　
ｍｍｏｊ　）を９５−水性エタノール１５ｓｄに溶かし
た。アルデヒドを加え、次に１当量の２０％水酸化ナト
リウムを加えて、Ｉ）Ｈ５，Ｏの溶液が得られた。この
溶液に３００”ｌＦ（４８ｍｍｏｌ　）のシアノ本書化
硼素ナトリウムを加えた。室温で３日間攪拌した後、反
応生成物を１００１のシリカゲルでクーマドグラフィー
処理し、１６０：１０：ＩＶ／マ／Ｖのクロルホルム：
メタノール：濃水酸化アンモニウムで溶離すると、６２
０１１ＦのＴ４エステル中間体が融点８４〜９０℃の白
色粉末として得られた。

分析：Ｃ３魯ＨｓｍＦｓＩａ　ＮａへとしてＣＨＮ 計算値　　３１，４５　　３．０２　　１２４実測値　
　３０９２　　１８０　　５．００６００Ｍｆｌ（０５
６ｍｍｏｌ　）の前記Ｔ４　Ｘ　Ｘ　？　ｋ中間体を、
水１０ｄ中に８−一水酸化カリウム１１ｔを溶かすこと
によって作った溶液１ｄに溶かした。室温で４８時間攪
拌した後、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル上、４
：４：１マ／　Ｖ　／　Ｖクロロホルム：メタノール：
濃水酸化アンモニウム）処理すると、Ｎ−（（３−（４
−（２−アくノエチル）ピペラジニル−１〕プロピル〕
〕チロキシンｃ以下Ｔ４酸中間体と記す）に完全に変換
したことが判った。溶剤を除去し、残渣を水１０−に取
った。溶液のｐＨを重炭酸ナトリウムで９．０に調節し
、ＤＭＦ４０ＭＩを加えた。

同時に、２３０”９（０，６２ｍｍｏｌ　）の前記７−
β−ガラクトシルクマリン−３−カルボン酸及び７０１
９（０，６７ｍｍｏｌ　）のＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドを５−のＤＭＦに溶かし、０℃に冷却した。ジシク
ロへキシルカルボジイミド（１２７１１Ｆ、　０６２ｍ
ｍｏｌ　）を加え、溶液を室温に加温し、３時間攪拌し
た。ジシクロヘキシル尿素の沈澱を濾過により除去し、
濾液をＴ４酸中間体の冷（−５℃）溶液に加えた。合し
た溶液を一夜攪拌した。溶剤を除去し、残渣を１００２
のシリカゲルでり田マドグラフィー処理し、５：１マ／
Ｖエタノール：１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶
液で溶離した。こうして、２３０岬のチロキシン誘導体
（■）が融点２０７〜２１５℃（分解）の白色固体とし
て得られた。

分析：Ｃ４・Ｈ４４Ｉ４　Ｎａ　Ｏｕ　・′地０として
ＣＨＮ 計算値　　３６．０５　　３．６３　　４２０実測値　
　３５．８７　　３．８９　　４．０６β−ガラクトシ
ルーウンベリ７工四ンービペラジニルーチｐキシン豪合
体（Ｋ）の前記合成法を変更して、■の合成における４
−（２−アミノエチル）ピペラジン−１−酢蒙を■に示
したような適当な４−（６１−アミノアルキル）ピペラ
ジン−１−アルカン酸Ｍで代えることによって烏＝２−
〜９、ｍ＝２〜９の複合体を製造することができる。

Ｂ、相対的蛍光強度の研宛 ４　Ｑ　Ｑ　ｎｍに設定した励起波長及び４５９　ｎｍ
に設定した発光波長を用いてアミンコ・ボーマン分光蛍
光針（Ａｍ１ｎｃｏ　Ｂｏｗｎａｎ　８ｐｅｅｔｒｏｆ
ｌｕｏｒｏ−ｍｅｔｅｒ　）　（メリーランド州シルパ
ースプリンゲスのアメリカン・インスシラメント社（、
＾ｍｅｒｉｃａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、　）　
）で測定した。

結果を表Ｂに示す。前記の５種の標識複合体（Ｖ−ＩＫ
　）をβ−ガラクトシダーゼで分解した蛍光性ウンペリ
７工ｐンーチｐキシン生成物及び被分析物に結合してな
い蛍光性ウンベリ７工ｐン誘導体（＠ＲＡ８”と記す）
について蛍光データを集めた。

データから、結合手にＮ、Ｎ／−ビペラジニレン基を挿
入す、ると、蛍光物質標識はその正常な蛍光（未結合、
即ちクンペリ７工四ン誘導体の蛍光）の約２０弧の蛍光
を示すことが判った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　被分析物まえはその結合アナｐ−グ及び発光
   性標識から成る標識複合体を含む試験系と試験試料を混
   合し、これＫより酋記榔Ｈ合体の結合種及び遊離種を含
   む反応混合物を形成させ、前記遊離−が励起すると発光
   しうる発光団（ｐｈｏｔ・ｐｈｏｒ　）　Ｋ結合し大前
   記値分析物またはアナローブから成る被分析物−一党団
   一複合体を生成し、前記被分析物−発光団一複舎体の被
   分析−まえはアナ四−グ部分が員光団と消光配列に１に
   ′）えと１にそのような発光を着しく減少することかで
   １１．前記ｌ１ｌＦｌ＃種または遊離種中の前記発光団
   を＃匍し、１じる発光を試料中の被分析物の画数として
   一定することＫより、試験試料中の拳分析物を一定する
   特異結合分析において；前記標識複合体中の前記被分析
   物またはアナローブを、前記発色団と前記被分析物また
   はアナローブ部分との消光配列な実質的に妨害する結合
   基によって前記発光性標識に結合させること及びそのよ
   うな結合基がビペラジニレン、フェニレン、シクロヘキ
   シレン、２価炭素同嵩濃及びヘテロ濃縮合ｉ１％アセチ
   レ′ン、ビス−置換単糖類、２価ビシクロオクタンロッ
   ド及び２価スビｐ−結合濃構造から選択され九基から成
   ることを特徴とする試験試料中の被分析物を一定する特
   異結合分析法。 ＋２１　　前記結合基がＮ　、　Ｎ’−ビペラジニレン
   基から成る特許請求の範Ｉｌ篇１項記載の分析法。 （３）　　前記発光団が螢光物質である特許請求の範囲
   第１項記載の分析法。 （４）　　前記標識複合体が遊離種である場合に比べて
   結合種で存在する場合に１発光団の発光性が測定可能Ｋ
   ｉｋ１にり、前記発光団を反応混合物中で励起肯せ、生
   じる発、光が試料中の被分折物の函数である均−置の特
   許請求の１ＩｌｉＩ第１項記載の分析法。 （５）Ｃｄ　　被分析物の結合対手、及び伽）前記被分
   析物まえはその結合７ナローグ及び発光性ａｍから成る
   標識複合体 から威ｐ％この試薬系を試験試料と拠金して筐体反応混
   合物にすると、前記標識複合体の結合対手−緒金種及び
   遊離種が生威し、前記遊離種が励起すると発光しうる発
   光ｍに紬含し大前記被分析物またはアナローブかう虞為
   被分析物−発光団−複合体を生威し、前記被分析物−発
   光団−複合体の被分析物資えはアナローブ部分が発光団
   と消光配列に１に′：）えと１１にそのような発光を著
   しく減少す為ことができる。試験試料中の被分析物の特
   異結合分析用の試薬系において；前記被分析物書えはア
   ナ田−グが、前記発色団と前記被分析物★たはアナロー
   ブ部分との消光配列を実質的に妨害する一合基によって
   前記標識複合体中の前記発光性標識に結合し、そのよう
   な結合基がピペラジニレン、フェニレン、シクロヘキシ
   レン、２価炭素同ｓｍ及びヘテロ壌式縮合濃、アセチレ
   ン、ビスー置換拳糖類％２価ビシクロオクタンロッド及
   び２価スピロ−結合製構造から選択された基から成るこ
   とを％像とする試験試料中の被分析物の特異結合分析用
   の試薬系。 （６）前記結合基がＮ、Ｎ’−ビペラジニレンかう成る
   特許請求の範Ｓ菖５項記載の試薬系。 ゛（７）前記発光団が螢光物質である特許請求の範ＷＡ
   第５項記載の試薬系。 （８）励起すると発光しうる発光団に化学的に結合され
   た前記被分析物またはその結合アナローブからなり、該
   発光が、複合体の被分析物またはアナローブ部分が発光
   団と消光配列になる場合に着しく減少する。試験試料中
   の被分析物の特異分析測定に使用する標識複合体におい
   て；前記被分析物またはアナローブが。 前記発光団と前記被分析物またはアナローブ部分との消
   光配列を実質的に妨害する結合基によって前記発光団に
   結合し、該結合基がビペラジニレン、フェニレン、シク
   ロヘキシレン、２ｍ炭素同＊＊及びヘテロ褒式纏舎濃、
   アセチレン、ビスー置換単糠ＩＩ１．２価ビシク■オク
   タンｐツド及び２価スヒロー曽舎拳構造から選択された
   基から成ることを４１１１とする試験試料中の被分析物
   の特異結合分析用の標識複合体。 （一式： 〔式中ｗｚ　＃ｉ２〜９の整数であ〕、１は３〜９の整
   数であＩｌｌ、　Ｒａ！艙舎基でＴｏＭｈＬ＆！被分析
   物またはそのアナローブである〕の！−ガラクトシルー
   ウンベリフエｐンー標識複金体。 Ｉ＠Ｌが分子量１５００未満のハプテンである特許請求
   の範Ｉ！１篇９項記載の複合体。