JPS5816471B2 - 免疫化学的測定試薬の安定化剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫化学的測定試薬の安定化剤及びその製造方
法並びにそれを使用する免疫化学的測定試薬の安定化法
に関する。

従来、血液、尿その他の体液中に含まれる生理活性物質
を測定する方法として多くの免疫化学的方法が用いられ
ている。

なかでも、血球、高分子ラテックス等の微粒子固体を、
抗原又は抗体の担体とする測定試薬はその使用方法が簡
便であり、測定結果が迅速にわかることから前記生理活
性物質の測定に広く用いられている。

例えば、前記の試薬を用いて妊娠の凝いのある婦人の血
清又は尿中のゴナドトロピン（以下ＨＣＧと略す）を測
定して妊娠を診断すること、あるいは妊婦の尿中エスト
リオールを測定して胎児の発育の状態を判断すること等
が行なわれている。

これらの測定試薬は免疫化学的凝集反応又は凝集阻止反
応を利用するものであり、この試薬を用いて正確な測定
を行なうためには、被検物質が微量でも存在すれば、被
検物質と試薬との間に生じる免疫化学的反応に基づいて
凝集反応又は凝集阻止反応が生起して、その被検物質を
測定することができるという高い測定感度と、被検物質
が存在しなければ凝集反応又は凝集阻止反応は全く生起
しないという高い特異性とが要求される。

更にこれらの試薬は長期間保存した後でも製造直後の感
度と特異性を実質的に保持していること、すなわち保存
安定性の良いことが必要である。

微粒子固体を担体として用いた従来の測定試薬は製造直
後の測定感度と特異性を長期間に亘って保持することが
困難であったため、試薬の有効期間が短かったり、ある
いは有効期間内であっても誤った測定結果を与えること
がしばしばであった。

そこでえれらの欠点を除去するため、微粒子固体を予め
当該免疫反応に関与しない蛋白質で被覆したのち、抗原
又は抗体を吸着させる方法や、微粒子固体に抗原又は抗
体を吸着させた後、当該免疫反応に関与しない蛋白質溶
液で処理する方法が提案されている。

（特公昭４３−１２，７４１号、特公昭４９−１１，４
０７号及び特開昭５０−８２．２３０号公報参照）。

これらの先行技術においては免疫反応に関与しない蛋白
質として血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）、卵アル
ブミン（以下ＥＡと略す）、ラクトアルブミン、ヘモグ
ロビン、血清グロブリン、ラクトグロブリン等が用いら
れており、ある程度の効果は得られているが必ずしも十
分でない。

本発明者らは十分に高い測定感度と特異性を長期間保持
させ得る安定化剤について研究を重ねた結果、チトクロ
ームＣが優れた効果を有することを見出し、本発明を完
成した。

本発明の安定化剤を得るには、例えばチトクロームＣを
０．０１〜５％、好ましくは０．１〜１．０％の濃度に
なるように０１０５〜０．２％アジ化ナトリウム溶液に
溶解した後、緩衝液、例えばグリシン緩衝食塩水（以下
ＧＢＳと略す）（ｐＨ８，２）に対して１夜透析する。

チトクロームＣの濃度は０．０１％以上であることが必
要であり、それ以下では所望の効果が得られない。

高濃度側におけるチトクロームＣの濃度は臨界的ではな
いが、実用上５係以下、特に１％以下が好ましい。

本発明の安定化剤は主成分であるチトクロームＣを加熱
処理することによって更に有利な効果を発揮し得る。

このチトクロームＣ熱変性物を主成分とする安定化剤は
次のようにして得ることができる。

即ち、チトクロームＣを０．０１〜５％、好ましくは０
．１〜１．０％の濃度になるように０．０５〜０．２％
アジ化すｌ−ＩＪウム溶液に溶解した後、オートクレー
ブで２〜８時間、１００〜１３０℃、好ましくは１１５
〜１２５℃に加熱する。

その後生じた凝固物を除去して得たチトクロームＣ熱変
性物溶液を緩衝液、例えばＧＢＳに対して透析して安定
化剤を得る。

安定化剤を製造するに際しては、チトクロームＣ溶液を
緩衝液に対して透析する代わりに、緩衝液の各組成分を
各々所望の濃度となるように添加した後、所望のｐＨに
調整してもよい。

第１図は加熱処理しない馬心筋チトクロームＣを主成分
とする安定化剤の可視部吸収スペクトルを示すものであ
る。

５５０ｍｍにチトクロームＣ特有の吸収のピークが認め
られる。

第２図は馬心筋チトクロームＣ熱変性物を主成分とする
安定化剤の可視部吸収スペクトルを示すものであり、熱
変性により、チトクロームＣ特有の５５０龍における吸
収は消失し、短波長側に向ってゆるやかな吸収の増大が
認められる。

本発明の安定化剤を用いて、測定感度及び特異性を長期
間保持し得る安定化された試薬を得るには、抗原又は抗
体を吸着させた微粒子固体を安定化剤で処理するが、そ
れとともに合わせて、検体稀釈用緩衝液にも安定化剤を
含有させることにより、より一層大きな効果を得ること
ができる。

微粒子固体を安定化剤で処理するには、緩衝液に溶解し
た抗原又は抗体の溶液と微粒子固体の懸濁液とを混合し
て、微粒子固体に抗原又は抗体を吸着させた後遠心分離
する。

次いで、この沈澱物に安定化剤を加えて混合した後、微
粒子固体を遠心分離し、沈澱物を緩衝液に再懸濁させる
。

また、検体稀釈用緩衝液に安定化剤を含有させるには、
チトクロームＣ溶液又はチトクロームＣ熱変性物溶液に
、使用すべき緩衝液の組成成分、例えばＧＢＳわ使用す
る場合にはグリシン及び塩化ナトリウムを各々０．７５
％及び０．８５％の濃度となるように加え、更にアジ化
ナトリ１クムを０．１％の濃度となるように加えた後、
０．ＩＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８，２に調整する
。

ここで使用する緩衝液としてはＧＢＳの他リン酸緩衝食
塩水（以下ＰＢＳと略す）、ホウ酸緩衝食塩水（以下Ｂ
ＢＳと略す）など、免疫化学の分野において通常用いら
れる緩衝液が使用できる。

本発明の安定化剤は微粒子固体を使用する測定試薬の安
定化に有効であるが、微粒子固体として各種動物の面球
又は高分子ラテックス（例えばポリスチレンラテックス
、スチレン−ブタジェンコポリマーラテックス、スチレ
ン−ジビニルベンゼンコポリマーラテックス、スチレン
−メタアクリレートコポリマーラテックスなど）あるい
は水酸基又はカルボキシル基などの官能基を導入した高
分子ラテックスを用いた試薬の安定化に特に有効である
。

本発明に用いるチトクロームＣとしては馬心筋チトクロ
ームＣのほか牛心筋チトクロームＣ１酵母チトクローム
Ｃも同様に使用できる。

本発明を実験例及び実施例によって更に説明する。

実験例 １ 本発明の安定化剤と従来から使用されている蛋白質との
効果を比較した。

本発明の安定化剤としては、チトクロームＣを後述の実
施例１又は２の方法で処理して製造したものを用い、従
来の蛋白質としてはＢＳＡとＥＡを各々０．１係の濃度
にＧＢＳに溶解したものを用いた。

そして微粒子固体としてポリスチレンラテックスを用い
て、これに後述の実施例６の方法で抗体を吸着させた後
、前記安定化剤又は蛋白質で処理して試薬を製造した。

又、実施例３に準じて本発明の安定化剤を含有させた検
体稀釈用緩衝液を製造して、前記の試薬と共に３７℃で
第１表に示した期間保存した。

各期間経過後、前記の試薬及び緩衝液を用いてＨＣＧを
測定して、測定感度の変化と非特異反応の生起について
調べた。

測定感度はＨＣＧＩ ＩＵ／ｍｌ及び０．５ Ｉ Ｕ
／ｍｌを測定したときの凝集の強さで示し、非特異的反
応はＨＣＧを含まない非妊娠尿を測定したときの凝集の
強さで示した。

・ 凝集の強さの判定基準は次の通りである。

升 ：肉眼的に強い凝集像を示すもの ＋ ：肉眼的に明瞭な凝集像を示すもの ± ：肉眼的に凝集像の不明瞭なもの 一：肉眼的に凝集像を全く示さないもの 本発明の安定化剤のうち、チトクロームＣを主成分とす
るものを使用した試薬は、６ケ月間の保存後わずかに特
異性が変化したが、測定感度には変化がなかった。

チトクロームＣ熱変性物を主成分とする安定化剤を使用
した場合は、長期間保存しても測定感度の変化や非特異
反応は生じない。

ＢＳＡを使用した場合は測定感度は比較的よく保たれた
が、保存期間の経過とともに非特異的反応が強くなるの
で、試薬の信頼性は損なわれる。

ＥＡを使用した場合は保存期間の経過にしたがって測定
感度が上昇するとともに特異性が低下し、ＨＣＧを含ま
ない非妊婦尿でも強い凝集像を示すようになるのでＨＣ
Ｇ測定の意味をなさなくなる。

なお、試薬の劣化は第２表に示した４つの型に大別する
ことができるが、上記の結果から明らかなように、ＢＳ
Ａは■型の、ＥＡは■型の劣化型を示す。

実験例 ２ 抗ＨＣＧγ−グロブリンを吸着させた微粒子固ン体をチ
トクロームＣ熱変性物を主成分とする安定化剤で処理し
て得た試薬、安定化のための何らの処理も行なわない試
薬、前記安定化剤を含有させた検体稀釈用緩衝液及び安
定化剤を含有させない検体稀釈用緩衝液の４者を第３表
に示す期間３７℃に保存し、各期間経過後、第３表に示
すように組合せてＨＣＧを測定して安定化剤の効果を調
べた。

第３表に示すように、安定化剤で処理した試薬と安定化
剤を含有させた検体稀釈用緩衝液とを組。

合せた場合に安定化の効果は最大であったが、試薬のみ
を安定化剤で処理した場合にもある程度の効果が認めら
れた。

なお、判定基準は実験例１と同様である。

実験例 ３ 安定化剤中のチトクロームＣの濃度が安定化効果に及ぼ
す影響を調べた。

実験操作及び判定基準は実験例１に準じた。

第４表に示すように、０．０１％では長期の保存後に感
度の低下及び非特異的反応が生ずるが、０．１係以上で
はいずれの濃り度においても優れた効果を示している。

実施例 １ 馬心筋チトクロームｃ （Ｈａｇｉｈａｒａ、Ｂ 、
、ｅｔａｌ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ４５巻、５
５１頁（１９５８年）〕を０．１係アジ化ナトリウム溶
液に０．３％の濃度になるように溶解する。

この溶液をＧＢＳ（ＰＨ８，２）に対して１夜透析して
、チトクロームＣを主成分とする安定化剤を得る。

実施例 ２ 牛心筋チトクロームｃ （Ｈａｇｉｈａｒａ、Ｂ、 、
ｅｔａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ４５巻、５５１
頁（１９５８年）〕を０．１％アジ化ナトリウム溶液に
０．５％の濃度になるように溶解する。

この溶液をオートクレーブで１２１℃、６時間加熱処理
する。

生じた凝固物を除去した後、ＧＢＳに対して１夜透析し
て、チトクロームＣ熱変性物を主成分とする安定化剤を
得る。

実施例 ３ 酵母チトクロームｃ （Ｈａｇｉｈａｒａ、Ｂ、 、ｅ
ｔ ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ、 １７８巻、６２９頁（１９５６年）〕
を０．１％アジ化ナトリウム溶液に１．０係の濃度にな
るように溶解する。

この溶液をオートクレーブ中で１２１℃、４時間加熱処
理する。

生じた凝固物を除去した後、これにグリシン、塩化ナト
リウムをそれぞれ０．７５％、０．８５％及びｏ、ｔ％
の濃度になるように加え、０．ＩＮ水酸化ナトリウム溶
液でｐＨ８，２に調整して、安定化剤を含有する検体希
釈用緩衝液を得る。

実施例 ４ ＨＣＧ ＣＤｉｏｓｙｎｔｈ製、オランダ）ライオン交
換クロマトグラフィーによって精製した画分（比活性６
０００ＩＵ／〜）を０．０３係の濃度になるようにＢＢ
Ｓに溶解する。

この溶液５０ｒＩＬｌにポリスチレンラテックス（平均
粒子径０，５４μ）の１０％懸濁液を５０ＷＬｌ加え、
３７℃で３０分間加熱してＨＣＧをポリスチレンラテッ
クスに吸着させる。

遠心分離の後、沈澱物に実施例２に準じて製造した安定
化剤２００ｍ１を加える。

４℃に１夜静置した後遠心分離し、沈澱物をＢＢＳに再
懸濁して、安定化されたＨＣＧ測定試薬を得る。

実施例 ５ ヒト胎盤性ラクトーゲン〔以下ＨＰＬと略す。

）森用ら、日本内分泌学会誌、４９巻、８８２頁（１９
７３年）〕をウサギに免疫して得た抗 ′ＨＰＬ血清を
硫酸ナトリウム塩析によって精製して、抗ＨＰＬγ−グ
ロブリン分画を得た後、この分画を０．０６％の濃度に
なるようにＰＢＳに溶解する。

この溶液２００１′Ｌｌに、ホルマリン及びタンニン酸
で処理した羊血球の３．３％浮遊液を２００Ｍ加えて混
合し、３７℃、１０分間加熱した後遠心して、抗ＨＰＬ
γ−グロブリン吸着血球を分取する。

この面球をＰＢＳで洗浄した後、実施例２に準じて製造
した安定化剤を２００ｒｆＬｌ加え、１０℃で１夜静置
する。

その後、抗ＨＰＬγ−グロブリン吸着血球を遠心分離し
てＰＢＳに再懸濁して安定化されたＨＰＬ測定試薬を得
る。

実施例 ６ 精製したＨＣＧをウサギに免疫して抗ＨＣＧ血清を得、
この血清から硫酸ナトリウム塩析によって精製したγ−
グロブリン分画を０．０６％の濃度になるようにＧＢＳ
に溶解する。

この溶液２０ｒｎｌに、水酸基を導入したスチレン−ジ
ビニルベンゼンコポリマーラテックス（平均粒子径０．
３μ）の１０％懸濁液を２０ｄ加え、３７℃で１０分間
加熱してラテックスに抗ＨＣＧγ−グロブリンを吸着さ
せる。

ＧＢＳで洗浄した後、沈澱物に実姉例２で製造した安定
化剤２２０ｒｎｌを加える。

４℃に１夜静置した後、ラテックスを遠心分離してＧＢ
Ｓに懸濁して、安定化されたＨＣＧ測定試薬を得る。

実姉例 ７ ＨＰＬをウサギに免疫して得た抗ＨＰＬ血清から、硫酸
ナトリウム塩析によってγ−グロブリン分画を精製する
。

この分画を０．０６％の濃度になるようにＰＢＳに溶解
し、この溶液２０ｒｎｌに、スチレン−ジビニルベンゼ
ンコポリマーラテックス（平均粒子径０．３μ）の１０
％懸濁液を２０ｒＩＬｌ加え、５６℃で２０分間加熱し
てγ−グロブリン分画をラテックスに吸着させる。

遠心分離して得た沈澱物に、実姉例１に準じて製造した
安定化剤を加えて１夜低温に静置した後、遠心分離して
沈澱惚を集め、ＰＢＳに再懸濁して、安定化された測定
試薬を得る。

実施例 ８ エストリオール１６，１７−ジヘミサクシネー； トー
ＢＳＡ（Ｇｒｕｐｉｄｅ、Ｅ、、ｅｔ ａｌ、Ａｍ、
Ｊ 。

０ｂｓｔ 、Ｇｙｎｅｃｏｌ 、、 １０９巻、８９７
頁（１９７１年）〕をウサギに免疫して得た抗エストリ
オール血清から、硫酸ナトリウム塩析によってγ−グロ
ブリン分画を精製し、この分画を０．０８％の濃度にな
るようにＧＢＳに溶解する。

この溶液５ｒｒＬｌに、１０％濃度のスチレン−ジビニ
ルベンゼンコポリマーラテックス（平均粒子径０．３μ
）を５ｍｌ加え、４５℃で１時間加熱して抗エストリオ
ールγ−グロブリンをラテックスに吸・着させる。

遠心分離の後、沈澱物に実施例２に準じて製造した安定
化剤を加え、４℃に１夜静置した後遠心分離して沈澱を
集め、ＧＢＳに再懸濁して安定化された測定試薬を得る
。

【図面の簡単な説明】

第１図は馬心筋チトクロームＣを主成分とする安定化剤
の可視部吸収スペクトル、第２図は馬心筋チトクローム
Ｃ熱変性物を主成分とする安定化剤の可視吸収スペクト
ルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ チトクロームＣ又はチトクロームＣ熱変性物を主成
   分とすることを特徴とする凝集反応又は凝集阻止反応に
   基づく免疫化学的測定試薬の安定化剤。 ２ チトクロームＣ溶液を１００〜１３０℃で加熱する
   ことを特徴とするチトクロームＣ熱変性物を主成分とす
   る凝集反応又は凝集阻止反応に基づく免疫化学的測定試
   薬の安定化剤の製造方法。