JPH0384461A - 免疫学的凝集反応試薬及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は免疫学的凝集反応試薬及びその製法に関する。 さらに詳細には、抗原又は抗体が感作された不溶性人工
担体粒子からなる免疫学的凝集反応試薬の凍結乾燥製剤
及びその製法に関する。 ［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］臨床検
査、医薬品製造等の分野において、間接凝集反応試験法
、凝集反応抑制試験法等の抗原−抗体反応を用いた免疫
学的凝集反応試験法により、血清、血液製剤等の検体中
に含まれる抗原、抗体等を測定することが行われている
。最も一般的である間接凝集反応試験法は、希釈用液で
適宜希釈された検体に、抗原又は抗体を適当な大きさの
不溶性担体粒子に結合又は吸着させた感作担体粒子を添
加し、上記抗原又は抗体にそれぞれ対応する抗体又は抗
原が検体中に存在すると感作担体粒子が凝集する反応を
利用して、検体中の抗体又は抗原を測定する方法であり
、例えば、精製した抗原や遺伝子操作により取得した抗
原を不溶性担体粒子に感作して得られる抗原感作担体粒
子を検体と適切な条件下で混合した時の凝集反応の有無
により検体中に抗体が存在しているか否かを判定でき、
また陽性コントロールと対比することにより検体中の抗
体量を半定量することができる。同様に、精製したポリ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体を不溶性担体粒
子に感作させて抗体感作担体粒子を調製すれば、検体中
の抗原を測定することができる。 免疫学的凝集反応試験法は、特殊の装置を必要とせず、
゛また操作が簡便であり、短時間で測定が終了し、大量
の検体を迅速に処理することができるという利点を有す
るので広く用いられている。 免疫学的凝集反応は水性媒体中で行われるので、抗原又
は抗体が感作された不溶性担体粒子は水性媒体中に懸濁
した状態で使用されるが、水性媒体に懸濁された感作担
体粒子は冷所（例えば、２〜８℃）に保存されていても
１ケ月頃から、非特異凝集が生じやすくなり又感度の低
下が認められる。 特に、高感度を維持して測定することが必要とされるウ
ィルス疾患（例えば、Ｂ型肝炎、エイズ、ヒトＴ細胞白
血病等）の抗原や抗体を測定する場合等においては可能
な限り高感度且つ高精度での測定が要求されるが、懸濁
状態で保存された感作担体粒子を使用した場合には、感
度の低下等から測定結果の信頼性に欠けるという問題が
ある。 かかる問題を解消し、長期間の保存安定性を維持するた
め、通常、感作担体粒子懸濁液を凍結乾燥して凍結乾燥
製剤とすることが行われる。しかし、凍結乾燥された感
作担体粒子と凍結乾燥前の感作担体粒子とを比較すると
、凍結乾燥された感作担体粒子は感度、特異性、判定像
の明瞭性等が著しく劣り、極端な場合には測定に使用で
きなくなることもある。 本発明は上記従来技術の課題を解決するために創案され
たもので、本発明者らが保存性に優れた免疫学的凝集反
応試薬の研究を種々重ねた結果、感作担体粒子懸濁液に
特定の安定化剤を添加することにより、凍結乾燥時の安
定性が改善されると共に保存安定性が著しく向上するこ
とを見出して完成した。すなわち、本発明は、感度、特
異性、判定像の明瞭性等の要求される諸性能を長期間維
持できる免疫学的凝集反応試薬の凍結乾燥製剤及びその
製法を提供することを目的とする。 ［課題を解決するための手段］ 上記の課題を解決すべくなされた本発明の免疫学的凝集
反応試薬は、抗原又は抗体を感作させた不溶性人工担体
粒子からなり、安定化剤としてアルブミン及びデキスト
ランより選ばれた少なくとも一種の化合物を含むと共に
凍結乾燥されていることを特徴とするものである。さら
に、上記の免疫学的凝集反応試薬は、追加的にマンニト
ール、ソルビトール、イノシトール、クエン酸及びアミ
ノ酸からなる群より選ばれた少なくとも一種の化合物を
含んでいてもよく、かかる化合物を含有することにより
保存安定性（特に、高温時）を−層内上させることがで
きる。 また、本発明の免疫学的凝集反応試薬の製法は上記免疫
学的凝集反応試薬の製法であって、抗原又は抗体を感作
させた不溶性人工担体粒子の懸濁液に、アルブミン及び
デキストランより選ばれた少なくとも一種の化合物を添
加した後、凍結乾燥することを特徴とするものであり、
さらに本製法においては、上記と同様な理由に基づき、
アルブミン及び／又はデキストランと共にマンニトール
、ソルビトール、イノシトール、クエン酸及びアミノ酸
からなる群より選ばれた少なくとも一種の化合物を添加
してもよい。 上記構成からなる本発明において用いられる不溶性人工
担体粒子としては、従来から免疫学的凝集反応の不溶性
人工担体粒子として使用されているものが何れも使用す
ることができ、例えば、ポリスチレンラテックス、ゼラ
チン粒子、エポキシ樹脂粒子、セルロース粒子、カオリ
ン粒子、炭末等が挙げられ、好ましくは無機化合物／染
料複合体粒子（例えば、特開昭６３−１８４０５６号公
報参照）が挙げられる。これらの不溶性人工担体粒子の
粒径としては０．５〜５μｍ程度、好ましくは１．２〜
２．０μｍ程度、比重としては１〜２６５程度、好まし
くは１．２〜２．０程度のものが例示される。 上記の不溶性人工担体粒子への抗原又は抗体の感作は慣
用の方法より行うことができ、例えば、該担体粒子に物
理的に吸着させる方法、グルタルアルデヒド、トリレン
ジイソシアネート等のカップリング剤を用いて化学的に
結合させる方法等が挙げられる。抗原又は抗体が感作さ
れた不溶性人工担体粒子は、非特異的結合を防止するた
め、抗原又は抗体が未反応の粒子表面をブロッキング剤
（例えば、脱脂粉乳、ウシ血清アルブミン、動物血清、
ゼラチン及びその加水分解物、カゼイン及びその加水分
解物、デキストラン、ポリエチレングリコール等）で処
理してもよい。 本発明で安定化剤として用いられるアルブミンの由来は
特に限定されず、例えば、ヒト、ウシ、ウサギ、ヒツジ
、ウマ、ヤギ由来のアルブミンが挙げられ、好ましくは
ヒト又はウシ由来のアルブミンが用いられる。これらの
アルブミンは加熱処理されたものが好ましく、例えば、
６０℃で１時間加熱されたアルブミン（以下、熱処理ア
ルブミンという）が用いられる。加熱処理をすることに
より凝集時の判定像が明瞭になるという効果を奏する。 また、デキストランとしては、水溶性のものであれば、
種々の分子量のものが何れも使用することができる。 本発明にかかる凝集反応試薬中のアルブミン及びデキス
トランの含有量としては、抗原又は抗体が感作した不・
溶性人工担体粒子（以下、免疫物質感作担体粒子という
）５重量部当り、両者の合計量が３〜２０重量部程度と
される。アルブミン及びデキストランの合計含量が３重
量部未満であると、凍結乾燥時における安定性が十分に
確保できず、凍結乾燥後の免疫物質感作担体粒子は感度
、特異性、判定像の明瞭性の低下を生ずるおそれがあり
、また合計含量が２０８量部を越えても特に問題はない
が、２０重量部までで十分な効果を奏するので、それを
越える量は格別必要としない。 また、アルブミン及び／又はデキストランと共に安定化
剤として用いられるマンニトール、ソルビトール、イノ
シトール及びアミノ酸の本発明凝集反応試薬中の含量は
、免疫物質感作担体粒子５重量部当り、それぞれ１〜２
０重量部程度とされ、またクエン酸塩の含量は１〜５０
１ｉ量部（クエン酸に換算して）程度とされる。なお、
クエン酸塩としては、例えば、クエン酸ナトリウム、ク
エン酸カリウムなどのクエン酸アルカリ金属塩、クエン
酸アンモニウム等が挙げられる。また、アミノ酸として
は種々のアミノ酸が使用し得るが、好ましくは塩基性ア
ミノ酸が用いられ、例えば、アルギニン、リジン、アス
パラギン等が挙げられる。 本発明の免疫学的凝集反応試薬は、例えば、免疫物質感
作担体粒子を適当な水性溶媒中に懸濁させた後、アルブ
ミン及び／又はデキストランを所定量添加し、さらに必
要に応じて、マンニトール、ソルビトール、イノシトー
ル、クエン酸及び／又はアミノ酸を所定量添加し、次い
で凍結乾燥することにより得られる。 上記の方法において、免疫物質感作担体粒子を懸濁させ
る水性溶媒としては適宜な水性溶媒が使用されるが、通
常、ｐＨ５〜９、より好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液、
例えば、リン酸緩衝液、食塩側リン酸緩衝液等が用いら
れる。 免疫物質感作担体粒子懸濁液に添加されるアルブミン等
の安定化剤の添加量は前記の範囲内で行われ、例えば、
懸濁液中の免疫物質感作担体粒子の濃度が５％（Ｗ／Ｖ
、以下特に明示のない限り同じ）の場合、アルブミン及
び／又はデキストランをその合計量が３〜２０％程度と
なるように添加し、さらに必要に応じて、マンニトール
、ソルビトール、イノシトール及び／又はアミノ酸を１
〜２０％程度、クエン酸塩を０．０５〜０．２５Ｍ程度
となるように添加する。 上記の安定化剤が添加された免疫物質感作担体粒子懸濁
液の凍結乾燥は慣用の方法にて行われ、例えば、該懸濁
液を適当なバイアルに分注した後、予め−４０〜−４５
℃程度に冷却された凍結乾燥器内に配置し、２４〜４８
時間程度真空凍結乾燥し、次いで乾燥空気又は窒素置換
した後、バイアルを密封することにより行われる。 かくして得られた本発明の免疫学的凝集反応試薬は、そ
の使用に際して、水又は適当な希釈液を加えて再懸濁さ
せ、免疫物質感作担体粒子濃度が０．３〜０．６％（好
ましくは０．５％）程度の懸濁液となるように調整して
用いられる。 本発明の免疫学的凝集反応試薬を用いて測定される測定
対象物質は特に限定されず、種々の抗原、抗体、ハブテ
ン、薬剤等の測定に用いることができる。なお、不溶性
人工担体粒子上に感作される、これら測定対象物質に対
応する抗体

【ポリクローナル抗体若しくはモノクローナ
ル抗体又はそれらのＦ（ａｂ−）２両分】又は抗原は慣
用の方法にて調製することができ、また測定対象物質が
ハプテン等の免疫原性のない物質の場合には、アルブミ
ン、グロブリン、ヘモグロビン等の慣用のキャリアーと
結合させて免疫抗原を調製した後、常法の抗体産生法に
より抗体を得ることができる。 ［発明の作用・効果］ 本発明の免疫学的凝集反応試薬及び製法によれば、安定
化剤としてアルブミン及び／又はデキストランが添加さ
れ、凍結乾燥時及び保存時における免疫物質感作担体粒
子の劣化等を防止することができるので、凍結乾燥前の
免疫物質感作担体粒子と同様な感度、特異性、再現性、
判定像の明瞭性等を長時間維持することができ、保存安
定性が著しく改善されるという効果を奏する。特に、ア
ルブミン及び／又はデキストランと共にマンニトール、
ソルビトール、イノシトール、クエン酸及び／又はアミ
ノ酸を用いた場合には、高温における保存安定性の向上
を図ることができるという効果を奏する。 ［実施例］ 以下、製造例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 製造例１ 感作用担体として高比重複合体粒子（徳山曹達■製、直
径１．８μｍ、比重１．５）を用い、ヒ）ＨＢｓＡｇ　
（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）陽性血漿、にり、６０℃
、１０時間のウィルス不活化処理、硫安・エアロジル◆
ＰＥＧ分画、ゲルクロマトグラフィー及び密度勾配超遠
心分離で精製されたＨＢｓＡｇを適量混合し、３７℃の
恒温水槽中で１０分間感作した。次いで０．１５Ｍ食塩
加リン酸緩衝液で遠心洗浄を行い、未感作ＨＢｓＡｇを
除去した後、アルブミン（又は動物血清）を添加して未
反応の表面をブロッキング処理した。このようにしてＨ
ＢｓＡｇ感作粒子を調製した。 実施例１ 製造例１で得られたＨＢｓＡｇ感作粒子の５％懸濁液（
溶媒：０．１５Ｍ食塩加リン酸緩衝液、ｐＨ７，０，以
下、単にｒＰＢＳＪという）に、熱処理ウシアルブミン
（最終濃度で５％）とマンニトール（最終濃度で５％）
を加えた後、必要に応じてｐＨを７□　０±０．２に再
調整した。得られた懸濁液をバイアルに分注した後、−
４０℃〜−４５℃に冷却した凍結乾燥器内に配置し、減
圧下で２４時間凍結乾燥した。 次いで、ＨＢｓ抗体陽性検体及びＨＢｓ抗体陰性検体を
用いた間接凝集反応試験法により、凍結乾燥前後におけ
る抗原感作担体粒子の感度、特異性、再現性及び判定像
の明瞭性を比較試験したが、凍結乾燥前後で差は認めら
れなかった。なお、感度の試験は、常法に従って、陽性
検体を倍々希釈した希釈列を作成し、感作担体粒子と反
応させ凝集を示す最高希釈倍数で評価した。特異性の試
験は陰性検体を用いて非特異反応を評価した。再現性の
試験は、複数回の試験における試験結果の再現性を評価
した。判定像の明瞭性は、凝集体像の明瞭さを目視によ
り評価した。 また、室温での保存安定性を試験したが、３ケ月以上の
品質維持ができることが判明し、さらにその際、溶解時
の溶状は良好であり、濁り、沈澱物等は認められなかっ
た。 実施例２ 製造例１で調製したＨＢｓＡｇ感作粒子の５％懸濁液（
溶媒：ＰＢＳ）に、デキストラン（最終濃度で５％）と
アルギニン（最終濃度で０．０５Ｍ）を加えた後、必要
に応じてｐＨを７．０±０．２に再調整した。得られた
懸濁液をバイアルに分注し、実施例１と同様に凍結乾燥
した。 次いで、実施例１と同様にして、間接凝集反応試験法に
より、凍結乾燥前後における抗原感作担体粒子の感度、
特異性、再現性及び判定像の明瞭性を比較試験したが、
凍結乾燥前後で差は認められなかった。 実施例３ 製造例１で調製したＨＢｓＡｇ感作粒子の５％懸濁液（
溶媒：ＰＢＳ）に、デキストラン（最終濃度で７％）と
イノシトール（最終濃度で１％）を加えた後、必要に応
じてｐＨを７６０±０．２に再調整した。得られた懸濁
液をバイアルに分注し、実施例１と同様に凍結乾燥した
。 次いで、実施例１と同様にして、間接凝集反応試験法に
より、凍結乾燥前後における抗原感作担体粒子の感度、
特異性、再現性及び判定像の明瞭性を比較試験したが、
凍結乾燥前後で差は認められなかった。 実施例４ 製造例１で調製したＨＢｓＡｇ感作粒子の５％懸濁液（
溶媒：ＰＢＳ）に、後記第１表に示される安定化剤を所
定の最終濃度となるように添加した後、必要に応じてｐ
Ｈを７．０ｔｈ０．２に再調整した。以下、実施例１と
同様に凍結乾燥した。 次いで、実施例１と同様にして、間接凝集反応試験法に
より、凍結乾燥後における抗原感作担体粒子の感度、特
異性、再現性、判定像の明瞭性及び溶状を比較試験した
。その結果を第１表に示す。 第１表から明らかなように、安定化剤を添加していない
系では、凍結乾燥操作により全てが凝集を生じるように
なり判定不能であったのに対し、本発明の凝集反応試薬
は凍結乾燥前と同等の性能を示した。 （以下余白） 実施例５ 製造例１で調製したＨＢｓＡｇ感作粒子の５％懸濁液（
溶媒：ＰＢＳ）に、後記第２表に示される安定化剤を所
定の最終濃度となるように添加した後、必要に応じてｐ
Ｈを７．０±０．２に再調整した。次に、実施例１と同
様に凍結乾燥し、窒素ガスを充填した後、密封した。か
くして得られた凍結乾燥製剤を室温で３ケ月間保存した
。 次いで、実施例１と同様にして、間接凝集反応試験法に
より、凍結乾燥直後と３ケ月間保存後の抗原感作担体粒
子の感度、特異性、再現性、判定像の明瞭性及び溶状を
比較試験した。その結果を第２表に示す。 また、凍結乾燥製剤を再懸濁後、冷所（２〜８℃）で３
週間保存した抗原感作担体粒子の感度、及び凍結乾燥製
剤を４０℃で３ケ月間保存後の抗原感作担体粒子の判定
像の明瞭性を試験した。その結果を第２表に併せて示す
。 （以下余白） 第２表から明らかなように、本発明の凝集反応試薬は保
存安定性が極めて良好であり、特にマンニトール、ソル
ビトール、イノシトール、クエン酸及びアミノ酸を添加
することにより高温における保存安定性が著しく改善さ
れることが判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原又は抗体を感作させた不溶性人工担体粒子から
   なり、安定化剤としてアルブミン及びデキストランより
   選ばれた少なくとも一種の化合物を含むと共に凍結乾燥
   されていることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。 ２、追加的に、マンニトール、ソルビトール、イノシト
   ール、クエン酸及びアミノ酸からなる群より選ばれた少
   なくとも一種の化合物を含む請求項１記載の免疫学的凝
   集反応試薬。 ３、抗原又は抗体を感作させた不溶性人工担体粒子の懸
   濁液と、アルブミン及びデキストランより選ばれた少な
   くとも一種の化合物とを混合した後、凍結乾燥すること
   を特徴とする免疫学的凝集反応試薬の製法。 ４、アルブミン及びデキストランより選ばれた少なくと
   も一種の化合物と共にマンニトール、ソルビトール、イ
   ノシトール、クエン酸及びアミノ酸からなる群より選ば
   れた少なくとも一種の化合物を用いる請求項３記載の免
   疫学的凝集反応試薬の製法。