JPS5816683A - プロテア−ゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロテアーゼ及びその製法に関する。さらに
詳しくは抗炎症効果の優れたプロテアーゼ及びこのプロ
テアーゼを微生物によって製造する方法に関する。

従来１微生物のプロテアーゼとしては、かび、細菌、放
線菌からの産生が知られている。

また、消炎プロテアーゼとしては、セラチアｎからのダ
ーゼン■（武田薬品工業ＫＫ）、ストレプトミセス・グ
リセウスによるエンビナース■（科研化学ＫＫ）、スト
レプトミセス・スバルソゲネスによるプロテアーゼ５５
−１１　Ａ、バチルス・スフエリカスによる新規プロテ
アーゼであるバチロペブチターゼ・０等が知られている
。

これらのプロテアーゼを消炎剤として用いる場合には、
これらが蛋白質であるため、多量に投与できないという
制約があり、少量の使用で効果のある消炎活性の高い、
すなわち比活性の高いプロテアーゼが求められていた。

また消炎プロテアーゼの至適ｐＨは、生体内と同じく中
性に近いものが求められていた。

本発明者らは、これらの点に注目し、比活性の高い中性
プロテアーゼについて検討した結果、消炎酵素活性の優
れたプロテアーゼを見出し、本発明に至った。

本発明はまた、このプロテアーゼの好適な製造−方法に
関するものであり、バチルス属に属する微生物を利用し
て消炎性の優れたプロテアーゼを製造する方法に関する
。

すなわち本発明は、下記の特徴を有するプロテアーゼＭ
ＴＫ−５６である。

（ａ）　　分子量：　５６．０００　（ゲルｐ過法）（
ｂ）紫外線吸収スペクトル＝２７５〜２８０ｎｍに極大
吸収を有し、２４５〜２５５ｎｍに極小吸収を有する。

（Ｃ）　　等電点：　ｐＩ＝８．９ｔ−０，１（ｄ）　
　溶解性：水に可溶であるが、アセトン、ベンゼン〜ヘ
キサン、クロロホルムには不溶。

（ｅ）　　ｐＨ作用性：カゼインを基質として使用した
蛋白質分解活性の好適Ｉｌｌは、６〜８であり、ｐＨ６
・５〜７．５に至適ｐＨを有する。

（ｔ）　　ｐＨ安ｒ性：５７℃、３１１分＋７）処理テ
Ｌｔ、ｐＨ６〜１０の範囲で、８ｏ％以上の活性を示し
安定である。

（ｇ）　　作用適温の範囲＝カゼインを基質として使用
した蛋白質分解作用の適温は、５５℃〜６ｏ℃であり、
至適温度は約５０℃である。

（１，）　　阻害：　ｆｆＤＴＡ及びジピリジルによっ
て阻害され、阻害の程度はＥＤＴＡ＞ジピリジルである
。

パ５クロロマーキュリツクベンゾニー）、（ＰＯＭＢ）
、フルオロリン酸ジイソプロピル、及び大豆由来のトリ
プシンインヒビターは、本件プロテアーゼＭＩＣ−５６
の活性に影響を与えない。またＨｇ′＋、Ｆｅ科及びＯ
ａ＋＋にょっても阻害されるが、その程度はＨｇ＋Ｆ＞
Ｆ　ｅ＋Ｆ〜ａ　ａ”　テアル。

（１）　　ｐＨ及ヒｍ度ニョル失活ｃ７）条件”　１）
Ｈ４，０％５７℃、３０分間て、７０％以上が失活する
。一方、ｐＨｊＤ、　３７℃、１０分間テノ失活は、２
０％以下テアル。サラニｐＨ７，７０℃、１０分間で完
全に失活する。

また本発明は、プロテアーゼの好適な製造方法に関する
ものであり、バチルス属に属し、プロテアーゼＭＴＫ−
５６を生産する細菌を、培地において好気的条件下で培
養し、培養物からプロテアーゼＭＴＫ−５６を採取する
ことを特徴とするプロテアーゼＭＴＥ−５６の製造方法
に関する。

本発明で使用されるプロテアーゼＭＴＥ−５６生産微生
物は、プロテアーゼＭＴＲニー５６を生産することがで
きるバチルス属に属する全ての菌株、突然変異株および
変種を包含する。中でもとくに好ましい菌株は、本発明
者が土壌の中から採取した消炎酵素活性の著しく高い菌
株ＭＴ２０５１である。

以下に本菌株の菌学的性質を記す。

（ａ）　　形態的性質 ブイヨン寒天上で３７°０２日培養した栄養細胞は、０
．７〜１．２Ｘ５〜１０ミクロンの桿菌である。

細胞は１ケ又は２ケが連結して存在する。３０℃２日〜
６日の培養で胞子の形成が認められる。

胞子は主として胞子のう中央にでき、端にも生ずる。大
きさは直径０．７〜１．２　Ｘ　１．２〜２．５の円筒
形である。運動性があり、ダラム染色は陰性で抗酸性で
ある。

（ｂ）　　各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板および肉汁寒天斜面培養２８℃にお
いて表面平滑で光沢のあるコロニーが生育する。コロニ
ーは金縁（ｅｎｔｌｒｅ）であり、２８℃、２週間の培
養で直径が８〜１０ｍｍになる。色は鈍黄色（ｂｕｆｆ
）、著しく粘稠。

（２）加糖寒天斜面培養 普通寒天斜面より生育が良好で、表面の光沢も著しい。

（３）食塩添加肉汁培養 ５％食塩添加で生育しない。

（４）肉汁液体培養 １〜２日で皮膜状となり、やがてかなり厚い粘性の扁い
ゲル状の膜になる。沈殿は、ごく少ない。

（５）肉汁ゼラチン穿刺培養 ２２℃、１週間で液化する。

（６）　　リドマスミルク すみやかに脱色する。皮膜が形成され、やがてペプトン
化する。また２〜３日でミルクの凝固がおこり、白い塊
を生ずる。

（７）グルコース、アス′パラギン寒天培養生育する。

（２）　　ＭＲテスト　　　　　　　　　　　陰性（３
）　　ＶＰテスト　　　　　　　　　　　陰性（４）イ
ンドールの生成　　　　　　　　陰性（５）硫化水素の
生成　　　　　　　　　陰性（６）でんぷんの加水分解
　　　　　　　陽性（７）　　クエン酸の利用（Ｋｏｓ
ｅｒ’ｓ）　　　　　陰性（８）無機窒素源の利用 硝酸塩　　　　　利用しない。

（ウイッケルハムの合成培 地で） アンモニウム塩　利用する。

（同　上） （９）色素の生成　　　認められない。

（１０）ウレアーゼの生成　　　陽性（著しい）（１１
）カタラーゼ　　　　　　陽性 （１の生育の範囲 ｐＨ４，５〜８．５で生育し、ｐＨ６〜８が最適である
。温度は５ＯＮ３８℃が最適であり、４５℃までは生育
しているが、５０℃を越えると生育しない。

（１３）　＃素に対する態度 好気性である。しかし嫌気的状態でも生育可能である。

（１４）糖類の資化性、酸の生成及びガスの発生本菌株
の諸性質をバージニーのマニュアル・オプ・デイターミ
ネーテイブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａａ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　１９７５年版により調べると、
バチルス属に属するが、既知の種に相当するものがない
。

従って本菌株をバチルス属の新種と判定し、バチルス・
イワクニエンシス・ノボ・スベーシーズＭＴ２０３１（
Ｂａｃｌｌｕｓ　ｉｗａｋｕｎｉｅｎｓｉｓ　−ｎ、　
Ｓｐ。

ＭＴ２０３１）と命名した。

本発明のプロテアーゼＭＴＥ−５６を生産するには、例
えば上記のバチルス属の新種バチルス・イワクニエンシ
スＭＴ−２０３１を、炭素源、窒素源、塩類その他の物
質を含有する培地に接種し、適当な温度、例えば約２８
〜３５℃で、酵素力価が最高に達するまでの適当な時間
、振とう又は通気攪拌培養して生産する方法がある。と
くに酵母菌体を含む培地や、大豆粕を含む培地を用いれ
ば、プロテアーゼＭＴＫ−５６の生産量を増加させるこ
とができる。

上記のようにして培養された培養物は、遠心分離、濾過
などの方法で清澄にした後、この清澄液に例えば硫酸ア
ンモニウムを加えて目的の酵素を沈でんさせ、採取する
ことができる。またさらにイオン交換樹脂、ゲルー過法
を利用して、上記沈殿物を精製して、極めて活性の高い
プロテアーゼかくして得られた新規のプロテアーゼＭＴ
Ｅ−５６の理化学的性質を以下に示讐。

（１）作用 カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の好適ｐ
Ｈは、図２に示す如く、６〜８であり、至適ｐＨ６，！
５〜７．５の中性プロテアーゼである。

（２）　　基質特異性 各種蛋白質に対する相対分解速度を表２に示した。なお
市販の酵素ダーゼン■の文献値を併表２．相対分解速度
” （３）　　至適ｐＨ カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用における
ｐＨの影響を図２に示す。至適ｐＨは６．５〜７．５で
ある。

（４）　　ｐＨ安定性 各種ｐＨで５７℃、３０分間加熱後の残存活性を測定し
た結、果を図３に示す０ ｐＨ６〜１０の範囲で８０％以上、Ｉ）Ｈ６，５〜９の
範囲で、９０％以上の残存活性を示した。

（５）力価の測定法 蛋白質分解活性の測定は、Ｋｕｎｉｔｚの方法を一部改
変して（ｐＨを９．０から７．５に変更して）行った。

すなわち、２．０％ハマルステン氏法カゼイン液１−０
ｍ／ｓ　（Ｌ２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　
０−５Ｊおよび酵素液０−５ｍ１からなる反応液を用い
１５７℃で１０分間インキュベートした。反応直後に５
％トリクロル酢酸（ＴＯＡ）液３．ＯＪを加え、攪拌し
て反応を停止し、５０分間放置したのち、遠心分離（３
０００ｒｐｍ）シた。上清のＯＤ２７５ｎｍを測定し、
酵素液のかわりに水０．５ｃ＋＋５を反応液に加えて反
応して得たＴＯＡ上清を対照とし、対照のＯＤ　　　と
の差を求めた。チロシンの２７５７５ｎｍ ｎｍでの吸光係数からＯＤ　　　の値をチロシン２７５
ｎ重 量に換算し、上記条件下で、１分間に１μｇのチロシン
をＴＣＡ上清中に生成する酵素量を１ｕｎｉｔとして活
性を表示した。なお、１μｇ／ｍ１１のチロシン液（３
％ＴＯＡ中）のＯＤ　　　　は、０．００７３５７５ｎ
ｍ であった。

（６）至適温度及び嚇定温度範囲 カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の温度依
存性を図４に示す。本酵素の作用最適温度は約５０℃に
ある。

また温度安定性を図５に示す。本酵素は４０℃以下で安
定であり、５０℃では約９０％の残存活性がある。

（乃　ｐＨおよび温度による失活の条件図３に示す如＜
、ｐＨ４以下で急速に失活し、ｐＨ４，０，３７℃、３
０分間で約８０％が失活した。

一方、アルカリ性側では比較的安定で、ｐＨ１０、３７
℃、６０分で約１０％が失活するのみである。

また図５に示す如く、７０℃、１０分間て、完全に失活
する。

（８）イオン濃度の影響 リン酸緩衝液の濃度の影響を図６に示す。

（９）阻害剤の影響 阻害剤の影響を表５に示す。さらに金属塩による影響を
表４に示す。

表　　　　３ 表　　　　４ （１０）プロテアーゼの精製方法 実施例１に示す方法で得た粗酵素サンプルは次の方法で
分離精製することができる。

すなわち粗酵素サンプル１ｇを１０ｍ／の水に溶解し、
ｐＨ６，７の３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下ＫＰ
Ｂと略す）で平衡化したｓｐ−セファデックスカラム（
２，５Ｘ　６０α）上部に静かに流し込み、３０ｍＭの
ＫＰＢ（ｐＨ６，７）で活性ｐ　７　）：　３ｐ　全溶
出する。ここで得た活性画分はセファデックスＧ−１０
０ゲルｐ適用カラム（２，５Ｘ１００ＣＩＩＩ）にかけ
、さらに精製する。活性画分は硫酸アンモニウム塩析（
７０％飽和）で集め、透析したのち、凍結乾燥する。

（１１）分子量 ゲルｐ過法により測定した分子量は約５６．．０００で
ある。

（１２）元素分析値 ０　４４．３％ Ｈ６，１％ Ｎ　　１５．５％ ０　２５・５％ 元素分析値は、酵素の純度により多少変化することがあ
る。

（１３）紫外線吸収スペクトル 図１に示す如く、吸収極大は、約２７５〜２８０ｎｍに
あり、吸収極小は、２４５〜２５５ｎｍにある。

λ　　　”２７８ｎｍ ａｘ ｘ’、４　（２７８ｎｍ）＝　１４．１（１４）アミノ
酸組成物 表５に本酵素のアミノ酸組成を示す。

アミノ酸組成の割合は、酵素の純度、分析精度により多
少変化することがある。

表　　　　５ （１５）カラゲニン浮腫抑制活性測定法（イ）皮下投与
法 ７連合で購入したＷｉｓｔｅｒ系雄性ラットを１週間予
備飼育し、１区７匹としく対照区は１区１０匹）、酵素
を生理食塩水に溶解し、５．０ｍｌｌ／ｋｔｉＣラット
）の割合で皮下投与した。

酵素液投与１時間後に、１％カラゲニン溶液０・０５ｍ
／をラット右後肢足跳皮下に注射し、その３時間後に、
両後肢足首関節部位を切断し、両足首間の重量差を浮腫
強度として、酵素の浮腫抑制率を算出した。

（ロ）十二指腸投与法 ７連合で購入し、１週間予備飼育し、１夜絶食したＷｉ
ｓｔｅｒ　、１％雄性ラットをエーテル麻酔下で腹部正
中線に沿って約１備の切開を加え、十二指腸部位を引き
出した。胃の幽門部を指で軽く押え、酵素液が胃に逆流
しないようにして、十二指腸内投与を行った。投与後、
切開部位を２か所縫合して麻酔を解除した。

酵素液を投与して１時間後に１％カラゲニン溶液０・１
ｍｌをラット右足跳皮下に注入し、その後５時間して左
右足首の重量差を求めた。ただし予備テストにおいて麻
酔および手術の影響で正常ラットに比べ約６０％の浮腫
しか得られなかったので、起炎剤の量を皮下投与の場こ
れにより、対照区に対する投与区の浮腫抑制率を算出し
た。なお対照区は１区１０匹、投与区は１区７匹用い、
その平均値を算出した。

（１６）カラゲニン浮腫抑制活性（消炎活性）（１０）
の方法で精製したプロテアーゼＭＴ　Ｅ−５６を、（１
５）（イ）に示した方法で、ラットに皮下投与し１その
消炎活性を測定した。結果を表６に示す。

本発明の酵素は、市販されているエンビナース０やダー
ゼン■に比べ、ＥＤ５ｏの値が約４倍以上であり、著し
く優れたカラゲニン浮腫抑制活性を示している。

同様にして、精製された本発明のプロテアーゼを（１５
）（ロ）に示す方法で、ラットの十二指腸に投与し、そ
の腸管吸収によるカラゲニン浮腫抑制活性を測定した。

結果を表７に示す。

本発明の酵素は、市販のエンピナース■〜ダーゼン■に
比べ約６．５倍以上の活性を示していまた、本発明のプ
ロテアーゼＭＴＫ−５６と、市販されているダーゼンの
、エンピナース■の諸本発明のプロテアーゼＭＴＥ−５
６は１表８に示す如く、プロテアーゼとしての比活性が
著しく高い。また表６及び表７に示す如く、消炎活性が
従来知られている酵素に比べ著しく高いものである。

さらに本発明のプロテアーゼは、高力価であり、消化剤
、化粧品、洗剤、食肉の軟化剤、肉エキスの製造、絹の
精練、皮革製造、プラスティンの製造などの用途にも用
いられる。

次に実施例を示す。

実施例１ 表９に示す組成の培地４００　ｍｌを２４容の坂ロフラ
スコに入れ、１２０℃、１５分滅菌する。同組成の培地
で培養したバチルス・イワクニエンシスＭＴ２０３１の
前培養液５０ｍ１を加え、２８℃、１１００ｒｐで４８
時間振とう培養した。培養液中のプロテアーゼは（５）
に示した力価の測定法で測菜、２　ｓ　３００ｕｎ１ｔ
ｓ／ｍ１であった。培養後、硫酸アンモニウムを３０％
飽和になるよう（培養液に対し１７．６％（−／ｖ　）
）に加え、攪拌して不純タンパクを析出したのち、遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、　１０分）して＼これを除
去した。

得られた上清に硫酸アンモニウムをさらに９ｏ％飽和に
なるよう（上清に対し４４．９％）に加え、酵素活性画
分を析出させたのち、遠心分離（１０＋０００ｒｐｍ１
０分）して集めた。集めた酵素をできるだけ少量の水に
懸濁し、透析用セロハンチューブにつめ、両端をしつか
り結んだのち、２４時間ないしは４８時間冷水（１５℃
以下）中で透析した。透析後、不溶物を遠心分離して除
き、凍結乾燥し、得られた粉末を粗酵素サンプルとした
。これを本文（１０）に示したプロテアーゼの精製方法
に従って精製し、１１の培養液から０．１ｇのプロテア
ーゼＭＴＥ−５６を表９　培地組成 実施例２ 実施例１の培地の圧搾酵母の代りに乾燥酵母１％あるい
は大豆粕５％を主成分とする培地を用い、実施例１と同
様に２１の坂ロフラスコを用い、バチルス・イワクニエ
ンシスＭＴ２０３１を接種し、２８℃でｐＨ６，５〜７
．５の範囲にコントロールしつつ、４８表１０．主成分
のプロテアーゼ生産への影響実施例３ 実施例１に示した石油に食塩を添加し、プロテアーゼ生
産への効果を調べた。バチルス、イヮクニエンシスＭＴ
２０５１を接種後、培養は実施例１と同様に行った。結
果は表１１に示したように塩化ナトリウム０．１〜０・
５％、特に０．２５％添加することにより、パン用圧搾
酵母を用いても乾燥酵母（実施例２）と同配以上のプロ
テアーゼ活性が得られ表１１９食塩のプロテアーゼ生産
への影響

【図面の簡単な説明】

図１は、プロテアーゼＭＴＥ−５６の水溶液（ＭＴＥ−
５６３２５ｍｇ／ｌｔｎ＃蒸留水）の紫外線吸収スペク
トルを示す。 図２は、カゼイン分解活性に関するプロテアーゼＭＴＪ
Ｃ−５６の至適ｐＨを示す。 図３は、カゼイン分解活性に関するプロテアーゼＭＴＥ
−５６のｐＨ安定性を示す。 図４は、種々の温度におけるプロテアーゼＭＴＥ−５６
の蛋白分解相対活性を示す。 図５は、プロテアーゼＭＴＩ！１−５６の温度安定性を
示す（各温度て１０分間処理した）。 図６は一プロテアーゼＭＴＫ−５６の活性に゛およぼす
イオン濃度（リン酸緩衝液）の影響を示す。 出願人　　三井石油化学工業株式会社 代理人　　山　　口　　　　　和 図２　至適ＩＨ ＝Ｈ 図４　至適湿度 温度（′Ｃ） 図３　ミＨ安定性 Ｈ 図５　湿度安定性 湿度（’Ｃ） ｍ６、　イオン濃度Ｌ トン酸緩 ・影響

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特徴を有するプロテアーゼＭＴＫ−５６（
   ＩＩＬ）　　分子量：　５６，０００（ゲルｐ過法）（
   ｂ）　　紫外線吸収スペクトル：２７５〜２８０ｎｍに
   極大吸収を有い２４５〜２５５ｎｍに極小吸収を有する
   。 （、）　　等電点：ｐｌ二８．９±０．１（ｄ）　　溶
   解性：水に可溶であるが、アセトン、ベンゼン、ヘキサ
   ン、クロロホルムむこ（１不溶。 （ｅ）　　ｐＨ作用性：カゼインを基質として使用した
   蛋白質分解活性の好適ｐＨは６〜８であり、ｐＨ６，５
   〜７．５に至適ｐＨを有する。 （ｆ）　　Ｉ）Ｈ安定性：３７℃、３０分の処理で＆ま
   、ｐＨ６〜１０の範囲で８０％以上の活性を示し、安定
   である。 （Ｃ）　　作用適温の範囲：カゼインを基質とじて使用
   した蛋白質分解活性の適温は、５５℃〜６０℃であり、
   至適温度は約５０°Ｃである。 （ｈ）　　阻害：　ＥＤＴＡ及びジピリジルによって阻
   害され、阻害の程度はＫＤＴＡ＞ジピリジルである。パ
   ラクロロマーキュリツクベンゾエート（ＰＯＭＢ）、フ
   ルオロリン酸ジイソプロピル、および大豆由来のトリプ
   シンインヒビターは本件プロテアーゼＭＴＥ−５６の活
   性に影響を与えない。またＨｇ、ＦｅおよびＯａ　　に
   よっても阻害されるが、その程度はＨｇ＋＋＞ｙｅ＋＋
   〜Ｏａ′＋である。 （１）　　ｐＨ及び温度による失活の条件？ｐＨ４，０
   ，３７℃、６０分間で、７０％以上が失活する。 一方、ｐＨ１０，５７℃、１０分間での失活は、２０％
   以下である。さらにｐＨ７，７０℃、１０分間で完全に
   失活する。
2. （２）バチルス属に属し、プロテアーゼＭＴｆｆｉ−５
   ６を生産する細菌を培地において好気的条件下で培養し
   、培養物からプロテアーゼＭＴＦニー５６を採取するこ
   とを特徴とするプロテアーゼＭＴＫ−５６の製造方法。
3. （３）バチルス属に属し、プロテアーゼＭＴＢ−５６を
   生産する細菌が、バチルス・イワクニエンシスＭＴ−２
   ｏｓｉ（微工研菌寄第６０３４号、ＦＩＲＭ　ｐ−１０
   ３４）であることを特徴とする特許請求の範囲第（２）
   項に記載の製造方法。
4. （４）　　培地として、培地成分中に塩化ナトリウムを
   ０．１ないし０．５重量％含有する培地を用いることを
   特徴とする特許請求の範囲第（２）項に記載の製法。