JPS58175497A - 胆汁酸の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は胆汁酸の分析方法に関するものである。

従来より遊離型、グリシン抱合型及びタフリン抱合型等
を含む胆汁酸を分析するＫは、単に液体クロマトグラフ
によって分離するだけでは分内された胆汁酸を検出する
ことが困難であるが、胆汁酸各成分が補酵素ニコチンア
ミドアデニシフジヌクレチオド（以下ＮＡＤ＋と略す）
の共存下で、酵素３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（以下３α−）ＩＳＤと略す）Ｋよってブト型
に化学変化を受け、同時Ｋ　ＮＡＤ＋が検出容易な蛍光
物質ＮＡＤＨＫ変化するという反応を利用し、この反応
で生成し九ＮＡＤＨの量すなわち存在していた胆汁酸の
量を紫外線吸収測定や蛍光測定などの光学的手法によ秒
定量することが行われていた。そして上記定量法におい
て、３α−ＩＳＤを有効に使用する丸め、ガラスピーズ
等の支持体に固定化して用いることが知られている。

ｌ、かじながら、ガラスピーズは強度的にすぐれている
という長所があるが、一方においてはアルカリ性溶液を
使用することが出来ないので通常Ｐ　Ｈ８，５以下で使
用しなければならない。この様な条“件ではＰＨ９以上
のアルカリ条件’ＦＫおける様な３α−ＩＳＤの高い酵
素活性は示さないので、分析の感度を向上させることは
困難である。又、上記支持体に有機物質特に蛋白の非特
異吸着が起り易く、これが表面汚染による酵素活性の低
下にりながシ、固定化酵素の寿命が短かくなるという欠
点がある。

又、胆汁酸各成分を分離するだめの液体クロマトグラフ
における分離用カラムについても、胆汁ｌｌ！分離用と
してシリカ変性ゲル系のものが知られているが、これは
、蛋白質等の雑多な化合物を非特異吸着し、その分離性
能が急速に低下するため、これらの非特異吸着物質を除
去するための前処理を要して使いＫくい、アルカリに対
して不安定でＰ　Ｈ８，５以下の溶離液しか使えないの
で、分離後の胆汁酸成分を３ａ−ＩＳＤと高い酵素活性
で反応させるＫは、分離カラム流出後、高められた一定
値に保たれる様ＰＨを調節する必要がある、胆汁酸各成
分の分離が十分でない等の欠点がある。

本発明は上記の如き胆汁酸の分析における現状にかんが
み、胆汁酸を含む試料についての前処理を要することな
く簡単に％長期間にわたって安定にしかもすぐれた精度
で分析することが出来る方法を提供する【とを目的とし
てなされたものであり、その要旨は χメチロールアルキルｙアクリレート（又はメタクリレ
ート）で示される単量体Ａ（ただしＸ及びｙけ４≧Ｘ≧
ｙ≧３の関係にある整数）１００重量部と、下記一般式
で表わされる単量体Ｂ Ｒ１００Ｒ。

（式中Ｒ１，Ｒ２は水素又はメチル基、詞＃′ｉ３〜１
８の整数である） １００重量部以下とからなるモノマー混合物が水性懸濁
重合されて形成された重合体小粒子が充填された力２ム
が分離用カラムとして用いられ、必要に応じて８０重量
％以下の水溶性有機溶剤を含むＰＨ表Ｏ〜１（１５の緩
衝液が溶層液として用いられた液体クロマトグラフによ
り胆汁酸各成分を分離し、上記分離用カラムから流出し
た分離液Ｋ　ＮＡＤ＋を含む反応液が含まれかつＰＨが
９．０以上Ｋｓｌ整され九混合液を、セルロース支持体
に固定化された３α−ＩＳＤが充填されたカラムに導い
て通過させ、上記３α−ＩＳＤの作用により各胆汁酸成
分とＮＡＤ＋とを順次反応させ、該反Ｉ１３により生成
した蛍光物質を測定することを特徴とする胆汁酸の分析
方法に存する。

本発明において、分離用カラムに充填剤として充填され
て用いられるのけ、前記単量体Ａと前記単量体Ｂとのモ
ノマー混合物が水性懸濁重合されて形成された重合体小
粒子であり、上記モノマー混合物中にお轄る単量体Ａ、
Ｈの割合としては、単量体Ｂの量が多くなりすぎると、
得られる共重合体は軟らかくなり、高速液体クロマトグ
ラフ用充填剤として用いた場合傾機械的強度において問
題が生じ、又、胆汁酸の分離能も低Ｆするので、単量体
Ａ１００重量部に対し１００重量部以下の量で用いられ
るのであり、とくに単量体Ａ対Ｂの使用割合を１０＝１
〜１０：３とするのが好ましい。又、単量体Ｂにおける
＋ＣＨ２−ＣＨ２−０＋の繰り返し単位の歌ｎが１９以
上になると共重合体粒子の機械的強度の点で問題が生じ
、又小さすぎて本分離能が糺下するので、該ｎは３〜１
８．！：され、より好ましく＃−ｉ３〜１４である。

上記単量体Ａの例きしては、テトラメチロールメタンテ
トラアクリレート、テトラメチロールメタンテトラメタ
クリレート、テトラメチロールメタントリアクリレート
、テトラメチロールメタントリメタクリレート、トリメ
チロールメタントリアクリレート、トリメチロールメタ
ントリアクリレート、トリメチロールプロパントリアク
リレート、トリメチロールプロパントリアクリレート等
が挙げられ、とくにテトラメチロールメタンテトラアク
リレート、テトラメチロールメタントリアクリレート、
テトラメチロールメタントリメタクリレートが好適に用
いられる。

又、上記単量体Ｂの例としては、トリエチレングリコー
ルジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレ
ート、テトラエチレングリコールジアクリレート、テト
ラエチレングリコールジアクリレート、ノナエチレング
リコールジアクリレート、ノナエチレングリコールジメ
タクリレート、テトラデカエチレングリコールジアクリ
レート、テトラデカエチレングリコールジメタクリレー
トなどが挙げられ、キくにテトラエチレングリコールジ
アクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート
、テトラエチレングリコールジメタクリレートが好適に
用いられる。

しかして七ツマー混合物の重合は常法に従って必要に応
じてラジカル発生触媒を添加して水性懸濁重合により行
われるのであるが、この重合に際して、用いられる単量
体は溶解するがその重合体は溶解しない有機溶媒を存在
せしめておくと、生成する重合体粒子は多孔質にな９、
表ＩＩ＋１槍が増加するので充填剤として好ましいもの
となる。

上記有機溶媒の例としてはトルエン、キンレン、ジエチ
ルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類、
ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和歳化水
素類、イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オ
クチルアルコール等のアルコール類などが挙げられ、又
、その使用量はモノマー混合物１００重量部に対して１
５〜２００重量部用いられるのが好ましく、より好まし
くけ２０〜１５０重量部である。

又、本発明において分離用カラムに充填されて用いられ
る重合体小粒子の粒径は３〜４０μの範囲で均一に揃っ
ているのが好ましい。

そして、重合体小粒子を水中に分散し、定流量ポンプ等
によりスデンレス力ラム等のカラムに圧送して充填する
のであり、かくして本発明に用いられる分離用カラムが
用意される。

次に本発明において用いられるセルロース支持体に固定
化された３α−Ｈ５Ｄが充填されたカラムけ、数ミクロ
ンないしけ数百ミクロンの大きさの微粒状ないしけ粉末
状セルロースに、例えば上記セルロース表面を予め適宜
な試薬例えばシアン化ブロマイドで活性化させ、これに
３α−Ｈ５Ｄを接触させて該３α−Ｈ８Ｄをセルロース
表面に吸着や共有結合等の方式で化学的に結合させて同
定化し、これを常法によりカラムに充填するととＫより
用意されうる。

第１図は本発明分析方法の一例を示すフローチャートで
あり、該図にもとづいて本発明方法を説明すると、図中
ＩＦｉ溶離液であり、該溶離液はポンプ２により、液体
クロマトグラフの分離カラム４に接続する流路内を分離
カラム４の方へ移送される。セして該溶離＃ｌとしては
ＰＨ４，０〜ＩＱ５の緩衝液が用いられるのであるが、
これにＦｉ必要Ｋｔ５じて８０重量％以下の水溶性有機
溶剤が含まれてもよい。又、分離カラム４は前記した特
定の重合体小粒子が充填されたものである。

上記溶離液が分離カラム４に入る手前でインジェクター
３により胆汁酸を含む試料が注入され、溶離液と合流し
て分離カラム４内を通過する。

ここで試料中に含まれる胆汁１！は分離カラム４の分離
作用により各成分毎に分離されて分離カラム４より流出
する。

この分離液１ｃ、ＮＡＤ＋を含む反応液５をポンプ６に
より混入し、この混合液をセルロース支持体に固定化さ
れた３α−Ｈ５Ｄが充填され九カラム７に導いて通過さ
せるのであるが、該カラム７において胆汁酸がＮＡＤ＋
の共存下に３Ｏ−Ｈ５Ｄと接触することＫより、該３α
−Ｈ５Ｄの触媒作用により、胆汁酸とＮＡＤ＋とが反応
して、蛍光物質（ＮＡＤＨ）が生成するのである。

この蛍光物質の生成量は試料液中に含まれる胆汁酸の量
に依存するので、蛍光検出計８において、紫外線吸収測
定や蛍光測定などの光学的手法により、蛍光物質量を測
定することＫより胆汁酸の定量が出来るのである。又、
蛍光検出計８の測定結果は記録計９で記録されてもよい
。

なお、本発明においては、前記混合液がカラム７を通過
する際の該混合液のＰ　Ｈ＃ｉ９．０以上である様に調
整されるのであ抄、そしてこのＰＨの調整は溶離液１や
ＮＡＤ＋を含む反応液５として適宜な組成の緩衝液を使
用したり、その混合比を１節するとと忙よって簡単に行
うことが出来る。

上記の様に本発明において混合液のＰＨ１ｌ−調整する
のは、主として、本発明に用いられるセルロース支持体
はＢＰを９以上としても侵される恐れがなく使用可能で
あること及び３α−Ｈ８Ｄの触媒能（＃素活性）はＰＨ
９〜１１程度のアルカリ領域で最高に達することの理由
にもとづくものであり、本発明によれば、ＰＨが約＆５
以下の領域でしか使用しなかったガラスピーズ担体等を
用いた従来の胆汁酸分析法に比して格段にすぐれた高感
度で分析することが可能となるのである。

又、混合液のＰＨを９以上さすることにより、固定化酵
素の寿命の短縮につながる上記支持体への有機物質特忙
蛋白の非特異吸着が起９にくくなるという利点も生じる
。

本発明胆汁酸の分析方法は上述の通りの方法であり、と
くに前記特定の重合体粒子が充填されたカラムを分離用
力２ムとして用いること及び該分離用カラムから流出し
た分離液Ｋ　ＮＡＤ＋を含む反応液が含まれか５ＰＨが
９．０以上にｍ整された混合液を、セルロース支持体に
固定化された３α−Ｈ５Ｄが充填され九カラムに導いて
通過させることを要件とする方法であるので、試料中の
胆汁酸を高感度で精度よくシャープに分離する仁とが出
来、しかも繰返して連続的に分析することが可能であ抄
、さらに血清などの生体試料について除蛋白操作等の前
処理を要さずそのま＼分析することが出来る等のすぐれ
た効果を奏し得るのである。

以下本発明の実施例について説明する。

実施例１ 冷却器、撹拌機、温度計および滴Ｆロートの設置された
２１のセノ曵うプルフクスプに５１１ｔ’）ｉのポリビ
ニルアルコール水溶液４００１とテトラメチロールメタ
ントリアクリレート８４ｙおよびテトラエチレングリコ
ールジアクリレート１６Ｆおよびベンゾイルパーオキサ
イドｏ、１５ｆよりなる混合液を供給した。さらにトル
エン１００ｐを添加した。次に４０Ｏｒ、ｐｍに撹拌し
ながら８０℃に昇温し、１０時間反応を行なって冷卿し
た。冷却後、菫合生成物を分離した後、熱水およびアセ
トンで洗浄して粒径が５〜２０　ｆｉｍの多孔質球状ポ
リマーを得た。そのうち微粒子および粗粒子を取り除い
て得られた８〜１０μ講の粒子を８０−のイオン交換水
に分散しステンレスカラム（直径７．９　ｍ、　長さ３
０国）に定流量ポンプによりイオン交換水を２．　Ｏａ
ｔ　／−の速度で圧送して充填し、分離用カラムを用意
した。

次にセルロース微粒子（粒径約８０ミクロン）を支持体
として用い、該セルロース微粒子５　ｍｌＫ、イオン交
換水５ｗ！、２Ｍ炭酸ナトリクム水溶液１０ｄを加え、
撹拌稜、これに予めシアン化ブロマイド２ｙを溶解した
アセトニトリル１１を加え、激しく撹拌しつつ９０秒間
反応させた。こうして活性化させたセルロース微粒子を
すばやくα１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）、イオン交換
水及び（ＬＳＩの塩化ナトリウムを合むＯ１ＩＭＩ酸緩
衝液（ＰＨ９，５）で洗浄したのち、３α−Ｈ５Ｄ４４
岬を溶解させた０、５Ｍの塩化ナトリウムを含むα１Ｍ
炭酸緩衝液（Ｉｌ１９．５）５　ｍｌ　を加え、室温で
２時間撹拌して反応させた。

次に上記の処理によシ３α−ｆｌｓＤを固定化しまたセ
ルロース支持体上になお存在する活性点をブロックする
ため、ＱＯ５％の２−メルカプトエタノールを含む（Ｌ
　Ｉ　Ｍ　）　リスー垣酸緩衝液（ＰＨ＆Ｏ）中で４℃
で２時間反応させた。

かくして得られた３α−Ｈ５Ｄが固定化されたセルロー
ス支持体をα５Ｍの塩化ナトリフＡを含ｔｒ（１１ＭＩ
［Ｎ１１Ｎ［（ＰＨ５，０）、イオン交換水及びα５Ｍ
の塩化す）　ＩＪクムを含むＱＩＭ炭酸緩衝液（ＰＨ９
，５）で繰シ返し洗浄したのち、直径４ｍ％長さ１Ｇ６
１１のステンレスカラムに充填した。

上記により得られたカラムを第１図に示されるフローチ
ャートにおけるカラム７として用い、液体クロマドグラ
フトして前記で用意した分離用カラムが組み込まれた液
体クロマトグラフを用い、これらのカラム及び蛍光検出
計を第１図の如くに接続して胆汁酸の分析を行った。

溶離液としてはＣ１，３％リン酸アンモニウム水溶液に
ＮＨ４０Ｍを加えＰ　Ｈ９，５とした水溶液に１８　ｖ
ｏｌ　９６のアセトニトリルを加えたもの（Ａ液）又け
ａ３％リン駿アンモニクム水溶液ＫＮＨ４０Ｈを加えＰ
　Ｈ９，５とした水溶液に２７　ｖａｔ％のアセトニト
リルを加えたものを用いた。又、サンプルとしソ、コー
ル酸、クルンダオキシコール酸、ケノデオキシコール酸
、ダオキシコール酸、リトコール酸の５種類の胆汁酸及
びこれらのそれぞれの胆汁酸にりいてのグリシン抱合体
とタフリン抱合体の合計１５種類が１０■ずつ１１のメ
タノールに溶解されたものを用□意した。

又、第１図における、分離カラム４で分離された分離液
に混合される反応液５としては、ｌｌ中ＫＮＡＤ＋１９
９．１岬及びエチレンジアミン４酢酸２ナトリクム塩２
表５岬を含むＰＨ１０のα０２６Ｍピロリン酸績衡液を
用いた。

分析操作としては、ポンプ２により溶離ＩＡをＬ　Ｏｄ
　／　ｍ　ｆ）流速でポンプ６によ怜反応液を１０　ｍ
ｌ　／　ｍの流速で流しながら前記サンプル１０／１１
をインジェクター３より注入し、　タフリン・抱合ダオ
キシコール酸（ＴＤＣＡ　）が溶出した時点で溶離液Ｂ
Ｌ５ｓ／／ｊの流速に切換えた。

かくして＠２図に示される通松の、１５種類のすべてに
ついて明確なピークが描かれたクロマトグラムが得られ
た。

なお、第２図中１１〜２５は、夫々下記の胆汁酸のピー
クである。

１１：コール酸、１２ニゲリシン抱合ブール酸、１３：
タフリン抱合プール酸、１４：クルンデオキシコール駿
、１５ニゲリシン抱合クルンダオキシコール酸、１６：
タフリン抱杏りＩレソデ方キシコール酸、１７：ケノデ
オキシコール酸、１８；ダオキシコール酸、１９ニゲリ
シン抱合ケノデオキシコール酸、２０ニゲリシン抱合デ
オキシコール酸、２１：タフリン抱合ケノデオキシコー
ル酸、２２：タフリン抱合デオキシコール酸、２３：リ
トコール酸、２４ニゲｌＪシン抱合リトコール酸、２５
：タフリン抱合リトコール酸 実施例２ 実施例１と同様の装置及び方法で、閉塞性黄痘患者の血
ｇＺｏｏ戸ｌを前処理することなくその壕−分析した結
果は第３図に示される通りであった。この分析を２０回
繰返して行ったが、第３図に示す第１回目に得られた結
果と殆んど変化は見られなかった。

次に、上記患者の血ＩＩＩＬＯｓ／をαＩ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ９＃ｌと混合したものを合成樹脂吸着剤（アンノ（−
フィトＸＡＤ−２）　１０ｓ／を充填したガラスカラム
に通し、そして１００Ｂ／の純水を通して洗浄したのち
上記カラムにメタノール３０ｄを通して、通過液を蒸発
を日させその伐漬に〆クノ−ルＬ　Ｏｍｌを加えて、除
蛋白処理を行ったサンプルを用意し、該サンプルの１０
０１１１を用いて、前処理しない場合と同様に分析を行
った。

その結果Ｆｉ第４図に示される通シであり、第３図と較
べてピーク高さが約７０％程度に低められたクロマトグ
ラムが描かれた。

なお、第３図、第４図に示されるビークにおいて、１２
．１３．１９及び２１け４Ｍ２図における同番号の胆汁
酸を指し、２６は胆汁酸以外の成分である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明分析方法の一例を示すフローチャートで
あり、第２図は本発明実施例１で得られたクロマトグラ
ム、第３図及び第４図は本発明実施例２で得られたクロ
マトグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌｒメチロールアルキルｙアクリレート（又はメタクリ
   レート）で示される単量体Ａ（ただし、Ｘ及びｙ＃ｉ４
   ≧Ｘ≧ｙ≧３の関係にある１１１００重量部と、下記一
   般式で表わされる単量体Ｂ （式中１１　、　Ｒ２Ｆｉ水素又はメチル基、ｎは３〜
   １８の整数である） １００重量部以下とからがるモノマー混合物が水性懸濁
   重合されて形成された重合体小粒子が充填され九カラム
   が分離用カラムとして用いられ、必要に応じて８０重量
   ％以下の水溶性有機溶剤を含むＰＨ４Ｏ〜ＩＱ５の緩衝
   液が溶離液として用いられた液体クロマトグラフにより
   胆汁酸各成分を分離し、上記分離用カラムから流出した
   分＋１１にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
   ＡＤ”）を含む反応液が含まれかつＰＨが９．０以不上
   に調整された混合液を、セルロース支持体に固定化され
   た３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α
   −Ｈ５Ｄ＞が充填され九カラムに導いて通過させ、上記
   ３α−Ｈ５Ｄの作用により各胆汁酸成分とＮＡＤ＋とを
   順次反応させ、該反応により生成した蛍光物質を測定す
   ることを特徴とする胆汁酸の分析方法。 ２　モノマー混合物における単量体Ａ対重量体Ｂの割合
   が重量比で１０：１〜１０：３である第１項記載の分析
   方法。 ユ　モノマー混合物が、該混合物は溶解するがその重合
   体は溶解し々い有機溶媒の存在下に水性懸濁重合されて
   形成された多孔質重合体小粒子が充填された分離用カラ
   ムが用いられる第１項記載の分析方法。