JPH03118466A - 糖化ヘモグロビンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ｔｌｉ化ヘモグロビンの定量法、特に液体ク
ロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの定量法に
関する。

（従来の技術） 糖化ヘモグロビンは、赤血球中のヘモグロビンが非酵素
的に血液中のグルコースと反応して形成される。糖化ヘ
モグロビンを測定することにより血液中のグルコースの
平均濃度がわかるため、該糖化ヘモグロビンの測定は糖
尿病の診断に広く用いられている。糖化ヘモグロビンは
、現在では。

主として高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと
する）により定量が行なわれている。ＨＰＬＣ法によれ
ば、従来のカラムクロマトグラフィー法、電気泳動法、
比色法などに比べて迅速な測定が可能である。

糖化ヘモグロビンを測定するときのＨＰＬＣに用いられ
る充填剤は、一般に弱カチオン性のイオン交換樹脂でな
り１通常、イオン交換基としてカルボキシル基を有する
イオン交換樹脂が用いられる。

このようなＨＰＬＣ用充填剤としては、主として有機ポ
リマー系充填剤または無機系充填剤が使用されている。

有機ポリマー系充填剤としては１例えば。

特開昭５８−２２１１６４号に、テトラメチロールメタ
ントリアクリレートなどのアクリル酸またはメタクリル
酸のエステルとアクリル酸またはメタクリル酸との共重
合体でなる充填剤が開示されている。

無機系充填剤としては、特開昭６３−７５５５８号に、
シリカ基材にカルボキシル基を導入した充填剤が開示さ
れている。

一般に糖化ヘモグロビンの定量は、溶離液として溶出力
の弱い液（以下第１液とする）と溶出力の強い液（以下
第２液とする）との二種を用いてステップあるいは連続
グラジェント法により実施される。第１液は、充填剤中
の遊離カルボキシル基を増加させる。第１液を流した場
合、試料中の糖化ヘモグロビン以外のヘモグロビンは、
糖化ヘモグロビンよりも相対的に充填剤に保持されやす
く、糖化ヘモグロビンが分離されて溶出する。第２液は
イオン強度が大きいため、遊離カルボキシル基が塩とな
る。そのため、保持されていた糖化ヘモグロビン以外の
ヘモグロビンが速やかに溶出する。

しかし、上記方法にポリマー系充填剤を用いる場合に次
のような問題がある。ポリマー系充填剤は１例えば上記
特開昭５８−２２１１６４号に示されるように、疎水性
および親水性のモノマーを用いて調製されるため、主と
して親水性七ツマ−に起因するイオン交換基が充填剤粒
子全体に分布する。このような充填剤に第２液を接触さ
せると、充填剤が膨潤してカラム内の圧力が高くなる。

ひとつの検体を測定した後２次の検体を測定するために
は。

第１液を流してカルボキシル基を遊離型に戻す操作が必
要とされる。このときに、充填剤内部に存在するイオン
交換基を充分に遊離型にもどすための平衡化には相当量
の第１液を流す必要があるため測定時間が長くなる。ポ
リマー系充填剤を用いたＨＰＬＣにより糖化ヘモグロビ
ンを比較的高速で測定できるようになったが、さらに測
定速度を上げようとすると上記のように、充填剤内部の
イオン交換基が充分に交換せず分離性能が低下する。あ
るいは、カラム内の圧力が高くなり、充填剤が変形して
１分離性能が低下する。したがって、高精度での分離を
行なうには、溶離速度を低下させる必要があり、測定時
間の短縮は困難となる。

他方シリカを基材とする無機系充填剤は、一般に耐圧性
および耐膨潤性において優れているが。

表面に残存するシラノール基によってタンパクの非特異
吸着を起こしやすいなどの問題が措摘されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来法の欠点を解決するものであり、その
目的とするところは、　ＨＰＬＣにより糖化ヘモグロビ
ンを短時間のうちに高精度で分離・定量する方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、カラム操作時に
カラム圧を上昇させることがなく、溶離液との平衡化が
速やかであり、かつタンパクなどを非特異吸着させるこ
とのない充填剤を用いて、　ＨＰＬＣにより糖化ヘモグ
ロビンを効果的に定量する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化
ヘモグロビンを定量する方法であって。

該液体クロマトグラフィーに使用する充填剤が。

疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、カルボキシル基を
有する（共）重合体の層が形成された被覆重合体粒子で
なり；該被覆重合体粒子が、加水分解反応によりカルボ
キシル基を生成し得る官能基を有する単量体を、該疎水
性架橋重合体粒子の表面部分で重合させ、生成する重合
体で該疎水性架橋重合体粒子を被覆し；そして、該官能
基を加水分解して得られ、そのことにより上記目的が達
成される。

本発明方法に使用される疎水性架橋重合体粒子の素材と
しては、疎水性架橋性単量体を（共）重合させて得られ
る（共）重合体または疎水性架橋性単量体と疎水性非架
橋性単量体との共重合体が用いられる。これらの単量体
は、後述する加水分解反応条件において、化学反応（例
えば、加水分解）しない重合体を形成するものであるこ
とが必要である。したがって、加水分解反応条件におい
て、化学反応し得る官能基を持たない単量体が用いられ
る。上記疎水性架橋性単量体および疎水性非架橋性単量
体は、それぞれ単独で、あるいは二種以上が組みあわせ
て用いられ得る。上記疎水性架橋性単量体としては１例
えばジビニルベンゼン。

ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタ
レンなどの２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物
などが用いられる。上記疎水性非架橋性単量体としては
９例えばスチレン、メチルスチレンなどが用いられる。

上記架橋性および非架橋性の単量体を混合して用いる場
合には、架橋性単量体が全単量体１００重量部に対し１
０重量部以上。

好ましくは２０重量部以上となるように使用される。

上記疎水性架橋重合体粒子を調製するときに用いられる
重合開始剤、および得られた疎水性架橋重合体粒子−含
浸させる重合開始剤は、ラジカルを発生する触媒であり
、疎水性であれば特に限定されない。例えばベンゾイル
パーオキサイド、クメンパーオキサイドなどの有機過酸
化物；アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチ
ロアミドなどのアブ化合物など既知のラジカル発生触媒
のいずれもが使用され得る。

本発明方法で、疎水性架橋重合体粒子を被覆するために
用いられる単量体は、加水分解によりカルボキシル基を
生成し得る官能基を有する単量体（以下、加水分解性の
基を有する単量体とする）である。このような単量体と
しては、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルなどの
、アクリル酸またはメタクリル酸（以下、（メタ）アク
リル酸とする）のアルキルエステル類；（メタ）アクリ
ルアミド、　（メタ）アクリロニトリルなどが挙げられ
る。上記加水分解性の基を有する単量体は。

必要に応じて二種以上が混合して用いられ得る。

加水分解性の基を有する単量体の使用量は、単量体の種
類によって異なるが疎水性架橋重合体１００重量部に対
して５〜５０重量部の割合である。

本発明方法に用いる液体クロマトグラフィー用充填剤を
調製するには、まず、疎水性架橋重合体粒子が調製され
る。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸濁
重合法により調製され得る。

まず上記疎水性単量体（疎水性架橋性単量体および必要
に応じて疎水性非架橋性単量体）に上記重合開始剤を溶
解させる。さらに、必要に応じて希釈剤を添加すること
によって多孔性の疎水性架橋重合体を得ることができる
。希釈剤としては、上記単量体を溶解させ、かつその重
合体を溶解させない有機溶媒のいずれもが使用可能であ
る。例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、
ドデシルヘンゼンなどの芳香族炭化水素類；ヘキサン、
ヘプタン、オクタン、デカンなどの飽和炭化水素１；イ
ソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルア
ルコールなどのアルコール類があげられる。その使用量
は何ら限定されないが上記単量体１００重量部に対して
２００重量部までの割合であることが好ましい。上記単
量体の混合液を。

ポリビニルアルコール、リン酸カルシウムなどの懸濁安
定剤を分散した水相に添加し、窒素置換後攪拌しながら
４０〜１００　’Ｃに加熱することにより懸濁重合を行
う。希釈剤を添加して重合を行った場合、得られた重合
体粒子中には希釈剤である有機溶媒が分散して存在する
ため２重合終了後に有機溶媒を除去することにより、多
孔性の球状粒子が得られる。希釈剤として上記疎水性単
量体混合物と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用する
ことにより、多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変化
させることが可能である。

次に、得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含
浸させる。重合開始剤を含浸させるには該重合開始剤を
、低沸点で、かつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶媒
に溶解させ、これに上記疎水性架橋重合体粒子を浸漬す
る。このことにより重合開始剤が粒子中に浸透する。こ
れを必要に応じて重合開始剤の分解点以下の温度で加熱
して。

溶媒を留去すれば重合開始剤を疎水性架橋重合体粒子中
に含有する粒子が得られる。この重合開始剤含有粒子を
上記加水分解性の基を有する単量体が溶解する分散媒中
に分散させ、あるいは、該粒子が分散する分散媒中に加
水分解性の基を有する単量体を添加し、溶解させて、窒
素置換後、撹拌しながら加熱して重合を行なう。分散媒
としては加水分解性の基を有する単量体を熔解する水ま
たは有機溶媒、あるいは両者の混合物が使用される。

分散媒中における疎水性架橋重合体の分散性を安定化さ
せるため、カルボキシメチルセルロース。

ポリビニールアルコールなどの分散安定剤を使用しても
よい。重合の温度および時間は９反応させる加水分解性
の基を有する単量体の種類と２重合開始剤の種類によっ
ても異なるが、４０〜１００°Ｃで０．５〜ＩＯ時間程
度である。

上記重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を加
水分解性の基を有する単量体の重合反応に供する方法の
他、疎水性架橋重合体粒子の調製に引き続いて加水分解
性の基を有する単量体を反応させる連続法によっても上
記二層構造の重合体粒子が調製され得る。この方法にお
いては、まず。

上記疎水性架橋重合体粒子を調製するための重合反応を
開始させる。重合がある程度進行し、かつ未反応の単量
体が残存しているときに上記加水分解性の基を有する単
量体を反応系に加える。このような状態においては、系
内の油相および生成した疎水性架橋重合体粒子内部に重
合開始剤が存在するため、引き続いて加水分解性の基を
有する単量体の重合が起こり、しかも該疎水性架橋重合
体粒子の表面部分を被覆する形で、加水分解性の基を有
する重合体の層が形成される。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒など
で十分洗浄し１粒子に含有されている。

あるいは付着している懸濁安定剤、溶媒、残存単量体な
どを除去する。

得られた重合体粒子を酸触媒またはアルカリ触媒により
加水分解を行うことにより２粒子表面の被覆層に存在す
る加水分解性の官能基が加水分解されて、カルボキシル
基となる。例えば、加水分解性の基を有する単量体とし
てアクリル酸メチルを用いた場合１重合体粒子を水酸化
ナトリウムの１５〜２５重量％メタノール溶液中で６０
〜８０°Ｃの温度で４〜７時間反応させることによって
粒子表面のＣ００ＣＩ＋３基はカルボキシル基となる。

加水分解反応後１重合体粒子を濾取し、数回水洗して乾
燥し、さらに必要に応じて粒子を分級して、充填剤が得
られる。

本発明方法により糖化ヘモグロビンの測定を行なうには
、まず、試料の血液を必要に応じて溶血させる。これを
、上記充填剤が充填されたカラムにかけ１通常の液体ク
ロマトグラフィーの手法により糖化ヘモグロビンの定量
を行なう。適当な緩衝液を選択することにより、試料中
の糖化ヘモグロビン、次いで他のヘモグロビンが分離さ
れて順次溶出される。

本発明方法に用いられる充填剤は、疎水性架橋重合体を
骨格とし、カルボキシル基を有する重合体で該疎水性架
橋重合体の表面部分が被覆された二層構造の重合体粒子
からなる。骨格部分として架橋度の高い重合体を用いる
ことによって２機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れ
た液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる
。この充填剤の骨格部分には親水性の基が存在しないた
め、水性溶出液による充填剤の膨潤および収縮の度合が
極めて低い。したがって糖化ヘモグロビンの定量におい
て、第２液通液時の圧力上昇が極めて少ない。表面部分
のみがカルボキシル基を有する重合体層で覆われている
ため、充填剤のイオン交換能が高く、さらに、カルボキ
シル基の平衡化も非常に速い。そのため糖化ヘモグロビ
ンの分離性能が優れ、短時間での測定が可能となる。さ
らにタンパクの非特異的吸着も全く認められない。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた充填剤の物
性測定および性能評価の方法は次の通りである。

「充填剤の評価方法」 得られた充填剤を内径６ｎｎｎおよび長さ７５Ｍのステ
ンレス製カラムに充填し、耐圧性および水に対する膨潤
性を調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し、流速を変
えて流速と圧力損失との関係より測定した。膨潤性は、
イオン強度の異なる液を流した時のカラム圧の変化より
求めた。

京都電子工業■製電位差自動滴定装置ＡＴ−３１０によ
り充填剤表面のイオン交換基を定量した。さらに■京都
第−科学製旧〜ＡＵＴＯＡ、ｃでヒト血液のへモグロビ
ンの分析を行い分離能などを従来品と比較した。測定方
法は次の通りである。ヒト血液検体として、同一人（Ｒ
常人）の血液を採取後直ちにヘパリンを添加したものを
用いた。血液検体は。

本装置付属の専用溶血液２１Ｌ（ノニオン系界面活性剤
を含むリン酸緩衝液）によって、自動的に２９０倍に希
釈、溶血される。溶離液は本装置付属の専用試薬である
Ａ液（ｐＨ５，９のリン酸緩衝液）、Ｂ液（ｐ）１７．
２のリン酸緩衝液）およびＣ液（ｐＨ５，９のリン酸緩
衝液）を使用した。

失血器上 スチレン（疎水性非架橋性単量体）１００ｇ、ジビニル
ベンゼン（疎水性架橋性単量体）２００ｇおよびベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤）１ｇをトルエン（希
釈剤）２００ｇに溶解させた。これを４％ポリビニルア
ルコール水？容７夜２．５４２に添加して、攪拌しなが
ら羽枝した後、窒素置換下で８０°Ｃに加熱し懸濁重合
を行った。８０°Ｃで８時間重合した後、生成物を熱水
およびアセトンで順次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架
橋重合体粒子を得た。

この疎水性架橋重合体粒子２００ｇをアセチルパーオキ
サイド０．５ｇが溶解しているアセトンＩＰに浸漬して
該重合開始剤を含浸させた。次にアセトンを２０°Ｃに
おいて減圧下で留去した。５０％メタノール水溶液２．
５２に上記の含浸処理した疎水性架橋重合体を懸濁させ
、攪拌しながらアクリル酸メチル（加水分解性の基を有
する単量体）５０ｇを添加し窒素置換後７０゛Ｃで５時
間重合反応を行った。

生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。

この重合体粒子１５０ｇを水酸化ナトリウムの２０重量
％メタノール溶液５００ｄに添加し、７５”Ｃで５時間
加熱して、ポリアクリル酸メチルのエステル部分を加水
分解した。反応混合物を室温に冷却した後１重合体粒子
を濾取して、数回水洗し。

乾燥した。得られた微小のポリマーゲルを日清エンジニ
アリング■製空気分級機ターボクラシファイアＴＣ〜１
５Ｎにより分級して粒径が８〜１０μｍの粒子を集め、
充填剤を得た。これを内径６ｒＭ１および長さ７５Ｍｎ
のステンレス製カラムに充填した。充填は精製水３５ｍ
１にゲル（充填剤）２ｇを取り５分間攪拌した後、２．
０ｄ／分で定流量充填することにより行った。

上記の方法により耐圧性および膨潤性の評価を行った。

耐圧性評価においては、　　１５０ｋｇ／ｃｄまで圧力
損失が流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶
離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリン酸
緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められなか
った。滴定によりゲル表面のカルボキシル基を定量した
ところゲル１ｇ当たり０．０７ｍｍｏ　１のカルボキシ
ル基が存在し、従って加水分解反応前にゲル表面に存在
していたアクリル酸メチルは１．２ｇであった。■京郁
第−科学製旧−ＡＵＴＯＡＩＣでヒト血液の分析を行っ
た。その結果得られたクロマトグラムを第１図に示す。

第１図および後述の第２図、第３図において、１はヘモ
グロビン（以下Ｈｂとする）　ＡＩ−およびＡＩｂ、２
は胎児性Ｈｂ（Ｆ）、　　３は不安定型１（ｂＡ、Ｃ，
４は安定型ＨｂＡ、、。

そして５は正常ｕｂ（Ａａ）に起因するピークである。

実上桝主 スチレン（疎水性非架橋性単量体）１００ｇ、ジビニル
ベンゼン（疎水性架橋性単量体）２００ｇおよびベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤゛）１ｇをイソアミル
アルコール（希釈剤）２００’ｇに溶解させた。実施例
１と同様にして疎水性架橋重合体粒子を調製した。

この疎水性架橋重合体粒子２００ｇをベンゾイルパーオ
キサイド０．５ｇが溶解しているアセトン１ρに浸漬し
て該重合開始剤を含浸させた。次にアセトンを２０゛Ｃ
において減圧下で留去した。５０％メタノール水溶液２
．５１に上記の含浸処理した疎水性架橋重合体を懸濁さ
せ、攪拌しながらメタクリル酸メチル５０ｇを添加し窒
素置換後８０″Ｃで５時間重合反応を行った。生成物を
熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。得られた
乾燥ゲルを実施例１と同様に加水分解１分級、充填し評
価した。

その結果、耐圧性については１５０ｋｇ／ｃ１１１まで
圧力損失は流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ
、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリ
ン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められ
なかった。滴定によりゲル表面のカルボキシル基を定量
したところゲル１ｇ当たりＱ、１ｍｍｏｌのカルボキシ
ル基が存在し、従って加水分解反応前にゲル表面に存在
していたメタクリル酸メチルは１．７ｇであった。実施
例１と同様にしてヒト血液の分析を行った。その結果得
られたクロマトグラムを第２図に示す。

実音■主 この実施例では、疎水性架橋重合体粒子の調製に続いて
加水分解性の基を有する単量体を反応させる連続した重
合法を採用した。

スチレン１００　ｇ　、ジビニルベンゼン２００ｇおよ
びベンゾイルパーオキサイド１ｇをトルエン２００ｇに
溶解し、４％ポリビニルアルコール水溶液２．５２に添
加して、攪拌しながら羽枝した後、窒素置換下で８０°
Ｃに加熱し懸濁重合を行った。８０°Ｃで２時間重合し
た後アクリルアミド５０ｇを添加し、さらに８０°Ｃで
２時間重合し、生成物を実施例１と同様に加水分解２分
級、充填して、評価した。

その結果、耐圧性については１５０　ｋｇ／ｃｄまで圧
力損失は流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、
溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００１のリン酸
緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められなか
った。滴定によりゲル表面のカルボキシル基を定量した
ところ、ゲル１ｇ当たり０．４ｍｍｏ　ｌのカルボキシ
ル基が存在し、従って加水分解反応前にゲル表面に存在
していたアクリルアミドは５．７ｇであった。実施例１
と同様にしてヒト血液の分析を行った。その結果得られ
たクロマトグラムは第１図と同様であった。

ル較■上 スチレン１００　ｇ　、　ジビニルベンゼン２００　ｇ
　、アクリル酸メチル７０ｇ、アセチルパーオキサイド
１ｇをトルエン２００ｇに？容解し、４％ポリビニルア
ルコール水溶液２．５！に添加して、攪拌しながら羽枝
した後、７０°Ｃに加熱し懸濁重合した。７０’Ｃで８
時間重合した後、生成物を実施例１と同様な操作により
加水分解１分級、充填し評価した。

その結果、耐圧性については８０ｋｇ／ｃ＋ｆｌまで圧
力損失は流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、
溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリン
酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力が２０ｋｇ／ｃｆｆ
ｌ上昇した。このように実施例１の充填剤より耐圧性お
よび耐膨潤性は劣ることが明らかである。さらに実施例
１と同様にヒト血液の分析を行った。

その結果を第３図に示す。第１図に比較すると明らかに
糖化ヘモグロビン類に対する保持力は弱く。

分離能が劣っている。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、高精度でかつ短時間のう
ちに糖化ヘモグロビンの定量がなされる。

本性を用いて、血液中の糖化ヘモグロビンを測定するこ
とにより、糖尿病の診断などが迅速かつ正確になされ得
る。

４、Ｊ　　　の　　　なｉ′日 第１図〜第３図は、それぞれ実施例１．実施例２および
比較例１において得られた充填剤をカラムに充填し、糖
化ヘモグロビンの分離を行なった際のクロマトグラムを
示す。

以上 第１ 図 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化ヘモグ
   ロビンを定量する方法であって、該液体クロマトグラフ
   ィーに使用する充填剤が、疎水性架橋重合体粒子の表面
   部分に、カルボキシル基を有する（共）重合体の層が形
   成された被覆重合体粒子でなり、 該被覆重合体粒子が、加水分解反応によりカルボキシル
   基を生成し得る官能基を有する単量体を該疎水性架橋重
   合体粒子の表面部分で重合させ、生成する重合体で該疎
   水性架橋重合体粒子を被覆し、そして、 該官能基を加水分解して得られる、 糖化ヘモグロビンの定量法。