JPH02309253A - 糖化ヘモグロビンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖化ヘモグロビンの定量法、特に液体クロマ
トグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの定量法に関す
る。

（従来の技術） 糖化ヘモグロビンは、赤血球中のヘモグロビンが非酵素
的に血液中のグルコースと反応して形成される。糖化ヘ
モグロビンを測定することにより血液中のグルコースの
平均濃度がわかるため、該糖化ヘモグロビンの測定は糖
尿病の診断に広く用いられている。糖化ヘモグロビンは
、現在では。

主として高速液体クロマトグラフィー（以下１（ＰＬＣ
とする）により定量が行なわれている。ＨＰＬＣ法によ
れば、従来のカラムクロマトグラフィー法、電気泳動法
、比色法などに比べて迅速な測定が可能である。

糖化ヘモグロビンを測定するときの）ＩＰＬｃに用いら
れる充填剤は、一般に弱カチオン性のイオン交換樹脂で
なり３通常、イオン交換基としてカルボキシル基を有す
るイオン交換樹脂が用いられる。

このようなＨＰＬＣ用充填剤としては、主として有機ポ
リマー系充填剤または無機系充填剤が使用されている。

有機ポリマー系充填剤としては１例えば。

特開昭５８−２２１１６４号に、テトラメチロールメタ
ントリアクリレートなどのアクリル酸またはメタクリル
酸のエステルとアクリル酸またはメタクリル酸との共重
合体でなる充填剤が開示されている。

無機系充填剤としては、特開昭６３−７５５５８号に、
シリカ基材にカルボキシル基を導入した充填剤が開示さ
れている。

一般に糖化ヘモグロビンの定量は、溶離液として溶出力
の弱い液（以下第１液とする）と溶出力の強い液（以下
第２液とする）との二種を用いてステップあるいは連続
グラジェント法により実施される。第１液は、充填剤中
の遊離カルボキシル基を増加させる。これにより試料中
の糖化ヘモグロビン以外のヘモグロビンは充填剤に保持
され。

糖化ヘモグロビンは分離されて溶出する。第２液はイオ
ン強度が大きいため、遊離カルボキシル基が塩となる。

そ、のため、保持されていた糖化ヘモグロビン以外のヘ
モグロビンが速やかに溶出する。

しかし、上記方法をポリマー系充填剤を用いる場合に次
のような問題がある。ポリマー系充填剤は１例えば上記
特開昭５８４２１１６４号に示されるように、疎水性お
よび親水性のモノマーを用いて調製されるため２主とし
て親水性モノマーに起因するイオン交換基が充填剤粒子
全体に分布する。このような充填剤に第２液を接触させ
ると、充填剤が膨潤してカラム内の圧力が高くなる。ひ
とつの検体を測定した後９次の検体を測定のためには。

第１液を流してカルボキシル基を遊離型に戻す操作が必
要とされる。このときに、充填剤内部に存在するイオン
交換基を充分に遊離型にもどすためには相当量の第１液
を流す必要があるため測定時間が長くなる。ポリマー系
充填剤を用いた）ＩＰＬＣにより糖化ヘモグロビンを比
較的高速で測定できるようになったが、さらに測定速度
を上げようとすると上記のように、充填剤内部のイオン
交換基が充分に交換しない、あるいは、充填剤が膨潤す
るという理由から１分離性能が低下する。高精度での分
離を行なうには、溶離速度を低下させる必要がある。

他方シリカを基材とする無機系充填剤は、一般に耐圧性
および耐膨潤性において優れているが。

表面に残存するシラノール基によってタンパクの非特異
吸着を起こしやすいなどの問題が指摘されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来法の欠点を解決するものであり、その
目的とするところは、　ＩＩＰＬｃにより糖化ヘモグロ
ビンを短時間のうちに高精度で分離・定量する方法を提
供することにある。本発明の他の目的は、カラム操作時
にカラム圧を上昇させることがなく、溶離液との平衡化
が速やかであり、かつタンパクなどを非特異吸着させる
ことのない充填剤を用いて、　）ＩＰＬ（’により糖化
ヘモグロビンを効果的に定量する方法を提供することに
ある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化
ヘモグロビンを定量する方法であって。

該液体クロマトグラフィーに使用する充填剤が。

疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、アクリル酸および
／またはメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被
覆重合体粒子でなり、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

本発明方法に用いられる充填剤を調製するのに使用され
る疎水性架橋重合体粒子の素材としては。

疎水性架橋性単量体を（共）重合させて得られる（共）
重合体または疎水性架橋性単量体と疎水性非架橋性単量
体との共重合体が用いられる。上記疎水性架橋性単量体
および疎水性非架橋性単量体は、それぞれ単独で、ある
いは二種以上が組みあわせて用いられ得る。上記疎水性
架橋性単量体としては、たとえばエチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アク
リレートなどのジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラ
メチロールメタントリ　（メタ）了クリレート、テトラ
メチロールメタンテトラ（メタ）アクリレートなどの多
価アルコールのポリ　（メタ）アクリル酸エステル；ジ
ビニルベンゼン。

ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタ
レンなどの２個以上のビニル基を有する芳香族系化合物
などが用いられる。上記疎水性非架橋性単量体としては
、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性単量体であれ
ば、いずれもが使用され得る。例えばメチル（メタ）ア
クリレート、工チル（メタ）アクリレート、プロピル（
メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレー
ト。

ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アク
リレートなどの（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニ
ル；およびスチレン、メチルスチレンなどのスチレン系
単量体が用いられる。上記架橋性および非架橋性の単量
体を混合して用いる場合には、架橋性単量体が全単量体
１００重量部に対し１０重量部以上、好ましくは２０重
量部以上となるように使用される。

上記疎水性架橋重合体粒子を調製するときに用いられる
重合開始剤、および得られた疎水性架橋重合体粒子に含
浸させる重合開始剤（後述）は。

ラジカルを発生する触媒であり、疎水性であれば特に限
定されない。例えばベンゾイルパーオキサイド、クメン
パーオキサイドなどの有機過酸化物；アゾビスイソブチ
ロニトリル、アゾビスイソブチロアミドなどのアゾ化合
物など既知のラジカル発生触媒のいずれもが使用され得
る。

上記疎水性架橋重合体粒子を被覆するために用いられる
アクリル酸および／またはメタクリル酸く以下、　（メ
タ）アクリル酸とする）は、カルボキシル基を有するた
め、疎水性架橋重合体粒子の表面において重合したとき
に、該カルボキシル基がイオン交換基として機能する。

アクリル酸およびメタクリル酸以外にもカルボキシル基
を持ち。

水溶性の単量体であれば他の単量体も使用することが可
能である。（メタ）アクリル酸の使用量は。

単量体の種類によって異なるが１通常、疎水性架橋重合
体１００重量部に対して５〜５０重量部である。

本発明方法に用いる液体クロマトグラフィー用充填剤を
調製するには、まず、疎水性架橋重合体粒子が調製され
る。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸濁
重合法により調製され得る。

まず上記疎水性架橋性単量体および必要に応じて疎水性
非架橋性単量体と上記重合開始剤とを希釈剤に溶解させ
る。希釈剤としては、上記単量体を溶解させ、かつその
重合体を溶解させない有機溶媒のいずれもが使用可能で
ある。例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン
、ドデシルベンゼンなどの芳香族炭化水素類；ヘキサン
、ヘプタン、オクタン、デカンなどの飽和炭化水素類；
イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチル
アルコールなどのアルコール類があげられる。

その使用量は何ら限定されないが上記単量体１００重量
部に対して１５〜２００重量部の割合であることが好ま
しい。上記単量体の希釈液を、ポリビニルアルコール、
リン酸カルシウムなどの懸濁安定剤を分散した水相に添
加し、窒素置換後攪拌しながら５０〜１００℃に加熱す
ることにより懸濁重合を行う。得られた重合体粒子中に
は希釈剤である有機溶媒が分散して存在するため１重合
終了後に有機溶媒を除去することにより、多孔性の球状
粒子が得られる。希釈剤として上記疎水性単量体混合物
と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用することにより
、多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変化させること
が可能である。

次に、得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含
浸させる。重合開始剤を含浸させるには。

該重合開始剤を、低沸点で、かつ疎水性架橋重合体と親
和性の良い溶媒に溶解させ、これに上記疎水性架橋重合
体粒子を浸漬する。このことにより重合開始剤が粒子中
に浸透する。溶媒を、必要に応じて重合開始剤の分解点
以下の温度で加熱しながら留去すれば重合開始剤を疎水
性架橋重合体粒子中に含有する粒子２が得られる。この
重合開始剤含有粒子を（メタ）アクリル酸が溶解する水
性分散媒中に分散させ、あるいは、該粒子が分散する水
性媒体中に（メタ）アクリル酸を添加し、窒素置換後攪
拌下に加熱して重合を行なう。水性分散媒には疎水性架
橋重合体の分散性を安定させるため、カルボキシメチル
セルロース、ポリビニールアルコールなどの分散安定剤
を使用することが望ましい。重合の温度および時間は、
アクリル酸を用いるかメタクリル酸を用いるかによって
、あるいは重合開始剤の種類によって異なるが、５０〜
１００℃で０．５〜ｌＯ時間程度である。

上記重合開始剤を含浸させた架橋重合体粒子を（メタ）
アクリル酸の重合反応に供する方法の他。

架橋重合体粒子の調製に引き続いて（メタ）アクリル酸
を反応させる連続法によっても上記二層構造の重合体粒
子が調製され得る。この方法においては、まず、上記架
橋重合体粒子を調製するための重合反応を開始する。重
合がある程度進行し。

かつ未反応の単量体が残存しているときに（メタ）アク
リル酸が反応系に加えられる。このような状態において
は、系内の油層および生成した疎水性架橋重合体粒子内
部に重合開始剤が存在するため。

引き続いて（メタ）アクリル酸の重合が起こり。

しかも該疎水性架橋重合体粒子の表面部分を被覆する形
で（メタ）アクリル酸の（共）重合体の層が形成される
。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒など
で十分洗浄し１粒子に付着している懸濁安定剤、溶媒、
残存単量体などが除去される。さらに必要に応じて粒子
を分−級して、クロマトグラフィー用の充填剤が得られ
る。

本発明方法により糖化ヘモグロビンの測定を行なうには
、まず、試料の血液を必要に応じて溶血させる。これを
、上記充填剤が充填されたカラムにかけ１通常の液体ク
ロマトグラフィーの手法により糖化ヘモグロビンの定量
を行なう。適当な緩衝液を選択することにより、試料中
の糖化ヘモグロビン、次いで他のヘモグロビンが分離さ
れて順次溶出される。

本発明方法に用いられる充填剤は、疎水性架橋重合体を
骨格とし、　（メタ）アクリル酸重合体で該疎水性架橋
重合体の表面部分が被覆された２層構造の重合体粒子か
らなる。骨格部分として架橋度の高い重合体を用いるこ
とによって２機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れた
液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。

この充填剤の骨格部分には親水性の基が存在しないため
。

膨潤および収縮の度合が極めて低い。したがって糖化ヘ
モグロビンの定量において、第２液通液時の圧力上昇が
極めて少ない。表面部分のみがカルボキシル基を有する
（メタ）アクリル酸重合体層で覆われているため、充填
剤のイオン交換能が高く、さらに、カルボキシル基の平
衡化も非常に速い。そのため糖化ヘモグロビンの分離性
能が優れ。

短時間での測定が可能となる。さらにタンパクの非特異
的吸着も全く認められない。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた充填剤の物
性測定ふよび性能評価の方法は次の通りである。

「充填剤の評価方法」 得られた充填剤を内径６　ｍｍおよび長さ７５ｍ＋ｎの
ステンレス製カラムに充填し、耐圧性および水に対する
膨潤性を調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し、流速
を変えて流速と圧力損失との関係より測定した。膨潤性
は、イオン強度の異なる液を流した時のカラム圧の変化
より求めた。

京都電子工業■製電位差自動滴定装置ＡＴ−３１０によ
り充填剤表面のイオン交換基を定量した。さらに■京都
第−科学製旧−Ａ（ＪＴＯＡ＋ｃでヒト血液のヘモグロ
ビンの分析を行い分離能などを従来品と比較した。測定
方法は次の通りである。ヒト血液検体として、同一人（
健常人）の血液を採取後直ちにヘパリンを添加したもの
を用いた。血液検体は。

本装置付属の専用溶血液２１Ｌ（ノニオン系界面活性剤
を含むリン酸緩衝液）によって、自動的に２９０倍に希
釈・溶血される。溶離液は本装置付属の専用試薬である
Ａ液（ｐＨ５，９のリン酸緩衝液）、Ｂ液（ｐＨ７，２
のリン酸緩衝液）およびＣ液（ｐＨ５，９のリン酸緩衝
液）を使用した。

実施例１ スチレン（疎水性非架橋性単量体）　１００　ｇ、ジビ
ニルベンゼン（疎水性架橋性単量体）　２００　ｇおよ
びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）　１ｇをト
ルエン２００　ｇに溶解させた。これを４％ポリビニル
アルコール水溶液２゜５１に添加して、攪拌しながら調
粒した後、窒素置換下で８０℃に加熱し懸濁重合を行っ
た。８０℃で８時間重合した後。

生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥して微
小の疎水性架橋重合体粒子を得た。

この疎水性架橋重合体粒子２００ｇをベンゾイルパーオ
キサイド０．５ｇが溶解しているアセトンｌｌに浸漬し
て該重合開始剤を含浸させた。次に。

アセトンを２０℃において減圧下で留去した。１％ポリ
ビニルアルコール水溶液２．５１に上記の含浸処理した
疎水性架橋重合体を懸濁させ、攪拌しながらアクリル酸
５０ｇを添加し、窒素置換後８０℃で２時間重合反応を
行った。生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾
燥した。得られた微小のポリマーゲルを日清エンジニア
リング側製空気分級機ターボクラシファイアＴＣ−１５
Ｎにより分級して粒径が８〜１０μｍの粒子を集め、充
填剤を得た。

これを内径６ｍｍおよび長さＴ５＋ｎｍのステンレス製
カラムに充填した。充填は精製水３５ｒｄ、にゲル（充
填剤＞２ｇを取り５分間攪拌した後、　　２．Ｏｒｄ／
分で定流量充填することにより行った。

上記の方法により耐圧（ｔＪよび膨潤性の評価を行った
。耐圧性評価においては、　　１５０ｋｇ／ｃｕｔまで
圧力損失が流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ
、溶離液を４０　ｍ　Ｍのリン酸緩衝液から２００ｍＭ
のリン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認め
られなかった。滴定によりゲル表面のカルボキシル基を
定量したところゲル１ｇ当たり０．０８ｍｍｏｌであり
、従って反応したアクリル酸は４．３ｇであった。さら
に■京都第−科学製旧−ＡＵＴＯＡｒｃでヒト血液の分
析を行った。その結果得られたタロマドグラムを第１図
に示す。第１図および後述の第２図、第３図において、
１はヘモグロビンＡｌａおよびＡ＋ｂ、　　２は胎児性
ヘモグロビン（Ｐ）、　　３は不安定型ヘモグロビンＡ
、ｅ、４は安定型ヘモグロビンＡＩＣ＋　そして５は正
常ヘモグロビンに起因するピークである。

実施例２ 疎水性架橋重合体としてジエチレングリコールジメタク
リレー）３００ｇ、そして溶媒としてトルエンに代えて
イソアミルアルコール２００ｇを用い。

実施例１に準じて疎水性架橋重合体粒子を得た。

さらに、アクリル酸の代わりにメタクリル酸５０ｇを用
い、８０℃で２時間反応させて実施例１と同様の操作法
によりポリマーゲル（充填剤）を調製した。

実施例１と同様の評価を行った結果、耐圧性については
１５０　ｋｇ／ｃｆｆｌまで圧力損失と流速とが比例し
た。膨潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリ
ン酸緩衝液から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えた場合
、カラム圧力の上昇は認められなかった。

さらに■京都第−科学製旧−＾ＵＴＯＡ、ｃでヒト血液
の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを第
２図に示す。

実施例３ この実施例では、疎水性架橋重合体粒子の調製に続いて
親水性単量体を反応させる連続した重合法を採用した。

スチレン１００ｇ、　　ジビニルベンゼン２００　ｇオ
ヨびベンゾイルパーオキサイド１ｇをトルエン２００ｇ
に溶解し、４％ポリビニルアルコール水溶液２．５１に
添加して、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下で８０
℃に加熱し懸濁重合を行った。８０℃で２時間重合した
後、アクリル酸５０ｇを添加し、さらに８０℃で２時間
重合し生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥
し２分級した。得られた微小のポリマーゲルを実施例１
と同様の方法で評価した。

耐圧性については１５０　ｋｇ／Ｃｒｌまで圧力損失と
流速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離液
を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍ１．！のリン酸
緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められなか
った。さらに■京都第−科学製ＨｉＪＵＴロＡｒｃでヒ
ト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラ
ムは第１図と同様であった。

比較例１ スチレン１００ｇ、　ジビニルベンゼン２００　ｇ　、
アクリル酸１５０ｇおよびベンゾイルパーオキサイド１
ｇをトルエン２００ｇに溶解し、４％ポリビニルアルコ
ール水溶＊２，５１に添加して、攪拌しながら調粒した
後、８０℃に加熱し懸濁重合した。８０℃で８時間重合
した後、生成物を実施例１と同様な操作により分級、充
填し評価した。

実施例１と同様の評価を行った結果、耐圧性については
ＢＱｋｇ／ａ＋！まで圧力損失と流速とが比例した。膨
潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩
衝液から２００　ｍＭのリン酸緩衝液に変えた場合、カ
ラム圧力が２０ｋｇ／ｃａ！上昇した。このように実施
例１の充填剤より耐圧性および耐膨潤性が劣ることが明
らかである。さらに■京都第−科学製）１ｉ−Ａ［ｌＴ
ＯＡｒｃでヒト血液の分析を行った。その結果得られた
クロマトグラムを第３図に示す。第２図と比較すると、
明らかに糖化ヘモグロビン類に対する保持力は弱く１分
離能が劣っている。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、高精度でかつ短時間のう
ちに糖化ヘモグロビンの定量がなされる。

末法を用いて、血液中の糖化ヘモグロビンを測定するこ
とにより、糖尿病の診断などが迅速かつ正確になされ得
る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、それぞれ実施例１．実施例２および
比較例１にふいて得られた充填剤をカラムに充填し、糖
化ヘモグロビンの分離を行なった際のクロマトグラムを
示す。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体クロマトグラフィーにより試料中の糖化ヘモグ
   ロビンを定量する方法であって、 該液体クロマトグラフィーに使用する充填剤が、疎水性
   架橋重合体粒子の表面部分に、アクリル酸および／また
   はメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重合
   体粒子でなる、 糖化ヘモグロビンの定量法。