JPS5818074B2 - α↓−サイクロデキストリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 従来、α−サイクロデキストリン（別名Ｓｃｈａｒｄ−
ｉｎｇｅｒ α−ｄｅｘｔｒｉｎ又はＣｙｃｌｏｈｅｘ
ａａｍｙｌｏｓｅ）は例えばＵ、Ｓ、Ｐ、３，６４０，
８３７号、特開昭５１−１２，９４１号、同５１＝１２
，９４２号、特公昭４６−２，３８０号及び特開昭５０
−２５，７４３号各公報、澱粉工業学会誌、第９巻、２
３頁（１９６１年）、Ｄｉｅ ５ｔａｒｋｅ、第８巻、
２８０頁（１９６３年）、京都府大学報・農、第２２巻
、１０６頁（１９７０年）、澱粉科学、第２２巻、６頁
（１９７５年）などに記載されているような方法で製造
されていた。

即ち、その生育の至適ｐＨを弱酸性から中性領域に有す
るバチルス（Ｂａｃｉｌ−１ｕｓ ）属の細菌、例えば
Ｂ、 ｍａｃｅｒａｎｓ ＋ Ｂ。

ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ｔ Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉ ｌｕｓ ＋ Ｂ。

ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどを培養して得られるサイクロ
デキストリン・グリコジルトランスフェラーゼ（以下Ｃ
ＧＴａｓｅと略す。

）を、テトラクロルエタン、トリクロルエチレン、ブロ
モベンゼン、フルオルベンゼン、アンスラセン、ｎ−デ
カノール、アセトン、エタノール、メタノールなどの有
機溶媒の存在下に澱粉に作用させるか、もしくは澱粉に
作用させた後上記有機溶媒を添加することにより、グル
コース分子゛６ケ、７ケ又は８ケからなるα−２β−２
γ−サイクロデキストリンとその他の高級サイクロデキ
ストリン類あるいは澱粉の枝分れ構造に由来するα−１
，６−グルコシド結合をもったいわゆる枝付きサイクロ
デキストリン類との混合物を反応系外に沈澱させ、この
沈澱物からさらに種々の有機溶媒を用いてα−サイクロ
デキストリンを分離精製するものである。

しかし、この方法では操作が非常に繁雑であるばかりで
なく、製品となるα−サイクロデキストリンの対基質当
りの収量も低く、かつ綿層的にも問題があり、β−サイ
クロデキストリン、゛γ−サイクロデキストリン及び枝
付きサイクロデキストリン類の完全な除去は困難であっ
た。

しかも、使用される中性細菌の生産するＣＧＴａｓｊは
温度及びｐＨに対する安定性を欠くものが多く、５０〜
５５℃以下、ｐＨ５〜７程度の温和な条件でしか作用さ
せられないために、雑菌による汚染を受けやすく容易に
腐敗現象を起した。

□本発明者らは、以上のような従来法の欠点
を改善すべく鋭意検討した結果、中性細菌が生産するＣ
ＧＴａｓｅとは基質特異性及び安定性が異なる好アルカ
リ性細菌の生産するＣＧＴａｓｅを用い、これを従来法
とは異なり、β−サイクロデキストリン１００部に対し
てグルコース及び／又はマルトース、マルトトリオース
等の直鎖オリゴ糖を２０〜８０部含有させてなる基質液
に、ｐＨ４〜１１の範囲で作用させることにより、反応
系に多量のα−サイクロデキストリンを蓄積させること
に成功した。

さらに後処理として未反応のβ−サイクロデキストリン
や内部相互変換（Ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）反
応の結果生成した微量のγ−サイクロデキストリンは、
バチルス属の細菌が生産する糖化型α−アミラーゼをα
−サイクロデキストリン生成反応後に作用させることに
より、完全にグルコース、マルトース及びマルトトリオ
ースにまで分解させることができた。

本発明法におけるこのようなβ−サイクロデキストリン
からα−サイクロデキストリンを生成する反応は、従来
から酵素の給源として用いられてきたバチルス・マセラ
ンスなどのＣＧＴ ａ ｓ ｅでは殆ど起らない。

又、本発明法における基質は従来法の澱粉とは異なりβ
−サイクロデキストリンとグルコース及び／又はマルト
ース、マルトトリオースなどの直鎖オリゴ糖との混合物
であることから、反応物中に枝付きサイクロデキストリ
ン類は生成しない。

そのため、本発明法によれば、後処理で用いる細菌糖化
型α−アミラーゼの作用が完全に行なわれて、β−サイ
クロデキストリン及びγ−サイクロデキストリンをグル
コース、マルトース、マルトトリオースに完全に分解す
ることが可能であり、α−サイクロデキストリン六これ
らの非環状糖質とのみからなる単純系にまですることが
できた。

従来法である澱粉からのα−サイクロデキストリン生成
反応の後処理として細菌糖化型α−アミラーゼを作用さ
せた場合には、枝付きα−サイクロデキストＩＪンが分
解不可能となり、反応は不完全となる。

この枝付きα−サイクロデキストリンは大部分がα−１
，６−グルコシル−α−サイクロデキストＩＪンもしく
はα−１，６−マルトシル−α−サイクロデキストリン
であり、グルコアミラーゼあるいはプルラナーゼ（澱粉
板切り酵素）でも分解不可能であることは既に報告され
ている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、 ３９．５２１（１９７１） ；ｃｅｒｅａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ４３゜１１１ （１９６６）
；Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ 、 １
３ ７ 、 ４８ ３（１９７０）など）。

これに対して、本発明による反応後の糖質は、従来法と
異なりα−サイクロデキストリンとグルコース、マルト
ース、マルトトリオースとのみからなる単純な組成であ
るから、問題となる有機溶媒の使用は１回で済むことに
なり、大幅なコストダウンが可能となるばかりでなく、
廃水処理などの公害対策上の問題点も殆どなくなる。

本発明に使用されるＣＧＴａｓｅの給牟である好アルカ
リ性のバチルス属細菌としては、例えば、特許第８８６
，５８３号明細書及び特公昭５３−３１，２２３号公報
に記載されているバチルス属４３８２菌（微工研菌寄第
６１４号）、同、４１３５菌（微工研菌寄第６１７号）
、同Ａ１６９菌（微工研菌寄・第６１８号）、同席１３
菌（微工研菌寄第６１１号）、同慮１７−１菌（微工研
菌寄第６１２号）及び特公昭５２−３１，９４９号公報
に記載されているバチルス・オーベンシス（微工研菌寄
第１．９９０号）などがあげられる。

上記のＣＧＴａｓｅの酵素活性は以下の方法により測定
した： ０．．０５％（Ｗ／Ｖ）のアミロースを含む０
．ＩＮ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．３１ｎｌに、蒸
留水で希釈した被験酵素液０．２ ｍｌを加えて４０℃
で１０分間反応させ、この反応液に０．２ Ｎ塩酸４ｍ
ｌを添加して反応を停止させた後、これに蒸留水４ｒｆ
Ｌｌを添加した調製液、並びに上記被験酵素液を予め加
熱して失活させたものを用いて上記と同様の操作で調製
したブランクの夫々に、０．０２％ヨード及び０．２
％ヨードカリを含むヨード液０．５罰を加え、これらに
ついて液層１ｃｒｒＬで７００ｍμの吸光度を測定して
、この吸光度を１０係減少させる酵素量を１単位とした
。

又バチルス・マセランス（ＩＦＯ３４９０）の生産する
ＣＧＴａｓｅは基質のｐＨを燐酸緩衝液によりｐＨ６，
０に調整して同様に測定した。

本発明の原料（基質）となるβ−サイクロデキストリン
とグルコース及び／又はマルトース、マルトトリオース
等の直鎖オリゴ糖（以下補助基質と言う。

）との混合比に関しては、β−サイクロデキストリン／
補助基質の比が５．以上になるとβ−サイクロデキスト
リンからのα−サイクロデキストリンへの内部相互変換
反応速度が非常に小となり、α−サイクロデキストリン
は殆ど生成しない。

上記比率が１，２５以下の場合は内部相互変換反応速度
は非常に犬となるが、ＣＧＴａｓｅの有するカップリン
グ（Ｃｏｕｐｌ ｉｎｇ ）作用によりα−サイクロデ
キストリンは殆ど生成せず、非環状糖質が多量に生成す
るので工業的に不利である。

本発明者らは、内部相互変換反応によるβ−サイクロデ
キストリンからのα−サイクロデキストリンへの生成条
件を鋭意検討した結果、β−サイクロデキストリンと組
み合せる補助基質としてグルコース及ヒ／又はマルトー
ス、マルトトリオース等の直鎖オリゴ糖が適しており、
β−サイクロデキストリン／補助基質の比が５以下で１
．２５以上の混合物がα−サイクロデキストリン生成反
応の基質に適していることを発見した。

又、本発明法を実施するさいの基質の濃度は１ｏ ％
（Ｗ／Ｖ ）以上、好ましくは２０〜３０％（Ｗ／Ｖ）
で行なうのがよい。

本発明法における酵素の基質への添加量は、β−サイク
ロデキス） ＩＪンと補助基質との合計（固形分）１ｇ
について、ＣＧＴａｓｅは５０〜３００単位、後処理の
糖化型α−アミラーゼは５〜３０単位程度が適当である
。

さらには、本発明の反応の第２段処理である細菌糖化型
α−アミラーゼ反応時にグルコアミラーゼを併用するこ
とにより、α−サイクロデキストリンとグルコースとの
混合系にまで単純化することも可能となることから、グ
ルコース吸着樹脂もしくはサイクロアキストリ４及着樹
脂（例えば特公昭４６−９，２２３号あるいは特開昭５
１−１３６，８８９号各公報に記載のもの。

）を用いて、有機溶媒を何ら使用することなくα−サイ
クロデキストリンを製造することも可能となる。

以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 １ １５％（Ｗ／Ｖ）のβ−サイクロデキストリン（日本食
品化工（ａ）製、商品名セルデツクスーＮ）と６％（Ｗ
／Ｖ）のグルコースとを含有する混合液１ｇに、好アル
カリ性細菌バチルスＡ３８−２菌の生産したＣＧＴａｓ
ｅの粉末（４万単位／ｇ）を２００単位／ｇ・固形分添
加してｐＨ７，Ｑ、温度６０℃で５０時間反応させた。

この反応液を１２０℃で５分間加熱してＣＧＴａｓｅを
変性失活させた後、これに細菌糖化型α−アミラーゼ（
大和化成（株）製、１万単位／７）を２０単位／ｇ・固
形分添加し、ｐＨ５，５、温度５０℃で２４時間反応さ
せて未反応のβ−サイクロデキストリン及び内部相互変
換反応で副生じた微量のγ−サイクロデキストリンを直
鎖オリゴ糖へ分解させた。

反応終了液中に含まれるα−サイクロデキスｌ−ＩＪン
の含量を、澱粉科学、第２５巻、第１号、第１９頁（１
９７８）年）に記載されている高速液体クロマトグラフ
ィー法に準じて測定した。

即ち、デュポン−島津製８３０型高速液体クロマト装置
を用い、カラム二日本つォーターズ社製マイクロバンド
パックＣＨ（４ｘ３ｏｏｍ）；溶媒：水／アセトニトリ
ルニブ２５ ／７５ （Ｖ／Ｖ ）の混合液；カラム温
度５０℃；流速１ｒＩＬｌ／分の条件で分析した。

その結果、液中に６．８ ％ （Ｗ／Ｖ）のα−サイク
ロデキストリンが生成し、未反応のβ−サイクロデキス
ｌ−ＩＪン及び副生したγ−サイクロデキスＩ−ＩＪン
は全て分解しノていることが認められた。

これは使用したβ−サイクロデキストリンの約４５係が
α−サイクロデキストリンに変化したことになる。

次に、上記の反応終了液に６］９のテトラクロルエタン
を添加し、室温で攪拌しながら３日間放装置した後、生
成したα−サイクロデキストリンの沈澱をＰ別分取し、
水蒸気蒸留に付して溶媒を除去した。

ついで活性炭脱色、沢過して得られたα−サイクロデキ
ストリン溶液を凍結乾燥して６１ｇのα−サイクロデキ
ストリンを得た。

？実施例 ２ １０ ％ （Ｗ／Ｖ）のβ−サイクロデキストリンと３
％（Ｗ／Ｖ）のマルトースとを含有する混合液２１に、
好アルカリ性細菌バチルス４１７−１菌の生産したＣＧ
Ｔａｓｅの粉末（３万単位／、！９）を２００単位／ｇ
・固形分添加してｐＨ１０，０、温度５５℃で５０時間
反応させた。

以下実施例１と同様な方法で細菌糖化型α−アミラーゼ
処理をしたところ、使用したβ−サイクロデキストリン
の約４１係がα−サイクロデキストリンに変換していた
。

反応□終了液に５（ｌのシクロヘキサンを添加し、室温
で攪拌しながら３日間放置してα−サイクロデキストリ
ンを沈澱させ、この沈澱を沢別し、水蒸気蒸留に付して
溶媒を除去した。

ついで活性炭脱色処理して得られたα−サイクロデキス
ｌ−ＩＪン溶液を凍結乾燥して７５ｇのα−サイクロデ
キストリンを得た。

実施例 ３ 実施例１における補助基質としてのグルコースに替えて
、予めプルラナーゼ（澱粉板切り酵素）とβ−アミラー
ゼきを用いて澱粉を加水分解して得たバイマルトースシ
ラツブ（固形分中グルコース３％、マルトース８６％１
その他の糖１１％）を添加した混合基質溶液を使用し、
酵素反応をｐＨ５，０とした以外は実施例１と同様に処
理反応させて、５７．９のα−サイクロデキストリンを
得た。

なお、上記バイマルトースシラツブは以下の方法で調製
した： ｐＨ６，０に調整した５％（Ｗ／Ｖ ）の馬鈴
薯澱粉懸濁液を１３０℃で３０分間加熱して均質に糊化
させ、５５℃に急冷し、これに３０単位／ｇ・澱粉のプ
ルラナーゼ粉末（ＡＢＭ社製、商品名プルザイム）と２
０単位／ｇ・澱粉のβ−アミラーゼ粉末（長瀬産業（株
）製）とを添加して６０時間糖化させた後、常法により
活性炭脱色・沢過を行った。

実施例 ４ １５％（Ｗ／Ｖ）のβ−サイクロデキストリンに対して
グルコースを夫々０％（Ｗ／Ｖ） 、 １．５ ％（Ｗ
／Ｖ）、３％（Ｗ／Ｖ）、 ８％（Ｗ／Ｖ）、１２％（
Ｗ／Ｖ） 、 １５％（Ｗ／Ｖ）及び２０％（Ｗ／Ｖ）
添加した混合溶液各１ｇを調製し、これらについて実施
例１と同一の操作条件で処理反応させた。

その結果、β−サイクロデキストリンからα−サイクロ
デキストリンへの変換率は夫々２係、８％。

３１係、４８％、２３％、３％及び０．２係であった。

即ち、１５ ｑｌｙ （Ｗ／Ｖ）のβ−サイクロデキス
トリフに対して３％（Ｗ／Ｖ）から１２％（Ｗ／Ｖ）（
７）グルコースを使用した場合にα−サイクロデキスト
リンへの変換率は犬であった。

実施例 ５ 実施例４におけるグルコースに替えてマルトースを使用
した以外は同側と同様に操作反応させた。

その結果、β−サイクロデキストリンからα−サイクロ
デキストリンへの変換率は夫々１．２％、６条、２８係
、４３％、２０係、１．７係及び０．１条であった。

即ち、この場合も１５％（Ｗ／Ｖ ）のβ−サイクロデ
キストリンに対して３％（Ｗ／Ｖ）から１２％（Ｗ／Ｖ
）のマルトースを使用した場合にα−サイクロデキスト
リンへの変換率は犬であった。

比較例 １ 実施例１で使用したＣＧＴａｓｅに替えてバチルス・マ
セランス（ＩＦＯ３４９０）の生産したＣＧＴａｓｅの
粉末（長瀬産業（株）製、１万年位／９）を２００単位
／ｇ・固形分使用し、液ｐＨを５６５とした以外は実施
例１と同様に処理反応させた。

その結果、わずかに６ｇのα−サイクロデキストリンが
得られただけであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス（Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ ）属に属し、生
   育の至適ｐＨをアルカリ側に有する好アルカリ性細菌を
   培養して得られるサイクロデキストリン・グリコジルト
   ランスフェラーゼ（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒ ｉｎ ｇｌ
   ｙｃ−ｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を、β−サ
   イクロデキストリン１００部に対してグルコース及び／
   又はマルトース、マルトトリオース等の直鎖オリゴ糖を
   ２０〜８０部含有する混合基質溶液に、ｐＨ４〜１１の
   範囲で作用させた後、該反応液にバチルス属の細菌を培
   養して得られる糖化型α−アミラーゼを作用させて未反
   応のβ−サイクロデキストリン及び副生じたγ−サイク
   ロデキストリンをグルコース、マルトース及び／又はマ
   ルトトリオースに分解させ、この分解液からα−サイク
   ロデキストリンを分離採取することを特徴とするα−サ
   イクロデキストリンの製造法。