JPS6361920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えDNA技術の分野、すなわちポ
リペプチドの製造に対して組換えDNA技術で用
いられる方法に関する。 より詳細には、本発明は、ヒト白血球由来の遺
伝子の発現により得ることができる成熟ヒト白血
球インタフエロンであつて、165−166個のアミノ
酸を有し、部分アミノ酸配列Cys−Ala−Trp−
Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−
Arg−Serを含み、かつ114位にアミノ酸ASp、
GluまたはValの一つを有し、このインタフエロ
ンの第一番目のアミノ酸のＮ末端にメチオニンが
結合している場合は、166−167個のアミノ酸を有
し、かつ115位にアミノ酸Asp、GluまたはValの
一つを有する成熟ヒト白血球インタフエロンの製
造にあたり、 (a)(i) 該成熟ヒト白血球インタフエロンのコード
領域を含む遺伝子を該コード領域内の末端近
くに位置する制限酵素切断部位で切断し、該
コード領域の5′−末端側を除いた遺伝子制限
断片を得る工程、 (ii) ATG翻訳開始コドンを有し、該コドンに
連続する塩基配列が前記工程(i)で除かれた
5′−末端側のコード領域と同じアミノ酸配列
をコードするDNA断片を調製する工程、 (iii) 該遺伝子制限断片と該DNA断片とを連結
し、ATG翻訳開始コドンに連なる該成熟ヒ
ト白血球インタフエロンコード領域を有する
遺伝子を構築する工程、及び (iv) 該遺伝子と遺伝子発現調節因子と自己複製
に不可な領域（ori）とを連続する工程 を組合せて微生物発現ビヒクルを構築し、 (b) 上記工程(a)で得た微生物発現ビヒクルで公知
方法により微生物を形質転換し、 (c) 得られた形質転換微生物を培地中で発育さ
せ、 (d) この形質転換微生物を溶解し、成熟ヒト白血
球インタフエロンをその他の微生物蛋白質から
分離精製することにより採取する ことを特徴とする成熟ヒト白血球インターフエロ
ンの製造方法に関する。 本発明の方法で得られる成熟ヒト白血球インタ
フエロンの特定例としては成熟ヒト白血球インタ
フエロン（LeIF）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ
およびＪがあげられる。これらの成熟ヒト白血球
インタフエロンのアミノ酸配列は21頁表３および
24頁表５に示すとおりである。すなわち、表３に
おけるLeIF Ａ、LeIF Ｂ、LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、
LeIF Ｆ、およびLeIF Ｈならびに表５における
ＩおよびＪの各アミノ酸配列からＳを付した番号
で示されるシグナルペプチドを除いた165個また
は166個のアミノ酸からなるポリペプチドおよび
これらのポリペプチドの第１番目のアミノ酸のＮ
末端にさらにメチオニンが結合して166個または
167個のアミノ酸からなるポリペプチドが本発明
の成熟ヒト白血球インタフエロンＡ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪである。 本発明の背景についてまず記載する。ヒト白血
球インタフエロン（LeIF）は、最初、アイザツ
クス（Isaacs）およびリンデンマン
（Lindenmann）により、きわめて粗な沈殿物と
して、発見されそして調製された（プロク．アー
ル．ソシ．（Proc.R.Soc.）B147、258−267
〔1957〕；米国特許（U.S.P.）3699222）。それを精
製し特徴づける努力は長く続けられ、正常または
白血病の提供者から得た白血球に由来する比較的
均一な白血球インタフエロンの調製にみちびいた
（ドイツ特許公報No.2947134）。これらのインタフ
エロンは、それらの標的細胞にウイルス抵抗性の
状態を付与する能力を有することの知られている
一群の蛋白質である。さらに、インタフエロン
は、細胞の増殖を阻止しそして免疫反応を調節す
るように作用しうる。これらの性質から、ウイル
スの感染および悪性腫瘍に白血球インタフエロン
を臨床的に用いることが促進された。 白血球インタフエロンは、本質的に均一な状態
に精製されルビンシユタイン（Rubinstein）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）76、640−644〔1979〕；
Zoon等、同上76、5601−5605〔1979〕）約17500か
ら約21000の範囲の分子量を有すると報告された。
これらの調製物の比活性は、きわめて高く、２×
10⁸から１×10⁹単位／mg蛋白質であるが、細胞培
養法よりの収量はおそろしく低い。しかし、蛋白
質の配列をきめる技術の進歩で、部分的アミノ酸
配列が決定された〔ゾーン（Zoon）等、サイエ
ンス（Science）207、527〔1980〕；レビイ
（Levy）等、プログ．ナトル．アガド．サイ．米
国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）77、5102−
5104〔1980〕）。種々の白血球インタフエロンのグ
リコシル化は、現在完全には明らかでないが、種
類間におけるグリコシル化の差のみでは、観察さ
れている分子量の分布を説明しえない。その代わ
りに、白血球インタフエロンは、種類に従いアミ
ノ酸組成および配列において著しく差があり、ア
ミノ酸の相同性は、場合により80％より低い。 提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付け
および限定された臨床的研究のための十分な量
の、均一な白血球インタフエロンを与えたけれど
も、それだけでは、大規模な臨床試験および広範
な予防的および（または）治療的使用に必要であ
るインタフエロンを提供するにはまつたく不十分
である。またに、ヒト白血球由来のインタフエロ
ンを抗腫瘍および抗ウイルスに用いる現在の臨床
試験では、粗（１％より低い）調整物を用いてお
り、実際的でない価格においてすら十分な量を生
産するに至らず、広範な領域での研究を遅らせて
来た。 しかし、組換えDNA技術の出現にともなつて、
有用なポリペプチドのきわめて多様な種類を、微
生物により調節生産することが可能になつた。す
でに、この技術により修飾をうけて、ソマトスタ
チン、ヒトインシユリンのＡおよびＢ鎖およびヒ
ト生長ホルモンのようなポリペプチド鎖を生産た
細菌が存在するに至つている。 イタクラ（Itakura）等、サイエンス
（Science）198、1056−1063〔1977〕；ゲデル
（Goeddel）等、ネーチヤー（Nature）281、544
−548〔1979〕）。より最近になつて、組換えDNA
技術が、プロインシユリンおよびチモシンアルフ
ア−１の生産を可能とし、さらに、なん人かの著
者は、ヒト白血球インタフエロンをコードする
DNAの採取および、その結果得られる、白血球
インタフエロン活性を有する蛋白質の生成につい
て報告しているナガタ（Nagata）等、ネーチヤ
ー（Nature）284、316−320〔1980〕；ナンテイ
（Nantei）等、ジエイン（Gene）10、１−10
〔1980〕；タニグチ（Taniguchi）等、ネーチヤー
（Nature）285、547−549〔1980〕）。 組換えDNA技術の工作室は、細菌および他の
微生物に存在し、しばしば、細胞中に多数のコピ
ーとして存在する、２重鎖DNAの非染色体性の
ループである、プラスミドである。プラスミド
DNA中にコードされる情報には、娘細胞中にプ
ラスミドを再生産するに必要な情報（つまり、
“レプリコン”）および、そして、ふつうは、１種
または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌
の場合では、抗生物質に対する抵抗性の情報があ
る。この情報により、対象とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを認識し、選択用の培
地中に優先的に発育さすことが可能となる。プラ
スミドが有用なのは、プラスミドDNA上の異な
る部位をそれぞれに認識する、ある種類または別
の種類の制限エンドヌクレアーゼまたは“制限酸
素”により、プラスミドが特異的に切断されうる
ということである。そのあとで、切断部位の両端
か、切断部位に接して再構築した末端をむすびあ
わすことにより、異質の遺伝子または遺伝子断片
をプラスミド中に挿入しうる。DNAの組換えは
細胞の外部で実施しうるが、生成する“組換え”
プラスミドは、形質転換と称される方法により細
胞内に導入され、その形質転換を発育さすことに
より、異質の遺伝子を含有する組換えプラスミド
をを大量に生産しうる。さらに、その異質遺伝子
が、プラスミド内のコードされるDNA情報の転
写および翻訳を支配する部分に関して正しく挿入
されるならば、生成する発現ビヒクルは、挿入さ
れた遺伝子のコードするポリペプチド配列を実際
の生成つまり発現と称されるプロセスに実際に使
用されうる。 発現は、DNAポリメラーゼにより認識されそ
れが結合する、プロモーターとして知られる領域
において開始される。ある場合には、たとえば、
本発明の実施において有利とされるトリプトフア
ンまたは“trp”プロモーターのような場合には、
プロモーター領域には、“オペレーター”領域が
重なり、結合された、プロモーター−オペレータ
ーとなつている。オペレーターは、特定のプロモ
ーターにおける転写開始の瀕度を調節する役割を
する、いわゆるリプレツサー蛋白質により認識さ
れるDNA配列である。RNAポリメラーゼは、
DNAに沿つて移動し、コード配列に含まれる情
報を、その5′末端から3′末端へと、メツセンジヤ
ーRNAに転写し、ついでそれは、DNAのコード
するアミノ酸配列を有するポリペプチドへと翻訳
される。それぞれのアミノ酸は、ヌクレオチドト
リプレツトまたは“コドン”によりコードされ
る。これらは、本発明の目的に関連して“構造遺
伝子”と称される部分、つまり、発現される生成
物のアミノ酸配列をコードする部分に存在する。
プロモーターに結合したあと、RNAポリメラー
ゼは、まず、リボゾーム結合部位をコードするヌ
クレオチドを転写し、ついで、翻訳開始または
“開始シグナル”（ふつうはATGで、得られるメ
ツセンジヤRNAではAUGとなる）を、ついで、
構造遺伝子自体に存在するヌクレオチドコドンを
転写する。構造遺伝子の端においていわゆる停止
コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼ
が、メツセンジヤーRNAの付加配列を形成する
ことがあつても、停止シグナルが存在するので、
リボゾームにより翻訳されないままとなる。リボ
ゾームは、ふつう、mRNAが形成されつつある
細菌においてはメツセンジヤーRNA上にある特
定の接合部位に結合する。そして、翻訳の開始シ
グナルに始まり、前記した停止したシグナルで終
了する、コードされたポリペプチドを生ずる。リ
ボゾーム結合部位をコードする配列が、AUG開
始コドンに関して適切に位置し、そして、残りの
コドンのすべてが、インフエース（in phase）に
開始コドンに従うならば、所望の生成物が生産さ
れる。得られた生成物は、宿主細胞を融解させ、
適当な精製法により他の細菌蛋白質より生成物を
採取することによりうることができる。 我々は、組換えDNA技術（つまり、インタフ
エロン遺伝子を微生物発現ビヒクルに挿入し、微
生物遺伝子調節要素の制御下にそれらを発現させ
ること）の利用が、大量の白血球インタフエロン
を提供するもつとも有効な方法と考えた。それは
ヒト由来の材料に特微的なグリコシル化の特性を
欠如するけれども、広範囲に及びウイルスおよび
新生物による病気の治療に用いられるであろう。 本発明の第１の白血球遺伝子を採取する方法は
次の各段階からなる。 (1) 均一な状態に精製されたヒト白血球インタフ
エロンの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミ
ノ酸配列をコードしうる、可能なヌクレオチド
の組合わせのすべてを表わす、集合体としての
コドンを含む、合成DNAプローブのセツトを
構成する。 (2) 誘導されたメツセンジヤーRNAから相補
DNA（cDNA）を含有する細菌コロニーバンク
を調製する。放射ラベルされた別の誘導
mRNAを、このバンクからのプラスミド
cDNAとハイブリドとする。ハイブリドとした
mRNAを溶出し、卵母細胞分析でインタフエ
ロンへの翻訳について試験する。このようにし
て、インタフエロン活性を誘導することが示さ
れたコロニーよりのプラスミドDNAを、上記
(1)のように製造したプローブに対するハイブリ
ド形成について試験する。 (3) 上記(2)の工程と平行して、プラスミド中の誘
導されたmRNAに由来するcDNAを用いて、
別の形質転換コロニーバンクを用意する。(1)の
プローブをハイブリド化プローブとして用いる
ための放射ラベル１本鎖cDNAの合成を誘起す
るのに用いた。合成プローブは鋳型としての
mRNAとハイブリドを形成し、逆転写により
拡大されて、誘導された、放射ラベルcDNAを
形成する。このようにして得られた放射ラベル
cDNAに対してハイブリド化されたコロニーバ
ンクよりのクローンについてさらに調べて、完
全長のインタフエロンコード遺伝子の存在を確
かめる。(1)または(2)で得られる部分長の推定さ
れる遺伝子断片も、それら自体、完全長遺伝子
のプローブに用いうる。 (4) 上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペ
プチドの微生物による発現を妨げるかも知んな
いリーダ（leader）配列があれば、それを除
き、そして、微生物プロモーターの開始シグナ
ルおよびリボゾーム結合部位に関して、発現ビ
ヒクル中に適当に位置することを可能とするよ
うに、合成DNAを用いて、仕立上げられた。
発現されたインタフエロンは精製して、その特
性を確認し、活性を測定する。 (5) 上記の方法で調製したインタフエロン遺伝子
断片それ自体は、他の部分に相同な白血球イン
タフエロン種のハイブリド化によるプローブに
用いられる。 上記に概要を示した組換えDNA技術を応用す
ることにより、相当する先行配列またはその一部
分を本質的にともなわない、成熟ポリペプチドと
しての１群の相同的な白血球インタフエロン（グ
リコシル化されていない）を、高収量、高純度
で、微生物的に生産することが可能となつた。こ
れらのインタフエロンは、動物およびヒトのウイ
ルスおよび悪性腫瘍疾患に用いる適当なレベルま
で、直接発現させ、採取し、そして精製すること
ができる。このように発現された、１群のインタ
フエロンはイン ビトロ試験で有効であることが
示され、そして、微生物的に生産された最初の白
血球インタフエロンとして、イン ビボの試験で
も、始めて、有効なことが示されたのである。 本明細書中で用いられる“成熟ヒト白血球イン
タフエロン”の用語は、グリコシル基を欠如す
る、微生物的（たとえば、細菌的に）生産される
インタフエロンを意味する。本発明の成熟白血球
インタフエロンは天然生成物の第１のアミノ酸コ
ドンのすぐ前にある翻訳開始シグナル（ATG）
より直ちに発現される。従つて、この“成熟”ポ
リペプチドはその配列中に第１のアミノ酸として
メチオニン（ATGがコードする）を含有するが、
本質的にその特性は影響されない。他方、微生物
宿主は翻訳生成物を加工して、最初のメチオニン
を除きうる。成熟白血球インタフエロンは、通常
のリーダー以外の接合蛋白質と一緒に発現されう
るが、この接合物は、細胞外または細胞内の環境
において特異的に除去しうる（英国特許公報No.
2007676Aをみよ。）最後に、成熟インタフエロン
は、接合物を細胞壁まで輸送する、微生物“シグ
ナル”ペプチドとの接合物として生産されうる。
細胞壁においてシシグナルは処理してはづされ、
成熟ポリペプチドが分泌される。 成熟白血球インタフエロンの“発現”とは、ヒ
ト白血球インタフエロンゲノムのmRNA翻訳に
直接に結果する、グリコシル基または先行配列を
含有しないインタフエロン分子の細菌または他の
微生物による生産を意味する。 特定の白血球インタフエロン蛋白質は、ここで
は、決定されたDNA遺伝子（表２および表４）
および演繹的に定められるアミノ酸配列（表３お
よび表５）により定義される。これらの特定のイ
ンタフエロン、実際ここに含まれるすべての群の
白血球インタフエロンタンパク質に対して、天然
の対立遺伝子変更（allelic variation）が存在
し、個体間にもおこりうる。これらの変異は、配
列全体におけるアミノ酸の相異または、配列中の
アミノ酸の欠落、置き代え、挿入、反転または追
加として表われる。本明細書で対象とする各イン
タフエロン、標示されたLeIF ＡからLeIF Ｊに
ついて、そのような、対立遺伝子変異は、標示の
範囲内または、その定義内に含まれ、従つて、本
発明の範囲内に含まれるとする。 つぎに、表および図について説明する。 【表】 【表】 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TGAGCCTAAACCTTAGGCTCACCCATT
TCAACCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACAATGGCCTTGACCTTTGC
TTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGC
LeIF B
TACTAGCTCAGCAGCATCC
GCAACATCTACAATGGCCTTGACTTTTTATTTAATGGTGGCCCTAGTGGT
GC
LeIF C
CAAGGTTATCCATCTCAAGTAGCCTAGCAATATTTGCAACATCCCAATG
GCCCTGTCCTTTTCTTTACTTATGGCCGTGCTGGTGC

LeIF D CAAGGTTCAGAGTCA
CCCATCTCAGCAAGCCCAGAAGTATCTGCAATATCTACGATGGCCTCGCC
CTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGC
LeIF E




LeIF F

ACATCCCAATGGCCCTGTCCTTT
TCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGC
LeIF G


LeIF H CCAAGGTTCAGTGTTACCC
CTCATCAACCAGCCCAGCAGCATCTTCGGGATTCCCAATGGCATTGCCCT
TTGCTTTAATGATGGCCCTGGTGGTGC
60
80 100
120 140
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGG
GCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATG
CTCCTGGCACAGATGAGGAAAAT
LeIF B TCAGCTACAAGTCATTCAGCTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACTCACAGCCTGGGTAACAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGCACAAATGCGAAGAAT
LeIF C TCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTCGGTAATAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGGACAAATGGGAAGAAT
LeIF D TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGG
GCTGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATG
CTCCTGGCACAAATGAGCAGAAT
LeIF E
CTGCCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGGCCCACAGCGTGGGTA
ACAGGAGGGCCTTCATACTCCTGACACAAATGAGGAGAAT
LeIF F TCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGCACAAATGGGAAGAAT
LeIF G




LeIF H TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGG
GCTGTAATCTGTCTCAAACCCACAGCCTGAATAACAGGAGGACTTTGATG
CTCATGGCACAAATGAGGAGAAT
160
180 200
220 240
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAG
ACATGACTTTGGATTTCCC CAGGAGGAGTTT GGCAACCAGTT
CCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCT
LeIF B CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGAATTCCCC CAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF C CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGATTTCCGAATCCCC CAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF D CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAG
ACATGACTTTGGATTTCCC CAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCCAGCTATCTCCCTCCT
LeIF E CTCTCCTTTTTCTTACCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGATTTTCCATCATCAGGTGTTTCATGGCAACCACTTCCAG
AAGGTTCAAGCTATCTTCCTTTT
LeIF F CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGGATTCCCC CAAGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF G
CATGACTTTGGATTTCCT C
AGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTC
CT
LeIF H CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGAATTTCCC CAGGAGGAATTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAAGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
260
280 300
320 340
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A CCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAG
ACAAATTCTACACTGAACTCTAC
LeIF B CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
CCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTTGGATGAGACCCTTCTAG
ATGAATTCTACATCGAACTTGAC
LeIF C CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAG
AAAAATTTTCCACTGAACTTTAC
LeIF D CCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAA
CCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAG
ACAAATTCTGCACCGAACTCTAC
LeIF E CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAA
CCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGATACTTGGGATGAGACCCTTTTAG
ACAAATCCTACACTGAACTTTAC
LeIF F CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAG
AAAAATTTTCCACTGAACTTAAC
LeIF G CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGATGAGACACTTCTAG
ACAAATTCTACACTGAACTTTAC
LeIF H CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGAACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAG
AAAAATTCTACATTGAACTTTTC
【表】 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTC
CATTCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF B CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGTCCTG
TGTGATCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCTCCCCTGATGTACGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF C CAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGT
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF D CAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGT
GTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGTGGACTC
CATCTTGGCTGTGAAGAAATACT
LeIF E CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATGTAGAAGGTTGGAGTGGAAGAGACTCCCCTGAGGAATGTGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGAAAATACT
LeIF F CAGCAGCTGAATGACATGGAAGCCTGC
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTC
CATCTTGGCTGTGAAGAAATACT
LeIF G CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTAT
GATGCAGGAGGTTGGAGTGGAAGACACTCCTCTGATGAATGTGGACTCTA
TCCTGACTGTGAGAAAATACT
LeIF H CAGCAAATGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAAGAAATACT
460
480 500
520 540
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCTTTTTCTTTGTCAACAAA
LeIF B TCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCTCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATCAATCAA
LeIF C TCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATAG
AGAGGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
ASATCCCTCTCGTTTTCAACAAA
LeIF D TCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCCTCTCTTTATCAACAAA
LeIF E TTCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAA
AGAAGAAGTATAGCCCTTGTTCCTGGGAGGCTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATGAACGAA
LeIF F TCCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCTTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATCAAAAAT
LeIF G TTCAAAGAATCACCCTCTATCTGACAGAG
AAGAAATACAGCCCTTGTGCATGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAG
ATCCTTCTCTTTATCAGCAAA
LeIF H TCCAAAGAATCACTCTTTATCTGATGG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTTTCAACAAA
560
580 600
620 640
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A CTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGA
ATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGC
TCACCTTTTTATGATCTGCCATT
LeIF B CTTGCAAAAAAGATTGAAGAGTAAGGA
ATGAGACCTGGTACAACACGGAAATGATTCTCATAGACTAATACAGCAGT
CTACACTTTGACAAGTTGTGCTC
LeIF C CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGA
TTGAAAACTGGTTCAACATGGCAATGATCCTGATTGACTAATACATTATC
TCACACTTTCATGAGTTCTTCCA
LeIF D CTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATAATATCTGGTCCAACATGAAAACAATTCTTATTGACTCATACACCAGG
TCACGCTTTCATGAATTCTGTCA
LeIF E CTTGCAGGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGAGAAACATTTCCATGATTAATACA
TCATCTCACACATTCATGAATTC
LeIF F TTTTCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATGAAACCGTTTCAACATGGAAATGATCTGTATTGACTAATACACCAGTC
CACACTTCTATGACTTCTGCCAT
LeIF G CTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAAT
GAAAACTGGTTCAACATCGAAATGATTCTCATTGACTAGTACACCATTTC
ACACTTCTTGAGTTCTGCCGT
LeIF H CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGA
TTGAAAACTGGTTCATCATGGAAATGATTCTCATTGACTAATACATCATC
TCACACTTTCATGTTCTTCCATT
660
680 700
720 740
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TCAAAGACTCATGTTTCTGCTATGACC
ATGACACGATTTAAATCTTTTCAAATGTTTTTAGGASTATTAATCAACAT
TGTATTCAGCTCTTAAGGCACTA
LeIF B TTTCAAAGACCCTTGTTTCTGCCAAAA
CCATGCTATGAATTGAATCAAATGTGTCAAGTGTTTTCAGGAGTGTTAAG
CAACATCCTGTTCAGCTGTATGG
LeIF C TTTCAAAGACTCACTTCTATAACCACG
ACGCGTTGAATCAAAATTTTCAAATGTTTTCAGCAGTGTAAAGAAGTGTC
GTGTATACCTGTGCAGGCACTAG
LeIF D TTTCAAAGACTCTCACCCCTGCTATAA
CTATGACCATGCTGATAAACTGATTTATCTATTTAAATATTTATTTAACT
ATTCATAAGATTTAAATTATTTT
LeIF E TGCCATTTCTCATTTTTGCTATATCCA
TGACATGAGTTGAATCAAAATTTTAAAATGTTTTCAGGAATGTTAAGCAG
CATCATGTTCAGCTGTACAGGCA
LeIF F TTCAAAGACTCATTTCTCCTATAACCA
CCGCATGAGTTGAATCAAAATTTTCAGATCTTTTCAGGAGTGTAAGGAAA
CATCATGTTTACCTGTGCAGGCA
LeIF G TTCAAATATTAATTTCTGCTATATCCATG
ACTTGAGTTGAATCAAAATTTTCAAACGTTTCACACGTGTTAAGCAACAC
TTCTTTAGCTCCACAGGGACA
LeIF H TCAAAGACTCACTTCTATAACCACCAC
AAGTTGAATCAAAATTTCCAAATGTTTTCAGGAGTGTTAAGAAGCATCGT
GTTTACCTGTGCAGGCACTAGTC
【表】 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A GTCCCTTACAGAGGACCATGCTGACTG
ATCCATTATCTATTTAAATATTTTTAAAATATTATTTATTTAACTATTTA
TAAAACAACTTATTTTTGTTCAT
LeIF B GCACTAGTCCCTTACAGATGACCATGC
TGATGGATCTATTCATCTATTTATTTAAATCTTTATTTAGTTAACTACTA
TAGGGACTTAAATTAGTTTTGTT
LeIF C TCCTTTACAGATGACCATTCTGATGTC
TCTGTTCATCTTTTGTTTAAATATTTATTTAATTATTTTTAAAATTTATG
TAATATCATGAGTCGCTTTACAT
LeIF D TGTTCATATAACGTCATGTGCACCTTT
ACACTGTGGTTAGTGTAATAAAACATGTTCCTTATATTTACTC〓poly(
A)

LeIF E CTAGTTCCTTACGGATGATCATGCTGA
TGGATCTGTTTATCTATTTGTCTAAATAATTATTTAACTATTTATAATAT
TTAAAATCTTCTTTTCATGTATC
LeIF F CTAGTCCTTTACAGATGACCATGCTGA
TAGATCTAATTATCTATCTATTGAAATATTTATTTATTTATTAGATTTAA
ATTATTTTTGTCCATGTAATATT
LeIF G AAATCTTTACAGATGATCATGCCAATCTA
TCTATTCTATCTATTTATCTATCTGTCTGTCTTCTATCTAATCTATTTAA
ATATTTATTTATTTATAAGAT
LeIF H CTTTACAGATGACCATTCTGATGTCTC
CTTTCATCTATTTATTTAAATATTTATTTATTTAACTATTTTTATTATTT
AAATTATTTTTTATGTAATATCA
860
880 900
920 940
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A ATTACGTCATGTGCACCTTTGCACAGT
GGTTAATGTAATAAAATATGTTCTTTGTATTTGGT〓poly(A)


LeIF B CATATTATATTATGTGAACTTTTACAT
TGTGAATTGTGTAACAAAAACATGTTCTTATATTTATTATTTTGCCATGT
TTATTAAATTTTTACTATGAAAA
LeIF C TGTGGTTAATGTAACAATATATGTTCT
TCATATTTAGCCAATATATTAATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATA
C〓poly(A)
LeIF E ATGTATTTTTACTTTGTGGTTAATATA
ACAACACATGTTCTTTATATTTAGTCAATATATTACTTTGCTTTTTTCAT
TAAATTTTTACTATGG〓poly(A)
LeIF F ATGTGTACTTTTACATTGTGTTATATC
AAAATATGTTAATCTAATATTTAGTCAATATATTATTTTCTTTTTATTAA
TTTTTACTATTAAAACTTCTTAT
LeIF G TTAAATTATTTTAAACTTATGTTTGTT
CAGGTAATATTACATCCACCTTACTTTGTGGCTAATATAATAAAATATGT
TCTTTATGTTTTGTC〓poly(A)
LeIF H TGAGTACCTTTACATTGTGGTTAATGTAA
CAAATATGTTCTTCATATTTAGCCAATATATTAATTTCCTTTTTCATTAA
ATTTTTACTAT〓poly(A)
960
980 1000

〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓
LeIF B AATTCTTTATTTATTCTTTAAAATTGA
ACTCCAACCCATGAATTGTGCAAACTGATTAAAGAATGGATGGT〓poly
(A)
LeIF F ATTATTTGGTTATTCTTTAATAAAGAA
ATTCCAAGCCC〓poly(A)


【表】 〓 〓
〓 〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A M A L T F A L L V A L L V L
S C K S S C S V G C D L P Q T H S
L G S R R T L M L L A Q M R K I
S L F S C L K D R H D F G F P Q
LeIF B M A L T F Y L M V A L V V L
S Y K S F S S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L A Q M R R I
S P F S C L K D R H D F E F P Q
LeIF C M A L S F S L L M A V L V L
S Y K S I C S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L G Q M G R I
S P F S C L K D R H D F R I P Q
LeIF D M A S P F A L L M V L V V L
S C K S S C S L G C D L P E T H S
L D N R R T L M L L A Q M S R I
S P S S C L M D R H D F G F P Q
LeIF E
L P L G C
D L P Q A H S V G N R R A F I L L
T Q M R R I S P F S Y L K D R H D
F D F P H
LeIF F M A L S F S L L M A V L V L
S Y K S I C S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L A Q M G R I
S P F S C L K D R H G F G F P Q
LeIF G



H D F G F P
Q
LeIF H M A L P F S L M M A L V V L
S C K S S C S L G C N L S Q T H S
L N N R R T L M L M A Q M R R I
S P F S C L K D R H D F E F P Q
All M A F L
V L S K S S G C L
T H S L R R L L
Q M I S S C L D
R H D F P Q
50 60
70 80
90 100
〓
〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A E E F 〓 G N Q F Q K A E T I
P V L H E M I Q Q I F N L F S T
K D S S A A W D E T L L D K F Y T
E L Y Q Q L N D L E A C V I Q G
LeIF B E E F D D K Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A A L D E T L L D E F Y I
E L D Q Q L N D L E V L C D Q E
LeIF C E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A A W E Q S L L D K F S T
E L Y Q Q L N D L E A C V I Q E
LeIF D E E F D G N Q F Q K A P A I
S V L H E L I Q Q I F N L F T T K
D S S A A W D E D L L D K F C T
E L Y Q Q L N D L E A C V M Q E
LeIF E Q V F H G N H F Q K V Q A I
F L F H E M M Q Q T F N L F S T K
D S S D T W D E T L L D K S Y T
E L Y Q Q L N D L E A C V M K
LeIF F E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A T W E Q S L L E K F S T
E L N Q Q L N D M E A C V I Q E
LeIF G E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A T W D E T L L D K F Y T
E L Y Q Q L N D L E A C M M Q E
LeIF H E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M M Q Q T F N L F S T K
N S S A A W D E T L L E K F Y T
E L F Q Q M N D L E A C V I Q E
All E E F D Q F Q K A
I V L H E Q Q F N L
F T S S A L
L F E L Q Q N D
E Q
110 120
130 140
150 160 166
〓
〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A V G V T E T P L M K E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L K E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S T N L Q E S L R S K E
LeIF B V G V I E S P L M Y E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S S C A W E V V R A E I M R
S F S L S I N L Q K R L K S K E
LeIF C V G V E E T P L M N E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L I E R
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S L S F S T N L Q K R L R R K D
LeIF D E R V G E T P L M N V D S I
L A V K K Y F R R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S L S L S T N L Q E R L R R K E
LeIF E V G V E E T P L R N V D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L T K K
K Y S P C S W E A V R A E I M R
S F S L T N L Q E R L R R K E
LeIF F V G V E E T P L M N V D S I
L A V K K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S K I F Q E R L R R K E
LeIF G V G V E E T P L M N V D S I
L T V R K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S A N L Q E R L R R K E
LeIF H V G V E E T P L M N E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L M E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S F S T N L Q K R L R R K D
All V P L M
D S I L V K Y F R I T L Y
L E K Y S C A W E V V R
A E I M R S S S Q
L K
【表】 【表】 【表】 表１は、Ｔ−１およびＴ−13と称される、ヒト
白血球より分離されそして均一に精製された、す
べての種類のインタフエロンに共通の２つのアミ
ノ酸配列を示す。これらのペプチドをコードする
可能なmRNA配列のすべておよび対応するDNA
配列を示す。Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵの文字は、
それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシ
ンおよびウラシルの塩基を含有するヌクレオチド
を示す。文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよ
びＵのいずれかを示す。ポリヌクレオチドは、
5′（左側）から3′（右側）の方向に読むように記載
されている。そして、２重鎖（“d.s.”）DNAを示
す時には、下側またはコード鎖については、順序
は逆となる。第１図は、可能性のあるLeIFプラ
スミドと ³²p−ラベル合成デオキシオリゴヌクレ
オチドとのハイブリド化を示すオートラジオグラ
ムである。 第２表は、それぞれ、“Ａ”から“Ｈ”までの
記号を付されている、白血球インタフエロンの発
現のために候補として分離された８個の遺伝子断
片のヌクレオチド配列（コード鎖）を示す。それ
ぞれのLeIFによつて、ATGの翻訳開始コドンお
よび終止トリプレツトが下線で示されている。停
止コドンまたは終止コドンに続いて3′の未翻訳領
域が示されている。含まれているLeIF Ａの全遺
伝子長には、表２の第３列Ａラインに示されるよ
うに、他のコドンには存在するひとつのコドンが
欠如している。5′非翻訳域がリーダー配列に先行
している。分離したままの断片Ｅには、リーダー
の完全な先行配列は存在しない。しかし、仮定さ
れる成熟LeIF Ｅに対する全遺伝子を含有する。
分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完全で
ない。 表３では、ヌクレオチド配列より示される８個
のLeIF蛋白質配列を比較している。IUPAC−
LUBコミツシヨン オン バイオケミカル ノ
ーメン カルチヤー（Commission on
Bicchemical Nomepclature）の提案による１文
字省略が用いられている。つまり、アラニンはＡ
で、システインはＣで、アスパラギン酸はＤで、
グルタミン酸はＥで、フエニルアラニンはＦで、
グリシンはＧでヒスチジンはＨで、イソロイシン
はＩで、リジンはＫで、ロイシンはＬで、メチオ
ニンはＭ、アスパラギンはＮで、プロリンはＰ
で、グルタミンはＱで、アルギニンはＲで、セリ
ンはＳ、スレオニンはＴで、バリンはＶで、トリ
プトフアンはＷで、チロシンはＹで表わす。数は
アミノ酸の位置を示す。Ｓはシグナルペプチドを
示す。165個のアミノ酸配列であるLeIF Ａ配列
中の44位のダツシユは、このLeIF Ａ配列を他の
LeIFの166個のアミノ酸配列と一列にそろえるた
めに入れてある。LeIF Ｅの配列は、そのコード
領域の余分のヌクレオチド（表２の位置187）を
無視して定められている。星印は、インフエース
にある終止コドンを示す。すべてのLeIFに共通
のアミノ酸（プソイド遺伝子LeIF Ｅを除く）も
また示されている。アンダーラインした残基は、
ヒト線維芽インタフエロンにも存在するアミノ酸
である。 第２図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型
（ＡからＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図
を示す。ハイブリドプラスミドは、dC：dGテー
リング法（ゴデル（Goeddel、D.V.）等、ネーチ
ヤー（Nature）287、411−416〔1980〕）により構
築された。 それで、cDNA挿入物は、Pst を用いて切
断しうる。各cDNA挿入物の末端のラインは、側
面に接するホモ重合dC：dGテールを示す。Pvu
、EcoRおよびBgl の制限部位も示し
てある。濃い領域は成熟LeIFのコード配列を示
す。斜線の部分はシグナルペプチドコード配列で
ある。白い部分は3′および5′非コード配列であ
る。 第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成を
コードする遺伝子の構築を示す。制限部位および
残部が示されている（“Pst ”等）。“b.p.”は
塩基対を示す。 第４図および第５図は、LeIF Ｂ成熟白血球イ
ンタフエロンを発現するに用いられる２つの遺伝
子断片の制限地図を示す。示したコドン配列は、
示した２つの場合について制限酵素Sau ３ ａ
で消化することで生成するコード鎖末端である。 表４および表５は、タイプＩおよびＪを含め
た、５個のLeIF蛋白質の配列のDNAおよびアミ
ノ酸（省略符号については、第３表に同じ）を示
す。第５表において、星印は対応するDNA配列
における終止コドンを示し、ハイフエンは配列に
おける欠落またはギヤツプを示す。 つぎに、本発明を実施するための有利な具体例
を示す。 Ａ 使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つ
まり、米国特許（U.S.P.）4.190.495記載のイ
ー．コリ（E.coli）×1776およびイー．コリ
（E.coli）Ｋ−12 294株（エンドＡ、thi^-、
hsr^-、hsm⁺ _k、英国特許公報No.2055382に記載）
を用いている。それぞれ、ザ アメリカン タ
イプ カルチヤー コレクシヨン（the
American Type Culture Collection）に寄託
され、ATCCNo.31537および31446（ブタペスト
条約による国際寄託に基づく受託番号31446）
が付されている。組換えDNAの実験のすべて
は、ナシヨナル インスチチユート オブ ヘ
ルス（National Institute of Health）の該当
するガイドラインに従つて実施された。 本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義
の菌株イー．コリ（E.coli）×1776およびイー．
コリ（E.coli）Ｋ−12菌株294のみならず、他
の既知のイー．コリ（E.coli）株（以下E.coli
で示す）たとえばE.coli Ｂを含めたE.coliおよ
び他の微生物株に関連して記載してゆくが、こ
れらの多くは、ザ アメリカン タイプ カル
チヤー コレクシヨン（the American Type
Culture Collection）（ATCC）のような、知
られている微生物寄託施設に寄託されており入
手可能である。ドイツ特許2644432もみられた
い。これらの他の微生物には、バチルス
（Bacillus）たとえばバチルス サブチリス
（Bacillus Subtilis）および他の腸内細菌たと
えばサルモネラ チフイムリウム
（Salmonella typhimurium）およびセラチア
マルセセンス（Serratia marcescens）があ
り、異質遺伝子配列を発現しうる、複製しうる
プラスミドを使用する。酵母たとえばサツカロ
スマイセス セレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）もまた、酵母プロモーターの制御
下に、インタフエロンをコドンする遺伝子を発
現させることによるインタフエロン蛋白質の製
造に用いて有利でありうる。 Ｂ LeIF mRNAの原料および精製 LeIF mRNAはヒト白血球より採取しうる。
ふつうは、ドイツ特許No.2947134に記載のよう
に、センダイ（Sendai）ウイルスまたはニユ
ーカツスル（Newcastle）病ウイルスでインタ
フエロンを生産するように誘導した慢性骨ずい
性白血病患者の白血球より得たものを使用す
る。特に有利な、本明細書の仕事に用いられる
原料は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来す
るKG−１と称するセルラインである。このセ
ルラインは、コフラー（Koeffler、H.P.）およ
びゴルデ（Golde、D.W.、）サイエンス
（Science）200、1153（1978）に記載されている
ように、〔ロースウオル パーク メモリアル
インスチチユートRPMI（Rosewall Park
Memorial Institute）〕1640プラス10％熱不活
化FCS（牛胎児血清、25mM HEPES緩衝液
（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−
N′−２−エタンスルホン酸）および50μｇ／ml
のゲンタマイシン含有培地に容易に発育し、１
週間に２度、継代培養（１から３スプリツト）
しうる。上記の発育培地に10％ジメチルスルホ
キサイドを加えて、細胞は凍結させうる。KG
−１は、ザ アメリカン タイプ カルチヤー
コレクシヨン（the American Type
Culture Collection）（ATCCNo.CRL8031）に
寄託されている。 KG−１細胞は、ルビンステイン
（Rubinstein）等記載の方法プロク．ナトル．
アカド．サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.）76、640−644〔1979〕）により、センダイ
（Sendai）またはニユーカツスル
（Newcastle）病ウイルスを用い、白血球イン
タフエロンmRNAを生産するように誘導され
た。細胞は、誘導後５時間に採取しRNAを、
グアニジンチオシアネート−グアニジン塩酸塩
法（チヤーウイン（Chirgwin）等、バイオケ
ミストリイ（Biochemistry）18、5294−5299
〔1979〕）により調製した。誘導しない細胞から
のRNAも同様に調製した。オリゴデオキシチ
ミジン（dT）−セルローズクロマトグラフイー
およびスクロースグラジエント超遠心を用い
て、ポリ(A)mRNAの12S分画を得た。方法は、
グリーン（Green）等（アーク．バイオケミ．
バイオフイス（Arch.Biochem.Biophys.）172、
74−89〔1976〕）およびオクユマ（Okuyuma）
等（アーチ．バイオケミ．バイオフイス．
（Arch.Biochem.Biophys.）188、98−104
〔1978〕）の方法を用いた。このmRNAは、ア
フリカツメガエル卵母細胞分析（カバリーリ
（Cavalieri）等、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）74、
3287−3291〔1977〕）で8000−10000単位／マイ
クログラムのインタフエロンタイターを示す。 Ｃ LeIF cDNA配列を含有するコロニーバンク
の調製 5μｇのmRNAを用い、標準方法ウイケンス
（Wickens）等、ジエイ．バイオ．ケミ．（J.
Biol.Chem.253、2483−2495〔1978〕およびゴ
デル（Goeddel）等、ネーチヤー（Nature）
281、544−548〔1979〕）により、２重鎖cDNA
を調製した。cDNAは６％ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動により、大きさに従つて分
画し、500から1500b.p.の大きさの材料230nｇ
を、電気溶出により得た。このcDNAの100n
ｇ分を、デオキシシチジン（dC）残基でテー
リングし（チヤング（Chang）等、ネーチヤー
（Nature）275、617−624〔1978〕、Pst 部位
においてデオキシグアノシン（dG）残基でテ
ーリング（tailing）した470nｇのプラスミド
pBR322とアニーリングし（ボリバー
（Bolivar）等、ジエイン（Gene）２、95−113
〔1977〕）、これを用いてE.Coli×1776を形質転
換した。cDNAnｇについて約130個のテトラ
サイクリン抵抗性で、アンピシリン感受性の形
質転換株を得た。 第２の同様の実験では、cDNAnｇについ
て、約1000個のテトラサイクリン抵抗性で、ア
ンピシリン感受性のE.coli Ｋ−12株294の転換
株を得た。この場合、600から1300b.p.の範囲
の、サイズにより分画したcDNA材料を、電気
溶出により採取し、dCでテーリングするのに
用いた。 Ｄ 合成オリゴヌクレオチドの調製およびその使
用 ヒト白血球インタフエロンのいくつかのトリ
プシン分解断片のアミノ酸配列についての知見
は、LeIF mRNAの種々の領域に対して相補
的な合成デオキシオリゴヌクレオチドのデザイ
ンを可能とした。２つのトリプシンペプチド
T1およびT13を選んだ。その理由は、それら
のアミノ酸配列は、すべての可能なコード配列
（表１）を説明するのに、12個および４個のウ
ンデカマーを合成するだけですむからである。
それぞれの配列について、４組のデオキシオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成した。つまり
各々三つ（Ｔ−1A、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または一つ
（Ｔ−13A、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のオリゴヌクレオチ
ドを含有する。示した相補的デオキシオリゴヌ
クレオチド11塩基鎖長は、ホスホトリエステル
法で化学的に合成した（クレア（Crea）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）75、5765−5769
〔1978〕）。Ｔ−13シリーズでは、４個の個々の
プローブを調製した。表１に示すように、３個
のプローブの４プールとして、12個のＴ−１プ
ローブを調製した。 Ｔ−13シリーズの４個のそれぞれのプローブ
および各３個のプライマーの４プールとして調
製した12個のＴ−１プローブを、ハイブリド化
プローブに用いるための放射ラベル１重鎖
cDNAの合成を誘導するために用いた。鋳型
mRNAは、センダイ誘導KG−１細胞（8000単
位IF活性／μｇ）からの12S RNAまたは非誘
導白血球（＜10単位／μｇ）に由来する全ポリ
(A)mRNAである。 ³²−ｐ−ラベルcDNAを、
既知の反応条件（ノイズ（Noyes）等、プロ
ク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.）76、1770−1774〔1979〕）を
用いて、これらのプライマーより調製した。20
ｍＭトリス（Tris）（以下Trisで示す）−HCl
（PH8.3）、20ｍＭ KCl、８ｍＭ MgCl₂、30
ｍＭ β−メルカプトエタノール中で60μ容
量の反応をおこなつた。この反応は、各プライ
マーの1μｇ（つまり、Ｔ−１シリースについ
ては、全部で12μｇ、Ｔ−13シリースについて
は全部で4μｇ）、2μｇの“誘導”された12S分
画mRNA（または、非誘導ポリ(A)mRNAの10μ
ｇ）、0.5ｍＭのdATP、dCTP、dTTP、
200μCi（α³²p）dCTP（アメルシヤム
（Amersham）、２−3000Ci／ｍmole）および
60単位逆転写酵素〔ベセスダ リサーチ ラボ
ラトリイス（Bethesda Research
Laboratories）〕である。生成物は、10mlセフ
アデツクス（Sephadex ）（以下Sephadex
で示す）Ｇ−50カラム上のゲル濾過により、結
合されなかつたラベルより分け、70℃で30分間
0.3N NaOHで処理し、RNAを分解し、HCl
で中和した。ハイブリド化は、カフアトス
（Kafatos）等、ヌクレイツク アシド リサ
ーチ（Nucleic Acid Res.）７、1541−1552
（1979）記載に準じて実施した。 Ｅ クローンpL1−pL30の同定 500個のE.Coli Ｋ−12株294形質転換株（Ｃ
項参照）のそれぞれより、プラスミドDNAの
1μｇを調製するのに、バーンボイム
（Birnboim）等、ヌクレイツク アシド リサ
ーチ（Nucleic Acid Res.）７、1513−1523
（1979）の迅速プラスミド分離操作を用いた。
各DNA試料を変成させ、カフアトス
（Kafatos）等の上記引用の方法に従い、３反
復でニトロセルローズフイルター上につけた。 500個のプラスミド試料を含有するニトロセ
ルロースフイルターの３組は、 (a) プライマーのＴ−１のセツトでプライムさ
れた誘導cDNA、 (b) Ｔ−13でプライムされた誘導cDNAおよび (c) プライマーの両方のセツトを用いて調製さ
れた非誘導cDNAとハイブリダイズした。非
誘導プローブの全体に対するよりも誘導され
たcDNAプローブの一方または両方に対して
より強くハイブリド化するならば、クローン
は陽性と考えた。500個より30個の“陽性”
クローンpL1−pL30）を選択し、さらに分析
した。 Ｆ クローンpL31−pL39の同定、LeIF遺伝子断
片を含有するプラスミド（No.104）の分離 プローブとして ³²p−ラベル誘導mRNAリ
ーレンホーグ（Lillenhaug）等、バイオケミス
トリイ（Biochemishry、）15、1858−1865
〔1976〕）を用いて、グランステイン
（Grunstein）およびホグネス（Hogness）のコ
ロニーハイブリド化法（プロク．ナトル．アカ
ド．サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）
72、3961−3965〔1975〕）によりE.Coli×1776の
形質転換株をスクリーニングした。非誘導細胞
よりの非ラベルmRNAを ³²p−ラベル調製物
中に存在する非誘導mRNAと競合さすために、
プローブに対して200対１に混合した。ラベル
された mRNAのハイブリド化は、誘導された配列
を含有するコロニーに選択的に起るはづであ
る。３つの群の形質転換株が得られた。 (1) コロニーの２から３％が ³²p−mRNAに
非常に強くハイブリド化した。 (2) 10％は、ハイブリド化の程度が、上記(1)群
より著しく低かつた。 (3) 残りは、検出しうる程度のハイブリド化の
シグナルを示さなかつた。 陽性のコロニー（第(1)および第(2)群）につい
ては、インタフエロンmRNAがプラスミド
DNAに特異的にハイブリド化することによる
分析で、インタフエロンに特異的な配列の存在
について調べた。まず、テトラサイクリン
（20μｇ／ml）、ジアミノピメリン酸（100μｇ／
ml）、チミジン（20μｇ／ml）およびｄ−ビオ
チン（1μｇ／ml）を加えたM9培地の100mlに、
60個の強陽性コロニー（第１群）のそれぞれを
個別的に発育させた。M9培地は、１リツトル
について、Na₂HPO₄（２ｇ）、KH₂PO₄（３ｇ）、
NaCl（0.5ｇ）およびNH₄Cl（１ｇ）を含有し、
オートクレーブしたあと、無菌1M MgSO₄の
１mlおよび無菌0.01M CaCl₂の10mlを添加す
る。10個の培養物はプールし、クレベル
（Clewell）等、バイオケミストリイ
（Biochemistry）９、4428−440〔1970〕記載の
ように、６個のプールよりプラスミドDNAを
分離した。各プラスミドDNAプールの10μｇ
は、HindIIIで切断し、変性し、DBM（ジアゾ
ベンジルオキイメチル）紙に共有結合させた。
誘導細胞よりの精製のmRNAの1μｇをそれぞ
れの濾紙にハイブリドさせた。ハイブリドしな
いcDNAは洗つて除去した。特異的にハイブリ
ドされたmRNAは溶出し、アフリカツメガエ
ルの卵母細胞中で翻訳させた。この分析で、６
個のプールはすべて陰性であつた。弱陽性のコ
ロニー（第２群）の59個より、各10コロニーの
５プールと９コロニーの１プールを調製し、そ
れらのプールよりプラスミドを調製し、上記の
ように調べた。試験した６個のプールのうち、
１個（K10）は、試験の度に、バツクグラウン
ドレベルを著しく超えるレベルで、インタフエ
ロンmRNAにハイブリドした。特異的インタ
フエロンcDNAクローンを同定するために、プ
ールK10の９コロニーよりプラスミドDNAを
調製し、個別的に調べた。９個のプラスミドの
うち２個（No.101およびNo.104）がインタフエロ
ンmRNAと、バツクグラウンドレベルを十分
に超えて結合した。プラスミドNo.104より、
260b.p.を含有する、独特のBgl制限断片を分
離した。これを、テイラー（Taylor）等、バ
イオケミ．バイオフイス．アクタ（Biochim.
Biophys.Acta）422、324−330（1976）の方法
により ³²でラベルし、コロニースクリーニン
グ法（グランステイン等（Grunstein and
Hogness）、プロク．ナトル．サイ．米国
（Proc.Natl.Sci.U.S.A.）72、3961−3965
〔1975〕）によりE.Coli294転換株の400個を、個
別的にスクリーニングするためのプローブに用
いた。このプローブと種々の程度にハイブリド
化する、９個のコロニー（pL31−pL39）を同
定した。 さらに、ラベルされた260b.p.断片を用いて、
同様にして、4000個のE.Coli294転換株を個別
的にスクリーニングした。このプローブと種種
の程度にハイブリドする50個のコロニーを同定
した。ひとつは、LeIF Ｇ断片を、ひとつは、
LeIF Ｈ断片を、ひとつはLeIF H1と称する断
片（みかけ上、LeIF Ｈの対立遺伝子である）
を含有した。生ずるハイブリドプラスミドは、
“pLeIF Ｈ”等と称した。 Ｇ 最初の完全長LeIF遺伝子の分離および配列
の決定 全体で39個の可能性のあるLeIF cDNAクロ
ーンよりプラスミドDNAを調製した。そして
カフアトス（Kafatos）等（上記引用）のハイ
ブリド化操作により、同じ260b.p.DNAプロー
ブを用い再スクリーニングした。このプローブ
と３個のプラスミド（pL4、pL31、pL34）は
非常に強いハイブリド化シグナルを与え、４
（pL13、pL30、pL32、pL36）は中程度にハイ
ブリド化し、３個（pL6、pL8、pL14）は、弱
くハイブリド化した。 39個の可能性のあるLeIF cDNA組換えプラ
スミドは、また、 ³²p−ラベル合成ウンデカマ
ー（各々３種のプライマーからなるＴ−１プラ
イマープールのそれぞれまたはＴ−13プライマ
ーのそれぞれ）をじかにハイブリド化のプロー
ブに用いて検索した。検出しうるハイブリド化
のシグナルを与えるのに完全な塩基間の対が必
要であるように、ハイブリド化の条件を選んだ
（ワランス（Wallace）等、ヌクレイツク ア
シド リサーチ（Nucleic Acid Res.）６、
3543−3557〔1979〕）。つまり、39個のクローン
よりプラスミドDNAを、標準上澄液法
（cleared lysate procedure；クレベル
（Clewell）等、上記）で調製し、バイオラド
アガロース（Biorad Agarose）Ａ−50カラム
クロマトグラフイーで精製した。各調製物の試
料（3μｇ）は、EcoRで処理して開環し、ア
ルカリで変性させ、２枚の別々のニトロセルロ
ースフイルターにスポツトした。１スポツトに
ついて1.5μｇとする。上記引用のカフアトス
（Kafatos）等の文献をみよ。合成デオキシオ
リゴヌクレオチドＴ−13プライマーおよびＴ−
１プライマープールのそれぞれは、（γ³²P）
ATPでつぎのようにリン酸化した。50pmole
のオリゴヌクレオチドおよび100pmoleの
（γ³²P）ATP（ニユー イングランド ニユー
クレアー（New England Nuclear）、
2500Ci／ｍmole）を、50ｍＭのTris−HCl、
10ｍＭのMgCl₂および15ｍＭのβ−メルカプト
エタノールの混合物の30μl中で合併した。２単
位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、
37℃で30分後 ³²p−ラベルプライマーは、10ml
セフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−50カラム
上でのクロマトグラフイーで精製した。
10⁶cpmのプライマーＴ−13Cまたは３×
16⁶cpmのプライラープールＴ−1Cを用いてハ
イブリド化した。ハイブリド化は、ワランス
（Wallace）等の上記引用の方法に従つて、６
×SSC〔１×SSC＝0.15MNaCl、0.015Mくえん
酸ナトリウム、PH7.2）、10×Denhardts〔0.2％
牛血清アルブミン、0.2％ポリビニルピロリド
ン、0.2％Ficoll〕溶液中で、15℃で14時間ハイ
ブリド化した。フイルターは６×SSC中０℃で
５分間宛３度洗つた。乾操し、Ｘ−線フイルム
にさらした。結果は、第１図に、 ³²p−プライ
マーＴ−13CおよびプライマープールＴ−1Cの
場合について示してある。 クローン104からのプラスミドDNAは、プラ
イマープールＴ−1CおよびプライマーＴ−13C
と顕著にハイブリド化した。しかし、他のウン
デカマーとは、検出しうる程のハイブリド化は
示さなかつた。第１図に示すように、39個の可
能性のあるLeIFプラスミドのうちのいくらか
（pL2、４、13、17、20、30、31、34）はこれ
らのプローブの両方とハイブリド化した。しか
し、制限分析から、これらのプラスミドのうち
のひとつだけ、pL31が260b.p.内部Bgl 断
片をも含有した。pL31をPst で消化した結
果、cDNA挿入物の大きさは約1000b.p.であつ
た。 pL31のPst 挿入物全体の配列を、マキサ
ム−ギルバート（Maxam−Gilbert）化学法
（メソード エンザイモル．（Methods
Enzymol.）65、499−560〔1980〕）およびジデ
オキシ鎖末端化方法（スミス、メソード エン
ザイモル（Smith Methods Enzymol.）65、
560−580〔1980〕）で決定した。その際、Sau
３ ａ断片をM13ベクター中にサブクローン化
しておいた。DNA配列は表２の“Ａ”に示し
てある。入手しうる蛋白質配列についての情
報、既知のLeIF分子量の範囲、３個の可能な
読み枠における停止トリプレツトの相対的な存
在より適当な翻訳読み枠が示唆された。それか
ら、プレーまたはシグナルペプチドを含めて
LeIFアミノ酸全配列が示された。第１のATG
翻訳開始コドンは、配列の5′末端より60番目の
ヌクレオチドに存在し、188コドンあとに、
TGA終止トリプレツトが存在する。3′末端に
は342個の非翻訳ヌクレオチドがあり、ついで
ポリ(A)配列がつづく。仮定されるシグナルペプ
チド（おそらく、白血球よりの成熟LeIFの分
泌にあづかるのであろう）は23アミノ酸長であ
る。成熟LeIFを構成する165アミノ酸の分子量
の計算値は、19390である。我々は、このpL31
によりコードされたLeIFを“LeIF Ａ”と称し
た。表３の配列データ（“Ａ”）より、のトリプ
シンペプチドT1およびT13は、LeIF Ａの146
−150および58−62にそれぞれ相当することが
分る。これらの２つの領域に見出される実際の
DNAコード配列は、プライマープールT1−Ｃ
およびプライマーT13−Ｃに表されるものであ
る（表４をみよ）。 Ｈ 成熟白血球インタフエロンＡ（LeIFA）の直
接発現 １ 一般的既述 LeIF Ａを成熟インタフエロンポリペプチ
ドとして直接に発現させるための操作は、合
成（Ｎ−末端）および相補的DNAの組合せ
を包含する点でヒト生長ホルモンに用いられ
た方法（ゴデル Goeddel）等、ネーチヤ
（Nature）281、544−548〔1979〕の一変形で
ある。 第３図に示すように、Sau ３ ａ制勤エ
ンドヌクレアーゼ部位は、便宜なことに、
LeIF Ａのコドン１および３とのあいだに存
在する。ATG翻訳開始コドンを含有し、ア
ミノ酸１（システイン）に対するコドンを修
復し、EcoR粘着末端を新しく作製するこ
とを包含する、２つの合成デオキシオリゴヌ
クレオチドをデザインした。これらのオリゴ
マーは、pL31の34b.p.Sau 3a−Ava断片
に連結した。生ずる45b.p.生成物は２つの追
加のDNA断片に連結させ、865b.p.合成−天
然雑種遺伝子とした。これは、LeIF Ａをコ
ードし、EcoRおよびPst 制限部位によ
りはさまれている。この遺伝子は、EcoR
およびPst 部位のあいだにおいて、
PBR322に挿入し、プラスミドpLeIF Alと
した。 ２ トリプトフアン調節要素（E.Coli trpプロ
モーター、オペレーターおよびtrpリーダー
リボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始の
ためのATG配列を欠如する）の構築 プラスミドpGMI（ATCC 31622）は、欠
失ΔLE 1413を含有するE.Coliトリプトフア
ンオペロンを担う（ミオザリ（Miozzari）
等、ジエイ．バクテリオロジイ（J.
Bacteriology）133、1457−1466〔1978〕）。
それゆえに、trpリーダーの最初の６個のア
ミノ酸そしてtrp Ｅポリペプチドのおよそ最
後の1/3（以降、あわせてLE′と称する）な
らびにtrp Ｄポリペプチドの全体を含有する
融合蛋白質を発現する。これはすべてtrpプ
ロモーター−オペレーターシステムの調節下
にある。プラスミドpGM1の代りに容易に入
手可能なその他の同等のtrpプロモーター
（たとえば、Bennett.J.Mol.Biol（1978）121、
113−137の135頁Fig.10参照）を用いてもよ
い。このプラスミド20μｇを制限酵素Pvu
で消化した。これは、プラスミドを５個の
部位において切断する。この遺伝子断片はつ
いでEcoRリンカー
（pCATGAATTCATGの自己相補性のオリ
ゴヌクレオチドより成立つ）と結合させ、あ
とから、EcoR部位含有プラスミド中にク
ローン化するためのEcoR切断部位とする。
pGMlより得られるDNA断片の20μｇを、
200pmoleの5′−リン酸化合成オリゴヌクレ
オチドpCATGAATTCATGの存在で、
20μlT₄DNAリガーゼ緩衝液（20ｍＭ Tris
PH7.6、0.5ｍＭ ATP、10ｍＭ MgCl₂、
５ｍＭジチオスレイトール）中で10単位
T₄DNAリガーゼで４℃一夜処理した。溶液
はついで70℃で10分間加熱し、連結を停止さ
せた。リンカーはEcoR消化で切断し、
EcoR末端を有する断片を５パーセントポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（以降PAGE
と称する）を用いて分け、大きい方の３個の
断片を、エチジウムブロマイドでまず染色
し、紫外線で断片の位置を定め、ゲルより対
象となる部分を切り取る方法で分離した。各
ゲル断片（300μl0.1×TBE）を透析バツグに
入れ、そして、0.1×TBE緩衝液（TBE緩衝
液は10.8ｇのTris塩基、5.5ｇのホウ酸、0.09
ｇのNa₂EDTAを１リツトルのH₂O中に含
有）中で100V1時間電気泳動した。透析バツ
グより水溶液を採取し、フエノール抽出、ク
ロロホルム抽出、0.2M塩化ナトリウム濃度
とし、エタノール沈殿後水中にDNAを採取
した。EcoR粘着末端を有するtrpプロモー
ター−オペレーター含有遺伝子は、つぎに記
載する操作で同定した。つまり、テトラサイ
クリン感受性プラスミドに断片を挿入し、こ
れは、プロモーター−オペレーターの挿入
で、テトラサイクリン抵抗性とした。 プラスミドpBRHI（ATCC37070）（ロドリ
ゲズ（Rodriguez）等、ヌクレイツク アシ
ド リサーチ（Nucleic Acid Res.）６、
3267−3287〔1979〕）は、アンピシリン抵抗性
を発現しそして、テトラサイクリン抵抗性遺
伝子を含有する。しかし、それに組合わされ
たプロモーターが存在しないので、その抵抗
性を発現しない。このプラスミドは従つてテ
トラサイクリン感受性である。このEcoR
部位にプロモーター−オペレーターシステム
を導入することにより、プラスミドをテトラ
サイクリン抵抗性となしうる。 pBRHIをEcoRで消化し、酵素はフエノ
ール抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノ
ール沈殿させて水中にうる。別々の反応混合
物中に存在する生成DNA分子は、上記に得
られた３個のDNA断片のそれぞれと合併し、
そして、前記のように、T₄DNAリガーゼで
連結させた。反応混合物中に存在するDNA
を用いて、標準方法（ハーシユフイールド
（Hershfield）等、プロク．ナトル．アカド．
サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）
71、3455−3459〔1974〕）によりDNAとり込
み能のあるE.coli Ｋ−12株294を形質転換
し、この細菌を、20μｇ／mlのアンピシリン
および5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有
するLB（Luria−Bertani）プレートに接種
した。いくつかのテトラサイクリン抵抗性コ
ロニーを選び、プラスミドDNAを分離しそ
して、望む断片の存在を制限酵素分析で確か
めた。生ずるプラスミドをpBRH trpと称す
る。 肝炎ＢのウイルスゲノムのEcoRおよび
BamH消化生成物を常法により採取し、
プラスミドpGH6（ATCC31539）のEcoR
およびBamH部位にクローン化し（この
プラスミドpGH6は、GoeddelらのNature
281、544（1979）に示されているように、プ
ラスミドpKB268から単離された285塩基対
のEcoR断片（同断片は、95塩基対の異種
DNA断片を介在させた２つのUV−５ lac
プロモーターからなり、その構築方法は、
JohnsrudのProc.Natl.Acad.sic.USA、75
（11）5314−5318（1978）に記載されている）
を、プラスミドpBR322のEcoR部位に挿
入することより構築される。なお、UV−５
lacプロモータの塩基配列は、Dicksonら
のScience187、27−35（1975））、Simpsonら
のCell18、277−285（1979）、Siebenlistらの
Cell20、269−281（1980）等に記載されてお
り、公知である。〕、プラスミドpHS32とす
る。プラスミドpHS32をXba で切断し、
フエノール抽出し、クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿させた。沈殿は、0.1ｍＭ
dTTPおよび0.1ｍＭ dCIPを含有する30μ
ポリメラーゼ緩衝液（50ｍＭリン酸カリウム
PH7.4、７ｍＭ MgCl₂、１ｍＭ β−メル
カプトエタノール）中で、1μ E.coli
DNAポリメラーゼ、クレノーKlenow断
片〔ベーリンガー−マンハイム
（Boehringer−Mannheim）〕で、０℃で30
分、ついで37分で２時間処理した。この処理
でXba 切断部位の5′突出末端に相補的な
44個のヌクレオチドのうちの２個がみたされ
る。 5′ CTAGA− 5′ CTAGA− 3′ Ｔ− TCT− ２つのヌクレオチドdCおよびdTが組込ま
れて２つの突出する5′ヌクレオチドを有する
末端を与える。プラスミドpHS32（フエノー
ルおよびクロロホルム抽出後エタノール沈殿
させて水に取る）のこの直鎖残基を、EcoR
で切断した。大型プラスミド断片を、
PAGEで、より小さいEcoR−Xba 断
片より分け、電気溶出により分離した。
pHS32（0.2μｇ）よりのこのDNA断片は、上
記に類似の条件で、pBRH trpに由来するト
リプトフアンオペロン（約0.01μｇ）のEcoR
−Taq 断片に連結した。 上記のpHS32の断片をEcoR−Taq
断片に連結するこの方法において、完全なワ
トソン−クリツク塩基対ではないけれども、
Taq の突出する末端をXba の残存す
る突出末端に連結する。 −Ｔ CTAGA− −TCTAGA− ＋ → −AGC TCT− −ASCTCT− この連結反応混合物の１部はE.coli294細
胞の変換に用い、熱処理し、アンピシリン含
有LBプレート中に塗布した。24個のコロニ
ーを選択し、３mlLB（Luria−Bertani）中
で発育させ、プラスミドを分離した。これら
のコロニーのうちの６個が、E.coliによる
DNA修復および複製により再生されたXba
部位を有することが分つた。 −TCHAGA− −TCTAGA− → −AGCTCT− −AGATCT− これらのプラスミドは、EcoRおよび
Hpa の両方で切断されて、期待される制
限断片を与えることも分つた。PTrp14と称
するひとつのプラスミドを、つぎに論議する
ように異質のポリペプチドを発現さすのに用
いた。 プラスミドpHGH107（ATCC31538）この
プラスミドpHGH107は、Goeddelらの
Nature281、544（1979）に記載の方法（例え
ば同文献のFig.4参照）により、前述のpGH
６のlacプロモーターの下流にヒト成長ホル
モンをコードするDNA断片を挿入して構築
される。は、合成DNA断片より生成された
23個のアミノ酸コドンおよびヒト生長ホルモ
ンメツセンジヤーRNAの逆転写で生成され
る相補的DNAより得られる163個のアミノ酸
コドンより成立つヒト生長ホルモンに対する
遺伝子を含んでいる。この遺伝子は、ヒト生
長ホルモンの“先行”配列のコドンを欠如す
るけれども、ATG翻訳開始コドンを含有す
る。この遺伝子は、10μpHGH107より、
EcoR処理、それに続く、上記のようなE.
coli DNAポリメラーゼクレノー
（Klenow）（以下Klenowで示す）断片およ
びdTTPおよびdATP処理を経て分離した。
フエノールおよびクロロホルム抽出のあとエ
タノール沈殿させたプラスミドをBamHIで
処理した。 ヒト生長ホルモン（HGH）遺伝子含有断
片は、PAGE、つづいて電気溶出により分離
した。生ずるDNA断片は、テトラサイクリ
ンプロモーター−オペレーターシステムを欠
如するが、テトラサイクリン抵抗性構造遺伝
子の最初の350個のヌクレオチドをも含有す
るので、引きつづき発現プラスミド中にクロ
ーン化したときに、その挿入物を含有するプ
ラスミドは、テトラサイクリン抵抗性の回復
により見定め得る。断片のEcoR末端は、
Klenowポリメラーゼ法でみたされてある
ので、この断片は、ひとつの平滑末端
（blunt end）およびひとつの粘着末端を有す
る。それで、あとから発現プラスミドに挿入
されても正しい配向が確実になる。 発現プラスミドpTrp14を、ついで、上記
調製のHGH遺伝子含有断片を受け入れるよ
うに調製した。すなわち、pTrp14をXba
消化し、生ずる粘着性末端を、dATP、
dTTP、dGTPおよびdCTPを用いる
Klenowポリメラーゼ法でみたした。フエ
ノールおよびクロロホルム抽出およびエタノ
ール沈殿のあと、生ずるDNAはBam HIで
処理し、生ずる大型プラスミド断片をPAGE
および電気溶出で分離した。pTrp14由来の
断片は１個の平滑末端および１個の粘着末端
を有し、前記したHGH遺伝子含有断片と正
しい配向で再結合することを可能とした。 HGH遺伝子断片とpTrp14ΔXba−Bam
HI断片とは、上記と類似の条件で、合併し
相互に連結した。みたされたXba および
EcoR末端は、平滑末端による連結で、
Xba 部位およびEcoR部位の両方を再
構成した。 【表】 この構築はまたテトラサイクリン抵抗性遺
伝子をも創出する。プラスミドpHGH107
は、HGH遺伝子より上流に存在するプロモ
ーター（lacプロモーター）よりテトラサイ
クリン抵抗性を発現するので、pHGH207と
称するこの構築は、トリプトフアンプロモー
ター−オペレーターの調節下でのテトラサイ
クリン抵抗性遺伝子の発現を可能とする。つ
いで、連結混合物でE.coli294を転換し、5μ
ｇ／mlのテトラサイクリンを含有するLBプ
レート上でコロニーを選択した。 プラスミドpHGH207はEcoR消化し、
trpプロモーター−オペレーターおよびtrpリ
ーダーリボゾーム結合部位を含有するが翻訳
開始のためのATG配列を欠如する300b.p.断
片を、PAGEそれにつづく電気溶出で採取し
た。このDNA断片はpLeIF ＡのEcoR部
位にクローン化した。上記の変型trpレギユ
ロン（regulon）（発現レベルを高めるように
調節するためにアテニユエータ配列を欠失さ
せたE.coli trpオペロン）を含有する発現プ
ラスミドは、プロモーター−オペレーターシ
ステムを抑制するのに十分量のトリプトフア
ン添加培地にあらかじめ定めたレベルまで発
育させうる。ついで、トリプトフアンを除去
しシステムの抑制を除けば、目的とする生成
物が発現されうる。 より具体的に示すと、第３図を参照にし
て、250μｇのプラスミドpl31をPst で消
化し、1000b.p.の挿入物を６％ポリアクリル
アミドゲル上のゲル電気泳動で分離した。約
40μｇの挿入物をゲルより電気溶出し、３つ
に分けて、つぎのようにさらに消化した。(a)
この断片の16μｇ試料を、37℃で45分間Bgl
の40単位で部分的に消化し、反応混合物
は６％ポリアクリルアミドゲル上で精製し
た。望む670b.p.の断片約2μｇを採取した。
(b)1000b.p.Pst 挿入物の別の試料（8μｇ）
をAva およびBgl で消化した。ゲル
電気泳動のあとに、上記の150b.p.の断片1μ
ｇを得た。(c)1000b.p.片の16μｇををSau 3a
およびAva で処理した。10％ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動したあと、約
0.25μｇ（10pmole）の34b.p.断片を得た。２
つの示したデオキシオリゴヌクレオチド、
5′−dAATTCATGTGT（断片１）および
5′−dGATCACACATG（断片２）はホスホ
トリエステル法で合成した。断片２はつぎの
ようにリン酸化した。200μ（約40pmole）
の（γ³²P）ATP（アメルシヤム
（Amershem）、5000Ci／ｍmole）を乾燥し、
60ｍＭのTris−HCl（PH８）、10ｍＭの
MgCl₂、15ｍMβ−メリカプトエタノールよ
り成立つ、100pmoleのDNA断片および２単
位のTdポリヌクレオチドキナーゼ含有液30μ
に再懸濁した。37℃で15分後、1μの10
ｍＭのATPを添加し、反応はさらに15分進
行させた。混合物はついで70℃で15分加熱
し、100pmoleの5′−OH断片１および
10pmoleの34b.p.Sau 3a Ava 断片を合
併した。20ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、10ｍ
Ｍ MgCl₂、10ｍＭジチオスレイトール、
0.5ｍＭ ATPおよび10単位T4DNAリガー
ゼの50μ中で５時間４℃で連結させた。混
合物は６％ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動し、45b.p.生成物を電気溶出で採取し
た。45b.p.生成物の30nｇ（1pmole）を、
150b.p.Ava −Bgl 断片の0.5μｇ
（5pmole）および670b.p.Bgl −Pst
断片の1μｇ（2pmole）と合併した。20単位
のT4DNAリガーゼを用いて20℃16時間連結
処理した。65℃で10分間加熱してリガーゼを
不活化した。混合物はEcoRおよびPst
で消化して遺伝子の重合体を除去した。混合
物は６％PAGEで精製した。約20nｇ
（0.04pmole）の865b.p.生成物を分離した。
これの半分（10nｇ）を、pBR322（0.3μｇ）
のEcoRおよびPst 部位のあいだに挿入
した。E.coli294を形質転換すると70個のテ
トラサイクリン抵抗性、アンビシリン感受性
の転換株を与えた。これらのうちの18個から
プラスミドDNAを分離し、EcoRおよび
Pst で消化した。18個のプラスミドのう
ち、16個が865b.p.長のEcoR−Pst 断
片を有した。これらのうちのひとつpLeIF
Alの1μｇをEcoRで消化し、E.coli trpプ
ロモーターおよびtrpリーダーリボゾーム結
合部位を有する、上記製造のような300b.p.
EcoR断片（0.1μｇ）に連結させた。trpプ
ロモーターを含有する転換物は、グラステイ
ン−ホグネス（Grunstein−Hogness）コロ
ニースクリーニング法と組合わせて、 ³²P−
trpプローブを用いて同定した。trp断片中の
非対称的に位置しているXba 部位は、
trpプロモーターが、LeIF Ａ遺伝子の方向
に配向している、組換え生成物の同定を可能
とした。 Ｉ LeIF Ａのインビトロおよびインビボ活性 IF分析のための抽出物をつぎのように調製
した。培養物の１mlを5μｇ／mlのテトラサイ
クリンを含有するＬブロス中で発育させ、A₅₅₀
値を約1.0とし、ついで、5μｇ／mlのテトラサ
イクリンを含有するM9培地25ml中に希釈した。
A₅₅₀が1.0に達した時に10mlの試料を遠心採取
し、細胞塊を、15％スクロース、50ｍＭ
Tris−HCl（PH8.0）、50ｍＭ EDTAの１ml中
に懸濁させた。１mgのリゾチームを添加し、０
℃５分のあと、細胞は超音波処理で破壊した。
試料は10分間（15000rpm）で遠心し、上清中
のインタフエロ活性を、細胞変性効果（CPE）
の阻止分析により、標準LeIFと比較して測定
した。細胞あたりのIF分子数を測定するため
には、４×10⁸単位／mgのLeIF比活性を用い
た。 表６に示すように、trpプロモーターを望む
配向に挿入したクローンpLeIF Ａ trp25は高
い活性（2.5×10⁸単位／ｌ）を示した。表７に
示すように、E.coli Ｋ−12株294／pLeIF Ａ
trp25の生成するIFは、ヒトLeIF標品と同様に
挙動した。PH２での処理に対し安定で、ウサギ
抗ヒト白血球抗体により中和される。このイン
タフエロンの見かけの分子量は約20000である。
クローンpLeIF Ａ trp25はアメリカンタイプ
カルチヤーコレクシヨン（ATCC）に寄託され
ている。 インタフエロンのインビボでの効果には、マ
クロフアージおよびナチユラルキラー（NK）
細胞が必要である。そしてインビボでの作用
は、これらの細胞の刺激を含むようにみえる。
それで、E.coli294／pLeIF A25により生産さ
れるインタフエロンは、細胞培養の分析では抗
ウイルス活性を有するが、感染動物では無効で
ある可能性がある。さらに、細菌より生産され
た、非グリコシレート化LeIF Ａのインビボ・
抗ウイルス作用は、ヒト“バフイーコート
（buffy coat）”白血球に由来するグリコシレー
ト化LeIFとは異なることがありうる。それで
細菌により合成されたLeIF Ａ（２％純度）の
生物活性を、スクイレルモンキー（リスザル）
への致死量の脳心筋炎ウイルス（EMC）感染
において、バフイーコートLeIF（８％純度）と
比較してみた（表８）。 【表】 【表】 ＊表６に記載のE.coli294／pLeIF Ａ trp25
の抽出物mlあたり250000単位を、最小必須培地
で500倍希釈し、500単位／mlの比活性とした。
白血球インタフエロン標準〔ワドレインスチチ
ユート（Wadley institute）〕をあらかじめ
NIH白血球インタフエロン標準に対して、タ
イターを求めて、やはり500U／mlの最終濃度
に希釈した。１ml量を1NHClでPH２とし、４
℃で52時間インキユベートし、NaOHを添加
中和し、IF活性を標準CPE阻止分析で測定し
た。500単位／ml試料（未処理）の25μ分を
25μのウサギ抗−ヒト白血球インタフエロン
と37℃で60分インキユベートし、12000×ｇで
５分遠心し、上清を分析した。 【表】 サルはすべて雄（平均体重713ｇ）で、感染
前には、EMCウイルス抗体は有しない。サル
には、100×LD₅₀EMCウイルス（マウスで測
定）を筋肉内感染させた。対照感染サルは、感
染後134、158、164時間に死亡した。10⁶単位イ
ンタフエロン処理は、感染前４時間、感染後
２、23、29、48、72、168および240時間目に静
脈内投与した。細菌性白血球インタフエロン
は、E.coli294／pLeIF A25の融解物よりのカ
ラムクロマト分画で、比活性7.4×10⁶単位／mg
蛋白質であつた。対照細菌蛋白質は、E.
coli294／pBR322融解物よりの相当するカラム
分画で、２倍の全蛋白質量とした。白血球イン
タフエロン標準は、クロマトグラフイーで、32
×10⁶単位／mg蛋白質の比活性に精製した、正
常のヒト“バツフイーコート”細胞よりのセン
ダイ（Sendai）ウイルス誘導インタフエロン
であつた。 対照のサルは、序々に進行する昏睡、バラン
スの消失、後肢の弛緩、まひそして死亡前８時
間頃より開始する涙の流出を示した。インタフ
エロン処理サルは、これらの異常はまつたく示
さず、常時活動的で、ウイルス血症による症状
を示さなかつた。４日までウイルス血症を示さ
なかつた対照中の１頭のサルは、もつとも遅れ
て死んだ（感染160時間後）、しかし、死後、心
臓および脳に高タイターでウイルスを検出し
た。インタフエロン投与サルは、感染後14およ
び21日の検査でEMCウイルスに対する抗体を
生成しなかつた。これらの結果は、感染動物に
おけるLeIF調製物の抗ウイルス効果は、イン
タフエロンのみに帰せられうることを示す。理
由は、爽雑する蛋白質は、細菌とバツフイーコ
ート調製物ではまつたく異なるからである。さ
らに、これらの結果は、LeIF Ａのインビボ抗
ウイルス活性にグリコシル化が不要であること
を示す。 Ｊ その他の白血球インタフエロンに対する
cDNAの分離 完全に特徴づけられたLeIF Ａ cDNA含有
プラスミドよりのDNAをPst で切断し、電
気泳動により分離し、 ³²pでラベルした。生ず
る放射ラベルDNAをプローブに用い、上記の
グランステイン（Grunstein）およびホグネス
（Hogness）のインジトウ−コロニースクリー
ニング法により、上記Ｃ項におけると同様に得
られた、追加のE.coli294の転換株をスクリー
ニングした。種々の程度にプローブにハイブリ
ド化したコロニーを単離した。これらのコロニ
ーからのプラスミドDNAおよび上記Ｇ項に示
した10個のハイブリド化コロニーからのプラス
ミドDNAを、Pst 切断により分離し、３つ
の方法で特徴づけた。第１に、これらのPst断
片を、酵素Bgl 、Pvu およびEcoRを
用いる制限エンドヌクレアーゼ消化パターンで
特徴づけた。この分析は、第２図に示した、少
なくとも８種の異なる型（LeIF Ａ、LeIF Ｂ、
LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF Ｅ、LeIF Ｆ、
LeIF ＧおよびLeIF Ｈ）の分類を可能とした。
これは、これまでに知られているLeIF Ａの先
行配列およびコード配列に関する、種々の制限
切断点のおおよその位置を示している。これら
のうちのひとつLeIF Ｄは、ナガタ（Nagata）
等がネーチヤー（Nature）284、316−320
（1980）に報告したのと同じと信ぜられる。 第２に、それらDNAのいくつかについて、
ポリ−Ａ含有KG−１細胞RNAより、LeIF
mRNAを選択的に除去する能力について、ク
リーブランド（Cleveland）等がセル（Cell）
20、95−105（1980）に記載したハイブリツド化
選択分析により調べた。LeIF Ａ、Ｂ、Ｃおよ
びＦはこの分析で陽性であつた。第３に、これ
らのPst断片を発現プラスミドに挿入し、E.
coli294をそのプラスミドで形質転換し、断片
を発現させた。プレインタフエロンと信ぜられ
る発現生成物は、LeIF Ｆ断片がかろうじて陽
性以外は、インタフエロン活性に対するCPE
分析ですべて陽性であつた。上記に加えて、上
記のLeIF型のすべてについて配列を定めた。 Ｋ 第２の成熟白血球インタフエロン（LeIF
Ｂ）の直接発現 成熟LeIF Ｂに対する遺伝子を含有する分離
断片の配列は、型ＡおよびＢの最初の14個のヌ
クレオチドが同じであることを示す。それで、
trp−プロモーター−オペレーター、リボゾー
ム結合部位およびLeIF Ａ（＝Ｂ）遺伝子の第
１コドンを有する断片をpLeIF A25より分離
し、LeIF Ｂの発現プラスミドを構築するため
にＢ配列の残りの部分と結合させた。この場
合、前記Ｂ配列の残りの部分はLeIF Ｂの第２
のコドンから始まる。pL ４（第２図に示した
LeIF Ｂ Pst末端遺伝子を含有するプラスミ
ド）のPst断片およびpLeIF A25の１部に対す
る顕著な制限地図を、第４図および第５図にそ
れぞれ示す。 第４図の配列によりPst 断片に対してお
およそ950b.p.のsau ３ ａ−Pst 断片をう
るには、１個または１個より多くの介在する
Sau ３ ａ制限部位が存在するので、単にPst
とSau3aとを用いて切断する方法は適用でき
ずいくつかの段階が必要である。つまり、つぎ
のようになる。 LeIF Ｂ発現ベクターおよびこれを含む形質
転換体の製造方法を以下に記載する。 １ つぎの断片を分離した。 (a) Sau ３ ａからEcoRまでの110bb.
p.； (b) EcoRからXbaまでの132b.p. (c) XbaからPstまでの＞700b.p. ２ 断片（1a）および（1b）を連結させXba
およびBglで切断して、Sau ３ ａおよび
Xba末端を経由する自己重合を防いだ（関連
するSau ３ ａ部位はBgl 部位内にあ
り、；Bgl 切断はSau ３ ａ粘着性末端
を残した）。242b.p.断片を分離した。 ３ (2)および（1c）の生成物を連結させ、ふた
たび自己重合を防ぐために、Pst および
Bgl で切断した。Sau ３ ａからPst
までの（第４図）約950b.p.断片を分離し
た。この断片は、LeIF Ａに共通していな
い、LeIF Ｂ遺伝子の部分を含有した。 ４ LeIF Ａのtrpプロモーター−オペレータ
ー、リボゾーム結合部位、ATG開始シグナ
ルおよびシステインコドンを含有する約
300b.p.断片（HindからSau ３ ａまで）
を、pLeIF25より分離した。 ５ Pst からHind までの約3600b.p.断
片をpBR322より分離した。レプリコンおよ
びテトラサイクリン抵抗性がコードされてい
るが、アンピシリン抵抗性は含有しない。 ６ 段階３、４および５で得られた断片をトリ
プル連結し、生ずるプラスミドでE.coli Ｋ
−12株294を転換した。 転換株はミニスクリーニング（バーンボイム
（Birnboim）等、ヌクレイツク アシド リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）７、1513−1523
〔1979〕）に処し、プラスミド試料はEcoRで
消化した。消化物は３個の断片を与えたが、そ
れらの特徴は、(1)EcoR−EcoR trpプロ
モーター断片；(2)pL4の内部EcoR−EcoR
断片；および３）pL4の蛋白質翻訳開始シグナ
ル−EcoR断片。 ウイルスの細胞変性効果に基づく慣用の分析
方法であるCPE分析（The Interferon
System、Springer−Verlag、Wien／Austria、
1979、pp17および18参照）で、上記のように
調製したクローンより細菌抽出物は、代表的に
は、A₅₅₀＝１で約10×10⁶単位／のインタフ
エロン活性を与えた。このように調製されたひ
とつの代表的なクローンは、E.coli294／pLeIF
Ｂ trp7である。このクローンはATCCに寄託
されている。 Ｌ さらに別の成熟白血球インタフエロン
（LeIF Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪ）の直接
発現 他のLeIFタイプを含有する追加の完全長遺
伝子断片は、LeIF Ａにおけると同様に、テイ
ラーし発現のための発現ビヒクル中におきう
る。成熟LcIF Ａの発現のための、上記Ｈ項に
記載のようなアプローチ、つまり、制限切断に
より先行配列を除去し、先行配列除去で失なわ
れたＮ−末端アミノ酸コドンを合成DNA断片
の連結でおき代えるという、便利な方法がとれ
るかどうかを決めうるよう、成熟インタフエロ
ンタイプの第１のアミノ酸コドンに十分に近く
制限部位が存在するかどうかは、従来法による
完全な配列決定から分るであろう。それがうま
くいかなければ、つぎの操作を用いうる。要す
るに、成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸に対
するコドンの開始する点より正確に前のところ
で先行配列含有断片を切断する。つまり １ その点をとりまく領域内において２重鎖
DNAを１重鎖DNAに変える； ２ 段階(1)で生成した１重鎖の領域に目的とす
る切断部位と結合するヌクレオチドと反対側
にプライマーの5′末端が位置するようにし
て、１重鎖DNAの相補的なプライマーをハ
イブリド化する。 ３ プライマーより3′の方向にある、段階１で
除かれた第２の鎖の部分を、アデニン、チミ
ン、グアニンおよびシトシン含有デオキシヌ
クレオチドトリホスフエートの存在での
DNAポリメラーゼを用いる反応で恢復させ
る。 ４ 切断しようとする点をこえて突出してい
る、残存する１重鎖DNAを消化する。 翻訳開始シグナルATGを、コード鎖の3′末
端に有する短鎖長合成DNAを、ついで、得ら
れた成熟インタフエロンのために仕立上げられ
た遺伝子に、たとえば平滑末端連結で連結し、
そしてこの遺伝子を発現プラスミドに挿入し、
プロモーターおよびそれに組合わされたリボゾ
ーム結合部位による調節下におく。 上記のＫ項で用いたのと同様にして、LeIF
ＣおよびLeIF Ｄをコードする遺伝子断片を、
直接的細菌による発現のために適当に配列し
た。これらの追加の白血球インタフエロンの発
現のための戦略として、それぞれの場合につい
て、pLeIF A25よりのLeIF Ａのtrpプロモー
ター−オペレーター、リボゾーム結合部位、
ATG開始シグナルおよびシステインコドンを
含有する、約300b.p.の断片（HindからSau
３ ａまで）を用いる。これに対して、すべて
に共通である最初のシステインより向うの、そ
れぞれのアミノ酸配列をコードするその他のイ
ンタフエロン遺伝子よりの遺伝子断片を結合す
る。得られたそれぞれのプラスミドを用いてE.
coRi Ｋ−12株294を転換した。それぞれの遺
伝子を形成するための結合は次のようである。 LeIF Ｃ pLeIF Ｃより次の断片を分離する： (a) Sau ３ ａからSau 96までの35b.p. (b) Sau 96からPst までの＞900b.p. (c) 上記Ｋ(4)項におけるように、pLeIF Ａ−
25より約300b.p.の断片（Hind−Sau ３
ａ）を分離する。 (d) 上記Ｋ(5)項の約3600b.p.の断片を分離す
る。 構 築 (1) (a)および(c)を連結する。Bgl 、Hind
で切断し、約335b.p.の生成物を分離する。 (2) (1)＋(b)＋(d)とトリプル連結し、生ずるプラ
スミドでE.coliを転換する。 このように調製された代表的なクローンはE.
coli Ｋ−12株294／pLeIF Ctrp35である。こ
のクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｄ pLeIF Ｄよりつぎのように分離する： (a) Sau ３ ａからAva までの35b.p. (b) Ava よりBgl までの150b.p. (c) Bgl よりPst まで約700b.p. pLeIF A25より、つぎの断片を分離する： (d) HindよりSau ３ ａまで300b.p. pBR322よりつぎの断片を分離する： (e) HindよりPst まで約3600b.p. 構 築 (1) (a)＋(b)を連結し、Bgl で切断し、185b.
p.生成物(1)を精製する。 (2) (1)＋(d)を連結し、Hind、Bgl で切断
し、そして、約500b.p.生成物(2)を精製する。 (3) (2)＋(c)＋(e)を連結し、生ずるプラスミドで
E.coliを転換する。 このように調製された代表的なクローンは、
E.coli Ｋ−12株294／pLeIF Ｄ trp11である。
このクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｆ LeIF Ｆを含有する断片は、LeIF Ｂおよび
LeIF Ｆの１から13までのアミノ酸が完全に相
同であることを利用する再構成で直接的に発現
するよう仕立上げることができる。上記の
pHGH207より、Pst およびXba 消化
を経由し、ついで約1050b.p.の断片を分離する
ことにより、適当な配列末端を有するtrpプロ
モーター含有断片(a)をうる。第２の断片(b)は、
プラスミドpHKY10のPst およびBgl
消化より生ずる断片の大きい方としてうる。
（このPst−Bgl断片はアンピシリン抵抗性
遺伝子の一部および組合されたプロモータ以外
のテトラサイクリン抵抗性遺伝子のすべてを含
有している。従つて、プラスミドpHKY10を
用いなくとも、その他の入手可能なプラスミ
ド、たとえば、プラスミドpBR322（ATCC
31344）からもこの断片を調製することができ
る。）断片(a)はアンピシリン抵抗性をコードす
る遺伝子の約半分を含有し；断片(b)は、その遺
伝子の残りを含有し、また、組合わされたプロ
モーター以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝子
のすべてを含有する。断片(a)および(b)はT4リ
ガーゼにより結合し、生成物を、Xba およ
びBgl で処理して、二量化がおこらぬよう
にし、trpプロモーター−オペレーターおよび
テトラサイクリンおよびアンピシリン抵抗性の
遺伝子を含有する断片(c)とする。 約580b.p.の断片(d)はpLeIF ＦのAva お
よびBgl の消化で得られる。これは、LeIF
Ｆの14から166までのアミノ酸に対するコドン
を含有する。 断片(e)（49b.p.）は、pLeIF ＢのXba お
よびAva 消化で得られる。断片(e)はLeIF
Ｆのアミノ酸１から13をコードする。 断片(c)、(d)および(e)は、T4リガーゼの存在
で、トリプル連結する。それぞれ断片の接着末
端は、複合プラスミドが正しく環状となり、テ
トラサイクリン抵抗性遺伝子が成熟LeIF Ｆの
遺伝子とあわせて、trpプロモーター−オペレ
ーターの調節下に入るようになつており、それ
で、望むプラスミドで転換した細菌は、テトラ
サイクリン含有プレート上で選択しうる。この
ように調製された代表的クローンは、E.coli
Ｋ−12株294／pLeIF Ｆ trp1である。このク
ローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｈ 完全LeIF Ｈ遺伝子を、成熟白血球インタフ
エロンとして発現さすために、つぎのように配
列しうる。 １ プラスミドpLeIF ＨをHae およびRsa
消化に処して、シグナルペプチドアミノ
酸10から3′非コード領域までに及ぶ816b.p.断
片を分離する。 ２ この断片を変性し、DNAポリメラーゼ
のKlenow断片（クレノー（Klenow）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国
（Proc、Natl.Acad.Sci.U.S.A.）65、168
〔1970〕）により、合成デオキシリボオリゴヌ
クレオチドプライマー5′−dATG TGT
AAT CTG TCTを用いて修複合成に処す
る。 ３ 得られた生成物をSau ３ ａで切断し、
１から150のアミノ酸を現わす452b.p.断片を
分離する。 ４ Sau ３ ａおよびPst でpLeIF Ｈを
消化し、得られた500b.p.断片を分離し、150
番目のアミノ酸からコード配列の最後までを
コードする遺伝子をうる。 ５ 段階(3)および(4)で分離した断片を連結し
て、断片 １ 166 mct cys asp 停止 ATG TGT…―｜…GAT TGA−…−Pst
Sau ３ ａ をうる。これはLeIF Ｈの166個のアミノ酸
をコードする。 ６ pLeIF Ａ trp25をXba で消化し、
DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、
生成物をPst で消化する。得られた大型
断片を分離し、段階(5)の生成物と連結させて
発現プラスミドとしうる。これは、E.coli
Ｋ−12株294または他の宿主細菌の転換に用
いて、成熟LeIF Ｈを発現しうる。 LeIF Ｉ ローン（Lawn）等により構成されたヒトゲ
ノムのフエースλ Charon 4A組換えライブ
ラリー（セル（Cell）、15、1157（1978））を、
上記引用のローン（Lawn）等の方法およびマ
ニアチス（Maniatis）等、セル（Cell）15、
687（1978）の方法により、白血球インタフエロ
ンに関してスクリーニングした。cDNAクロー
ンLeIF Ａに由来する放射性LeIFプローブを用
いて、約500000個のプラークをスクリーニング
した。６個のLeIFゲノムクローンを選び出し
た。再スクリーニングおよびプラーク精製につ
づいて、これらのクローンのうちのひとつ
λHLeIF ２を選びさらに分析した。 上記の方法を用いて、他のプローブも、ヒト
ゲノムからその他のLeIFクローンを分離する
のに有利に用いうる。ついで、これらは、本発
明によるその他の白血球インタフエロン蛋白質
を製造するのに用いうる。 １ クローンλHLeIF ２の2000b.p.EcoR断
片を、EcoR部位において、pBR325中へ、
サブクローン化した。得られたプラスミド
LeIF ＩをEcoRで切断し、2000b.p.断片を
分離した。この2000b.p.EcoR断片にデオ
キシオリゴヌクレオチドdAATTCTGCAG
（EcoR−Pst コンバーター）を連結し
た。得られた生成物をPst で切断し、Pst
末端を有する2000b.p.断片とした。これ
をSau 96で切断した。ひとつのPst およ
びひとつのSau 96末端を有する1100b.p.断片
を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｃ trp 35をPst お
よびXba で消化した。大型断片を分離し
た。 ３ pLeIF Ｃ trp 35よりの小型Xba −
Pst 断片をXba およびSau 96で消化
した。40b.p.Xba −Sau 96断片を分離し
た。 ４ 段階(1)、(2)および(3)より分離した断片を連
結して、pLeIF Ｉ trp1発現プラスミドと
した。このクローンはATCCに寄託されてい
る。 LeIF Ｊ １ プラスミドpLeIF Ｊは、LeIF Ｊ遺伝子
配列を含有するヒトゲノムDNAの3.8キロベ
ースHind断片を含有する。このプラスミ
ドから760b.p.Dde −Rsa 断片を分離
した。 ２ プラスミドpLeIF Ｂ trp ７をHindお
よびDde で切断し、340b.p.Hind−
Dde 断片を分離した。 ３ プラスミドpBR322をPst で切断し、
DNAポリメラーゼとインキユベートし、
平滑末端とし、（Klenow断片）、ついでHind
で消化した。大型（約3600b.p.）断片を分
離した。 ４ 段階(1)、(2)および(3)で分離した断片を連結
して、発現プラスミドpLeIF Ｊ trp １と
した。このクローンはATCCに寄託されてい
る。 Ｍ 精製 細菌抽出物中の白血球インタフエロン含有量
は、つぎのようにして、増加させうる。 １ ポリエチレン−イミン沈殿。ここで、イン
タフエロンを含めた細胞蛋白質の大部分は上
清に留まる。 ２ 硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフ
エロンは、55％飽和硫酸アンモニウムの溶液
中から析出する。 ３ 硫酸アンモニウムペレツトを0.06Mリン酸
カリウム、10ｍＭ Tris−HCl、PH7.2に懸
濁させ、25ｍＭ Tris−HCl、PH7.9に対し
て透析する。インタフエロン活性は溶液中に
残る。 ４ 上記の上清をPH8.5に調整してDEAE−セ
ルロースカラムでクロマトグラフイーを行う
（25ｍＭ Tris−HCl、PH8.5中０から0.2M
NaClの直線勾配で溶出）。 ５ チバクロム−ブルー−アガロース
（Cibachrome Blue−Agarose）またはヒド
ロキシルアパタイト（hydroxylapatite）に
吸着させ、1.5MKClまたは0.2Mリン酸塩で
溶出する（必要により実施）。 ６ セフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−75カ
ラムで分子をサイズ分けする。 ７ PH5.0の25ｍＭ酢酸アンモニウム中CM−セ
ルローズ上陽イオン交換クロマトグラフイー
を行う。酢酸アンモニウム勾配（0.2M酢酸
アンモニウムまで）で展開する。 上記の方法で＞95％純度の生成物を得る。 この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフ
イー、逆相（RP−８）高圧液体クロマトグラ
フイー、または固定化抗インタフエロン抗体上
のアフイニテイクロマトグラフイーで精製しう
る。 別法として、上記の段階４よりの物質をミル
ステイン（Milstein）、サイエンテイフイツク
アメリカン（Scientific American）243、66
（1980）記載のように調整したモノクロカレ抗
体カラムに加え、0.2M酢酸、0.1％トリトン
（Triton）および0.15MNaClで溶出しうる。 別様の有利な具体例として、上記操作で製造
した白血球インタフエロンをつぎの段階で精製
しうる。 １ 発現された白血球インタフエロンを含有す
る凍結細胞塊を、手作業または適当な粉砕装
置で砕く。部分的にとけた細胞を、PH7.5−
8.0に調整した0.1M Tris、10％（ｗ／ｖ）
スクロース、0.2MNaCl、５ｍＭ EDTA、
0.1ｍＭ PMSFおよび10−100ｍＭ MgCl₂
含有緩衝液Ａの４容量中に懸濁させる。懸濁
液は約４℃に保つ。 懸濁液は、約6000psiでホモジナイザーを
通し、ついで、1000psi以下で２度目を通す。
両方の通過よりのホモジナイザーからの流出
液は、氷浴中で冷却する。 ２ ホモジネートにポリエチレン−イミンをゆ
つくりと添加して、約0.35％濃度とし、約30
分放置する。固型物は遠心または濾過で除去
する。この段階は、温度を調節するかまた
は、上清（濾液）を10℃より低く保つように
十分にすみやかに実施する。上清（濾液）を
限外濾過で濃縮して、もとの容量の約1/10と
する。粒状物またはにごりを認めたら、ミク
ロポアメンブレンのような適当なフイルター
で除去しうる。 ３ 澄明化溶液は、５−８cm／時間（たとえ
ば、直径2.6cmのカラムで、25−40ml／時間）
でモノクロナル抗体カラムに直接流す。つい
でこのカラムを約10カラム容量の20ｍＭ
Tris−HCl、PH7.5−8.5（NaCl（0.5M）およ
びトリトン（Triton）Ｘ−100（0.2％）また
は同等の表面活性剤含有）で洗う。洗つたあ
と、このカラムに0.15MNaClおよびトリト
ン（Triton）Ｘ−100（0.1％）または同等の
表面活性剤を含有する約10カラム容量の溶液
を通す。このカラムをトリトン（Triton）
Ｘ−100（0.1％）または同等の表面活性剤を
含有する0.2M酢酸て溶出する。モノクロナ
ル抗体カラムよりの蛋白質ピーク（UV吸収
またはその他の方法で測定）を集め、1N
NaOHまたは1.0M Tris塩基でPHを約4.5に
調整する。 ４ プールされたインタフエロンピークを、適
当な緩衝液たとえば酢酸アンモニウムPH4.5
（50ｍＭ）で平衡させたホワツトマン
（Whatman）CM52セルロースまたは同等の
陽イオン交換体に加える。加えたあと、カラ
ムを平衡のための緩衝液で洗い、流出液の
UV吸収がたいらとなるに至らせ、カラムか
らはほとんど蛋白質が溶出しない状態とす
る。カラムをついで、25ｍＭ酢酸アンモニウ
ム／0.12M塩化ナトリウムまたはインタフエ
ロンの回収を最高とする組合わせで溶出し、
満足な外観および溶解性を有する凍結乾燥ケ
ーキとする。 上記したこの有利な具体例におけるモノクロ
ナル抗体は、ストーヘリン（Staehelin）等が
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc、
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）78、1848−52（1981）
に記載した方法で調製しうる。モノクロナル抗
体は、下記するように、精製し、アフイゲル
（Affigel）−10に共有結合させる。 腹水液よりのモノクロナル抗体の調製および精
製 雌Balb／ｃマウス５頭のそれぞれに、対数
増殖期の中間でとつたハイブリドーマ
（hybridoma）細胞の５−10×10⁶個を接種し
た。マウスの生成する腹水液から得た約５×
10⁶個の生育しうる細胞を、10または10頭より
多くのマウスのそれそれに腹腔内接種した。こ
の腹水液を各マウスより反復（２から４回）採
取した。ひとつの群のマウスからつぎの群のマ
ウスに、３回まで、移しかえおよび採取を行な
つた。それぞれの移しかえ毎に、採取腹水液を
プールした。 低速遠心（500−1000×ｇ）で15分間処理し、
腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで
18000rpmで90分遠心した。上清を凍結させマ
イナス20℃に貯蔵した。融解させてから、
35000rpmで90分間遠心し、さらにフイブリン
および粒状物を除いた。各移しかえごとの腹水
液のバツチについて、固体相抗体結合試験（ス
トーヘリン（Staehelin）等、上記引用文献）
により特異抗体活性を試験し、満足ならばプー
ルした。 プールされた溶液中の蛋白質濃度は、１mgの
蛋白質が1.0cmの厚さのキユベツトで280nｍで
1.2の吸光値を示すという近似法で測定した。
高濃度の抗体を有する腹水液は30−35mg蛋白
質／mlを含有する。これは、４−７mg特異抗
体／mlに相当する。この液体をPBS（0.01Mリ
ン酸ナトリウム、PH7.3、0.15M NaCl）で希釈
し、10から12mg／mlの蛋白質濃度とした。 希釈溶液の各100mlに、室温で飽和した硫酸
アンモニウム溶液90mlを、０℃ではげしくかく
はんしながら添加した。懸濁液を40から60分間
氷中に保つた。ついで、４℃で、10000rpmで
15分遠心した。上清をけいしやして除き、十分
に液を切つた。蛋白質塊を0.02M Tris HCl
（PH7.9）／0.04M NaCl（緩衝液）に溶解し
た。蛋白質溶液を、100容量の緩衝液に対し
て、室温で16から18時間透析した。その間、少
なくとも１度緩衝液を交換した。透析溶液を
15000rpmで10分間遠心し、不溶物を除いた。
腹水中の全蛋白質の最初の量の約30から35％
が、280nｍの吸光値より概算して採取された。 次いで、１mlについて30−40mgの蛋白質を含
有する溶液をバツフアー（Buffer）で平衡
させたDEAE−セルロースカラムに加えた。添
加する蛋白質１グラムについて少なくとも100
mlのカラム床容量とした。0.02M Tris HCl
PH7.9中NaClを0.04Mから0.5M NaCl濃度に直
線状にNaCl濃度を変化させて、カラムより抗
体を溶出した。0.06から0.1M NaClのピーク分
画をプールし、等容量の硫酸アンモニウム飽和
溶液（室温）を加え沈殿遠心し、濃縮した。蛋
白質塊を0.2M NaHCO₃（PH約8.0）／0.3M
NaCl（緩衝液）に溶解し、室温で、同じ緩衝
液（３度交換）に対して透析した。透析した溶
液を20000×ｇで15分遠心し、不溶物を除いた。
蛋白質濃度を緩衝液で20から25mg／mlとし
た。 免疫吸着剤の調製 アフイゲル（Affigel）−10〔バイオ ラドラ
ボラトリイス、リツチモンド、カリホルニア
（Bio Rad Laboratories、Richmond、
California）をグラスフイルター上で氷冷イソ
プロパノールで３度洗い、ついで氷冷蒸留水で
３度洗つた。ゲルスラリー（冷水中約50％）を
プラスチツクチユーブに移し、短時間遠心して
沈降させた。上清をアスピレーターで除き、パ
ツクされたゲルを等容量の精製抗体溶液と混合
し、４℃で５時間、長軸が円状に廻転するよう
に回転した。反応後、ゲルを遠心し、緩衝液
（0.1M NaHCO₃／0.15M NaCl）で２度洗い、
非結合抗体を除いた。洗液を合併し蛋白質を測
定すると、90％以上の抗体がゲルに結合してい
た。 未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量
の0.1Mエタノールアミン・HCl（PH８）と混合
し、長軸を円こ状に回転させて室温で60分処理
した。ゲルスラリーよりPBSで洗浄して反応
剤を除き、４℃で0.02％（ｗ／ｖ）のアジ化ナ
トリウムの存在でPBSに貯蔵した。 Ｎ 非経口投与 LeIFは、抗腫瘍または抗ウイルス治療を要
する患者に非経口投与しうる。また、免疫抑制
状態を示す患者にも投与しうる。投与量および
投与割合は、ヒト由来の物質について現在臨床
的に行なわれているのと同様にする。たとえ
ば、約（１−10）×10⁶単位／日で１％より大の
純度の場合には、たとえば５×10⁷単位／日に
及びうる。 非経口投与用の形態とした本質的に均一な細
菌性LeIFの適当な投与形態では、たとえば、
２×10⁸単位／mgの比活性のLeIF3mgを25mlの
5Nヒト血清アルブミンに溶解し、この溶液を
生物学的フイルターを通し、濾過溶液を無菌的
に100本のびんに分けて、非経口投与に適当な
ように、１本が６×10⁶単位純インタフエロン
を含有するようにする。これらのびんは、使用
前は冷所（−20℃）に保つのが望ましい。 本発明の化合物は、医療として有用な組成物を
調製するための既知の方法に従つて製剤化でき
る。その際、このポリペプチドは、医薬として許
容されうる担体ビヒクルと混合する。適当なビヒ
クルおよびそれらの製剤化については、マーチン
（E.W.Martin）によるレミントンズ フアーマセ
ウチカル サイエンス（Remington′s
Pharmaceutical Sciences）に記載されていると
おりである。これを、本明細書の参考文献として
引用する。これらの組成物では、インタフエロン
蛋白質の有効量と適当な量のビヒクルとをあわせ
て、宿主に対して効果的な投与とするに適当な、
医薬として許容されうる組成物とする。ひとつの
有利な投与形態は非経口投与である。

【図面の簡単な説明】

第１図は可能性のあるLeIFプラスミドと ³²p
ラベル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリド化を示すオートラジオグラムである。第２
図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型（Ａか
らＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成
をコードする遺伝子の構築を示す。第４図および
第５図はLeIF Ｂ成熟白血球インタ−フエロンを
発現するために用いられる２つの遺伝子断片の制
限地図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト白血球由来の遺伝子の発現により得るこ
   とができる成熟ヒト白血球インタフエロンであつ
   て、165−166個のアミノ酸を有し、部分アミノ酸
   配列Cys−Ala−Trp−Glu−Val−Val−Arg−
   Ala−Glu−Ile−Met−Arg−Serを含み、かつ
   114位にアミノ酸Asp、GluまたはValの一つを有
   し、このインタフエロンの第一番目のアミノ酸の
   Ｎ末端にメチオニンが結合している場合は、166
   −167個のアミノ酸を有し、かつ115位にアミノ酸
   Asp、GluまたはValの一つを有する成熟ヒト白
   血球インタフエロンの製造にあたり、 (a)(i) 該成熟ヒト白血球インタフエロンのコード
   領域を含む遺伝子を該コード領域内の末端近
   くに位置する制限酵素切断部位で切断し、該
   コード領域の5′−末端側を除いた遺伝子制限
   断片を得る工程、 (ii) ATG翻訳開始コドンを有し、該コドンに
   連続する塩基配列が前記工程(i)で除かれた
   5′−末端側のコード領域と同じアミノ酸配列
   をコードするDNA断片を調製する工程、 (iii) 該遺伝子制限断片と該DNA断片とを連結
   し、ATG翻訳開始コドンに連なる該成熟ヒ
   ト白血球インタフエロンコード領域を有する
   遺伝子を構築する工程、及び、 (iv) 該遺伝子と遺伝子発現調節因子と自己複製
   に不可欠な領域（ori）とを連結する工程 を組合せて微生物発現ビヒクルを構築し、 (b) 上記工程(a)で得た微生物発現ビヒクルで公知
   方法により微生物を形質転換し、 (c) 得られた形質転換微生物を培地中で発育さ
   せ、 (d) この形質転換微生物を溶解し、成熟ヒト白血
   球インタフエロンをその他の微生物蛋白質から
   分離精製することにより採取する ことを特徴とする成熟ヒト白血球インタエロンの
   製造方法。 ２ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＡ（LeIF Ａ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ３ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＢ（LeIF Ｂ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ４ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＣ（LeIF Ｃ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ５ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＤ（LeIF Ｄ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ６ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＦ（LeIF Ｆ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ７ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＨ（LeIF Ｈ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ８ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＩ（LeIF Ｉ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 ９ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＪ（LeIF Ｊ）である特許請
   求の範囲第１項の製造方法。 １０ 微生物がE.coliである特許請求の範囲第１
   〜９項のいずれか一つの製造方法。