JPS58190398A - インシユリンへのプレプロインシユリン類似体の変換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はツレプロインシュリン類似体をインシュリンの
％電点以下のｐＨでトリプシンまたは類似のエンドＲプ
チグー七の存在下に天然アミノ酸のエステルまたはその
誘導体と反応させそして次にエステル基および場合によ
り存在ゴる他の保詐基を除去することを特徴とするプレ
ツロインシュリン類似体からのインシュリンの製法に関
する。

種々の方法を用いてそれ自体既知の酵素触媒されたアミ
ド交換により豚インシュリンを変換しうる〔例えばドイ
ツ特許出願公開第３１０４４９号明１ＩＥ１１５および
Ｒ、Ｏｂｓｒｍｅｉｅｒ氏他著［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓＮｅｕｅ　Ｉｎ５ｕｌｘｎｅＪ　１９８１年版癖照］
。それと並んでプロインシュリンおよび中間体インシュ
リンからインシュリンを生成させる１段階法も過当であ
る。トリプシンを用いると、庖定の方法による条件下洗
豚インシュリン変換させるに際しＬｙ、Ｂ　２９−　Ａ
　Ｉ、Ｂ　ｓＤ○Ｈの−Ｌｙｅ　　−Ｔｈｒ−０−−ｍ
ステルへのアミド交換が起り、このものから既知のエス
テル分解法により遊離のインシュリンが豹トされる。ソ
ロインシュリンまたは中間体インシュリンの場合は−Ｌ
ｙｓ）３２９−　Ａｌａ”０−　Ａｒｙ。

ＡｒｇのＬｙｓ　　−Ｔｂｒ　−０−エステルおよびさ
ら処ヒトまたは動物の体内で形成されるインシュリンは
はじめは線状のプレプロインシュリンの形態で人手され
、その場合Ｎ−末端Ｐｈｅ”に結合したブレ順列は約２
４個のアミノ醇基から構成される。機態としては蛋白質
生合成ならびに合成細胞の膜による輸送メカニズムにお
ける信号作用がこの分子によるものとされる。

天然の豚インシュリンからのヒトインシュリンの上記半
合成的Ｍは変形された大腸菌ＤＮＡのキメラ遺伝因子生
成物としてのヒトインシュリンの取得によりますます排
除されてき【いる。

この遺伝子工学的方法は、シグナルヌクレオチド部分を
変化させることにより天然のプレブロインシュリ／撃似
生成物を産生させることができる。かかるアミノ酸順列
変更の目標は、インシュリンへの至適分解ができる類似
プレプロインシュリンの生合成である。既知方法（Ａ、
Ｄ。

Ｒ１ｇｇｇ＋氏他著「ＰｅｐｔｉｄｅｓＪ　１９７９年
版第９８５〜９９２頁奈照うでは、プレ順列を変形させ
てメチオニン基を介してプロインシュリンのＮ−末端Ｐ
ｈｉ”に結合させるので、−Ｍｅｔ　−ＰｈｅＢｌ−結
合はＢｒＣＮ法（［Ｊ　、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、Ｊ第
２３７巻第１８５６負（１９６２年）参照〕により分解
されうる。生ずるプロインシュリンは次に酵素的方法［
Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅｍ、Ｊ第２４６巻第３７８６ｊＪ（１９７１年）
癖照〕でトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを
用いてヒトインシュリンに変換される。

Ｂｒ　ＣＮ分解そして第２段階での続く酵ｌＬａ金物で
の処理も非特異的反応により最終生成物のがなりの損失
が惹起されさる。それゆえ、遺伝子工学的に取得された
類似プレプロインシュリンから高収紮で、すなわちでき
るだけ少ない反応工程でインシュリンを取得する方法を
開発するのが望ましい。

この課題は、相当するプレプロインシュリンにおいて所
望のアミノ酸エステルの存在下にトリプシンまたは類似
酵素によりＰｈｅ”’およびＧｌｙＡｌのＮ−末端ペプ
チド結合のアミド交換およびＬｙ　ｓ　Ｂ　２９のアミ
ド交換を１拍時に実施することを特徴とする、プレプロ
インシュリン類似体からのインシュリンの製法（こより
触法された。

類似プレプロインシュリンは、プロインシュリンのＮ−
末端にリジンまたはアルキニンまたはそのアシルアミノ
アシル基をブレ順夕１］のカルホキシル末端として侑す
るものである（下記弐Ｂ−頻 式中ＹはＬｙｓまたはＡｒｇでありそしてＲ１は水素、
Ｌ−アミノ酸または以下に記載されるペプチド基Ｘを意
味する。

Ｘはシグナル順列として役立てられるペプチドのいずれ
でもよい。プロインシュリン部分としては、天然かまた
は合成的に既知のヌクレオチドｐ＋製法により変化され
たプロインシュリンでコード化されるあらゆる生成物が
適する３例えば豚のＣ−ペプチドに対する牛のＣ−はプ
チドの場合にそうであるように短縮されたＣ−ペプチド
順列を有する類似プレプロインシュリンも同様に本方法
にあげられる。声」様にヒトプレプロインシュリン類似
体も適当である。Ｃ−ペプチドの構造にとってそれが塩
基性Ｌ−アミノ酸Ｙ　＝　Ｌ　−ＡｒｇまたはＬ　−Ｌ
ｙｅを介し工インシュリン人鎖のグリシンと結合する、
すなわち構造Ｙ　−（Ａ８）ｎ　−Ｙ　（ここでＡｓは
コード化司熊なが存在することが必須要件である。遊離
のアミノ基を有するアミノ酸エステルおよヒ／ｌ　九ハ
　　　　　　ゞその誘導体は、所望の場合は天然でない
順列のインシュリン類似体が生ずるように本方法に選択
されうる。

好ましいのは天然に存在するインシュリンのＢ２Ｏ位の
末端アミノ酸・のエステルまたはエステルの誘導体であ
る。好ましいのは（０１〜Ｃ６）−アルキルエステル（
例えば第３ブチルエステル）および（０７〜Ｃ１９）−
アラルキルエステル（例えばベンズヒドリル、トリチル
ま九はフルオレニルエステル）、特にＡｈａ−ＯｔＢｕ
およびＴｈｒ　（ｔＢｕ）ＯｔＢｕである。適当なＬ−
スレオニンエステルの例はＬ−スレオニン第３ブチルエ
ステル、Ｌ−スレオニン第５ブチル−〇−第５ブチルエ
ステルおよびＬ−スレオニンメチルエステルである。本
発明の意味における遊１のアミノ基を育するスレオニン
エステルの誘導体にハ、スレオニンのＯＨ官能基に保護
基特にエーテル保護基を有するものがある。特に好まし
いエステル保護基は（０１〜Ｃ６）−アルキル特に第３
ブチルおよび（ｃ７〜０１９）−アラルキル特にベンズ
ヒドリル、トリチルまたはフルオレニルである。

遊離のアミノ基を有する場合によや保護され九アミノ酸
エステルまたはその誘導体はインシュリンに対するモル
比１：５０〜１　：５０（）、好ましくは１：１００〜
１：２５０で使用される。この反応はｐＨ５，５以下、
好ましくは褌４８〜５．０にて＋２〜＋３７℃、好まし
くは＋４〜＋１０℃で実施される。

トリノ’／　７　（Ｂｏｙｅｒ氏等＠４　［Ｔｈｅ　Ｋ
ｎｚｙｍａｅ　Ｊ第４巻第１１９〜１５２員（第４版）
および同第３巻嶋２５０〜２７５頁（第３版）参照〕と
並んで、文献上トリプシン類似であると知られるもの、
すなわち塩基性アミノ酸のカルボキシル末端で特定のペ
プチド結合を切断するエンドはブチダーゼも本発明方法
に適する〔例えば「ＫｏｎｔａｋｔｅＭｅｒｃｋ　Ｊ　
１　／　７５第８〜１０頁および２／７３第３〜８員、
　「Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　Ｊ第３４８
巻第１６１９Ｍ（１９６７年）、「Ｏｏｍｐｔ、　Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｊ第２８巻第１２７
５頁０９６９年）　、［ｚ、　ＰｈｙｓｉｏｌＣｈｅｍ
、　Ｊ第５５２巻第５８６頁（１９７１年）、「Ａｒｃ
ｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｊ第１２９巻第
６２０頁（１９６９年）および第１２６巻第９７１頁（
１９６８年）および「Ｂｉｏｃｈｓｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｅ、　Ｒｅｓ、　Ｏｏｍｍ、Ｊ第５７巻第９９頁（１９
６９年）参照〕。使用される酵素の狐はプレプロインシ
ュリン類似体：酵素のｉｔ比に基づき１：１〜１００：
１でありうる。好ましくは重φ４比１０：１〜４：１で
操作する。

本発明による反応ははじめにインシュリンのＢ３０エス
テルを生じ、これが所望の場合はそれ自体既知の方法に
よりエステル基の分解および場合により保護基の除去を
行うことにより相当する遊離のインシュリンに変換され
うる。

エステルは遊離のインシュリンに変換されるに先立って
例えば既知のカラムクロマトグラフィー法による必要な
精製操作を受けうる。

得られるインシュリンは慣用の投薬形態に―製されそし
て糖尿病治療のための医薬として使用されうる。

後掲の例において使用されるプレプロインシュリン類似
体は実質上既知方法（Ｖ　、Ｋ　、　Ｎａｉ　ｔｈａｎ
ｉ氏他著［Ｉｎ５ｕｌｉｎｓ　ｊ（Ｄ、Ｂｒａｎｄｅｎ
ｂｕｒｇおよび人。

Ｗａｌ１ｍａｒ両氏編＞１９８０年版ｆｔ４９９〜１０
６貞参照〕ニ従いプ０　イア　シ、：ＬリンをＢＯＣ−
Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ。

ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＡｄＯＣ）７−ＯＨ％ＢＯＣ−Ａｌａ
−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ％ＢＯＣ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ（ｐ、ｄＯＣ）２−ＯＲ，ＢＯＣ−Ｇｉｎ
（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＬｙＳ（ｂＯｃ）−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ（ＡｄＯＣ）２−ＯＨおよびＢＯＣ−Ｇｌ＋
１（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−０Ｈの混合無水物を用いて直
接アシル化することにより得られた。化合物の精製はイ
オン交撲体を用（・て、そして保静基の除去はトリフル
オロ酢酪を用〜・て遂行された。それぞれのアミン販分
析値は理論値と一致した。

例　１ Ｏ− ａ）牛のＬｙｓ　　　プロインシュリｙ　７５ＩＩＰを
ＡＩ−ａ。

（ｔＢｑ）　２５０１１ｖと一緒に水０．５　ｗｌｔに
溶解させそしてｐＨ値を氷酢酸を用いて４８にｖ１４Ｓ
する。このｔ　Ｐ２１．に水０．１　ｍに溶解した８■
のトリプシンを加える。４℃で１６時開放齢後アセトン
６８―を用いて沈殿させることにより反応を停止させる
。ｗ殿を遠心分離する。エーテルで洗ったのち真空下に
乾恢する。

この粗製物質をシリカゲルカラム上でクロロホルム／メ
タノール／水／トリエチルアミン／１に酸（＝６００１
５００／１２０／１５／３）溶媒系を用いてクロマトグ
ラフィー処理する。最初に溶出してくるピークを業めそ
して真空下に小量となるまで一縮する。この溶液にアセ
トン２５ｍｇを加えそして沈殿した牛インシュリンＢ５
０−エステルを遠心分離する。この沈殿をエーテルで洗
いそして丼空下に乾燥する。牛インシュリフ　−Ｂ　３
０−　ｔＢｕの収には４１岬であった。

ｂ）牛インシュリンＢ５０−ニスグル２５＋＋ｖをトリ
フルオロ酸ｉ（０，５ｍ）に溶解させそして呈温で６０
分間放りする。次にエーテル５ｇＩｔを加えそして沈殿
した遅番の牛インシュリンを遠心分離しそしてエーテル
で洗った後真空下に乾燥する。収ζ２６ｑ０ アミノ酸分析、ＨＰＬＣ溶離時間および生物学的゛ｒ占
性は牛インシュリンと同じ仙−を示す。

例　　２ Ｌｙｓ　　−牛インシュリン（［Ｃｈｅｍｉｋｅｒ−Ｚ
ｅｉｔｕｎｇ　Ｊ第１００巻第１１１頁（１９７６年）
およびＲ、Ｇｏ　ｉ　ｇＱ　ｒ代著［Ｍｅｌａｃｕｌａ
ｒ　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙＪ　（ＭａｃＩｎｔｙ
ｒｅ＆　５ｅｌｋｅ両氏＠）挑２７〜４１頁参照〕５０
０ｗＩｆをＡｌａＯ（ｔＢｕ・）：　２　ｔと共に水３
．０−に溶解させる。

酢酸を用いてｐＨ４，５に調整する。このインシュリン
溶液に水α５−に溶解したトリプシン２０〜を添加する
。あとは例１ａの記載と一１様にして操作する。ＨＰＬ
Ｃ分析によれば６７％の牛インシュリンＢ　３０−　Ａ
ｌａ　Ｏ（ｔＢｕ）をフカする粗製物餉の収ｉは５６６
■であった。カラムクロマトグラフィー精製後の収１は
４０９■である。

エステルの除去はｖｌｌｂの記載と同様にして遂イテさ
れる。

例　　３ 牛のＡｌａ、−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ　　−プロインシュリン
（前掲の論製法参敗）７５■を例１の記載と同様であろ
がただし−７℃およびｐＨ４，５においてトリプシンお
よびＡｌａ　Ｏｔａｕと反応させる。１６時間放置後、
後処理しそして生成した牛インシュリンＢ５０−エステ
ルをクロマトグラフィー分離する。収量４７ｗｑ。

この物質のアミノ酸分析は牛インシュリンのそれと一致
する。

エステルの除去は例１ｂの記載と同様にして逆行される
。

例　　４ Ｏ− 豚のＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ　　　プロインシュリン（
例３の記載と同様にして調製）７５ｑを＋９℃およびｐ
Ｈ４，４１Ｃおいて例３の記載と同様にしてＡｌａＯｔ
Ｂｕ　と反応させそして後処理する。豚インシュリンエ
ステルの収量は３９１１ＩＩであった（後処理は例１ｂ
の記載と同様である）。

例　　５ 豚のＡｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ　　−プロインシュリン７
５ｗｑを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存在下
にＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ　５００　’１２と反応さ
せる。１６時間反応させたのちヒトインシュリンＢ３０
〜（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ　４９１１Ｆが単離されうる。

これを例１ｂの記載と同様にしてさらに操作する。

例　　６ Ｏ− 牛のＡｒｇ　　　プロインシュリン７５Ｗをトリプシン
の存在下にｆＩＪｌａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢ
ｕ）ＯｔＢｕ　５００　Ｉｖと反応させる。−夜放置後
、例１ａの記載と同様にして後処理する。牛インシュリ
フ　Ｂ　３０−　Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収ｌは４
５ｗｌ１であり、これを例１ｂの記載に従いさらに操作
する。

例　７ Ｏ− 豚のＡｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ　　　プロインシュリン７
５ダを例１ａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢｕ）Ｏｔ
Ｂｕ４００１１Ｆと反応させる。６℃で２０時間反応後
のヒトインシュリンＢ　５０　（ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収
１は３９〜である（以後の掃作は例１ｂの記載と同様処
して行う）。

例　　８ 牛のＧｉｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−ＬｙｓＢｏ−プロインシュリン５１１ＦをＡｌａＯｔ
Ｂｕ　１５　ｗ／と共に水［１１１に溶解させる。痕跡
量の木酢幣を用いてｐＨを４〜５に１’！！ｈｌ−そし
てトリプシン１Ｍ９を加えそして４℃で２４時間反応さ
せる。ＨＰＬＣＫよれば６３チの牛インシュリンＢｇｏ
−ｔＢｕが測定され、これを例１ｂの記載と同様にして
さらに処理する。

例　　９ 豚のＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−ＡｒｇＢＯ−プロインシュリン５■を例８の記載と１
１ｆｆ＋様にして酎（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ　２５　’１？
と反え、させる。２４ＰＦ間反応させた後ＨＰＬＣＫよ
れば７１チのヒトインシュリンＢ　３０−　（ｔＢｕ）
ＯｔＢｕが分析された。製造用几を用いてエステルを単
象できた。収′％２．８ｗｑ０第３ブチル保護基を常法
により除去した後の生成物はＨＰＬＣおよびアミノ酸分
析でヒトインシュリンと同一であった。

例　　１０ 豚のＰｒｏ−Ａｌａ−人１ａ−Ｌｙｓ”−プロインシュ
リン７５ηを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存
在下Ｋ　Ｔｈｒ（ｔ８ｕ）ＯｔＢｕ　５００　ｗＩ！と
反応させる。

１６時間反応させた後に５２〜のヒトインシュリフ　Ｂ
　３０−　（ｔＢｕ）−０ｔＢｕが単離され得る。これ
を例１ｂの記載と同様にしてさらに操作する。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンケセルシャフド−
〕代゛ 手続補正書 昭和５８年６月９日 特許庁長官　着　杉和　夫　殿 １、＊件の表示 昭和５８１１′、特許願第　５９２９８　号２、　発明
ノ名称　　インシュリンへのプレプロインクニリン類似
体の変換法 ３、補正をする考 ・１ｆ件との関係　特許出願人 名称　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト４、代理
人 ｉｔ　　所　　東中部ｒ代１１１１ズ缶Ｉ町３ｒｔｉ２
番地（、相Ｊ１ザ５−ビル）５、補正命令の１１イ・１
　（自発） 昭和　　年　　月　　１１（発送１１　　昭＆１４正ｏ
対象　明細蓄の特許請求の範囲の樫７、補正の内容 特許請求の範囲を別紙のとおり補正します。

以北 ２、ＩＩＩｇ許請求の範囲 １）プレプロインシュリン類似体をインシュリンの等ｔ
、点以下のｐＨでトリプシンまたはトリプシン類似のエ
ンドはプチターゼの存在下に天然アミノ酸のエステ、ｖ
ｊたはその誘導体と反応させそして次にエステル基およ
び場合により存在する他の保護基を除去することを特徴
とする、プレプロインシュリン類（１からのインシュリ
ンの製法。

２）使用されるアミノ酸誘導体がＡｈａ−ＯｔＢｕまた
はＴｈｒ　（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ　′ｔ？あること全特徴
とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。

３）　　ｐＨ五８〜Ｓ５で操作が行なわれる前記特許請
求の範囲第１項記載の方法。

４）　　ｐＨ五８〜５０で操作が行なわれる前記特許請
求の範囲第１項記載の方法。

５）酵素−基ｖＬ重貴比が１：１〜に１００である前記
層許請求の範囲第１項記載の方法。

司　酵素−基買敵飯比が１：４〜１：１０である前記特
許請求の範囲第１項記載の方法。

Ｈｓｏ〜ｓｏｎ倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはそ
のａＳ体が使用される前記峙許罷求の範囲＠ｉ項記載の
方法。

８）　　１００〜２５０倍モル過剰のアミノ酸エステル
また社その誘導体が使用される前記特許請求の範囲第１
項記載の方法。

９）反応温度が＋２〜４−３７℃である前記特許請求の
範囲第１項記載の方法。

１０）反応温度が＋４〜１１０℃である前記特許請求の
範囲第１項記載の方法。

１１１　　ｐＦｆ＆８〜５５で４作が行なわれ、酵素−
基質ＩＩＩ比が１：１〜１：１ｎＯにあり、５０〜５ｆ
’ｌｎ倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されてして反応温度が１２〜÷３７℃であること
？：％徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。

１２）　　ｐＦＴ五８〜５．０で操作が行なわれ、酵素
−基１ｉ、重量比が１：４〜１：１０にあり、１００〜
２５０倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されそして反♂温度が＋４〜＋１０℃であること
を特徴とする特許 囲第１項記載の方法。

６４７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プレプロインシュリン類似体をインシュリンの等電
   点以下の坦でトリプシンまたは類似のエンドベプチタ；
   ゼの存在下に天然アミノ酸のエステルまたはその誘導体
   と反応させそして次にエステル基および場合により存在
   する他の保饅基を除去することを！徴とする、プレプロ
   インシュリン類似体からのインシュリンの製法。 ２）使用されるアミノ醒誘導体がＡｌａ−ＯｔＢｕまた
   はＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕであることを特徴とする特
   許３）　　ｐＨ３．８〜５５で操作が行われ、酵弊一基
   簀１を比が１；１〜１：１［１（３にあり、５０〜５０
   ０倍モル迦剰のアミノ艶・エステルまたはその誘導体が
   使用されそして反応温度が＋２〜＋３７℃であることを
   待機とする罰記％許膀求の範囲第１項記載の方法。 ４）ｐＨ３．８〜５０で操作が行われ、醇象一基質▲ゑ
   比が１：４〜１：１０にあり、１００〜２５０倍モル過
   剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体が使用されそし
   て反応温度が＋４〜＋１０℃であることを特徴とするｐ
   ＋１記特ト論求の範囲第１項記載の方法。