JPS58190759A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に分析化学、特に流体中の予め定られた
特定成分を分析する分析素子に関し、更、Ｃ詳しくは生
物学的流体試料中のリパーゼを分析するための定量分析
素子に関する、 従来、流体試料中の検体成分を分析する方法は、多数開
発がなされてき九が、それらは大別して、溶液内での反
応系と、固相の反応系の二樵類に分けられている。

溶液系における分析ス応（以下ウエットケミストリイと
略す）は、用手法と呼ばれる全く機械を用いない力析操
作法から、近年臨床検査室等で多用されている自動定量
分析装置まで、多々知られでいる。

このうち、特に自動定量分析装置は就中血液の分析に用
いられ有用である。例えば米国籍ｆ４Ｆｌ／Ｅ２．７９
７，１４９号に記載された連続流れ分析に基づく分析装
置はこの代表的なものである。

これらは、流体試料、希釈剤および分析試薬を混合し、
分析装置内へ移送し、分析反応および定量測定を行うと
いうものである。しかし々から、このような連続分析装
置は、複雑かつ高価であり、熟練し九操作技術を必要と
し、また分析操作の後には必らず繰返し洗浄操作が必要
とされ、これを行なうには多大な時間と努力を浪費し、
かつこれらの廃液は必然的に環境汚染を起こすという欠
点を有する。

一方、同相の分析反応（以下、ドライヶミストリイと略
す）を用いる分析法も広範に用いられている。例えば米
国特許第３，０５０，３７３号あるいは同３．０６１，
５２３号等に記載の如く、濾紙の如き吸水性担体に試薬
溶液を含浸させ、乾燥して作られるものである。

これらは、一般に分析試験紙または率に試験片上に流体
試料を滴下するか、または流体試料中へ試験片を浸漬さ
せ、試験片の色変化またはａｌ１度変化を肉眼判定か、
または反射濃度針により測定し、流体試料中の特定成分
のＩｉｌ：ｆレベルを決定するものである。これらの試
料片は、その取扱いが簡便であり、かつＩＨちｅＣ結果
が得られるので有用であるが、その構成上から、半定量
または定性分析の傾城にとどまっているものである。

前述のａｎき従来の分析方法に対して、操作法のｍ便な
ドライケミストリイを用ｂ１かっ高い定着性を１するも
のとして、特公昭５３−２１６７７号に記載のある如き
血液分析要素が提案されている。この提案は、光透過性
液体不浸透性支持体上の一側に位置し、流体試料中の成
分と反応する少くとも一層の試薬を含み、かつ親水性コ
ロイドからなる少くとも一層の試薬１１＃と、該試薬層
の上記支持体とは反対側に位置し、流体試料中の成分を
該支持しかしながら、ゼラチンの如き親水性コロイドか
らなる試薬層と組み合わされた上記血液分析要素は、そ
の親水性コロイドが形成するポリマーマトリックス中に
は、リパーゼの如き高い分子ｔを有する★白質は、浸透
不可能であ・ノ、従って上記提案による分析素子では定
量分析が不可能であるという致命的欠点を有している。

そこで本発明の目的は、前記の如き欠点を改良した流体
試料中に存在するリパーゼの如き縄い分子量をもった蛋
白質の分析が定量的に行ない得る分析素子を提供するこ
とにある。

前記の目的は、本発明によれば光透過性、液体不浸透性
の支持体と、該支持体の一側に位置し流体試料を収納す
ることが可能な少くとも一層の検知層と、該検知層の該
支持体とは反対側に位置し、該流体試料を該検知層へ供
給する少くとも一層の展開層を有する分析素子であって
、該検知層および該展開層のいづれか一方に次の一般式
で示される化合物を含有する分析素子によシ運成するこ
とができる。

一般式 式中、Ｍはアルカリ金属を表わし、ｎは０〜３０の整数
をホす。すなわち、本発明は支持体上に検知層と展開層
とを有する分析素子の検知層か展開層に、流体試料中の
脂肪分解酵素であるリパーゼと反応してアゾｇ木を形成
し得る前記一般式で表わされる化合物を含有せしめたこ
とを特徴とし、上δｃ　ｔｘ　ｃｃ、によるアゾ色素の
生成速度を時間的に測定することによシ流体試料中のリ
パーゼの活性を定ｔ　１１’Ｊに快矧し得る如く改良さ
れた分析素子を提案するものである。

以ドに、史に詳細に本発明を説明する。

先づ、本発明の分析素子は、基本的には支狩体七し・ζ
ｊ−次検知Ｉ−と展開層とｒ設けた構成になるものであ
る。本発明に係わる検知層は、一般的には親水性コロイ
ド物質からなるものが知られており、この場合の親水性
コロイド物質としては、例えばゼラチン、フタール化ゼ
ラチン等の如きゼラチン−導体、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等を挙げ
ることかでｊ己。また曲の構成になる検−（１１層の−
１１として、特願昭５６−１５５７８８号に記載されて
いるように高分子粒子結合層を検知層として用いること
もできる。

この高分子粒子結合層からなる検知層は、酵素の如き巨
大分子量を有する物質を該層内に収納するのに適してお
り、従って上記の酵素を・−内で検出することができる
。本発明における検知層のψ厚は、約８０ミクロン乃至
１０ミクロン、好ま（〜くけ約６０ミクロン乃至約２０
ミクロンであるっま九本発明に係わる展開層は特公昭５
３−２１６７７号に１叔された如き次のごとき３つの機
能を有する１−である。

（１）一定容量の流体試料を単位面績当り一定谷着にお
いて検知層内に均一に配布し、 （２）死体試料中の分析反応を阻害する物質、又は要因
を除去し、 （３）分光光度分析を行う際に支持体をへて透過する測
定光を反射するバックグラウンド作用を行なう。

従って本発明に糸わる展開層は、これら３つの機能を全
て行ないつるが、又、３つの権能を適宜分離し、各機能
毎に別の層を使用することも可能である。

更に３つの機能のうち２つの機能を有する層と残シの他
の機能を有する層を組合わせ使用することもできる。

例えば前記刊行物記載の二酸化チタンおよび二酢酸セル
ロースからなるプラッシ翼ポリマーと呼ばれる非Ｍ維多
孔質媒体の展開層、特開昭５６−２４５７６号、特願昭
５６−１３２０３号および同５６−６５４４６号等に記
載され九繊維構造展開層等を挙げることができる。特に
この繊維構造展開層は血球部分も速やかに移送すること
ができる素材として有用であり、本発明に係れる巨大分
子の展開移送に有効な展開層として用うろことができる
。

前記展開層の膜厚は、展開層の空隙率及び滴下する流体
試料の量によって決定されるが、好ましくは約４００ミ
クロン乃至約８０ミクロン、更に好ましくは約３５０ミ
クロン乃至約１００ミクロンである。

例えば前記の繊維構造展開層を用い約ｌθマイクロリッ
トルの試料を滴下する際、核層の膜厚は好ましくけ約１
２０ミクロン乃至約２２０ミクロンである。

次に上記の展開層または検知層に含有せしめられる前記
一般式で表わされる化合物は、下記の反応式に従い、リ
パーゼの作用によりアゾ色素化合物を形成する。

この形成されたアゾ色素化合物は４７５ｎｍ　ｉｃ％像
的な吸収を有しておシ、本発明においては、固相の分析
素子内で上記色素の吸収を測定することによシリパーゼ
の活性を検知するものである。

本発明に係わる化合物は、前記により明白な通シ、リパ
ーゼにより加水分解される色素前駆体の一檜であり、前
記一般式におけるｎの数は好ましくは５乃至２０であり
、更に好ましくは８乃至１６の整数である。前記一般式
で表わされる化合物を検知層中に含有させる場合には、
前述の特願昭５６−１５５７８８号記載の高分子粒子結
合層を咲知層として用いること必要である。上記本発明
に係わる化合物を検知層中に含有させるには、通常の分
散法１！ＡＪえはオイルプロテクト分散法、直接分散法
等任意の方法を用うろことができる。また別法として均
一に溶解した状態で含有させて吃よい。更には展開１−
と検知層との界面の検知層側に局在させても本発明の効
果を達することができる。これは流体試料中のリパーゼ
が展開層中では拡散することができるが、検知層の観水
性コロイド中では拡散することができない性質を利用し
たものである。

また更には、本発明に係わる化合物を検知層中に含有せ
しめるに際しては、予め第４級アンモニウム塩基を有す
る化合物と予めイオン結合によシ媒染させ、安定化させ
てから分散させること本できる。この４４ｉＩｉｉアン
モニウム塩は低分子でも高分子でもよい。

前記の低分子＃Ｉ４級アンモニウム塩化合物の１例とし
ては、例えばＮ、Ｎ、Ｎ　−トリブチル−Ｎ−オクタデ
シルアンモニウムブロマイド、Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−
ベンジル−Ｎ−オクタデシルアンモニラムクロライド、
Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ベンジル−Ｎ−セチルアンモニ
ウムクロライド等を挙げることができる。

さらに高分子凰合体第４級アンモニウム塩の１例として
は、特開昭５０−８０１３２号、同５０−６１２２８号
、同５１−７３４４０号、同５４−７４４３０号、同５
５−２２７６６号各明細書記載の重合体が有用に用いる
ことができる。籍に特開昭５１−７３４４０号、同５５
−２２７６６号に記載の高分子重合体第４級アンモニウ
ム塩は高分子ラテックスの形をとることで有用である。

本発明においては、前記一般式で表わされる化合物を流
体試料中のリパーゼが接触し得る各種の層に含有させる
ことができるが、検知層中に含有させることが好ましい
。すなわち、前記反応によシ形成された色；Ｘは検知層
中では拡散することもなく、従って生成色素の望ましく
ない泳動が極めて軽減されるからである。

一方、本発明に係わる化合物は、前記の展開層に含有さ
せることもできるが、この時の分散法としては化合物を
溶解した均一状態か、あるいは分散状態で分散する任意
の方法をとることができる。

本発明に係わる液体不浸透性の光透過性支持体（以下、
本発明に係る支持体と略す。）は、液体不浸透性でかつ
光透過性であればその種類を問わないが、例えば、酢酸
セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボ
ネート、又はポリスチレンのような種々の重合体材料お
よびガラスが、この使用目的に適する。

この場合の支持体の厚さは任意であるが、代表的には、
約５０ミクロンから２５０ミクロンである。

又、本発明に係る支持体の観察側の一側面は、その目的
に応じて任意に加工することは可能でろる。

又支持体上に本発明に係る前記検知層を設ける場合、直
接被横してもよいが、場合によっては、光透過性の下塗
シ層を使用して検知層と支持体との間の接着性を高める
ことが好ましい。

＝ｆ工紀の検知層および展開層には本発明に係わる萌Ｈ
ｒ２一般式で示される化合物以外に、分析反応に用いら
れる付加的な物質、例えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤
等を併用含有せしめることができる。

上記の界面活性剤として有用な化合物は、イオン性（ア
ニオン性又は、カチオン性）、非イオン性を問わず、効
果的であるが、好ましくは、非イオン性界面活性剤が有
効である。これらの非イオン性界面活性剤の例としては
、例えば２，５−ジ−ｔ−７’チルフエノキシポリエチ
レングリコール、ｐ−オクチルフェノキシポリグリシジ
ルエーテル、ｐ−イソノニルフェノキシポリエチレング
リコール等のアルキル置換フェノールのポリアルキレン
グリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアルキレングリコ
ールエステルなどが挙げられる。これらの界面活性剤は
、流体試料の検知層への浸透速ｆを−節し、同時に好ま
しからざる「クロマトグラフィ現象」の発生を抑制する
効果を有する。艇に界面活性剤の効果として生物学的流
体試料中に含まれる蚤白質による種々の好ましくない影
曽を軽減する作用もある。

この界面活性剤は、広範な使用量で用うることができる
が、層を構成する物質の重量に対して１０重量−乃至０
．００５重量−１好ましくは６＠［％乃至０．０５電量
慢用いることができる。

本発明に係わる化合物を検知層に分散せしめる時の分散
の液体キャリアは、水性液体を用いることができる。水
以外の代表的な液体キャリアとしては、水混和性有機溶
媒、水と水混和性有機溶媒の水性混和物および適当な水
不混和性有機溶媒等を挙げることができる。水混和性有
機溶媒には、例えば低級アルコール（アルキル基の炭素
原子数が１乃至４のアルコール）、アセトン、ナト２ヒ
ドロフラン等がある。また水不混和性溶媒には、低級ア
ルキルエステル（酢酸エチルなど）、／＼ロゲン化炭化
水素（クロロホルム、塩化メチル、四１化炭素など）等
がある。

本発明に係わる検知層および展開層、あるいはその他必
要に応じて設けられる構成層を支持体上に塗設させるだ
めの方法としては、例えば浸漬塗重法、エアーナイフ塗
布法、カーテン塗布法または米国特許第２，６８１，２
９４号に記載されたホツノ＜−を用いる押し出し塗布法
等各種の塗布法により塗設することができ、所望により
二層またはそれ以上の層を例えば米国特許第２，７６１
，７９１号および英国特許第８３７，０９５号に記載の
方法で同時に塗布することもできる。

本発明の分析素子は、種々の異なる配置ｊｆのうち任意
の１つをとることができる。また本発明に係わる検知層
と各種の機能層、試薬含有層および例えば米国特ｆｆ第
３，９９２，１５８号に記載された反射層下塗ｐ層、同
第４．Ｊ　４２，３３５号に記載のある放射線プレキン
グ層、同第４．０６６４０３号に記載されたバリヤ一層
、同第４，１４４，３０６号記載のレジストレー７１７
層、同第４，１６０．０９３号に記載されたマイグレー
シ画ン阻止層、同第４，１２７，４９９号記載の７ンチ
レ一シ画ン層、特開昭５５−９０８５９号に＃２畝のあ
る清掃層および米国Ｉｒｉ＃’Ｆ第４，１１０，０７９
ＱＫｓｄ教された破壊性ボッド状部材等を任意に組合わ
せて、本発明の目的に合わせた分析素子を構成すること
もできる。

上記の如き各構成層の製造およびこれらの各ノーの本発
明の分析素子への組み込みは、前掲の刊行物に記載され
九方法と同一または類似の方法によって実施することが
できる。

本発明の分析素子け゛、全血液、血清、血漿のいずれの
分析にも不都合なく用いることができる。

また尿、リンパ液、髄液等の他の体液も不都合なく用い
ることができる。特に全血液を用いる場合には、必要に
応じて検出の丸めの輻射線が血球により妨害をうけるの
をさけるために輻射線ブロッキング層または他の反射層
を設けることができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は、任意に
定めることができるが、好ましくは約５０μｌ〜５μｇ
であり、更に好ましくは約２０μｌ〜５μｌである。

本発明においては、反射分光光度測定によシ初速度法で
測定し、流体試料中のリパーゼの活性を検知することが
できる。すなわち、流体試料の一ポ電を本−Ａ明の分析
素子の展開層に滴下し、該流体試料中のリパーゼにより
検知層に含有させた前記一般式で表わされた化合物を加
水分解せしめ、形成されたアゾ色素化合物の４７５　ｎ
ｍにおける吸収を分析素子の支持体側から観測し、一定
時間当シの濃度の上昇速度を調べるとリパーゼの活性を
知ることかできる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、これＫよって本発明の実施態様が限定されるものでは
ない。

実施例−１ 透明な厚さ１８０μの下引き済みポリエチレンテ７タレ
ート支持体上に仄の組成の検知ノー及び展開層を順次塗
布した。

（１）検知層 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　２１．５　＆／ｍ″
リン酸二ナトリウム　　　　　　　　１．０８ｆｉ／ｍ
”塩化ナトリウム　　　　　　　　　Ｏ９５４Ｍ　／ｍ
２−アル　　　　　　　　　　　　　　０．２　ｇ／ｍ
″（乾燥膜要約２５μ） （２）繊維構造展開層 脱イオン化ゼラチン　　　　　　４゜Ｏむ背すンｍニナ
トリウム　　　　　　　１゜０８Ｆ／＋ｙ″塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　　０．５４１１ｙ背（乾燥膜要約
１６０μ） このようにして得られた分析素子に０乃至５００単位の
間の異なったリパーゼを含有する試料をｌＯμぎ繊維構
造展開層上に滴下し、３７℃でインキ−ベーン這ンを行
なった。試料滴下後、１ｆｉ−後から、１分間間隔で６
分間４７５ｎｍにおける反射＃度を測定し、各単位間の
濃度上昇の傾きを調べた。この１測定を衣−１に示す。

（表　−１） この結果から明らかなように、リパーゼ単位と傾きの間
には良好な相関が認められた。

実施例−２ 透明な厚さ１８０μの下引き済みポリエチレンテレ７タ
レート支持体上に次の組成の検知層及び繊維構造展開層
を順次塗布した。

（１）検知層 コホリ（スチレン−グリシジル リン酸二ナトリウム　　　　　　　　１．０８９／、＊
塩化ナトリウム　　　　　　　　　　０゜５４　、！ｉ
’／ｍ’（乾燥膜要約５５μ） （２）繊維構造展開層 （乾燥膜要約１６０μ） このようにして得られ九分析素子にリパーゼ単位でそれ
ぞれ０１２５．５０．１００．２５０．５００単位を含
有する試料を各々１０μ！繊維構造展開層に滴下した。

分析素子を４７°Ｃでインキ−ベートし、滴下１分後か
ら４７５μｍにおける反射濃度を５分間連続的に測定し
、その＃＆上昇の傾きを調べた。この測定結果を表−２
に示す。

（表　−２） この結果から明らかなように、本発明の分析素子を用い
る事によ１７パーゼを測定する事が可能である。

実施例−３ 透明な厚さ１８０μの下引き済みポリエチレンテレフタ
レート支持体上に次の組成の検知層及び展開層を順次塗
布した。

＋１１倹知ノー（その１） ｇイオン化セラチン１６．．５１／ｎ”（乾脈嗅厚２０
μ） （２）検知７？４　（その２） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　２．２５１７ｍ”
ドｍｌ嵐合体四級塩　　　　　　　　　１２５．９／ｍ
”リンはニナトリウム　　　　　　　　Ｏ１５２、！ｉ
’　／ｍ’ｉｘ　化ｆ　ト！Ｊ　’）　ム０．２７ｇ／
ｒｎ”オクチルフエノキシボリエトキ ソニーチル　　　　　　　　　　　０゜１５　ｇ／ｍ２
（乾燥膜厚６μ） ｘ：ｙ：ｚ＝４８：４８二４（モルチ）（３）繊維構造
展開層 粉末鑓紙（Ａ）　　　　　　　　　　９０゜０１／ｍ”
（乾燥膜厚１６０μ） このようにして得られた分析素子にリパーゼ単位でそれ
ぞれ０１２５．５０．１００，２５０．５００．１００
０単位を含有する標準血清試料各々１０μｌを線維構造
展開層上に滴下した。該分析素子を３７°０でインキニ
ーベートし、滴下１分後から４７５ｎｍにおける反射＃
度を１分間隔で５分間測定し、その濃度上昇の傾きを調
べた。この測定結果を表−３に示す。

（表　−３） この結果から明らかなように本発明の分析素子を用いる
事でリパーゼ単位０乃至１０００単位まで藺便に測定す
る事が出来る。

代理人　　　桑　原　義　美

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 光透過性、液体不浸透性の支持体と、該支持体の一側に
   位置し流体試料を収納することが可能な少くとも一層の
   検知層と、該検知層の該支持体とは反応側に位置し、該
   流体試料を該検知層へ供給する少くとも一層の展開層を
   有する分析素子であって、該検知層および該展開層のし
   ・づルか一方に、下記一般式で示される化合物を含イす
   ることを特徴とする分析素子。 （式中、Ｍはアルカリ金属を表わし、ｎはＯ〜３０の整
   数を示す）。