JPH0519103B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、一般に分析化学、特に流体中に予め
定られた特定成分を分析する分析素子に関し、更
に詳しくは生物学的流体試料中のリパーゼを分析
するための定量分析素素子に関する。 従来、流体試料中の検体成分を分析する方法
は、多数開発がなされてきたが、それらは大別し
て、溶液内での反応系と、固相の反応系の二種類
に分けられている。 溶液系における分析反応（以下ウエツトケミス
トリイと略す）は、用手法と呼ばれる全く機械を
用いない分析操作法から、近年臨床検査室等で多
用されている自動定量分析装置まで、多々知られ
ている。 このうち、特に自動定量分析装置は就中血液の
分析に用いられ有用である。例えば米国特許第
2797149号に記載された連続流れ分析に基づく分
析装置はこの代表的なものである。 これらは、流体試料、希釈剤および分析試薬を
混合し、分析装置内へ移送し、分析反応および定
量測定を行うというものである。しかしながら、
このような連続分析装置は、複雑かつ高価であ
り、熟練した操作技術を必要とし、また分析操作
の後には必らず繰返し洗浄操作が必要とされ、こ
れを行なうには多大な時間と努力を浪費し、かつ
これらの廃液は必然的に環境汚染を起こすという
欠点を有する。 一方、固相の分析反応（以下、ドライケミスト
リイと略す）を用いる分析法も広範に用いられて
いる。例えば米国特許第3050373号あるいは同
3061523号等に記載の如く、濾紙の如き吸水性担
体に試薬溶液を含浸させ、乾燥して作られるもの
である。 これらは、一般に分析試験紙または単に試験片上
に流体試料を滴下するか、または流体試料中へ試
験片を浸漬させ、試験片の色変化または濃度変化
を肉眼判定か、または反射濃度計により測定し、
流体試料中の特定成分の濃度レベルを決定するも
のである。これらの試料片は、その取扱いが簡便
であり、かつ直ちに結果が得られるので有用であ
るが、その構成上から、半定量または定性分析の
領域にとどまつているものである。 前述の如き従来の分析方法に対して、操作法の
簡便なドライケミストリイを用い、かつ高い定着
性を有するものとして、特公昭53−21677号に記
載のある如き血液分析要素が提案されている。こ
の提案は、光透過性液体不浸透性支持体上の一側
に位置し、流体試料中の成分と反応する少くとも
一種の試薬を含み、かつ親水性コロイドからなる
少くとも一層の試薬層と、該試薬層の上記支持体
とは反対側に位置し、流体試料中の成分を該支持
体とは反応側に位置し、流体試料中の成分を該試
薬層へ透過させる少くとも一層の非繊維質多孔性
媒体層とを有する血液分析要素に関するものであ
る。しかしながら、ゼラチンの如き親水性コロイ
ドからなる試薬層と組み合わされた上記血液分析
要素は、その親水性コロイドが形成するポリマー
マトリツクス中には、リパーゼの如き高い分子量
を有する蚤白質は、浸透不可能であり、従つて上
記提案による分析素子では定量分析が不可能であ
るという致命的欠点を有している。 そこで本発明の目的は、前記の如き欠点を改良
した流体試料中に存在する、高分子量の蚤白質で
あるリパーゼの分析が定量的に行ない得る分析素
子を提供することにある。 前記の目的は、本発明によれば光透過性、液体
不浸透性の支持体と、該支持体の一側に位置する
検知層と該検知層の該支持体とは反対側に位置
し、該流体試料を該検知層へ供給する少なくとも
一層の展開層を有する分析素子であつて、該検知
層が、疎水性かつ、該流体試料に実質的に非膨潤
性である核および親水性の外殻から成る核殻多層
構造を有する重合体粒子単位から構成されてお
り、かつ核検知層に下記一般式で示される化合物
を含有することを特徴とするリパーゼ分析用の分
析素子により達成することができる。 一般式 式中、Ｍはアルカリ金属を表わし、ｎは０〜30
の整数を示す。すなわち、本発明は支持体上に検
知層と展開層とを有する分析素子の検知層か展開
層に、流体試料中の脂肪分解酵素であリパーゼと
反応してアゾ色素を形成し得る前記一般式で表わ
される化合物を含有せしめたことを特徴とし、上
記反応によるアゾ色素の生成速度を時間的に測定
することにより流体試料中のリパーゼの活性を定
量的に検知し得る如く改良された分析素子を提案
するものである。 以下に、更に詳細に本発明を説明する。 先づ、本発明の分析素子は、基本的には支持体
上に順次検知層と展開層とを設けた構成になるも
のである。本発明に係わる検知層は、特願昭56−
155788号に記載されている高分子粒子結合層を用
いる。この高分子粒子結合層からなる検知層は、
酵素の如き巨大分子量を有する物質を該層内に収
納するのに適しており、従つて上記の酵素を層内
で検出することができる。本発明における検知層
の膜厚は、約80ミクロン乃至10ミクロン、好まし
くは約60ミクロン乃至約20ミクロンである。また
本発明に係わる展開層は特公昭53−21677号に記
載された如き次のごとき３つの機能を有する層で
ある。 (1) 一定容量の流体試料を単位面積当り一定容量
において検知層内に均一に配布し、 (2) 流体試料中の分析反応を阻害する物質又は要
因を除去し、 (3) 分光光度分析を行う際に支持体をへて透過す
る測定光を反射するバツクグラウンド作用を行
なう。 従つて本発明に係わる展開層は、これら３つの
機能を全て行ないうるが、又、３つの機能を適宜
分離し、各機能毎に別の層を使用することも可能
である。 更に３つの機能のうち２つの機能を有する層と
残りの他の機能を有する層を組合わせ使用するこ
ともできる。 例えば前記刊行物記載の二酸化チタンおよび二
酢酸セルロースからなるブラツシユポリマーと呼
ばれる非繊維多孔質媒体の展開層、特開昭56−
24576号、特願昭56−13203号および同56−65446
号等に記載された繊維構造展開層等を挙げること
ができる。特にこの繊維構造展開層は血球部分も
速やかに移送することができる素材として有用で
あり、本発明に係れる巨大分子の展開移送に有効
な展開層として用うることができる。 前記展開層の膜厚は、展開層の空隙率及び滴下
する流体試料の量によつて決定されるが、好まし
くは約400ミクロン乃至約80ミクロン、更に好ま
しくは約350ミクロン乃至約100ミクロンである。
例えば前記の繊維構造展開層を用い約10マイクロ
リツトルの試料を滴下する際、該層の膜厚は好ま
しくは約120ミクロン乃至約220ミクロンである。 次に上記の検知層に含有せしめられる前記一般
式で表わされる化合物は、下記の反応式に従い、
リパーゼの作用によりアゾ色素化合物を形成す
る。 この形成されたアゾ色素化合物は475nmに特徴
的な吸収を有しており、本発明においては、固相
の分析素子内で上記色素の吸収を測定することに
よりリパーゼの活性を検知するものである。 本発明に係わる化合物は、前記により明白な通
り、リパーゼにより加水分解される色素前駆体の
一種であり、前記一般式におけるｎの数は好まし
くは５乃至20であり、更に好ましくは８乃至16の
整数である。前記一般式で表わされる化合物を検
知層中に含有させる場合には、前述の特願昭56−
155788号記載の高分子粒子結合層を検知層として
用いること必要である。上記本発明に係わる化合
物を検知層中に含有させるには、通常の分散法例
えばオイルプロテクト分散法、直接分散法等任意
の方法を用うることができる。また別法として均
一に溶解した状態で含有させてもよい。また更に
は、本発明に係わる化合物を検知層中に含有せし
めるに際しては、予め第４級アンモニウム塩基を
有する化合物と予めイオン結合により媒染させ、
安定化させてから分散させることもできる。この
第４級アンモニウム塩は低分子でも高分子でもよ
い。 前記の低分子第４級アンモニウム塩化合物の１
例としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ−トリブチル−Ｎ
−オクタデシルアンモニウムブロマイド、Ｎ，Ｎ
−ジメチル−Ｎ−ベンジル−Ｎ−オクタデシルア
ンモニウムクロライド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−
ベンジル−Ｎ−セチルアンモニウムクロライド等
を挙げることができる。 さらに高分子重合体第４級アンモニウム塩の１
例としては、特開昭50−80132号、同50−61228
号、同51−73440号、同54−74430号、同55−
22766号各明細書記載の重合体が有用に用いるこ
とができる。特に特開昭51−73440号、同55−
22766号に記載の高分子重合体第４級アンモニウ
ム塩は高分子ラテツクスの形をとることで有用で
ある。 前記反応により形成された色素は検知層中では
拡散することもなく、従つて、生成色素の望まし
くない泳動が極めて軽減される。 本発明に係わる液体不浸透性の光透過性支持体
（以下、本発明に係る支持体と略す。）は、液体不
浸透性でかつ光透過性であればその種類を問わな
いが、例えば、酢酸セルース、ポリエチレンテレ
フタレート、ポリカーボネート、又はポリスチレ
ンのよな種々の重合体材料およびガラスが、この
使用目的に適する。 この場合の支持体の厚さは任意であるが、代表
的には、約50ミクロンから250ミクロンである。
又、本発明に係る支持体の観察側の一側面は、そ
の目的に応じて任意に加工することは可能であ
る。又支持体上に本発明に係る前記検知層を設け
る場合、直接被覆してもよいが、場合によつて
は、光透過性の下塗り層を使用して検知層と支持
体との間の接着性を高めることが好ましい。 前記の検知層および展開層には本発明に係わる
前記一般式で示される化合物以外に、分析反応に
用いられる付加的な物質、例えば緩衝剤、保恒
剤、界面活性剤等を併用含有せしめることができ
る。 上記の界面活性剤として有用な化合物は、イオ
ン性（アニオン性又は、カチオン性）、非イオン
性を問わず、効果的であるが、好ましくは、非イ
オン性界面活性剤が有効である。これらの非イオ
ン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−ジ
−ｔ−ブチルフエノキシポリエチレングリコー
ル、ｐ−オクチルフエノキシポリグリシジルエー
テル、ｐ−イソノニルフエノキシポリエチレング
リコール等のアルキル置換フエノールのポリアル
キレングリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアル
キレングリコールエステルなどが挙げられる。こ
れらの界面活性剤は、流体試料の検知層への浸透
速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマト
グラフイ現象」の発生を抑制する効果を有する。
更に界面活性剤の効果として生物学的流体試料中
に含まれる蚤白質による種々の好ましくない影響
を軽減する作用もある。 この界面活性剤は、広範な使用量で用うること
ができるが、層を構成する物質の重量に対して10
重量％乃至0.005重量％、好ましくは６重量％乃
至0.05重量％用いることができる。 本発明に係わる化合物を検知層に分散せしめる
時の分散の液体キヤリアは、水性液体を用いるこ
とができる。水以外の代表的な液体キヤリアとし
ては、水混和性有機溶媒、水と水混和性有機溶媒
の水性混和物および適当な水不混和性有機溶媒等
を挙げることができる。水混和性有機溶媒には、
例えば低級アルコール（アルキル基の炭素原子数
が１乃至４のアルコール）、アセトン、テトラヒ
ドロフラン等がある。また水不混和性溶媒には、
低級アルキルエステル（酢酸エチルなど）、ハロ
ゲン化炭化水素（クロロホルム、塩化メチル、四
塩化炭素など）等がある。 本発明に係わる検知層および展開層、あるいは
その他必要に応じて設けられる構成層を支持体上
に塗設させるための方法としては、例えば浸漬塗
布法、エアーナイフ塗布法、カーテン塗布法また
は米国特許第2681294号に記載されたホツパーを
用いる押し出し塗布法等各種の塗布法により塗設
することができ、所望により二層またはそれ以上
の層を例えば米国特許第2761791号および英国特
許第837095号に記載の方法で同時に塗布すること
もできる。 本発明の分析素子は、種々の異なる配置のうち
任意の１つをとることができる。また本発明に係
わる検知層と各層の機能層、試薬含有層および例
えば米国特許第3992158号に記載された反射層下
塗り層、同第4042335号に記載のある放射線ブロ
キング層、同第4066403号に記載されたバリヤー
層、同第4144306号記載のレジストレーシヨン層、
同第4160093号に記載されたマイグレーシヨン阻
止層、同第4127499号記載のシンチレーシヨン層、
特開昭55−90859号に記載のある清掃層および米
国特許第4110079号に記載された破壞性ボツド状
部材等を任意に組合わせて、本発明の目的に合わ
せた分析素子を構成することもできる。 上記の如き各構成層の製造およびこれらの各層
の本発明の分析素子への組み込みは、前掲の刊行
物に記載された方法と同一または類似の方法によ
つて実施することができる。 本発明の分析素子は、全血液、血清、血漿のい
ずれの分析にも不都合なく用いることができる。
また尿、リンパ液、髄液等の他の体液も不都合な
く用いることができる。特に全血液を用いる場合
には、必要に応じて検出のための輻射線が血球に
より妨害をうけるのをさけるために輻射線ブロツ
キング層または他の反射層を設けることができ
る。 本発明の分析素子に適用される流体試料の量
は、任意に定めることができるが、好ましくは約
50μ〜5μであり、更に好ましくは約20μ〜
5μである。 本発明においては、反射分光光度測定により初
速度法で測定し、流体試料中のリパーゼの活性を
検知することができる。すなわち、流体試料の一
定量を本発明の分析素子の展開層に滴下し、該流
体試料中のリパーゼにより検知層に含有させた前
記一般式で表わされた化合物を加水分解せしめ、
形成されたアゾ色素化合物の475nmにおける吸収
を分析素子の支持体側から観測し、一定時間当り
の濃度の上昇速度を調べるとリパーゼの活性を知
ることができる。 以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明するが、これによつて本発明の実施態様が限定
されるものではない。 実施例 １ 透明な厚さ180μの下引き済みポリエチレンテ
レフタレート支持体上に次の組成の検知層及び繊
維構造展開層を順次塗布した。 (1) 検知層 コポリ（スチレン−グリシジルメタアクリレー
ト）の約4μの粒子に脱イオン化ゼラチンをカ
プセリングした粒径約5μの粒子 34.5ｇ／m² 1.3ｇ／m² リン酸二ナトリウム 1.08ｇ／m² 塩化ナトリウム 0.54ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエーテル
1.08ｇ／m² （乾燥膜厚約55μ） (2) 繊維構造展開層 粉末濾紙(C) 91.0ｇ／m² （東洋濾紙(株)製300メツシユ以上） 91.0ｇ／m² コポリ（スチレン−グリシジルメタアクリレー
ト）（重量比90：10） 13.9ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエーテル
3.15ｇ／m² （乾燥膜厚約160μ） このようにして得られた分析素子にリパーゼ単
位でそれぞれ０、25、50、100、250、500単位を
含有する試料を各々10μ繊維構造展開層に滴下
した。分析素子を47℃でインキユベートし、滴下
１分後から475nmにおける反射濃度を５分間連続
的に測定し、その濃度上昇の傾きを調べた。この
測定結果を表−１に示す。

【表】 この結果から明らかなように、本発明の分析素
子を用いる事によりリパーゼを測定する事が可能
である。 比較例 特開昭55−90859号に第28頁右下欄例５に記載
されているビーズ−ポリ（スチレン−コービニル
ベンジルクロライド−コーメタクリル酸（75：
20：２）直径約100μｍと、接着剤−ポリ（ｎ−
ブチルアクリレート−コースチレン−コー２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸
（76：19：５）を用いて例５と同様の構造物をつ
くり、それを検知層を用いて分析素子を作成し
た。 リパーゼ用基質及びバツフアーは、実施例−１
で用いたように検知層に加えた。 このようにして得られた分析素子に、リパーゼ
単位でそれぞれ約０、50、100、500、単位を含有
する流体試料を各々10μ1滴下した。その後の操
作は、実施例−１と同様に行つた。 その結果を下の（表−２）に示す。

【表】 本発明のように親水性の殻を持たない有機ポリ
マービーズでは、リパーゼが粒子間の空〓に入り
込みにくく、従つて発色効率が著しく悪く、感度
は悪くなる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光透過性、液体不浸透性の支持体と、該支持
   体の一側に位置する検知層と該検知層の該支持体
   とは反対側に位置し、流体試料を該検知層へ供給
   する少なくとも一層の展開層を有する分析素子で
   あつて、該検知層が、疎水性かつ、該流体試料に
   実質的に非膨潤性である核および親水性の外殻か
   ら成る核殻多層構造を有する重合体粒子単位から
   構成されており、かつ該検知層に下記一般式で示
   される化合物を含有することを特徴とするリパー
   ゼ分析用の分析素子。 一般式 （式中、Ｍはアルカリ金属を表わし、ｎは０〜
   30の整数を示す。）