JPS5819277B2 - リヴア−ス トランスクリプタ−ゼソガイブツシツレビスチンノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は癌ウィルスのりヴアース・トランスクリプター
ゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の阻害物質であ
るレビスチン（Ｒｅｖｉｓｔｉｎ ）の製造法に関する
ものであり、特に本発明者らによって発見された一放線
距Ｅ３９７−１株の培養によって得られるレピスチンの
製造法に関するものである。

本発明はこの特異的阻害物質レピスチンを採取し、精製
する方法および薬剤または試薬としての利用に関するも
のである。

本発明によればレビスチンは遊離酸として、その種々の
金属または有機塩基との塩として存在するものを包含し
、また粗製の形、精製された形、純粋な形として存在す
るものをすべて包含する。

ＲＮＡ腫傷ウィルス中にＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
、即ちリグアース・トランスクリプターゼの存在が知ら
れている。

（Ｔｅｍ１ｎ 、Ｈ−Ｍ、 ａｎｄＭｉｚｕｔａ ｎｉ
、 Ｓ 、：ＲＮＡ −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ
Ｐ ｏｌｙ−ｍｅｒａｓｅ １ｎＶｉｒｉｏｎｓ ｏ
ｆ Ｒ８Ｖ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２６ ｅｌ ２１１
（１９７０）ｓ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅｙ Ｄ。

： Ｖｉ−ｒａｌ ＲＮＡ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮ
Ａ Ｐ ｏｌｙｍｅｒａｓｅ −Ｎａ −ｔｕｒｅ
２２６，１２０９（１９７０））。

従って、このＲＮＡ型癌ウィルスに特有な酵素りヴアー
ス・トランスクリプターゼの活性を阻害する物質は（１
）発癌を防ぐ癌予防薬として、Ｃ）癌治療薬または癌治
療の補助薬として、（３）生化学実験の試薬として、な
どの利用が期待される。

本発明者らはマウスの白血病ウィルスであ６ Ｒａｕｓ
ｃｈｅｒ １ ｅｕｋｅｍ ｉａ Ｖ １−ｒｕｓ （
ＲＩ；Ｖ ）を感染退せたマウスに対する治療実験で、
□その効果を認めることができた。

レスビチンは本発明者らによって、放線菌、カビ、キノ
コ、などの微生物の培養液中に生産される物質について
、マウス白血病ウィルスのりヴアース・トランスクリプ
ターゼによる核酸合成を阻止する作用を有する活性物質
の系統的探索によって発見された。

次にレスビチンを生産する菌について記述する。

本発明で用いられるレスビチン生産菌の一例としては、
ストレプトミセス属に属するＥ３９７−１株（微工研菌
寄第２８６９号）がある。

このＥ３９７−１株は昭和４７年４月３日、本発明者ら
によって栃木県小山市大字出井の畠の土壌より分た。

このＥ３９７−１株の菌学的性状は次の通りである。

（ａ） 形態 た気菌糸に胞子鎖を生じ、各胞子鎖は通常１０箇以上の
胞子を着生し、３巻き以■のゆるい環状、鉤状、らせん
状の形態を示す。

電子顕微鏡観察では、胞子は円柱状（０，５〜０．７Ｘ
１．Ｏ〜２．４μ）で表面に株がある。

（ｂ） 各種培地における生育状態 １）蔗糖・硝酸塩寒天（ワックスマン培地Ａ１２７°Ｃ
培養）：発育良好。

裏面は淡−色。気菌糸は真珠色粉状で露滴形成。

バター黄色の拡散する色素を産生する。

この色素は０．０５Ｎ苛性ソーダや０．０５ Ｎｕｍで
変化しない。

２）ブドウ糖アスパラギン寒天（ワックスマン培地Ａ２
．２７℃培番）：発育良好。

裏面は褐色。

淡黄灰色ないし黄灰色の気菌糸を形成し、淡黄色メ拡散
する色素を産生ずる。

３）グリセリン・アスパラギン寒天（ＩＳＰＩ ｎｔｅ
ｒｎａｔ’１ｏｎａｌ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ’
Ｐ ｒｏｊｅｃｔ ）培地Ａ５’、 ２７°Ｃ培養）
：牢育良好。

鼻面は濃茶褐色。

痺黄灰色の粉状の気菌不編形成し、コ・・り色の拡散す
る色素を産生ずる。

培養４日の若い培養は黄色の色素を産生じ、その色素は
０．０５Ｎ苛性ソーダで茶褐色に変る一／！（、酸で元
のｐｔ＜戻らない。

６ ′４）普通寒天（ワックスマン培地＄４，
２７℃培養）：無色でかなり発育する。

気菌糸を形成しない。

淡黄褐色の拡散する色素、を産生する３５）無機塩・デ
ンプン寒天りＳＰ培′□Ａ ４ 。

２７℃培養）二発育良好。

裏面は黄褐色ないし濃黄褐負。

黄灰色ないし黄桃灰色の粉状の気菌糸を形成し、淡い小
麦色の拡散する色素を産生、する。

デンプンを水解する。６）オートミール寒天（ＩＳＰ培
地Ａ３．２７℃培養）二発育良好。

裏面は淡黄色。黄灰色粉状ないしビロード状の気菌糸を
形成し、淡黄茶色の拡散する色素を産生ずる。

７）イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ培地Ａ２
，２７°Ｃ培養）：極めて良好の発育裏面は褐色、黄灰
色ないし黄桃灰色のビロード秋気菌糸を形成し、明るい
茶色の拡散する色素を産生する。

４日の培養でコ・・り急の、酸やアルカリで変色しない
色素を産生ずる。

８）合成硝酸塩プロス（２７℃培養）：淡黄色の容性色
素な生じ、その色氷は０．０５Ｎ苛性ソーダで明、るい
黄色に変化し、酸で、匹の色に戻る。

９）栄養寒天（ワックスマン培地Ａ１４，２７°Ｃ培養
）：無色でかなり生育する。

気菌糸を形成しない。

淡黄褐色の拡散する色素な産生１詮ニーシン寒天（ＩＳ
Ｐ培地屋７，２７°Ｃ培養）二発育良好。

裏面は暗褐色。真珠色、粉状の気菌糸を形成し、黒褐色
の拡散する色素を産生ずる。

（ｃ）生理的性質 ｌ）生育温度範囲：、グルコース。

アスパラギン寒天及びイーストエキス・麦芽エキス基本
では２０℃、２７°Ｃ，３７℃で良好ないし極めて良好
な発育をするが５０°Ｃでは発育しない。

２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼラチン培
地上）＝３週間後に液化が僅かに認められる。

３）スターチの加水分確（無機塩・スターチ寒天培地上
）：陽性 、４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：陰性、弱いペプト
ン化が認、められる。

５）メラニン様色素の産生（チロシン寒天培地、グルコ
ース・ペプトンゼラチン培地、トリプトン・イーストプ
ロヌ培地上）：陽性、但しペプトン・イース、トエキス
鉄寒天培地 （ＩＳＰ培地Ａ６）上では陰性。

６）硫酸塩の還元（硝酸塩ブ〒ス及び合成硝酸塩ブ、ロ
ス培地よ）二陰性 ７）硫化水素の生成（プロテオーゼ・ペプトン・グクコ
ース寒天培地上）：陽性（酢酸鉛紙で検出）。

８）炭素源の同化性（プリド・・ム・ゴントリープ寒天
基礎培地上）： （ｉ） 利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノ、
−ス、シュクａ−ヌ、Ｄ− キシロース、ｉ−イノシト− ル、Ｄ−マンニトール、Ｄ− ７ラクトース、ラフィノース。

（ｉ） 利用１ｊｆ＝ｂしい：ラムノーヌ、セルロース
Ｅ−３９７−１株の示す、以上の性状を既知の放線菌の
性状と比較すると、Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｉｌ
ｉｐｉｎｅｎｓｉｓ ＡＮＶ沃ＮＮ、ＧＯＴＴＬＩＥＢ
。

ＢＲＯＣＫ、ＣＡＲＴＥＲａｎｄＷＨ，ＩＴＦＩＥＬＤ
１９５５：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｕｒｈａ
ｍｅｎｅｓｉｓ ＧＯＲＤＯＮａｎｄＬＡＰＡ １９
６６ ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃ
ｈｒｏ −ｍｏｇｅｎｅｃｓ ＦＵＫＵＮＡＧＡ、ＭＩ
ＳＡＴＯ，ｌ５ＨＩＩａｎｄ ＡＳＡＫＡＷＡ １９５
５ ； Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌａｎｏｓｉｎ
ｉｃｕｓ ＴＨＩＥＭＡＮＮ ａｎｄ ＢＥＲＥＴＴＡ
１９６６の４種の放線菌と共通の性質を有するが下記の
点でＥ３９７−１株はこれら４種の放線菌と相異する。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ
ｌ５Ｐ５１１２株は、イーストエキス・麦芽エキス寒
天、オートミール寒天、無機塩−デンプン寒天、ブドウ
糖・アスパラギン寒天で淡褐灰色の気菌糸を形成する。

裏面の淡黄褐色はＥ３９７−１株のそれよりも遥かに淡
い。

合成硝酸塩プロスを含めて各種の培地で、拡散する色素
を産生じないか、或いは僅かに痕跡程度の淡い青味がか
った黄色の色素を生産するに過ぎない。

Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｕｒｈａｍｅｎｓｉ
ｓ Ｉ Ｓ Ｐ ５５３９株は、気菌、糸の色、培地上
に発育している裏面の色、拡散性色素がＳ 、ｆｉｌｉ
ｐｉｎｅｎｓｉｓ Ｉ Ｓ Ｐ５１１企株のそれらと殆
んど同じである。

牛乳を凝固する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉ
ｓｅｃｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｌ５Ｐ５４９９株は、
気菌糸の急、裏面の色、各種培地での拡散性色素がＳ
、 ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ Ｉ Ｓ Ｐ ５１１２
株及び、Ｓ 、 ｄｕｒｈａｍｅｎｓｉｓ Ｉ Ｓ Ｐ
５５３９株のそれらに極めて近似している。

植酸塩を還元して亜硝酸塩にする。

普通寒天培地で薄い淡黄褐灰色（真珠色）の気菌糸を形
成する。

Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌａｎｃｓｉｎｉｃｕ
ｓ Ｉ Ｓ Ｐ ５６０ ｆ５株はグリセリン・アスパ
ラギン寒天培地で、５回以上捲いたらせんを形成する。

オートミール寒天無機塩・デンプン寒天培地で淡茶桃色
の気菌糸を形成する。

各種培地で拡散性の色素を産生じないが、或いは淡い青
味がかった橙黄色の拡散する色素を僅かに産生ずる。

かくして、Ｅ３９７−１株はＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｆ １ｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓに最も近縁であるが、次
の点で、これとは区別される。

即ち、合成硝酸塩プロスでのｐＨに感受性のある色素の
産生、発育の裏面を着色し、培地中（拡散する色素の産
生、気菌糸の色あいである。

その他には、Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｉｌｊｐｉ
ｎｉｓは抗カビ性ポリエン抗生物質であるｆｉｌｉｐｉ
ｎを生産するが、Ｅ３９７−１株は抗菌物質を生産しケ
い。

放線菌は人工的に、また自然界で変異をおこしやすいが
、本発明ではストレプトミセスＥ３９７−１株およびそ
れらの変異菌のすべてを使用できる。

本発明にいうレビそチン生産菌はストレプトミセス属に
属してレビスチンを生産する限りすべての菌株を包含す
る。

レビスチンはレピスチン生産菌、例エバストレプトミセ
スＥ３９７−１株の胞子または菌糸を栄養源含有培地に
接種して、好気的に発育させることによって得られる。

栄養源としては放線菌の栄養源として公知のものを使用
できる。

例えば、市販されているグリセリン、ぶどう糖、乳糖、
蔗糖、澱粉、麦芽糖、糖蜜などの炭水化物、あるいは脂
肪、油などの炭素源および市販されているペプトン、肉
エキス、コーンスチープリカー、綿実油、落花生粉、大
豆粉、酵母エキス、Ｎ−Ｚ−７ミン、カゼイン、硝酸ン
ーダ、硝酸アンモニアなど窒素源と、食塩、燐酸塩、炭
酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩を使用で
きる。

その他必要に応じて、微量の金属塩を添加する。

これらのものはレビスチン生産菌が利用し、レビスチン
の生産に役立つものであればよい。

公知の放線菌の培養材料臂すべて使用できる。

大量生産には液体培養が好ましい。

培養温度はレピスチンを生産する微生物が発育し、レビ
スチンを生産する範囲で適用し得るが、殊に好ましいの
は２５〜３５℃であ。

る。

培養は普通レピスチンが充分蓄積するまで継続される。

例えば、グリセリン２．５％、ポリペプ）：／１．０％
、酵母エキス０．２％、ＣａＣＯ３０，６係を水道水に
溶解した培地をｐＨ６，８ｊＣ調整、滅菌後、これにス
トレプトミセスＥ３９７−１株などレビスチン生産菌の
斜面培養から胞子および菌糸を接種し、２７°Ｃで好気
的に振盪培養を行ったところ培養３〜５日目にレビスチ
ンの蓄積が認められた。

レピスチンはりヴアース・トランスクリプターゼ（ＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の阻害で定量される。

その定量法として、次の通り阻害活性の測定を行った。

酵素りヴアーヌ・トランスクリプターゼ源として、精製
したネズミ白血病ウィルスＭＬＶを用いた。

反応数は全量０．１２ｒｒＬｔで、その中に次の成分を
含有する。

Ｔｒ ｉ ｅ （ｐＨ８，１）４．８μモル、ＭｇＣｌ
２０．３モル、Ｎａ Ｃｌ ３．６ ｔｔモ元、ｄｉｔ
ｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌＯ，０１２モル、Ｎｏｎ１ｄｅ
ｔ Ｐ −４０２，４ｘｌＯ’ｍ７＊ｄＡＴＰ０．０１
２”Ｅル、ｄＣＴＰＯ，０１２ｔｔモル、ｄＧＴＰＯ，
ｏ １２ｔｔモル、３ｆＫ ｍ ｅｔ ｌｙ１→ＴＴＰ
６ μｃｉ、 ｐｏｌｙ （ｄ ｔ ）ｐｏｌｙ（Ａ）
ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ３μｇ、ＭＬＶタンパク量で
２．１６μｇ、被検液０．０２５ｍ、／：ｏ反応液は振
しながら３７℃に６０分間保温した後、そのｏ、１ｒ
ｒＬｔを、予じめ０．１ Ｍビｏ Ｉ）ン酸塩醇液につ
げて乾かした直径２．４ｃｍの円形濾紙につげ、その濾
紙を直ちに氷冷した５係溶液中にひだす。

冷５ＳＴＣＡ液は濾紙１枚につき１０ ｍｌの割で使用
する。

１ｏ分後、液をすて一濾紙を冷５ＳＴＣＡ液で２回、冷
９５係エタノールで１回洗ってから乾かす。

その濾紙をバイアルびんに入れ、トルエン−ｐｐｏ−ｐ
ｏｐｏｐ系のシンチレータ−を加え、液体ンンチレーシ
ョンで酸不宕画分にとり込まれた３Ｈ＝ＴＭＰの放射能
を測定し、被検群の３Ｈ−ＴＭＰ値（’ｒ）と対照群の
それＣ）とより検体のりヴアース・トランスクリプター
ゼ阻害活性（Ｉ％）を次式により算出する。

レビスチンを生産させる振盪培養は５００ ｒｒｔｔの
フラスコに１００ ｒｒｔｌの培養液を入れ、２７〜２
９℃で振幅８ｃＩＩＬ、４分間１３０往復の振盪機上に
のせて行われた。

ストレプトミセスＥ３９７−１株を用いて、下記表１に
示すような栄養源組成の各種液体培地について、予めＥ
培地で２７”−２９℃、３日間振盪培養した培養液をシ
ードとし、１ｒｒＬｔづ＼接種し、培養４日後に培地中
に生産されているレビスチンの活性を測定した。

Ｅ培地、Ｅｇ、ｆｆ培地（Ｅ培地の炭素源グリセリンを
ブドウ糖でおきかえた培地）およびＳＧＦ培地が生産に
最適で、これらの培養液中のレビスチンを前記の検定系
で測定すると、リヴアースパトランスクリプターゼ活性
を５０％阻害する濃度は培養ブロスを１ ／ １００〜
１．３／１００は希釈して加えれば充分であった。

チオ硫酸ソーダ、塩化マンガン、塩化コバルトをＥ培地
に添加しても増産効果は殆んどないか、あるいはむしろ
軽度に減少した。

なお大豆粉Ｆは日華油脂ＫＫのニツカミートであり、大
豆粉Ｓは味の素ＫＫの８３−Ｓ−ルである。

上記の表１０Ｍ−シリーズの培地、ＧＦ−培地１Ｘ−培
地ではレビスチンはＥ培地を用いた時の６０〜１０多し
か生産されなかった。

レピスチンは水によく宕け、その生産菌Ｅ３９７−１株
の培養液では、主として液体部分に存在するレビスチン
は実質的にブタノール、酢酸エチル、エーテル、クロロ
ホルム、ベンゼン等に抽出さｉない。

これらの溶剤による処理は爽雑物の除去に必要とすれば
利用できる。

培養液をろ過または遠心分離によって菌体な含む固形分
を除いた培養ろ液またはその他の水溶液中のレビスチン
は塩析または適当な沈澱剤の添加により沈澱させること
ができる。

塩析には硫安飽和による方法は好ましい一例である。

また、レビスチンは酸性物質であるのでレビスチンを含
む水溶液をｐＨ３以下に調整することにより沈澱させる
ことができる。

酸性多糖類の沈澱剤として知られているセチル、ピリジ
ニクムクロライドは沈澱剤として好ましい一例であるみ
またレビスチンの採取には、その酸性の性状に基いて陰
イオン交換樹脂、陰イオン交換セルロース等の利用が可
能である。

この場合Ｄｏｗｅｘ−１（ダウケミカル社製りような強
塩基性陰イオン交換樹脂、アノパーライトＩＲ−４Ｂ（
ローム・アンド・ハース社）のような弱塩基性樹脂、Ｄ
且ＡＥ＋、ＥＣＴＥＯＬＡ−、セルロース（プラクン社
製など）を用いて採取することができる。

また、レビヌチン水醇液から、活性炭にレビスチンを吸
着させ、５０チアセトン水などで溶出してレビ哀チンを
採取することも可能である。

レビスチン（後記の実施例３の生成物）は白巳及至淡褐
巳粉末状の酸性物質であり、明瞭な融点を示さずに３０
０°Ｃ以上で徐々に分解する。

水に再啓でブタノール、酢酸エチル、エチルエーテルク
ロロホルム、ベンゼンに実質的に酔げない。

比旋光度は〔α″ｊＤ７−６０°（０，００５チ、水）
である。

強塩基性陰イオン交換樹脂、活性炭に吸着される。

レビスチンは２．５〜３分の分子量をもつと推定される
高分子物質である。

紫外線吸収スペクトルでは、末端吸収が認められた。

レビスチンの赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ ）は添付
図面に示しである。

レビスチンは熱に安定性でｐＨ３〜１０の範囲で１００
℃２０分間の加熱に安定である。

電気泳動、ゲル沢過、超遠沈、限界瀘過などの結果から
みてレビスチンは酸性高分子物質である。

レビスチンの呈色反恒は次の通りである。

陽性：アンスロン−硫酸（緑色）、板目、ミロン（赤褐
色の沈澱）ニンヒドリン（紫がかった桃色）反応。

陰性：モーリツシユ、フェーリング、パウリ、ビユレツ
ト、キサントプロティン反応。

レビスチンの生理活性について、前記のレピスチン粗粉
末は２３μＥｌ／ｒｒＬＬでりヴアース・トランスクリ
プターゼの活性を５０係阻害する。

この５０係阻害の濃度は他の抗生物質たとえばＮ−デメ
チルリファンピシン（Ｎ −ｄｅｍｅｔｈｙｌ −ｒｉ
ｆ −ａｍｐｉｃｉｎ ）の２００ ｔｔ＆／ｍｌ−プ
レオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ） の２４μ、
／Ｊ比べて遥かに低く、レビスチンがりヴアース・トラ
ンスクリプターゼに対して強い阻害効果を有することを
示している。

黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８ｐ、枯草菌ＡＴＣＣ６
６３３カンジダ０アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌ
ｂｉｃａｎｓ ３１４７ ） ｓ ）リコフイトン
・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍ
ｅ −ｎｔａｇｒｏｐｌｙｔｅｓ ６４０八緑膿菌、
大腸菌、ＮＩＨＪ恥こう菌ＡＴＣＣ６０７，いもち菌、
ザントモナス・ントリ（Ｘａｍｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉ
ｔｒｉ ）に対して′１０μｇ／ｍｌで抗菌活性を示さ
ない。

生理食塩水に宕示してマウスに静脈注射しても、５００
ｒＩＬＶｋ１９体重の量で急性毒性をあられさない。

レビスチンはマウスの白血病ウィルスであるＲａｕｓｃ
ｈｅｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｅ （ＲＬＶ
）を感染させたマウス−しても、ＲＬＶ感染によって生
ずる牌陣を抑える作用を示す。

マウスにＲＬＶ感染後、早期に見られる牌腫は、白血病
性よりはむしろ赤芽球の増殖という病変が関連している
が、ＲＬＶの感染実験、治療実験には指標として通常採
用されている。

本発明者らも、この牌腫を指標にしてレピスチンのＲＬ
Ｖ感染に対する治療効果なしらべた。

実施例１で得られた、レビスチン粗粉末を用いてＲａｕ
ｓｃｈｅｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ （ＲＬＶ
）感染マウスに対する治療効果をしらべた。

実験ｌでは、ＲＬｖ感染後４週のマウスの牌をすりつぶ
したものを感染後ウィルスとし、これを生理食塩水で６
４０倍に稀釈したウィルス液の０．５ｍ、！をマウスの
腹腔に注射することによって感染を成立させた。

■記の表２ａに示すように、感染治療群（ｖ十Ｒ＋）は
感染当日から１回４日間しビスチンを腹腔に注射した第
１群と、感染５日後から５日間に注射した第■群とに分
け、それぞれに、ウィルス感染を行なわず薬剤のみに与
えた対照（Ｖ−Ｒ十）をおいた。

また、感染させて薬剤を投与しなかった対照（ＶＲ）も
おいた。

１２日後に全部のマウスを殺して肺臓を別出し、重量を
測定した。

１群を４匹通とし、肺臓量について、 て阻害率（ａＡとした。

分母はウィルスのみの影響による肺臓の増大部であり、
分子はウィルスと薬剤との相互の関連作用丁における牌
の増大部から薬剤のみたよる影響を除いたものである。

試験結果を表２ｂに示す。

・表２ｂの結果から明らかなように、第１群では８ｒｒ
Ｌｇ／マウス／日、４ｒｒＬｇ／マクス日で約４０係の
阻止を示したが２ｍ９／マウス／日では効果がなかった
。

第■群では８ｒｒＬｇで約５０％、４ｒｎｇで、は強い
阻止を示した。

２ｒｎ９でも効果があった。

これによると、レビスチンによる治療は感染初期に行う
よりも、や＼おくれてから開始する方が効果的のように
思われる。

次に、実験２では、ＲＬＶの感染量を減らして１０００
倍稀釈ウィルス液０．５ｍｔとした。

下記の表３ａに示すように、感染翌日から１１日間薬剤
を投与した第１群、翌日から６日間投与した第■群、感
染６日後から６日間投与した第■群に分けた。

この実験ではおくれて治療を開始した第■群にのみ阻止
効果がみられた。

試験結果を表３ｂに示す。

以上の実験から、Ｖビスチンの投与によりウィルス感染
による肺臓重量の増大阻止が認められた。

％に、ウィルス感染６日後からレビスチンを投与した場
合に明らかな阻止効果が認められた。

′この事実はレビスチンがウィルスによる発癌に対し癌
治療薬ないしは癌治療の補助薬として利用し得ることを
示している。

現在、リヴアース・トランスクリプターゼの阻害剤とし
て報告されている物質としてリファマイシン誘導体（Ｓ
−Ｓ、Ｙａｎｇら、Ｊ −Ｎａ ｔ’ｔＣａｎｃｅｒ
Ｉｎ５ｔ 、 ４ ’ｊ 、 ’ ７及び’ ６１（１
９７２））と、ポリ核酸類（’Ｒ−Ｊ −Ｅｒ１ｃｋｓ
ｏｎら、Ｂ、Ｂ。

Ｒ，Ｃ，５２，１４７５（１９７３）、Ｓ、Ｋ。

Ａ ｒｙａら、Ｂ、 Ｂ、 Ｒ，Ｃ５９，６０８（１９
７４）’）が知られている。

上記のような、レビスチンの強い阻止作用からも明らか
であるが、レビスチンは高分子物質であり、リファンピ
シン誘導体は低分子であるから異なっている。

また、レビスチンはフェノール抽出で７工ノール層に移
行するので、ポリ核酸や核酸ではないことが明らかであ
る。

従って、レビスチンは新しいりヴアース・トランスクリ
プターゼの阻害剤であることが確認された。

なお、後記の実施例３に於て得られたレビスチンの粉末
は１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（トリス−グ
リシン緩衝液、ｐＨ８，６）でのコマ−ジー・ブリリア
ント・ブルー染色では単一バンドであったので、次の元
素分析、アミノ酸分析糖分析を行った。

元素分析の結果は、Ｃ４７，０４係、Ｎ６．５０係Ｎ９
．９６％、硫黄及び・・ロゲンを含まず、灰分１．７％
であった。

アミノ酸分析のために、上記のレビスチン試料を６Ｎ塩
酸中１１０℃、１６時間酸氷解して、アミノ酸分析を行
ったところ、Ｌｙ ｓ １．７５ ＊ Ｈｉｓｌ、２０
．Ａｒｇ３．０６．Ａｓｐ ５．１０．’Ｉ’ｈｒ２．
９７，５ｅｒ４．２３．Ｐｒｏ ３．６８．Ｇｌｙ２．
７４． Ａｌ ａ ３．０５． Ｇｙｓ Ｏ，２４，Ｖ
ａ １３．５４＊ Ｍｅ ｔ Ｏ，７８ｙ ＩＬｅｕ
１．４Ｌ Ｌｅｖ２．９０．ＴｙｒＯ，８９，Ｐｈｅ
１．７３％（全アミノ酸４２．２８係）であった。

次に糖分析のために、試料をＩＮ硫酸で１００℃９時間
水解した後処理をして、無水酢酸ピリジンでアセチル化
した後、ガスクロマトグラフ法により糖含量の分析を行
った。

その結果（Ｗ／Ｗ％は、グルコース３．２６．ガラクト
ース２．０９．マンノース４．０１％で他にラムノース
とキシロースの微量が認められた。

更に、この試料の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、’を測
定したところ、添付図面のグラフを得た。

この試料を用いて組織培養法によって正常ラット腎臓細
胞の、ＲＮＡ腫瘍ウィルスによる形質転換に対する影響
を調べたところ、細胞にウィルスを感染させた直後に培
地にレビスチンを加えると次のように非常に顕著に、ウ
ィルスによる細胞の形質転換（腫瘍化）を阻止した。

すなわち、５０℃ｍｇ／ｒｒｔｔで１００％、２５℃ｍ
ｇ／ｒａｔで８３％、１０μｇ／ｒＩＬｔで６５係阻止
した。

またウィルス感染後２４時間を経てから培地ｒレビスチ
ンを加えても以下のようにかなりの程度に形質転換を阻
止することがわかった。

すなわち７５μｇ／ｒｒＬｔで４５５６．．５０μｇ／
ａｔで３５係、２５μｇ／ｒｒＬｔで５％阻止した。

以上の結果は、人癌のウィルス関与を考えた場合、その
予防的効果をレビスチンに期待できることを示している
。

以Ｆ、レビスチンの生産及び採取に関して実施例を示す
が、レビスチンの性状並びに生産方法、その抽出精製法
を本発明者らによって明らかにされたので本明細書に示
された知見に基いてその採取法は修飾法も包括し、実施
例に限定されるものではない。

実施例 ル ビスチンを産出するス）Ｌ／ブトミセス Ｅ３９７−１株（微工研菌寄第２８６９号）を２．５％
、グリセリン、１係ポリペプトン、０．２％酵母エキス
、０．６％、炭酸力ルシクムを含む培地に接種し、２７
〜２９℃で４日間振盪培養した。

その後、１０℃で、培養液を１０．ＯＯＯｒｐｍｌＯ分
の遠心沈澱にかげ、これによって菌体を含む固形分を除
去した。

得られた上清培養液（３ｔ）に硫安（２１６１）を飽和
に加え、２０分室温で攪拌後、４℃で一夜静かに攪拌す
る。

４℃で１０００Ｏｒ、ｐｍ、１０分の遠心沈澱で沈澱を
集め、蒸留水（１００ｍ、ｆｆ）にｍ解する。

不溶部分は蒸留水（１００ｒｒＬｔ）で再び抽出する。

水尋液層を合せて、蒸留水（５，／、Ｘ５回）に対して
２４時間透析内液を凍結乾燥して３（Ｂｉ’の粗粉末を
得た。

リヴアーヌ・トランスクリプターゼり活性５０係阻止（
ＩＤ、。

）に要する量は４．６μｇであった（収率８７％）。

本粉末を１２５ｍ、、ｆｆの蒸留水に后かし、２０℃以
上に保って、１０％セチル・ピリジニウム・クロライド
液を過剰（１５０ｒｒＬａに加え、生ずる沈澱を２０℃
ｍ １０．００Ｏｒｐｍｔ１０分の遠心沈澱で集め、蒸
留水（３０７７１ｔｘ２）２４Ｍ、４．８Ｍ食塩水（各
３ｏｍ、＋ｇで順次洗滌した後、０．ＩＮ苛性ソーダ水
醇液（ｌＯＯｍｔ）ＶＣＣ啓上た。

このｍ液を２０°Ｃ以上に保って０．ＩＮ苛性ソーダ水
啓液（１４Ｘ２）、つマいて蒸留水（１ｔＸ２）に対し
て夫々４〜５時間透析を行い、更に蒸留水（５ｔ×３）
で４℃、一夜透析を行った。

この透析内液を凍結乾燥してレビスチン粗粉末（褐ｅ）
（１−５Ｆｓ ＩＤ５０ ： ２．３μ、９／ａ収率８
７係）を得た。

実施例 ２ ３０リツトル容量のジャーファーメンタ−に２．５係、
ぶどう糖、１％、ポリペプトン、０．２％酵母エキス、
０．６％、炭酸カルシウムを含む培地（’ ｐ Ｈ６，
８）を１５リットル加え、滅菌、２７℃に冷却した。

その後、これに対して、ストレプトミセスＥ３９７−１
株（微工研菌寄第２８６９号を同じ培地で２日間振盪培
養して得た培養歌ＯＯｍ、ｌを植え付け、通気量１５ｔ
／分、攪拌２００回転／分、２７℃で培養した。

培養７２時間後に培養液を遠心分離で菌体な含む固形分
を除き、□１３、／、、 （ｐＨ７，２）の培養ろ液
を得た。

これを実施例１と同様の方法で硫安（９，５ｋｇ）によ
り沈澱、透析して、透析内液を凍結乾燥してレビスチン
粗粉末１４．９を得た。

この粉末の■Ｄ５ｏは８．２μｇｍｌで、収率は８５チ
であった。

実施例 ３ 実施例１と同一条件下で得られたストレプトミセスＥ３
９７−１株（微工研菌寄第２８６９号）の培養液から菌
体除去を行い、上清培養液８４００ｒｒＬｔを得た。

これに硫安覧２ｋｙを加えて一夜静かに攪拌する。

４℃で１０００Ｏｒｐｍ−１０分間の遠心分離で沈澱を
集め、蒸留水に溶解した。

この際、で−きるだけ液量を少なくするため、少量の蒸
留水を加え、ＩＮ力性ソーダ溶液でｐＨを７入８に合わ
せ、遠心分離して上清を得た。

沈澱には同じ操作を繰り返して、最終的に蒸留水１１８
ｒｒＬｔ、力性ソーダ２３ ｒｒＬｌを加えて、はぼ全
ての沈澱な溶解できた（全量２２０ ｒｒＬ７ ）。

この容液を、４℃で、０．０２５Ｎのカ性ンーダ容液で
平衡させたセファデックスＧ−７５０カラム（５×１５
０儒）Ｋ１回当９７０ｍ１の上記抽出液（２２０ｍ４）
を注入し、０．０２５Ｎ力性ソ一ダＭ液で展開してカラ
ムクロマトグラフィを行った。

１０ｍ、／、ずつ分取して、１６０本目本目２００本目
本目出する部分を、５０時間蒸留水に対して透析し、凍
結乾燥を行って、６．９ｇの粗粉末（Ｉ）を得た。

この粉末α）を０．ＯＩＭ）リス緩衝液（ｐＨｓ、１）
７０ｒｒｔｔＫ宕解し、同緩衝液で処理したセファデッ
クｋＧ−７５のカラム（５Ｘ１２５ｍ）［より同じ緩衝
液で展開した。

１０ｍ４ずつ分取して２００本目本目２４０本目本目出
する部分を再度４５時間蒸留水に対して透析し、凍結乾
燥を行って１．６８．！９の粗粉末（社）を得た。

これを０．ＯＩＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，１） １０
ｒｒｔｔに溶解し、同緩衝液で調整したウルトロゲル（
ＬＫＢ社）ＡｃＡ５４のカラム（２Ｘ８０ｃｒｎ）Ｋか
げ、同緩衝液で展開し、５ｍ、／：ずつ分取して、４０
本１から５０本１に溶出する部分をとり、３０時間蒸留
水に対して透析し凍結乾燥して粉末０．９２としてレビ
スチンを得た。

この粉末のＩＤ、６１．３ μｇ／ｒｎｌ、収率は４
９係であった。

このレビスチン粉末は１５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動でみると単一バンドを与えた。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明の実施例３で得たレビスチン粉末の赤
外吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属するレピスチン生産菌を培
   養し、その培養液からりヴアース・トランスクリプター
   ゼ阻害物質であるレビスヂンを採取することを特徴とす
   る、リグアース・トランスクリプターゼ阻害物質しビス
   チンの製造法。