JPH0799982A - 新規抗生物質MJ885−mF8およびその製造方法 - Google Patents

新規抗生物質MJ885−mF8およびその製造方法

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JPH0799982A
JPH0799982A JP5274763A JP27476393A JPH0799982A JP H0799982 A JPH0799982 A JP H0799982A JP 5274763 A JP5274763 A JP 5274763A JP 27476393 A JP27476393 A JP 27476393A JP H0799982 A JPH0799982 A JP H0799982A
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JP
Japan
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antibiotic
methanol
culture
attached drawing
antibacterial activity
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JP5274763A
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Tomio Takeuchi
富雄 竹内
Toshio Tsuchida
外志夫 土田
Hironobu Iinuma
寛信 飯沼
Ryuichi Sawa
竜一 澤
Yoshikazu Takahashi
良和 高橋
Hiroshi Osanawa
博 長縄
Tsutomu Sawa
力 澤
Masa Hamada
雅 濱田
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Microbial Chemistry Research Foundation
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Microbial Chemistry Research Foundation
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 魚の細菌感染症の病原細菌に対する優れた抗
菌活性を有して低毒性である新規な抗生物質を提供する
ことである。 【構成】 抗菌活性を有して分子式C18226 で示さ
れる無色透明油状の中性物質である抗生物質MJ885
−mF8。この抗生物質を、ストレプトミセス属に属す
るMJ885−mF8生産菌の培養により製造する。 【効果】 この抗生物質MJ885−mF8は抗菌活性
を有し、特に魚の類結節症菌のパストレラ・ピシシダに
強力な抗菌活性を示すが、魚に対する毒性が低いので漁
業用抗菌剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ストレプトミセス属に
属する微生物によって生産されて抗菌活性を有する新規
抗生物質であって、特に魚の細菌感染症の一種である類
結節症を生じる細菌であるパストレラ・ピシシダ(Paste
urella piscicida) に対して強力な抗菌活性をしめす新
規な抗生物質MJ885−mF8、並びにその製造方法
に関する。本発明の抗生物質MJ885−mF8は特に
漁業用抗菌剤として有用である。
【0002】
【従来の技術】水族を自然環境から人為環境に移して飼
育すると、自然の水圏では普通みられないいろいろな障
害(魚病)が発生し、時には産業規模で大きな被害を生
じる。特に、養殖されるブリなどの類結節症は細菌パス
トレラ・ピシシダ(Pasteurellapiscicida) の感染によ
り結節様の小白点がブリの腎臓,ひ臓,鰓などに生じ、
大きな被害を与える。その魚病に対し有効な抗生物質と
して、アモキシリン,アンピシリンなどが使用されてお
り、また合成医薬品として、アクアフェン,チアンフェ
ニコール,オキソリン酸,スルフィソゾールなどが使用
されている。
【0003】
【発明が解決しようとする問題点】魚病である類結節症
などの病原菌に対して抗菌活性をしめす抗生物質及び合
成医薬品としては、上記のものが現在広く利用されてい
るが、より強力な抗菌活性をもつ化合物が期待されてい
る。また、耐性菌の出現は避けられないから、新規な抗
生物質が要求されている。現在まで、微生物が生産する
類結節症の治療に有効な抗生物質は、報告されておらず
有効かつ毒性の少ない新規な抗生物質の提供が待たれ
る。
【0004】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、従来よ
り有用な抗生物質の開発,実用化の研究を促進してきた
が、本発明もかかる研究の一端をなす。本発明者らは土
壌から本発明者らにより分離された放線菌でMJ885
−mF8の菌株番号を付された微生物が抗菌活性を有す
る抗生物質を培養物中に産生、蓄積することを見出し、
この抗生物質を単離することに成功した。この抗生物質
の物理化学的性質を調べると、新規物質であることを認
めて抗生物質MJ885−mF8と命名した。更に、こ
のように従来の文献未載の新規抗生物質MJ885−m
F8がグラム陽性菌に抗菌活性を有し、特に、魚病の細
菌パストレラ・ピシシダ(Pasteurella piscicida) の発
育を強く阻害することを見い出して本発明を完成したも
のである。
【0005】従って、第1の本発明によると、新規な抗
生物質MJ885−mF8が提供されるものである。
【0006】第1の本発明による新規な抗生物質MJ8
85−mF8は、下記の理化学的及び生物学的性質によ
り特徴づけられる物質である。
【0007】(1)抗生物質MJ885−mF8の理化
学的性状 A)性状:無色透明油状の中性物質 B)旋光度:[α]D 23−6°(c 0.5,MeOH) C)分子式:C18226 高分解能FABマススペクトル 335.1477(M+H)+
positive D)FABマススペクトル(m/z):335(M+
H)+ positive 333(M−H)- negative E)紫外線吸収スペクトル: λmax,nm(ε)271(12500)(メタノール
中),添付図面の図1に示す λmax,nm(ε)270(12600)(0.01N−HCl
−90%メタノール中),添付図面の図2に示す λmax,nm(ε)252(8230)(0.01N−NaOH
−90%メタノール中),添付図面の図3に示す。
【0008】F)赤外線吸収スペクトル(KBr錠剤
法):添付図面の図4に示す。主な吸収ピークを次に示
す υmax :2930,1780,1670,1590,1
440,1280cm-1 G) 1H−NMRスペクトル(重クロロホルム中):添
付図面の図5に示す H)13C−NMRスペクトル(重クロロホルム中):添
付図面の図6に示す I)Rf値(TLC; Merck社製シリカゲルArt. 57
15): 0.47(クロロホルム−メタノール,10:1) 0.66(トルエン−アセトン,1:1) J)呈色反応:ニンヒドリン、ライドンスミスおよび塩
化第二鉄試薬に陰性であり、リンモリブデン酸−硫酸に
陽性である。
【0009】(2)抗生物質MJ885−mF8の生物
学的性状 A)抗菌スペクトル 第1の本発明による抗生物質MJ885−mF8は、各
種の細菌に抗菌活性を有するので、該抗生物質のミュー
ラー・ヒントン寒天板上での各種の細菌と真菌に対する
最低発育阻止濃度を標準の倍数希釈法で測定した。その
結果は次の表1にしめす通りである。
【0010】
【表1】
【0011】B)急性毒性 新規抗生物質MJ885−mF8のマウスに対する急性
毒性を試験した結果、マウス腹くう内で投与量が100
mg/kgでも、マウスに異常は見られなかった。
【0012】C)魚毒 ヒメダカを用いる魚毒試験では、10ppmの濃度で抗
生物質MJ885−mF8を含む水中でメダカに対する
毒性が見られず、該抗生物質が安全な医薬品であること
が認められる。
【0013】本発明の新規抗生物質MJ885−mF8
は、第2の本発明の方法に従って有利に製造することが
できる。
【0014】即ち、第2の本発明によると、ストレプト
ミセス属に属する抗生物質MJ885−mF8の生産菌
を栄養培地に培養し、培養物から該抗生物質を採取する
ことを特徴とする抗生物質MJ885−mF8の製造法
が提供される。
【0015】第2の本発明の方法で用い得る抗生物質M
J885−mF8生産菌の一例には、平成4年10月、
微生物化学研究所において、東京都杉並区の土壌より分
離された放線菌で、MJ885−mF8の菌株番号が付
された菌株がある。
【0016】MJ885−mF8株の菌学的性状を次に
記載する。 1.形 態 MJ885−mF8株は、分枝した基生菌糸より直状の
気菌糸を伸長する。らせん形成、輪生枝及び胞子のうは
認められない。成熟した胞子鎖には30個以上の円筒形
の胞子の連鎖を認め、胞子の大きさは約0.5 〜0.6 ×0.
9 ×1.2 ミクロンであった。なお、胞子の表面はしわ状
である。
【0017】2.各種培地における生育状態 色の記載について[ ]内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual) を用いた。
【0018】(1)シュクロース・硝酸塩寒天培地(2
7℃培養) 無色の発育上に、灰白[3dc, Natural]の気菌糸をう
っすらと着生し、溶解性色素は認められない。 (2)グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃培
養) うす黄[2ca,Lt Ivory]の発育上に、白〜灰白[2d
c, Natural]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色
素は認められない。 (3)グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−培
地5、27℃培養) うす黄[2ec, Biscuit]〜灰味黄茶[2ie,Lt Musta
rd Tan]の発育上に、灰白[3dc, Natural]〜明るい
灰[3fe, Silver Gray]の気菌糸を着生する。溶解性
色素は認められない。 (4)スターチ・無機塩寒天培地(ISP−培地4、2
7℃培養) うす黄[2ec, Biscuit]〜灰味黄茶[2ie,Lt Musta
rd Tan]の発育上に、明るい灰[3fe, Silver Gray〜
5fe, Ashes]の気菌糸を着生し、溶解性色素は認めら
れない。
【0019】(5)チロシン寒天培地(ISP−培地
7、27℃培養) うす黄[2ec, Biscuit]〜うす黄茶[2lg, Mustard
Tan]の発育上に、灰白[3dc, Natural]〜明るい灰
[3fe, Silver Gray]の気菌糸を着生する。溶解性色
素は認められない。 (6)栄養寒天培地(27℃培養) うす黄[3ec,Bisque]の発育上に、白の気菌糸をわず
かに着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる。 (7)イースト・麦芽寒天培地(ISP−培地2、27
℃培養) うす黄[2ec, Biscuit]〜灰味黄茶[2ie,Lt Musta
rd Tan]の発育上に、明るい灰[3fe, Silver Gray〜
5fe, Ashes]の気菌糸を着生し、溶解性色素は認めら
れない。 (8)オートミール寒天培地(ISP−培地3、27℃
培養) うす黄[2ec, Biscuit]の発育上に、明るい灰[2f
e, Covert Gray〜3fe, Silver Gray]の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。 (9)グリセリン・硝酸塩寒天培地(27℃培養) うす黄[2cd,Ivory Tint]の発育上に、白の気菌糸を
うっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
【0020】(10)スターチ寒天培地(27℃培養) うす黄[2ec, Biscuit]の発育上に、白の気菌糸をう
っすらと着生するが、部分的に明るい灰[2fe, Cover
t Gray]を呈する。溶解性色素は認められない。 (11)リンゴ酸石灰寒天培地(27℃培養) 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められ
ない。 (12)セルロース(ろ紙片添加合成液、27℃培養) 21日間の培養では生育しなかった。
【0021】3.生理的性質 (1)生育温度範囲 イースト・スターチ寒天培地 (溶性デンプン 1.0%、イ
ースト・エキス 0.2%、ひも寒天 3.0%、pH7.0)を用
い、10℃,20℃,24℃,27℃,30℃,37
℃,50℃の各温度で試験した結果、50℃を除き、そ
のいずれの温度でも生育する。生育至適温度は27℃〜
30℃付近と思われる。
【0022】(2)スターチの加水分解(スターチ・無
機塩寒天培地、ISP−培地4及びスターチ寒天培地、
いずれも27℃培養) いずれの培地においても培養後3日目頃より水解性が認
められ、その作用は強い方である。 (3)メラニン様色素の生成(トリプトン・イースト・
ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ISP−培地6;チロシン寒天培地、ISP−培
地7;いずれも27℃培養) トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト
・鉄寒天培地では陽性、チロシン寒天培地でのメラニン
の生成は疑わしい。
【0023】(4)炭素源の利用性(プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ISP−培地9、27℃培養) D−グルコース、D−キシロース、ラムノース、ラクト
ースを利用して発育し、L−アラビノース、D−フラク
トース、シュクロース、イノシトール、ラフィノース及
びD−マンニトールは利用しない。
【0024】(5)リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰
寒天培地、27℃培養) 陰性である。 (6)セルロースの分解(ろ紙片添加合成液、27℃培
養) 20日間の観察で分解は認められない。
【0025】以上の性状を要約すると、MJ885−m
F8株は、その形態上、基生菌糸より直状の気菌糸を伸
長し、らせん形成、輪生枝及び胞子のうは認められな
い。成熟した胞子鎖には30個以上の円筒形の胞子を連
鎖し、その表面はしわ状である。種々の培地で、発育は
うす黄〜灰味黄茶、気菌糸は灰白〜明るい灰を呈し、溶
解性色素は認められない。生育至適温度は27〜30℃
付近である。メラニン様色素の生成は陽性、スターチの
水解性は強い方である。なお、細胞壁に含まれる2,6
−ジアミノピメリン酸はLL−型であった。
【0026】これらの性状より、MJ885−mF8株
は、ストレプトミセス(Streptomyce s)属に属すると考え
られる。近縁の既知菌種を検索すると、ストレプトミセ
ス・ザオミセティクス (Streptomyces zaomyceticus,
文献1:Shirling, E.B. andD. Gottlieb「Internation
al Journal of Systematic Bacteriology」22巻,3
74頁,1972年;文献2:Skerman, V.B.D., V.Mcg
owan, and P.H.A. Sneath 「International Journal of
Systematic Bacteriology」30巻,406頁,198
0年)があげられた。現在、上記菌種の当研究所保存菌
株とMJ885−mF8株とを実地に比較検討中であ
る。そこで現時点では、MJ885−mF8株をストレ
プトミセス・エスピー (Streptomyces sp.) MJ885
−mF8とする。
【0027】なお、MJ885−mF8株を茨城県つく
ば市の工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託申請
し、平成5年9月13日、寄託番号FERM P−13
863として受託された。
【0028】第2の本発明の方法を実施するに当り、抗
生物質MJ885−mF8生産菌の培養に用いられる栄
養源としては、放線菌の栄養源として通常使用されるも
の、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄
養源を使用できる。例えば、ぶとう糖、麦芽糖、糖蜜、
デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭化水素や、大
豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ペプトン、
肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コ
ーン・スチープリカー、NZ−アミン、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素
源、燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カル
シウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩
が使用でき、必要により微量金属例えばコバルト,鉄な
どを添加することができる。栄養源としては、その他、
新規抗生物質MJ885−mF8を生産するのに使用生
産菌が利用しうるものであれば、いずれの公知の栄養源
でも使用できる。
【0029】上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約
されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、
使用する抗生物質MJ885−mF8生産菌によって最
適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単
な小規模な予備実験により容易に決定することができ
る。
【0030】また、上記の栄養源からなる栄養培地は、
培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後
で、培地のpHを6−8の範囲、特にpH6.5 −7.5 の
範囲に調節するのが有利である。
【0031】かかる栄養培地での抗生物質MJ885−
mF8生産菌の培養は、一般の放線菌による抗生物質の
製造において通常使用されている方法に準じて行なうこ
とができる。通常、好気条件下に培養するのが好適であ
り、通常攪拌しながら及び/又は通気しながら行なうこ
とができる。また、培養方法としては静置培養、振とう
培養、通気攪拌をともなう液内培養のいずれも使用可能
であるが、液体培養が抗生物質MJ885−mF8の大
量生産に適している。
【0032】使用しうる培養温度は抗生物質MJ885
−mF8生産菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物
質を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものでは
なく、使用する生産菌に応じて適宜選択できるが、特に
好ましいのは25−30℃の範囲内の温度を挙げること
ができる。
【0033】培養は通常は抗生物質MJ885−mF8
が培養物中に十分に蓄積するまで継続することができ
る。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、
使用生産菌株などにより異なるが、通常24−72時間
の培養で目的の抗生物質を得ることができる。
【0034】培養中の抗生物質MJ885−mF8の蓄
積量はパステレラ・ピシシダを使用して、通常の抗生物
質の定量に用いられる円筒平板法により定量することが
できる。
【0035】かくして、培養物中に蓄積された新規抗生
物質MJ885−mF8を培養物から採取するには、培
養後に必要により、濾過,遠心分離などのそれ自体公知
の分離方法によって菌体を除去した後、その濾液を有機
溶媒、特に酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム−メ
タノール系などの混合溶媒を用いた溶媒抽出や、吸着や
ゲル濾過を利用したクロマトグラフィー、向流分配によ
るクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて使
用することにより単離精製して採取することができる。
また、菌体はメタノール、アセトンなどの有機溶媒によ
り抽出され、目的抗生物質を含む抽出液から上記の分離
精製法により単離精製することができる。吸着やゲル濾
過を有するクロマトグラフィー用担体としては、活性
炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼ
ン樹脂もしくは各種のセファデクスを用いることができ
る。かくして、前記した特性を有する新規抗生物質MJ
885−mF8が得られる。
【0036】次に実施例により本発明を更に具体的に説
明する。
【0037】
【実施例】実施例1 抗生物質MJ885−mF8の製造 ガラクトース2%、デキストリン2%、バクト−ソイト
ン1%、コーンステープリカー 0.5%、グリセリン1
%、硫酸アンモニウム 0.2%、炭酸カルシウム0.2%、
シリコンオイル1滴(pH7.4 に調整)を含む液体培地
を三角フラスコに110mlずつ分注し、常法により1
20℃で20分滅菌した。その後、その液体培地に対し
て、寒天斜面培地上に生育したストレプトミセスsp.M
J885−mF8株(微工研菌寄第P−13863号)
を接種し、27℃で1日間、回転振とう培養(毎分18
0回転)した。得られた培養物を種培養液として用い、
上記と同じ組成の液体培地を110mlずつ分注した三
角フラスコ54本に2mlずつ接種し、27℃で2日
間、回転振とう培養(毎分180回転)した。
【0038】得られた培養液を遠心分離し、上澄み液を
酢酸エチル 5.8lにより抽出した。菌体は、アセトン2
lを用い抽出しアセトンを除去した後、水を加え2lと
してから酢酸エチル2lにより抽出した。両抽出液を合
わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去する
と残留物が 1.4g得られた。
【0039】残留物をヘキサン20ml,メタノール2
0mlに分配し且つメタノール層を濃縮乾固すると、残
さが 1.2g得られ、これをシリカゲル60(メルク社Ar
t.7734)100mlのカラムに展開した。溶出溶媒
としてトルエン(200ml)と、トルエン−アセト
ン,20:1(210ml),15:1(160m
l),10:1(220ml),7:1(159ml)
および5:1(300ml)の各々を用いて順次溶出し
た。
【0040】TLC(メルク社シリカゲルArt.571
5)によりRf値0.47(展開溶媒:クロロホルム−メタ
ノール,10:1)にUV(254 nm)吸収を示す
フラクションを集め、濃縮乾固すると前述した理化学的
性質で特徴付けられる無色透明な油状物として純粋なM
J885−mF8物質が146mg得られた。また、若
干の不純物を含んだMJ885−mF8物質が98mg
得られた。
【図面の簡単な説明】
【図1】メタノール中の抗生物質MJ885−mF8の
紫外線吸収スペクトル曲線図である。
【図2】0.01N−HCl−90%メタノール中の抗生物
質MJ885−mF8の紫外線吸収スペクトル曲線図で
ある。
【図3】0.01N−NaOH−90%メタノール中の抗生
物質MJ885−mF8の紫外線吸収スペクトル曲線図
である。
【図4】抗生物質MJ885−mF8の赤外線吸収スペ
クトル曲線図である。
【図5】抗生物質MJ885−mF8の 1H−NMRス
ペクトル曲線図である。
【図6】抗生物質MJ885−mF8の13C−NMRス
ペクトル曲線図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成5年11月9日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0040
【補正方法】変更
【補正内容】
【0040】TLC(メルク社シリカゲルArt.571
5)によりRf値0.47(展開溶媒:クロロホルム−メタ
ノール,10:1)にUV(254 nm)吸収を示す
フラクションを集め、濃縮乾固すると前述した理化学的
性質で特徴付けられる無色透明な油状物として純粋なM
J885−mF8物質が146mg得られた。また、若
干の不純物を含んだMJ885−mF8物質が98mg
得られた。なお、本発明のMJ885−mF8物質は下
記の構造式で表わされる化合物であると認められた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:465) (72)発明者 澤 竜一 神奈川県綾瀬市綾西四丁目6番7号 (72)発明者 高橋 良和 東京都多摩市桜ケ丘3丁目2番地の3 (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町3番17号 (72)発明者 澤 力 神奈川県綾瀬市綾西四丁目6番7号 (72)発明者 濱田 雅 東京都新宿区内藤町1番地26 秀和レジデ ンス405号

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記の理化学的性質:− A)性状:無色透明油状の中性物質 B)旋光度:[α]D 23−6°(c 0.5,MeOH) C)分子式:C18226 高分解能FABマススペクトル 335.1477(M+H)+
    positive D)FABマススペクトル(m/z):335(M+
    H)+ positive 333(M−H)- negative E)紫外線吸収スペクトル: λmax,nm(ε)271(12500)(メタノール
    中),添付図面の図1に示す λmax,nm(ε)270(12600)(0.01N−HCl
    −90%メタノール中),添付図面の図2に示す λmax,nm(ε)252(8230)(0.01N−NaOH
    −90%メタノール中),添付図面の図3に示す F)赤外線吸収スペクトル(KBr錠剤法):添付図面
    の図4に示す。主な吸収ピークを次に示す υmax :2930,1780,1670,1590,1
    440,1280cm-1 G) 1H−NMRスペクトル(重クロロホルム中):添
    付図面の図5に示す H)13C−NMRスペクトル(重クロロホルム中):添
    付図面の図6に示す I)Rf値(TLC; Merck社製シリカゲルArt. 57
    15): 0.47(クロロホルム−メタノール,10:1) 0.66(トルエン−アセトン,1:1) J)呈色反応:ニンヒドリン、ライドンスミスおよび塩
    化第二鉄試薬に陰性であり、リンモリブデン酸−硫酸に
    陽性である を有することを特徴とする、抗菌活性を有する抗生物質
    MJ885−mF8。
  2. 【請求項2】 ストレプトミセス属に属する、請求項1
    に記載の抗生物質MJ885−mF8の生産菌を栄養培
    地に培養し、培養物から該抗生物質を採取することを特
    徴とする、抗生物質MJ885−mF8の製造法。
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