JPS58195155A - 補体結合テストの原理により血清学的検査を行なう方法及びその方法に用いる試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は補体結合テストの原理Ｖこより血清学的検査
を行う方法に関し、その方法に用いるためのテス、トパ
ッケイジを便用する方法−１ にも関する。イギリス時計明細薔屑１４６７３５１ｔ、
ｉ％／ヶＸ　）４ｉ”１ｉｇＫｆ＠−ｆｈ　％ｔｎアあ
、。

このメ２・下のＢＺ術的生韮を開発する間Ｖこ殻祭が行
わね、開発がなされた。そしてそれらが本発明の基礎と
なっている。それら観察を以下に述べる。

古典的袖体結合テストは本世紀の最初に発見された。鷺
〈べきことに今日までその技術はそれほど改善されてい
ない。反応は２つの部分からなっている。即ちそのテス
トの最初の部分では、抗体（ｆａＤち患者血清中の天然
抗体）が一定の敏の補体の存在下、抗原（ｊ！１１ちビ
ールス抗（２）と反応する。抗体と抗原との反応にエリ
えられる免疫コンプレックスは禰体活動萄納せする。テ
スト第２の部分で抗体（Ｉ０１受体）感作ヒツジ赤血球
の浴岬又に非浴亨かいわゆる袖体溶血反応によって可視
的になり測定される。抗体抗原反応の場合（患者にバイ
ラル感呆にさらされた）結果として生じる免：： ＠：ｙｙ７’ｌｙ噸ｑ：：：二“°１．．　ｌ：：７ジ
赤面球は　　　　　　　　ために溶解せずに残る０もし
その反゛応し５がネガテア′であると刃口えなれた袖体
活性が残り、補体に仲介され　　　　　　　　　　　ま
たヒツジ赤血球の喀ｈＬ２＞ｉ起こり、コンタクトミッ
クスのにこりが数少する。その反応の定菫化は極〈最近
になって始めて血清試料希釈法によって達成さへその楊
合各希釈が十反応又は−反応についてチェックされてい
る。いくつかの補体［Ｍ定テスト用光度測定法が説明さ
れて来たが、それら方法はノットブックに近年現れてい
るもの金含めて、王妃の基本的困難によって特徴づけら
れて４八る。部ち補体溶血の等級しか光度測定により測
だできな−（部分浴血性）。こび）方法では分離［、た
血液着色”＋１１（ｃ・ｏＩＩｏｕｒａｎｔ　）の蓄２
＞Ｋ１Ｇ１＋定されるだけである。それらの方法によっ
てあたかも数＋１グラムの抗原物質／　ｍ１反応物の感
度範囲が測定出来るとしてもそれらの方法は多くの不利
を含んでいる。

即ち（１）　　反応の停止が使めて困難である。

現在知られているある方法は遠心分離全行−次いで遊喘
した赤い血液Ｎ色物の量を測定する。ことに工つている
。そして（２）測ず範囲は常時前身って決定された反応
混合物の溶解、非溶解碑件範囲に永久に留まっている。

以下用いられる／［分析テスト糸１なる飴は分析テスト
媒体としての抗原又は抗体の使用を含んでいる。

以下用いられる［対照テスト系１は分析テスト媒体とし
ての抗原又はｆ／ｌ、体の使用を官んでいる。

この発明はそれら困難１にψ−服する皿渭検ｆｒ朽う方
法ｆ提供するにある。

この発明により、過剰の補体音用い反応の絆ｖＢＪをカ
イ不チック法によって行う如き補体結合テストのｙＡ埋
にエリ血ｔＰｔ慎食を行う方法が提供さｆている。

この発明の他の目的は、試薬及び刈照試料中の補体ｔｔ
−相互に勾洟さぜる点にある。

この発明ｄ史に反応を竹うための試薬を用いる血清検査
用の即時ｙ用テストパッケイジであってその試薬が１個
のパッケイジ中に別個にか部分的に４賄にしてか、又に
好ましくは分析系用又は対照系用に一対になってアン７
”−ル中で製造できる様になったものｔ提供するもので
ある。

この発明の一実ＩＭｇ様では、補体結合テストをできる
だけ能率的に可視的に行うための方法であって、その試
薬７・・は固形状に保存さレテオリ、ネガテン対照中又
はブランク中主たる偏置の完了後であって指示反応であ
る溶血反応の開始以前に、分析糸と灼熱系との両刀に於
て同し湘体活性が存在することが可能となるに、適切な
様な方法ケ用い、その反応結果を評価する様になってい
る。そして、溶血の遅延はポレチプな反応と兄イ杖され
溶血−ｐｌｋＬの程度は反応のだ菫に使用できるのであ
る。

好チしくはこの方法において分析値及び対照系中の実測
補体活性め同靭化は下ｄピの如く行われる。　　　　　
・］〒 ａ）実測補体活性に影−一及ぼさない高純度の試薬を使
用するか、 ｂ）補俸起原とは別の試薬による分析系及びテスト糸い
中の非特異効果ができるたけ小さいか、両糸で回じであ
る力ζ 度の補体を加えるか又は、 ｄ）＋Ｌ温装置開始前であって、抗原抗体の結合の開始
以前、好ましくは保存固形（深冷又は凍結乾そうした）
試薬の適当な稜＃液での溶解直後、袖体活性の商い系を
光分に希釈し、王謳直の終りには、分析系及び対照系の
円方においでネガチプな反応（ブランク又はテスト用に
ネガチプ対照血清を便用）の場合、指示反応の開始前に
は、同じ実測補体活性が存在する様にすること。

この発明は、史に反応を固７０′状に保存された試薬を
用いて竹い、・・特異抗体／抗原反応の完了前に、分析
糸及６テスト系、中に決めた補体活性、過剰な袖体ふ存
在して種々の糸の□・・・。

残り袖体活性を適当な方法で逆側ポする補体　　　　　
　　　　　　　　覧固定テストに定量１シする方法を提
供するものび結果としての溶解時間の許浴量のあるα５
０チ溶解時間分析法がある。核状においては、恥舶定の
のち抗原又は抗体の、儂度をその天然対数１−に変え、
好ましくは直１’ｆｒ与える他方に対してプロットする
。

その外、この発明は補体固定テストの原理によって血清
検査を行うための普通の市販抗原／対照抗原又は抗血清
及びブランク血清の解説を提供する。即ち、それら試薬
の抗補体活性の附加的な説明又に詳細によってこび）発
明の原理及び使用性は、使用者が更に前調整を行う必要
なしに軒並となる。従来の不利は新しい方法によって兇
服された。もし、補体溶血が光測的に好ましくｆ１５４
６ｎ、（又は、その近くの波長でにとり全測定すること
によりモニターされるときは（第１図ン補体浴血の幾つ
かの基本ルールはたちどころに理解さ九そうして補体結
合テストの適正化Ｖこ利用できる０ 即ち、補体ｌン餐血はシグマ字状の反応曲紛金伴う。存
在する袖体枯件敞にエリ長短相異う潜在時間後に溶解反
応が起る（感応赤血球からの赤１１ｉ色の遊離、にごり
の減少、反応混合物の透明産の上昇、吸光又は吸収の減
少）。

反りら・混合物中の袖体活性が高ければ高いほどシグマ
字状のカーブのスロープは太きく、補体活性が低斉４荊
４′いほど溶解曲軸は平坦で夛）る。

もし袖体粘性りすへてか用いられるときに、赤血球は溶
解せずＶＣ残り、戊え、混合物のにとりは小駕の１１で
めも（古典的か梱体結合テストにおけるグラス反応に内
応する）。さて反応混＠物のにとり（牧元吸／吸収）は
久方に減少するがこれは非溶解赤血球サスペンションの
漸時沈吟に対応する。こ１を力・ら欠配事実を確認でき
る。

１）もし袖体活性の増大する神体溶血の原曲線（第１図
）を観察するならば尤度測定による輛俸結曾テストに、
その反応、σ）過当な定ｒｒイしｌ？−Ｆフてエリ敏感
であるだろう。そして古典的ＣＦＴの場合と同様（・こ
、そのテスト系列の典様の右端！（おける反応混合物の
溶解又は非溶解愼件の状態か補体結合テストの反応階な
ども測定され適当にｙｔ化さ〕Ｌる、２）その上よく知
られている光蛍的岬１定による評価法、即ち赤色物の遊
離の測定（部分溶血測定法）が最適でありえないことは
明確である。なぜならこの方法は不便であり、不利であ
りまた反応の停止や不溶解赤皿球の分離は不都合だ力・
らである。その上この方法で汀理論的且つ実際的に可能
な測定範囲は狭いものでしかない。・：なお箇た、部分
溶血の範囲内でしか慄作できない。

３）英国特許明→薔應１４８７３５１の方法に、補体結
合テストの町成りの合理化を可能にし九例故なら即時使
用安定試巣の使用によりすべてのコントロールの可能性
は保持している七ノテストシステムｔ−提供してい（ｂ
からである。にもかかわらず非特異反応を完全に排除で
きｔ−・ために理論的な可能性を良好に用・い　ｂイ能
性を見出すことができなかった。

４）神体結合テストを活用する別の口丁廂件は反応力イ
ネチックから訪導できる。即ち ａ）常圧神体過剰の範囲で操作するカイネテック計帥法
のような反応核ｆ＃會使用するときは、測定範囲は可成
り拡大するＯ ｂ）刀イネチック元を側足的に評価し適当な数式と組み
合せ、こうして−望ましい伸１淀、頚囲で標準ｌｌｌ１
Ｉ稼が陵退曲線として表視されうる礪会は、その壷株性
は反応の感ＩＷにおいて糟大する。

Ｃ）通冨非％兵的影譬の性賀と【７てのプロバンド材料
、にＪ！：印する蒔異反応えの非特異効果の＋＝Ｊ成り
。ｍ＋ｌｄ／ｊＥ、Ｊ’１ＪＨ４６１，Ｍｕゎ応、６７
カ、６□。

１す る。°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１も（−１反応物混合物の
補体溶血の時間を超えての完全な拡がりが利甲され−・
・るときに、補体結合テストの測定範囲を可成り掃、げ
うることに明台である。一つの必要後件は補体結合テス
ト定性定量評価か溶血対非溶血の比によって決定きれる
だけでなくて、完全溶血の遅延にまで拡大されなければ
ならない。その補体溶血の遅延が司滉的・定量的にか、
又は半定量的に測定されるか光学測定的に分析されるか
、兎してその分析結果を結果の定量化に使用するかの決
定は利用者にゆだねられている。

この方法の主たる特徴は、過剰の補体Ｊ）存在でのカイ
ネチック測定であ褐 ちネガチプ反応の場合（例えば加えられた（ビールス）
抗原に対するプロバンド血清中に全く抗体が存在しない
場合）と力〜研究されるべき材料中に測定されるべき物
質が全く存在しない場合、分析試料中や対照試料中（仇
原テスト対照抗原テス）Ｋ対応する）の主反応（ボンド
（抗原の抗体との！ひと補体活性の結合）の完了後、溶
血反応（吸光の減少、にごりの減少）が完全に同ＷＸｋ
進行する。

ドイツ特許／１６２３３３４３４による即時使用試薬の
場合又は　原特許のクレームの拡張範囲に対応するその
拡張形の場合は、その即時使用（゛試薬は一対のアンプ
ル中又トｒ罰時イφ用パッケイジ中で造られる。

しかもそれら即時使用アンプル対又はパッケイジは必要
とする各バックさｎた試薬、部ち神体及び抗俸又４ｒ％
桶体及び対照抗体又は、補体及びテストさるべき物に対
する抗原、即ち補体及びブランク血清（同じ棟のもので
はあるが、／？！ｒ個に免役されていな鬼へ血消又は動
物血清）用の試薬しか言まない場合も七うである。そし
て石典的溶血禾のためＶこ溶血反応に使用されている。

俗ｒｌ１１反応における遅延たけ（反応のデシンクロニ
セーンヨン）ば、十の結果と鈷敵されるべきであり、ガ
テブである場合溶血反応が対照中及び分仇ポ甲で王温直
の後同鋪されているというイボ証を賛求する。そのこと
はドイツ特、＋ｚＭ２３３３４３４に対応すゐ反比〜の
拡張したＪ旧悪にとっても大切である、灯普１．〈はこ
の明細書の附加的な公開力博に用１八られ厘う。また古
典的溶血系をつくるために必要な琳験室的作業を避ける
ため１（即時使用アンプル対又は、試薬パッケイジ中に
両受体が加えられ〆よう。

詳細なるｖＩ＋示から活用された、可視的補体結合テス
トの達成についてのその特有理り的位置及び重要な要求
は普通、市販の試薬（抗体、対照抗体、抗体及び対照系
）を補体と！、２ン昆合すること及び両受体の添加Ｉｌ
ｅよっては達成されないことが判る。何故ならば多くの
場＠試楽は相異う非特異抗補体活性を持っているからで
ある。

それから異なる抗桶体活１性はしかし、ＲＩＪ時便月賦
薬の唄造省により先品、って決めだ計重できる。

そ１．でそれは製造工程スルそれらの非特異活性を見越
］２て指示書が７ｊｌｌ’２れているときに−Ｔ能であ
る。従ってネガチプな場合Ｉ）冷血反応の必要な同一化
１・ま使用者に保証で久る０不ガテプな場合、反応の活
用に必要な溶血反応ね必要な々調合化が起ることを保証
する巳うの方法が存仕する。

１、例えばム山峨培養からの高純度のレテルン（Ｒ’ｉ
＝−＋４翫）補体内定テスト抗体及び、対照抗体を使用
すること。その場合抗体／対照抗体は更に超遠心分離機
で４１１する。そしてその際高純度試薬は反応混合物の
実測補体活性に対し、非特異効果を全く及ぼさない。

２、或は、多くの場合補体活性の非ｔＰ！ｊ異消耗に対
応する実測補体活性へのその非特異的効果を補体活性の
菫を増すことによりその非特異消耗會即時使用試楽の製
造段階で均省化するという方法で拘倫させる。或は、そ
の代りにネガチプ対応テストにおける王結合ののち、補
体活性の尚い試薬混合物を適当な敏衝液で一定ｔファク
ターに従って史に希釈することによって、七の反応１１
ｒｆって非特異袖体ＩＦ４粍を補正する。　□：１□：
□１旨七〇輛正は好ましくは本結合反応の開＃ｊ＾ＩＩ
、即ちテストの始まる罰に即時便用試薬を溶解した直　
　　　　　　　　　　　を恢に打われる。そしてその結
果としてネガチプ対照テストに所望の同調化が達成され
る。この希釈ファクターは製造者によって決められる。

そして各チャージに関連した指示の中に示されている。

ネガチプ対照テストの溶血カーブの同着ｙ（ヒの最終段
階は次いで使用者自体により行われる。

活用可視補体結合テストの場合Ｙの反応全マイクロチタ
」プレート上で行うのが好ましい。そし壬τのルートは
可能なら補体結合テストにとって最適の温度である３７
℃に加ｊｉされ、好ましくは光学的な手段を使用する。

この光学的な手段は棺妙に造られた澄明な下敷きである
それによって遅延した溶血、その反ル６の非同ｊ譚をよ
り正確に定量的ではないが牛定蓋的に＾い分析法で決め
ることができる。実際上２０−４０秒が再現性を以って
測定出来ることが判った０浴血におけるこの遅延は、反
応混合物の−当りｌＯ〜１５＋１ｇｚのコンプレックス
抗原に＠当し古典的補体結付テストに比較して約１０倍
の感度上昇に相当する。

定テストの１１５プラス希釈に相当する様に試薬ｔｇｉ
ｉ＋整する。

即時便用試薬による袖体結合テスＨＣ光学測定定量法に
とっては測定の最も適当な方法はいわゆる５０悌補体浴
血測定法、即ちＣＨ３０％溶解時間分析法である。代替
法は傾斜の測定、溶血曲線をつるための時間当りの吸光
減少、又はにとり減少である。後者の方法は、　しかし
乍ら古典的補体結合テストの不利を有している０即ち試
薬の測定範囲は再度浴血相（不溶血／完全溶血）に限定
されているし、溶血反応の潜在相會含む広い測定範曲の
可能性が失われている。

Ｃ１５０チー浴解一時間−分析法１ｄ実際反応混合物の
測定補体活性全測定するための方法であり、自体で袖体
結合テストの浚れた党測定量法′ｆｔ提供するものでな
い。そのためＫは、−１定した溶解時間σ）自然対数値
への変換が必要であり、且つ試験抗原ｓ匿又は抗体量の
同様に自然対数値での表示を必景としている０この手続
きは測定結果のｆ？価のダブル対飲法と呼ばれている。

この好筐しい＋ン十続きはμ■成りの利点全達成する、
第：λ図はその様な抗原／抗体標準曲線金示すものであ
る〇特異抗体／抗原試薬による補体結合のそれら若干の
パラメーターから、その反応を活用するために使用で負
る。

１、過剰の抗体（対応する抗原の増加ｉｋ加えた過剰抗
体にあっては補体活性免疫コノプレックスの一定量が必
要である（　１ｎｓｔａｔｕ　　ｎｏｓｃｅｎｄｉ　）
Ｍ故ならば測定可能な補体結合反応が起るからである。

実験によってそのことが１５〜２５＋１ｇｒ／ＩＩＬ１
反゛応混合物なる抗体濃度で進行することがホされてい
る。

４　その点が達成されると補体の特異結合が次式式中ｔ
は補体結合の温置時間（秒）であり、ＤＶｉ抗体又は抗
原の希釈−１Ｃｏは最初の補体嬢度、Ｃｔは時間ｔにお
ける同一濃度、Ｑは温度係数、そしてＴは温置時間であ
ΣＯ Ｒ，バーゲス、Ｇ、バーゲス及びＳ、ベルナンスに〆る
この方程式即ちニューヨークで１９７０年１１月２〜４
日開催のテクニコン　インターナショナル　コンブレス
で紹介されたオース）ＩＪア抗体の測定における補体結
合のカイネテック　−　エヂュアロス　リサーチ基金Ｉ
ｎｃ　ｏに対する寄附金により支持されている　−　フ
ロリダ　マイアミのＲ，ツールマン　アッソ／ヱートに
よる１９７１年着イ￥利−は係数Ｋ（Ｋ＝補体結合反応
の係数）に転換できる。もしも補体と抗体からなるある
系（第３図）が加えられた抗原を含有するときは、直ち
に補体の消費が始まる。

もしこのことがグラフで示されているときは反応のカイ
ネチックはシグマ字状の曲線となる（第３図もこの曲線
の傾斜は一定の最初の補体活性において各抗体／抗原に
ついて特蝋的である。

′ｌ。

式中Ｃｆは遊離成分の濃度、Ｃｔの結合成分の濃度−１
には成分結合の係数、Ｄは抗血清の希釈度、そしてｔは
反応開始から成分結合の時１＆！１に示わす。

この式と観察はしかし乍ら部分溶血によりバーゲス等に
より決められた。即ち抗体／抗原比における変化は補体
結合の係数の変更を起す。抗象醸度の上昇及びその他の
変動＋ｉ数の維持により、補体結合の係数の蛾適抗体／
抗原に至るまで、線状増大が観察できる。この点は抗原
の同時「り結合中の補体消耗用にアローワンスがなされ
ている場合、反応混合物中の与えられた抗体普の最通結
合能力に対応している。抗原濃度におけるその役の上昇
は補体結合を過剰抗体中の係数における前増加と幾分対
称的に減少せし検る。抗体の過剰が大きいときに補体は
結合していない。

それらのパラメーターＦｉ部分溶血範囲中でバーブニス
他法で決められもそしてそれらの定ｑ的な組成（Ｃσｐ
ｏｓｉｔｉ４ｎ１．ｎ　）において古典的袖体結合テス
トのチェス−ボード滴定法の結果に対応している。

テクニコン社Ｆｉｌｅ７０年の当初にそのテストに基〈
補体結合テスト用の自動装置全開発し市場に提供した。

即ちこの方法はかｉしかし部分溶血の不利によって悩ま
された。それ會迂目するために検出糸２１− に到着したとき部分溶血の範囲内にその反応混合物があ
る様に反応時間を変更するためチューブの長さを変えよ
うとテクニコンの自動分析装置は試みム ３、補体結合を起し実験によれば、１８０社１ｍ置装後
、完結することが明かになっていて、その反応のカイネ
チックに対応する特異杭体／抗原反応の完了後残余の実
測補体活性は、その後ある時間（３０〜６０分）の間反
応混合物中では、その特異反応の完了後に存在している
量に相当しているということは新しい発見である。この
現象は１物質（即ち（抗原）又は抗体の濃度以外の試薬
の割合が同一であるような一連のテストで確認された。

この脩件はカイネチック（常に補体全過剰にして操作）
評価形での補体結合テストの光学的定量又はセミ定量可
視性定量を可能にする。そのやり方としては個々のテス
ト即ち抗原物質標準曲線テストを利用して、抗体／抗原
の完了後すぐに特異補体結合を決める実測補体活性全定
量的に決めることができ、そしてその個々の実測補体活
性値から、定量化が行われるというものである。

個々のテストでの実測補体活性は長期間効果である、そ
して抗原／抗体反応の合計的生成物と結合補体とはバー
ゲエス等による定量に有利に対応していて補体結合の評
価／定量は溶血反応とは係りを有（することなく（部分
溶血の枠内で行われない）むしろ反応の定量は補体溶血
の潜ａ、舶ｚ含み、抗原／抗体決定補体結合に直接係る
か、又は好ましくは、その後その結果として結合混合物
の広汎な測定範囲内で行われるのである。

もし、この方法での評価が反応開始俊１８０分（＋約３
０〜４０分）より後に、遅延評価を以って行われるなら
ば、厳正な定量反応結果の障害が各個テストの反応混合
物中の補体システムの非特異的□ な不活性化によって各個テスト中に生成する。パ１゛）
’１ ラメ−ターは部分的に正確であるＫすぎ１、標準−―は
直線す成するこや：１−く、その反均よそれほど鋭敏で
はないだろう。

実際の補体活性の自然的測定は溶血反応の５０９！減少
するポイントが最適であると見做され好んで使用せられ
るべきではあるけれども、その嫌なポイントに絶対的に
は拘束せられていなへ指示材料である赤血球系の２０％
〜ＳＯＳなる範囲での嵐看を行うことができる。但し各
テストの読みはその溶血反応の同じ段階で行われること
ヲ脩件としているＯ 抗体／抗原結電補体結合を定量するときは試薬の比率は
平衡点（補体結合にとって最適の抗体／抗原比のポイン
ト）が１５〜２０分の範囲にある桟に選ぶのがよｈｏ その上、その反応系は好ましくは少量の抗原又は抗体で
プレゼンジタイズ（１”≦ｃｎｓａ＋３々Ａ）Ｉａｔ−
＜＊−１ｑて・・ブランクはＣ＋１不活性系のポイント
ラ示し、且つそれを超過している。この様にして試験す
べき極めて少量の物質をただちに測定することができる
。

そしてそれはその反応（約１．５〜５ナノグラム抗体／
　ｍ１反応剤混液）の反ｉ性ヲ基装置いている。

この方法によって抗原し抗体用の直顧準曲線をＩＩ、） うろことができる。但しその評価法、即ち実際の補体活
性に対応するＣＨ３０％−溶解時間分析の自然対数値１
　　社抗原／抗体濃度に対してプロットされており、従
ってそれらが自然対数値に表示されている必要がある。

この場合この測定範囲において必要とするものはブラン
ク値、対照１１！Ｌ及び分析値である。その対照は充分
なテスト物質を含んでいてその物質は同時に測定系の平
衡点を示している（＃高可能測定点／テストのための物
質の濃度）。この場合次式を用いて未知濃度を決めるこ
とができる。

Ｃ＝旦×！ を凰 式中ＣＩＩ′ｉ未知濃度、ｃ４好ましくはＩＩＩＪ犀さ
れている抗体の一定１ｋｔ−有するブランク値であって
補体系ｔｉｅ−１−不活性化剤一系のレベル上にグレゼ
ンジタイズされている。ｔはサンプルのＣＨ３０’ｆｋ
溶解時間［株］）であり、Ｆはファクターである。ファ
クター（Ｆ）の計算においては公知の濃度（ナノグラム
／ゴ）及び対応するＣＨ３０％−溶解時間（秒）はその
自然対数に書き換えられる（第５図参照）一連のヒト血
清サンプルは大多数のプロバンド血清が少量から多量ま
でのいわゆる両受体活性を含んでいることを示した。プ
ロバンド血清の両受体活性は、プロバンド血清でのテス
トがブランクに較べてより高い実際の補体活性を示すこ
とＫよシ、各個テストの実際の補体活性に非特異的に影
響を与える。何故ならばこの値は補体濃度とインジケー
ター赤血譚の感受性度の函数であるＯ プロバンド血清をそのサンプルから両受俸禄抗体を除去
するために５０℃で１５〜３０分間通常―置を行装たの
ち、ヒツジ赤血球の一定量でプロバンド血清の上記非特
異的効果は除去できる。この場合吸収によるサンプル自
体の補体活性不活性化工Ｓｔ−含むことができる。この
目的のためにホルマリン又はゲルタールアルデヒドで安
定化した洗浄ヒツジ−赤血球を使用するのがよい。経験
によるとプロバンド血清１ＩＩＪ当り約１００〜２００
がの沈降赤血球が血清サンプルの両受体活性を完全圧除
去するのに充分であることが判っている。その様に鯰理
した血清サンプルは溶血反応をおくらせる障害効果を示
すだけである。そしてその溶血反応は多かれ少かれ実際
の補体活性の非特異障害によって起るのである。疾病に
より循還免疫複合体（コンプレックス）を含むプロバン
ド血清はその複合体の遺体結合能　による補体結合奮起
す。

この補体結合はしかし実際の（抗原）系及びコントロー
ル（抗原）系において同一の濃度にある、それは主結合
に続く補体活性の低い実際（実測）レベルの破−に補体
溶血における遅延の原因となる。しかしプラスに評価さ
れる溶血反応の非同調化奮起すことはないのである。

もし標準血清を使用するならばプロバンド血清のコント
ロール中における溶血の遅れをブランクコントロールと
比較することによって参照糸として標準血清の非特異的
一体の消費を用いるとき、病）１゜ 理的に高い抗補体活性を有する血清サンプルを理解する
ことができる０ ヒツジ−赤血球の代りにそれからの抽出物も使用できる
。抽出物は３モル塩化カリヴム浴液中溶解赤血球の遠心
分離によってつくることができる。

１６時間の後に０．９１塩化ナトリウム溶液に対してそ
れを透析する。　　は補体に対して不活性のカルボキシ
セルローズ又はセファローズに結合されているＯ 適合化された可視性補体結合テストにおいては両受性活
性を有しない不活性化及び吸収プロバンド血清を使用す
るのがよい。

古典補体結合テストにおりてはプロバンド血清の両受体
活性は、ダ東に試薬１−当りのプロバンド血清含量が比
較的高い当初希釈ではその反応の間に１’ｌｌ＋％貯千
有するのであるが、その両受体活性は除去されていない
。

・１・生の書と 例１　プロバンド血清の各種両受俸禄活ｍ明及びプロバ
ンド血清の幼処理に′よるそれら研究要因の吸収／除去
の説明（：：：実験）。

最適濃度の両−一及び補体からなる反応混合物。ｌ！、
＃Ｊ　ｍｕｆｆｉｎ！Ｉ１．１よ、ッ。Ａ７Ｙｅｌｌ。

オ。えゆ果ｔ−醐定する鴎のテスト系（セロバック−補
体−変　　　　　　　　　　　＼動テストエ）。

カルシウム及びマグネシウムを有するリン酸緩衝食塩水
中５０，４’Ｚ（マイクロリットル）の補体を含む試薬
混合物の１−（１０ツチのへ及び　５ツ嘩のダを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＪ）及び０゜２両受体１　
：　４０００　（ベーリングペルケ　ＡＣ，Ｄ−３５５
０マーブルグの製品）。

この反応物混合物に補体を除いたヒトプロバンド血清の
１０ｏｆ４／を５６℃で３０分をかけて加え、その混合
物音３７℃で１８０分間温置装置。プロバンド血清の代
りＫＩＯｏＩ−Ｉｆ’の緩＃准によるテストｔ一対照と
する、ＣＨ−５０−一溶解時間一分析は、補体結合テス
トの主装置の３０″’Ｃｌ８０分なる温＠後に行われそ
の系の実測補体活性ｄＪ定されたヒツジ赤血球ｌｏ　ｏ
ｒｅを０．４なる当初吸光度を与えるために加え九 結果：　　　ｃＨｓｏｓ浴解時間溶解 対照系は溶けないまま残る。これにその系が両受体を含
んでいるためと期待することかできる、ヒツジ赤血球の
感作はまったく起らなかっへプロバンド血清は違った両
受俸禄活性を示す。即ち研究の最初の系列のおＡてはプ
ロバンド血清がより高い実測補体活性によ〈似ているこ
とは理解できる。

その両受俸禄活性を除去するためのプロバンド血清のヒ
ツジ赤血球での吸収： ５６℃で３０分間温重したプロバンド血清８００，１”
　／室温で１０分間放置し最後に遠心分離した、この上
Ｍみが補体分解しく　ｄｅｃω嘗１釘ｅｎｔｅｄ　）且
つ吸着されたプロバンド血清となる。

前以って行われた二つの研究全前処理したプロバンド血
清で４１１収した◇ 両受体活性′に飼足する試験の結果 油性　　−〇）ｉ−５０チ浴解時間 対照゛　プロバンド血ｆＩＩｔ　１２３４５６不浴、解
　３７℃で３０分後何れのプロバンド血清も完全に溶血
しなかった。

判定；　上述のプロバンド血清の前処理はプロパンド血
清の障害となる両受体活性を完全圧除去するのに通常充
分である。

テスト系の実測補体活性に対する前処理プロバンド血清
の非特異的効果を決定するためのテスト結果対照系　プ
ロバンド血清　ＣＨ５・チ溶解時間２３４５６ ３１５秒　　　　３７０３８５４０１４０（１３５５３
９０判定；前処理したプロバンド血清（補体分解し且つ
畝収したヒト血清）は非特異的な補体−消費効果だけを
示し非特異的な高い実測補体活性は、もｉ″：ｉや示す
ことがない 例２ 反応剤混合物の実測補体活性への抗原／ＣＦ’Ｔ用対照
抗原の非特異性効果のテスト 分析系　１．／Ｃ百−緩衝液　含有 ５ｏ１ｂｔ　　の補体。

０．２．＆ど　　の両門採１：４０００（ベーリングベ
ルケ社アールプルグの製品）この反応剤混合物に古典Ｇ
１の上述の抗原／対照抗原濃度に対応する様な量の抗体
及び対照坑井の“　　、°　　　１０苧ＱＣＦＴ−緩衝
液希釈液を加えた。

例えば１：６０の力価を有するベーリングペＶ社ａ４−
（伶”ｌ　−（ｃｙｔｏ　ｍｅｇａｌｙ　）−抗原／対
照抗原。２軍位の０．２５−抗原希釈液上１ｍ反応剤混
合物中古典ＣＦＴ中で使用した。そうしてこのテストで
ｌＯ−の０９緩衝液は凍結製品の丹調整後２５０／　３
０　＝　８．３３みｌの不布釈浴鮮抗原を含んでいる。

／ 灯照抗坏のａ度も同様である。

この系ｉ３７℃で１８０分間龜置装た。最後にこの糸の
実測補体活性の測定はＣＨ−５０囁−俗解時間分析によ
って行った。このテスト系にＣＦ′Ｔ−緩爾液中ヒツジ
赤血球サスペンション１００Ｓ會加えることに工り０，
４なる駁光値が得られた。

異なる抗原と対照抗原の結果 ′繭・・ チトメガリーー抗原（ぺ品すングベルク　　ＡＧ　）チ
ャー？１　　　ｆで一″′　　　む−″３３抗原　３１
５１　　　３４０ｇ　　　　３３０１　　　　　　　　
　　　　　　覧対照抗ｍ　　３２０＃　　　　３４０１
　　　３１０１０テルン抗原（ベーリングベルク　ＡＱ
）チャージｌ　　チ　−ジ２　　チャージ３ヤ 抗原　　　３１０＃　　　ゴ３１５＃　　　　３１ＣＤ
対照抗原　３１４＃　　　　３１２＃　　　　３１１＃
トキンプラスモーゼ抗原（ビオメリウックス社）抗原　
　　３５５＃　　　　３６０−　　　４４０＃註；トキ
ンプラズマ病−抗体生物測定はマウスの腹水病から得ら
れた。そのためコントロール抗原社なくコントロール系
があるたけでありコントロール抗原の代りにＣＦＴ−緩
衝液全使用した。

判定；適正可視補体結合テストの原理は試薬を簡単べ混
合しただけでは現実できず例外的な場合だけ可能である
ことは簡単に判る。

試薬を混合しただけの場合は高度に精製した高純度高品
質の試薬（抗原／コントロール抗原父は疫疾血清及びコ
ントロール血清）であって試薬混合物の実際の補体活性
に最小の非特異作用しか及ぼさないか全く同一の非特異
作用しか及ぼさないものを用いてはじめて可能である。

実施例中ではそのことはベーリングベルタＡ、Ｇのロー
テルンー〇ｉ−抗原を用いて始めて可能である。

このものは組織培養から造られた最純度の抗原である。

その他の場合にはすべて抗原／コントロール抗原系の再
同鼎化會保証するために適眞な工程を必要としている。

例えばサイトメガリーチャー−／Ｉ６１の様に」ｔカ＼
な偏りのある場合はそのことは主装置の完了後抗原系に
ヒツジ赤血球サスベンジョｙ’ｌ加えて指示反応の開始
を正確に５秒おくらねたときに起りつる。

こうすることによってネガテブなコントロール系におい
て同期化溶血反応の生起全保証することができる０ 同期化の別の方法は一連の実験に於いてどれだけ多くの
補体を例えばサイトメガリーチャー九３の抗原系が必要
としているか？決定することである、そうすることによ
り２０秒なるＣＨ−５０９解時間がバランスされている
、この目的のために、その分析系に次第に装置し友補体
を加えるテストがｌｄの試薬混合物中５０１５５／６０
／６５等戸と補体を用いて行われる。理想的な補体活性
が主装置の完了後に得られるように５０ハｆ補体をＭす
るコントロール系に対応して抗原糸に５ｒ、ｓ７ｄ補体
量なる値が決められる。

系中実際の補イト活性の同期化の鳩の可能性は稀釈ファ
クターの決定である。

この目的のために、ドキンプラズマ病−Ｃドｒ−テスト
に２いてはコントロール系は主装置の促始以藺Ｋ　ＣＩ
Ｉ’Ｔ−１１ｋｌ［ｋ送画にｍｔｔして稀釈をする０即
ち凍結伸え東試楽は書−姫の後すぐに稀釈きれている。

コントロールシステム（１ｉｄ）にＨＩＯ／′２００／
３００　／　４００　／　５００　／　６００７’（Ｃ
Ｆ’Ｔ　−＊両液を加え、よ＜ｉ餉ｇし次いて過当量を
移す。こうして高′：ｉ′ い実際補体活性【有する糸の百分率稀釈液か傅ら：１ １１’、：１ｌ ｆＬ；ｂｏ　１！Ｊ１１ｊ”Ｋ門、・下、４０．６（、
＝５０２）６６７７？ターが次められ魁そのことＦｉｉ
−の反応剤に０．５−のＣＦＴ−緩＊＊に加えなければ
ならないことｊＩ！４Ｃ５０％稀釈を意味している。即
ち王装置の完了後（３７℃　１８０分］抗龜の非特異的
な抗原活性に拘らず二りの系が同一の補体活性を持ち適
市なにテストパッケイジに限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

添付の第１〜５図は本発明を説明するための説明図であ
る。 、：：′ ハ ＼ 手続補正書（ｈ＊） 昭和５８年５月１２−日 特許庁長官　若　杉　和　実装 １、事件の表示 事件との関係ｔ％許出出願 人、ヵ、ヶ　アイルランド国　ダブリン２ハルコートス
トリート住　所　（無番地）　　ハルコートハウス４、
代理人 １）明細書４頁下より３行の「加へなれた」を伽へられ
た」と訂正する。 ２〕　同５頁１２行、１７頁１５行の［＋１グラム１全
１ナノグラム］と訂正する０ ３）同９頁初行の「許浴量１を［許容量ｊと訂正する。 ４）同１８頁２行目の［典様１全［曲線］と訂正、同末
行の「している１を抹消する。 ５）同１８頁２行目の１対応テスト」ヲ「対照テスト］
と訂正する。 ６）同１８頁２行目の「Ｙの反応」全「その反応］と、
同末行の［１１５プラスＪｉ「１　：　５プラス１と訂
正する。 ７）同１８頁２行の「テストにＪを［テストの１と訂正
する。　　。 ８）同１９頁３行、：１〜旨行の［パラメーターから：
″、、１ 一−−−−示されそいる。］ヲトくラメ−ターから何れ
がその適正化に使用できるかを決めること　　　　　　
朱ができる。 １過剰の抗体に対応する抗原の増加量を刃口へた過剰抗
体にあって（ｄ測定可能な補体結合反応が起る以前に補
体活性免疫コンプレックスの一定量を必要とする。実験
によってそのことか１５〜２０ナノグラム／ｍ１反応混
合物なる抗体濃度で進行することか判っている。ｊと訂
正する。 ９）同２１頁４〜５行の「により、−一一至るまで、線
状１を［により、最適抗体／抗原比に至るまで補体結合
の比係数の線状ｊと訂正する。 １ｏ）同２２頁５行の「１８０分」ヒ３７°Ｃ２１８０
分］と訂正する。 ］１）１用２５頁Ｑ行のｒ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｊ　ｋ　「
７アクターＪと訂正する。 ２〕同２８頁２行の「（Ｉ′ｉ補体」を「残渣は補体ｊ
と訂正する。 １３）同２２頁５行目の「両受体］を「　両受体ｊと訂
正し、１４行目に続けて状起千ｇ−ｓ：カロ入すｂ、「
結果；　　ＣＨ−５０’％陰解時間分析対照　血清試料
１２３４５６ ３０２秒　　　４２０２５５４８５３００４１５３７０
血清試料（ｄ、対照系が有するよりも補体の除去に拘ら
ず、より高い補体活性を有していることか判った。 同じ血清を上記試験システムで分析したが両受体（ｄ加
へなかった。このため同じ岐原の補体を用・ハた。　」 ンス　」二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１）　　　過剰の補体全使用すること及び力・■イチ
   ックメソド法で反応全評価すること′ｔｌ−％僅とする
   、補体結合反応テス）（ＣＦＴＩのＩＪｐ、理（（ｔ’
   −より、血清学的検査を実施するためγ）方法。 （２）　　　試薬中及び対照試料中の袖俸量會互いに均
   衡させることを特徴とする請求の範囲１の方法。 （３）　　ａ）実（１ｉ１Ｊ補体活性に影！１１’に及
   ぼすことＪ）ない高品質試薬を用論るか、あるいはｂ）
   補体賃への非特異性影響が同じである力〜できるだけ小
   さい試薬を用いるか、あるいはＣ）系（・こ史に袖体全
   顎えることにエリ、一つの試薬中のより昼い抗補体活性
   金補う力ｚ　　ｄ）王な処置のけじめで抗原と抗体との
   結合以前に同一の尖醐補体活件になるように適当な駿笑
   剤を用いて袖体活性のエリ制い系を傳めて、試薬中及び
   河特徴とする請求の範囲２の方法。 （４）　　本来の対数値や抗原・抗体の製置に対し侍ら
   また溶解時間をグラフ化し、こハらの叔頓全榛準曲線と
   比較し、袖体溶血の潜在相の許＄ｔを持つＣＨ３０係溶
   解時間分析によって、休々な糸の残存補体活性を逆渇定
   計価することを特徴とすｂ・　請求の範囲１の方法。 ｉ５）　　　５６’ＣＩ５〜３０分間の普】用の偏置後
   又はそのさせられているプロバンド血清？慄用すること
   【特徴とする請求の範囲ｌの１＝ｊｎかの方法。 抽出物で非特異住両父体様の活性が減少させられている
   プロバンド皿悄會用めること宿狩倣とする請求の範囲２
   の方法 （７１５６−Ｃｌ３〜３０分間の普通の温１に後又はそ
   の間にあるｍのヒツジ赤面坏又にヒツジ赤血球膜の抽出
   物で＃特異！Ｅ肉受体・７・・休の活性が滅（８）　　
   　５６℃１５〜３０分δ通の処置後父はそのれているプ
   ロバンド血清を用いることを特徴とする請求の範囲４の
   剪れかの方法 （９）　　　すべての試薬がパツキングー１に相互しく
   同じである〃・、均何されている過剰の補体τ含んでい
   ることを特徴とする補体結合テスト吊該１がすべて安定
   形をな／している、只θ時便用テストパッケイジ中のテ
   スト＠榮