JPH0526142B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は補体結合テストの原理により血清学
的検査を行なう方法に関し、その方法に用いるた
めのテストパツケイジを使用する方法にも関す
る。英国特許明細書No.1487351はモノテスト系の
原理に関するものである。

この方法の専門的な研究成果が進展する間に、
様々な所見が述べられ、議論が展開した。そして
それらが本発明の基礎となつている。それらの所
見を以下に述べる。

古典的補体結合テストは本世紀の最初に発見さ
れた。驚くべきことに今日までその技術はそれほ
と改善されていない。反応は２つの部分からなつ
ている。すなわちそのテストの最初の部分では、
抗体（例えば、患者血清中の天然抗体）が一定の
量の補体の存在下、抗原（例えば、ビールス抗
原）と反応する。抗体と抗原との反応により得ら
れる免疫コンプレツクスは補体と反応結合し、補
体が消費される。テストの第２の部分で抗体（両
受体）が結合しているヒツジ赤血球の溶解または
非溶解が、いわゆる補体溶血反応によつて可視的
になり測定される。抗体抗原反応の（患者がビー
ルス性感染を受けた）場合、結果として生じる免
疫コンプレツクスは補体と反応結合し、ヒツジ赤
血球は補体活性は欠如のために溶解せずに残る。
もしその反応がネガテイブであると加えられた補
体活性が残り、補体に仲介されたヒツジ赤血球溶
血が起こり、コンタクトミツクスのにごりが減少
する。その反応の定量化はごく最近になつて、初
めて血清試料希釈法によつて達成され、その場
合、各希釈が＋反応または−反応についてチエツ
クされている。いくつかの補体固定テスト用光度
測定法が説明されてきた。しかし、それらの方法
はハンドブツクに近年現われているものを含め
て、補体溶血を光学的に等級として測定するだけ
である（部分溶血法）という基本的な問題が指摘
される。すなわち、この方法では分離した血液着
色物（colourant）の量が測定されるだけである。
これらの方法により、反応物１ml当り数ナノグラ
ムの抗原物質の感度範囲が測定できるが、以下の
ような多くの問題がある。

(1) 反応の停止が極めて困難である。現在知られ
ている方法では、例えば、遠心分離を行ない、
次いで遊離した赤い血液着色物の量を測定す
る。

(2) 測定範囲は、常に事前に決定しておく反応混
合物の溶解、非溶解の条件の範囲内に永久に限
定される。

以下に用いられる「分析テスト系」なる語は分
析テスト媒体としての抗原または抗体の使用を含
んでいる。

以下用いられる「対照テスト系」は分析テスト
媒体としての抗原または抗体の使用を含んでい
る。

この発明は上記の問題を解消する決せ検査を行
なう方法を提供することを目的とする。

この発明により、補体結合テストの原理により
血清検査を行なう方法が提供される。この方法で
は、過剰の補体を用い、反応の評価をカイネチツ
ク法によつて行なう この発明の他の目的は、試薬および対照試料中
の補体量を相互に均衡させる点にある。

この発明は、さらに反応を行なうための試薬を
用いる血清検査用の即時使用テストパツケイジを
提供するものである。このパツケイジでは、上記
の試薬が１個のパツケイジ中に別個に、部分的に
一緒にして、あるいは好ましくは分析系用または
対照系用に一対になつてアンプル中で製造できる
ようになつている。

この発明の一実施態様では、補体結合テストを
できるだけ能率的に可視的に行なうための方法を
提供する。この方法では、試薬が固形状に保存さ
れており、ネガテイブの対照中またはブランク中
の主な温置の完了後、かつ指示反応である溶血反
応の開始以前に、分析系と対照系との両方におい
て同じ補体活性が存在することが可能となるよう
に適切な方法を用い、その反応結果を評価する。
そして、溶血の遅延はポジテイブな反応と見なさ
れ、溶血遅延の程度は反応の定量に使用できるの
である。

この方法において分析値および対照系中の実測
補体活性の同期化は、好ましくは、以下のように
行なわれる。

(a) 実測補体活性に影響を及ぼさない高純度の試
薬を使用するか、 (b) 補体起源とは別の試薬による分析系およびテ
スト系中の非特異効果でができる だけ小さい
か、両系において同じであるか、 (c) 他の系に比べて低い実測活性を補いかつ均衡
させるため、抗補体活性の高い系の中に高濃度
の補体を加えるか、または (d) 主温値の開始前でおつて、抗原抗体の結合の
開始以前、好かしくは固形保存または凍結乾燥
した）試薬を適当な緩衝液で溶解した直後、補
体活性の高い系を充分に希釈し、これにより、
分析系および対照系の両方においてネガテイブ
な反応（ブランクまたはテスト用にネガテイブ
対照血清を使用）の場合、主温置の終了後、か
つ指示反応の開始前には同じ実測補体活性が存
在するようにすること。

さらに、この発明は、固形状に保存された試薬
を用いて反応を行なう補体固定テストを定量化す
る方法を提供するものである。この方法において
は、分析系およびテスト系において特異的な抗
体／抗原反応が完了して補体活性を決定した後、
過剰な補体が存在し、そして適当な方法で種々の
系の残存する補体活性を逆測定する。

適当な方法としては、好ましくはCH50％溶解
時間分析法がある。この方法では、結果としての
溶解時間から補体溶血の潜在相を除く。この方法
においては、抗原または抗体の濃度をその自然対
数値に変換し、好ましくは標準曲線を与えるよう
に、互いにプロツトする。

そのほか、この発明は補体固定テストの原理に
よつて血清検査を行なうために、普通に市販され
ている抗原／対照抗原または抗血清およびブラン
ク血清の説明方法を提供する。すなわち、それら
試薬の抗補体活性を付加的な説明または解説する
ことが、使用者がさらに前調整を行なわなくて
も、この発明の原理および利用によつて可能とな
る。従来の問題は新しい方法によつて克服され
た。補体溶血を光学的に、好ましくは546nｍ
（または、その近くの波長）で、にごりを測定す
ることによりモニターすると（第１図参照）、補
体溶血のいくつかの基本ルールはたちどころに理
解され、これにより補体結合テストの適正化に利
用できる。

補体溶血はシグマ字状の反応曲線を伴なう。存
在する補体活性量により長短相異なる潜在時間後
に溶解反応が起こる（感応赤血球からの赤血色の
遊離、にごりの減少、反応混合物の透明度の上
昇、吸光または吸収の減少）。

反応混合物中の補体活性が高ければ高いほどシ
グマ字状のカーブのスロープは大きく、補体活性
が低いほど溶解曲線は平坦である。

もし補体活性の全てが用いられときは、赤血球
は溶解せずに残り、反応混合物のにごりは不変の
ままである（古典的な補体結合テストにおけるプ
ラス反応に対応する）。反応混合物のにごり（吸
光度／吸収）は次第に減少する。これは非溶解赤
血球サスペンシヨンの暫時沈降に対応する。これ
から次の事実を確認できる。

(1) 補体活性の増大する補体溶血の原曲線（第１
図）を観察すると、光度測定による補体結合テ
ストは、その反応の適当な定量化によつて、よ
り敏感となるであろう。そして古典的なCFT
の場合と同様に、そのテスト系列の曲線の右端
における反応混合物の溶解または非溶解条件の
状態が補体結合テストの反応のコースを判断す
るのに用いられる。さらに、補体溶血の溶解お
よび非溶解条件の中間段階なども測定され、適
当に定量化される。

(2) 加えて、良く知られている光学的測定による
評価法、即ち赤色物の遊離の測定（部分溶血測
定法）が最適でありえないことは明らかであ
る。なぜなら、この方法は不便であり、不利で
あり、また反応の停止や不溶解赤血球の分離は
不都合だからである。その上、この方法では理
論的かつ実際的に可能な測定範囲は狭いもので
しかない。さらに、部分溶血の範囲内でしか操
作できない。

(3) 英国特許明細書No.1487351の方法は、補体結
合テストのかなりの合理化を可能にした。すな
わち、全ての制御機能を保持している一方で、
即時使用安定試薬の使用により予備テストを必
要としない即時使用モノテストシステムを提供
している。しかし、非特異反応を完全に排除で
きないために、理論的な可能性の通りに良好に
用いることができなかつた。

(4) 補体結合テストを活用する別の可能性は、反
応カイネチツクから導かれる。すなわち、 (a) 常に補体過剰の範囲で操作するカイネチツ
ク評価法のような反応技術を使用するとき
は、測定範囲はかなり拡大する。

(b) カイネチツク法を光学的に評価し、これを
適当な数式と組み合せて、その結果、必要な
測定範囲で標準曲線が再帰曲線として表現さ
れる場合は、反応感度の多様性は増大する。

(c) 特異反応に対する、通常はプロバンド材料
に起因する非特異効果を、非特異的な影響の
特質として相当量を排除することは、反応曲
線および対応する反応から分析可能である。

もし、時間的に反応物混合物の補体溶血が完了
する範囲を利用するときは、補体結合テストの測
定範囲をかなり拡張できいることは明らかであ
る。一つの必要条件は、補体結合テストの定性定
量評価が、溶血対非溶血の比によつて決定される
だけでなくて、完全溶血の遅延にまで拡大されな
ければならないことである。その補体溶血の遅延
が可視的・定量的にか、または半定量的に測定さ
れるか光学測定的に分析されるか、そしてその分
析結果を結果の定量化に使用するかの決定は利用
者にゆだねられている。

この方法は主たる特徴は、過剰の補体の存在で
のカイネチツク測定である。

もし、補体溶血の遅延表示が可視的に測定され
次いで測定が行なわれなければならないならば、
すなわちネガテイブ反応の場合（例えば加えられ
た（ビールス性）抗原に対するプロバンド血清中
に全く抗体が存在しない場合）とか、研究される
べき材料中に測定されるべき物質が全く存在しな
い場合、分析試料中や対象試料中（抗原テスト対
照抗原テストに対応する）の主反応（ボンド（抗
原の後退との反応と補体活性の結合）の完了後、
溶血反応（吸光の減少、にごりの減少）が完全に
同調して進行する。ドイツ特許No.2333434による
即時使用試薬の場合または原特許のクレームの拡
張範囲に対応するその拡張形の場合は、その即時
使用試薬は一対のアンプル中または即時使用パツ
ケイジ中で作られる。しかもそれら即時使用アン
プル対またはパツケイジは必要とする各パツクさ
れた試薬（例えば、補体および抗原、補体および
対照抗原、または補体およびテストされるべき物
に対する抗体、すなわち補体およびブランク血清
（同じ種のものではあるが、各個に免疫されてい
ない血清または動物血清）用の試薬）しか含まな
い場合も同様である。そして古典的溶血系のため
に、溶血反応に使用されている。

溶血反応における遅延（反応のデシンクロニゼ
ーシヨン）のみは、＋の結果と見なされるべきで
あり、その結果として補体結合固定テストは、そ
の感度においてかなり上昇することは、明白であ
る。このことは、そのテストがネガテイブである
場合、溶血反応が対照中および分析系中で主温置
の後に同調されているという保証を要求する。そ
のことはドイツ特許No.2333434に対応する反応の
拡張した形態にとつても大切である。この明細書
の付加的な公開内容が常に好ましく用いられよ
う。また古典的溶血系をつくるために必要な実験
室での作業を避けるために即時使用アンプル対ま
たは、試薬パツケイジ中に両受体が加えられよ
う。

本明細書の詳細な例示から、最適に可視的な補
体結合テストを達成するための理想的な状態およ
び本質的に必要条件は、普通の市販の試薬（抗
原、対照抗原、抗体および対照系）を補体と単に
混合することおよび両受体の添加によつては達成
されないことが判る。なぜなら、多くの場合、試
薬は互いに異なる非特異的な抗補体活性を持つて
いるからである。しかし、それら異なる抗補体活
性は、即時使用試薬の製造者により前もつて決定
し、計算することができる。そして、それは製造
工程において、あるいはそれらの非特異活性を見
越して指示書が考慮されている場合に可能であ
る。従つてネガテイブな場合の溶血反応の必要な
同調化は使用者に保証できる。ネガテイブな場
合、反応の最適化に必要な溶血反応の再同調化が
起こることを保証する三つの方法が存在する。

１ 例えば、組織培養からの高純度のレテルン
（Ro¨teln）補体固定テスト抗原および対照抗原
を使用すること。その場合、抗原／対照抗原は
さらに超遠心分離機で精製する。そして、その
際に高純度試薬は、反応混合物の実測補体活性
に対して、非特異的な効果を全く及ぼさない。

２ あるいは、多くの場合、即時使用試薬の製造
段階で補体活性の量を増すことにより補体活性
の非特異消耗を均衡化するという方法で、その
非特異的消耗に相当する実測補体活性への非特
異的効果を均衡させる。あるいは、その代り
に、ネガテイブ対照テストにおける主結合のの
ち、補体活性の高い試薬混合物を適当な緩衝液
で一定のフアクターに従つてさらに希釈するこ
とにより、反応を進行させて非特異補体消耗を
補正する。

この補正は好ましくは主結合反応の開始前、す
なわちテストの始まる前に即時使用試薬を溶解し
た直後に行なわれる。そして、その結果としてネ
ガテイブ対照テストに所望の同調化が達成され
る。この希釈フアクターは製造者によつて決めら
れる。そして各チヤージに関連した指示の中に示
されている。ネガテイブ対照テストの溶血カーブ
の同期化の最終段階は、次いで使用者自身により
行なわれる。

活用可視補体結合テストの場合、その反応をマ
イクロ滴定プレート上で行なうのが好ましい。そ
してそのプレートは可能なら補体結合テストにと
つて最適の温度である37℃に加温され、好ましく
は光学的な手段を使用する。この光学的な手段と
しては、精妙に作られた透明な下敷きを用いる。
それによつて遅延した溶血、その反応の非同期性
をより正確に定量的ではないが半定量的に高い分
析法で決めることができる。

実際上、20乃至40秒が再現性をもつて測定でき
ることが分かつた。溶血におけるこの遅延は、反
応混合物のml当り10乃至15ナノグラムのコンプレ
ツクス抗原に相当し古典的補体結合テストに比較
して約10倍の感度上昇に相当する。

即時使用試薬の製造者は、力価比較がより容易
になるように完全相移動（phase shift）が古典
的補体決定テストの１：５プラス希釈に相当する
試薬を調製する。

即時使用試薬による補体結合テストの光学測定
定量法において測定の最も適当な方法は、いわゆ
る50％補体溶血測定法、すなわちCH50％溶解時
間分析法である。代替法は傾斜の測定、溶血曲線
をうるための時間当りの吸高減少、またはにごり
減少である。後者の方法は、しかしながら古典的
補体結合テストの問題点を有している。すなわち
試薬の測定範囲は再度溶血相（不溶血／完全溶
血）に限定されているし、溶血反応の潜在相を含
む広測定範囲の可能性が失われている。

CH50％−溶解−時間−分析法は、実際の反応
混合物の測定補体活性を測定するための方法であ
り、それ自体で補体結合テストの優れた光測定量
法を提供するものではない。そのためには、測定
した溶解時間の自然対数値への変換が必要であ
り、かつ試験抗原濃度または抗体量の同様に自然
対数値での表示を必要としている。この処理は測
定結果の評価のダブル対数法と呼ばれている。こ
の好ましい処理はかなりの効果を達成する。第２
図は、そのような抗原／抗体標準曲線を示すもの
である。

特異的な抗体／抗原試薬による補体結合の若干
のパラメータから、何れがその適正化に使用でき
るかを決定することができる。

１ 過剰の抗体に対応する抗原の増加量を加えた
場合においては、測定可能な補体結合反応が起
こる前に、一定量の補体活性免疫コンプレツク
スを必要とする。実験により、上記の反応が15
乃至20ナノグラム／ml反応混合物なる抗体濃度
で進行することが判明している。

２ 上記の点が達成されると、補体の特異的な結
合が次式に説明される厳密なパラメーターによ
つて進行する。

K₃₇＝2.3１／ｔ１／ＤlogCo／CtQ₁₀（37−Ｔ）／10 式中ｔは補体結合の温置時間（秒）であり、
Ｄは抗体または抗原の希釈度であり、Coは最
初の補体濃度であり、Ctは時間ｔにおける補
体濃度であり、Ｑは温度係数であり、そしてＴ
は温度時間である。

R.バーゲス、G.バーゲスおよびS.ベルナンス
によるこの方程式は、係数Ｋ（Ｋ＝補体結合反
応の係数）に転換できる。この方程式は、オー
ストリア抗体の測定における補体結合のカイネ
チツクとして、ニユーヨークで1970年11月２日
乃至４日開催のテクニコン・インターナシヨナ
ル・コングレス（エジユアロス・リサーチ基金
Inc.（フロリダ・マイアミのR.ツールマン・ア
ソシエートの著作権、1971年）に対する寄付金
で援助されている）で紹介された。補体と抗体
からなる糸（第３図）が、加えられた抗原を含
有する場合は、直ちに補体の消費が始まる。も
しこのことがグラフで示されているときは反応
のカイネチツクはシグマ字状の曲線となる（第
３図）。この曲線の傾斜は一定の最初の補体活
性において各抗体／抗原について特徴的であ
る。

試薬濃度相互の間の関係は以下の数式で表さ
れる。

Cf＝Co（１−e^-KDt） 式１ および Ct＝Co e^-KDt 式２ 式中Cfは遊離成分の濃度であり、Ctは結合
成分の濃度であり、Ｋは成分結合の係数であ
り、Ｄは抗血清の希釈度であり、そしてｔは反
応開始から成分結合までの時間を示す。

しかし、この式と観察は部分溶血によりバー
ゲス等により決定された。すなわち、抗体／抗
原比における変化は、補体結合の係数の変更を
起こす。抗原濃度の上昇およびその他の変動係
数の維持により、最適抗体／抗原比に至るま
で、補体結合の比係数の直線的な増加が観察で
きる。この点は、抗原の同時的結合中の補体消
耗用のアローワンスがなされている場合、反応
混合物中に与えられた抗体量の最適結合能力に
対応している。抗原濃度がさらに上昇すると、
過剰抗体中の係数における前増加とは、幾分対
照的に補体結合を減少せしめる。抗体の過剰が
大きいときに補体は結合していない。

それらのパラメータは、部分溶血の範囲内で
バーグエス他の方法により決定された。そし
て、それらの定量的な組成において、古典的補
体結合テストのチエスボード滴定法の結果に対
応している。テクニコン社は1970年の当初に、
そのテスト用の自動装置を開発し市場に提供し
た。しかし、この方法は部分溶血の問題によつ
て悩まされた。それを回避するために、検出系
に到着したときに、部分溶血の範囲内にその反
応混合物があるように反応時間を変更するため
チユーブの長さを変えようと、テクニコンの自
動分析装置では試みられている。

３ 実験により、補体結合を起す特異的な抗体／
抗原反応は、その反応のカイネチツクに対応す
る37℃で180分の主温置の後、完結することが
明らかになつていた。その特異的な抗体／抗原
反応の完了後、残余の実測補体活性が、その後
ある時間（30〜60分）の間、反応混合物中で、
その特異的反応の完了後の量のまま存在してい
るということは新しい発見である。この現象は
第一物質（例えば、抗原）または抗体の濃度以
外の試薬の割合が同一であるような一連のテス
トで確認された。この条件は、カイネチツク評
価形（常に補体を過剰にして操作）での補体結
合テストの光学的定量またはセミ定量的な目視
定量を可能にする。その方法によれば、個々の
テスト、例えば抗原物質標準曲線テスト、ある
いはサンプルテスト（サンプルの抗原濃度を決
定する）におけるCH50％−溶解−時間−分析
法を利用して、抗体／抗原の完了により特異的
な補体結合を決定した後、直ちに実測補体活性
を定量的に決定することができ、そしてその
個々の実測補体活性値から、活性が定量化でき
る。

個々のテストでの実測補体活性は、長期間効果
である。そして抗原／抗体反応の結合産物と結合
補体とはバーゲエス等による定量方法に有利に対
応している。補体結合の評価／定量は溶血反応と
は無関係であり（部分溶決の範囲内では進行しな
い）、反応の定量は、むしろ補体溶血の潜在相を
含み、抗原／抗体決定補体結合に直接係るか、ま
たは好ましくは、その後その結果として結合混合
物の広汎な測定範囲内で行なわれるのである。

もし、この方法での評価が、反応開始後180分
（＋30〜40分）より後に、遅延評価として行なわ
れるならば厳正な定量反応の結果としての障害
が、各個テストの反応混合物中の補体システムの
非特異的な不活性化により、各個テスト中に生成
する。パラメーターは部分的に正確であるにすぎ
ず、標準曲線は直線を形成することなく、その反
応はそれほど鋭敏ではないだろ。

実際の補体活性の自然な測定は、溶血反応の50
％が減少するポイントが最適であると見なされ、
そのポイントが好んで使用せられるべきではある
けれども、そのようなポイントに絶対的には拘束
されない。指示材料で赤血球系の20％〜80％なる
範囲での定量を行なうことができる。ただし、各
テストの読みはその溶血反応の同じ段階で行なわ
れることを条件としている。

補体結合を決定する抗体／抗原の定量におい
て、試薬の比率は平衡点（補体結合にとつて最適
の抗体／抗原比のポイント）が15乃至20分の範囲
にあるように選択することがよい。

さらに、その反応系は好ましくは少量の抗原ま
たは抗体でプレセンシタイズ（Presensitized）
されているので、ブランクはＣ＋１不活性系のポ
イントを示し、かつそれを超過している。このよ
うにして試験すべき極めて少量の物質を直ちに測
定することができる。そしてそれはその反応（約
1.5〜５ナノグラム抗体／ml反応剤混液）の反復
性を基礎に置いている。この方法によつて抗原／
抗体用の直線的な標準曲線を得ることができる。
ただしその評価法、すなわち実際の補体活性に対
応するCH50％−溶解時間分析の自然対数は抗
原／抗体濃度に対してプロツトされており、従つ
てそれらが自然対数に表示されている必要があ
る。この場合、この測定範囲において必要とする
ものはブランク値、対照値および分析値である。
その対照は充分なテスト物質を含んでいてその物
質は同時に測定系の平衡点を示している（最高可
能測定点／テストのための物質の濃度）。この場
合次式を用いて未知濃度を決めることができる。

Ｃ＝C₁／t₁×t^F フアクター(F)＝Inc₂−Inc₁／Int₂−Int₁ 式中Ｃは未知濃度であり、C₁は好ましくは測
定されている抗体の一定量を有するブランク値で
あつて補体系はＣ−１−不活性化剤−系のレベル
上にプレゼンジタイズされている。ｔはサンプル
のCH50％溶解時間（秒）であり、Ｆはフアクタ
ーである。フアクター(F)の計算においては公知の
濃度（ナノグラム／ml）および対応するCH50％
−溶解時間（秒）はその自然対数に書き換えられ
る（第５図参照） ヒト血清サンプルの一連の分析は、大多数のプ
ロバンド血清が少量から多量までのいわゆる両受
体活性を含んでいることを示した。プロバンド血
清の両受体活性は、プロバンド血清でのテストが
ブランクに比べてより高い実際の補体活性を示す
ことにより、各個テストの実際の補体活性に非特
異的に影響を与える。これは、この値が補体濃度
とインジケーター赤血球の感受性度の関数である
ためである。

サンプルから両受体様の抗体を除去する目的
で、プロバンド血清を50℃で15乃至30分間通常温
置を行なつたのち、プロバンド血清に一定量のヒ
ツジ赤血球を吸着させると、プロパンド血清の上
記非特異的効果は除去することができる。この目
的のために、安定化したヒツジ−赤血球を使用す
ることがよい。この場合、吸収によりサンプル自
体の補体活性を不活性化する工程を含むことがで
きる。この目的のために、ホルマリンまたはグル
タールアルデヒドで安定化した洗浄ヒツジ−赤血
球を使用することがよい。経験によると、プロパ
ンド血清１ml当り約100〜200μの沈降赤血球が
血清サンプルの両受体活性を確実に除去するため
に充分であることが判つている。そのように処理
した血清サンプルは溶血反応を遅らせる障害効果
を示すだけである。そしてその溶血反応は、多か
れ少なかれ実際の補体活性の非特異障害によつて
起こるのである。疾病により循環免疫複合体（コ
ンプレツクス）を含むプロバンド血清は、その複
合体の補体結合能による補体結合を起こす。この
補体結合はしかし、実際の（抗原）系およびコン
トロール（抗原）系において同一の濃度にある。
それは、主結合に続く補体活性の低い実際（実
測）レベルのため、補体溶血における遅延の原因
となる。しかし、プラスに評価される溶血反応の
非同調化を起すことはないのである。標準血清を
使用すると、参照系として標準血清の非特異的補
体の消費を用いる場合に、プロバンド血清のコン
トロール中における溶血の遅れをブランクコント
ロールと比較することによつて、病理的に高い抗
補体活性を有する血清サンプルを認めることがで
きる。

ヒツジ−赤血球の代りに、それらからの抽出物
も使用できる。抽出物は３モル塩化カリウム溶液
中溶解赤血球の遠心分離によつてつくることがで
きる。16時間の後に0.9％塩化ナトリウム溶液に
対してそれを透析する。残渣は補体に対して不活
性のカルボキシセルローズまたはセフアローズに
結合されている。

適合化された可視性補体結合テストにおいては
両受性活性を有しない不活性化および吸収プロバ
ド血清を使用することがよい。

古典補体結合テストにおいてはプロパンド血清
の両受体活性は、ことに試薬１ml当りプロバンド
血清含量が比較的高い当初の希釈では、その反応
の間に障害作用を有するものであるが、その両受
体活性は除去されていない。

例 １ プロバンド血清の各種両受体様活性の証明およ
びプロバンド血清の前処理によるそれら研究要
因の吸収／除去 最適濃度の両受体および補体からなる反応混合
物の実測補体活性へのプロバンド血清の非特異全
効果を測定するためのテスト系（セロバツク−補
体−変動テスト）。

カルシウムおよびマグネシウムを有するリン酸
緩衝食塩水中50μ（マイクロリツトル）の補体
を含む試薬混合物の１ml（10mg％のCaおよび５
mg％のmgを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS））
および0.2μ両受体１：4000（ベーリング・ベル
ケ AG、Ｄ−3550マーブルグの製品）。

この反応物混合物に補体を除いたヒトプロバン
ド血清の100μを56℃で30分をかけて加え、そ
の混合物を37℃で180分間温置する。プロバンド
血清の代りに100μの緩衝液によるテストを対
照とする、CH−50％溶解時間−分析は、補体結
合テストの主温置の30℃180分なる温置後に行な
われその系の実測補体活性が測定されたヒツジ赤
血球100μを0.4なる当初吸光度を与えるために
加えた。

結果：CH−50％溶解時間分析 対照 血清試料 １ ２ ３ 302秒 420 255 485 対照 血清試料 ４ ５ ６ 302秒 300 415 370 血清試料は、対照系が有するよりも補体の除去
に拘らず、より高い補体活性を有していることが
判つた。

同じ血清を上記試験システムで分析したが両受
体は加えなかつた。このため、同じ起源の補体を
用いた。

結果：CH50％溶解時間分析 対照 血清試料 １ ２ ３ 溶けない 880 445 1034 対照 血清試料 ４ ５ ６ 溶けない 670 1800 990 対照系は溶けないまま残る。これはその系が両
受体を含んでいるためと期待することができる。
ヒツジ赤血球の感作はまつたく起こらなかつた。

プロバンド血清は違つた両受体様活性を示す。
すなわち研究の最初の系列においてはプロバンド
血清がより高い実測補体活性によく似ていること
は理解できる。

その両受体様活性を除去するためのプロバンド
血清のヒツジ赤血球での吸収： 56℃で30分間温置したプロバンド血清800μ
にPBS−緩衝液に再びサスペンドしたPBS−バ
ツフアー50％洗浄ヒツジサスペンジヨンの200μ
を加え、室温で10分間放置し最後に遠心分離し
た。この上澄みが補体分解し
（decomplemented）かつ吸着されたプロバンド
血清となる。

前処理したプロバンド血清を用いて、上記の研
究過程を繰り返した。

両受体活性を測定する試験の結果 活性 −CH−50％溶解時間 対照 プロバンド血清 １ ２ ３ ４ ５ ６ 不溶解 37℃で30分後いずれのプロバンド血清も
完全に溶血しなかつた。

判定 ブロバンド血清の障害となる両受体活性を
完全に除去するために、上述のょプロバンド血
清の前処理で通常は充分である。

テスト系の実測補体活性に対する前処理プロバン
ド血清の非特異的効果を決定するためのテスト結
果 対照系 プロバンド血清 CH50％溶解時間 １ ２ ３ ４ ５ ６ 315秒 370 385 401 400 355 390 判定 前処理したプロバンド血清（補体分解しか
つ吸収したヒト血清）は非特異的な補体−消費
効果だけを示し、非特異的な高い実測補体活性
は、もはや示すことがない。

例 ２ 反応剤混合物の実測補体活性への抗原／CFT
用対照抗原の非特異性効果のテスト 分析系１mlCFT−緩衝液含有 50μの補体 0.2μの両受体の１：4000 （ベーリングベルケ社アールブルグの製品） この反応剤混合物に古典CFTの上述の抗原／
対照抗原濃度に対応するような量の抗体および対
照抗体の100μCFT−緩衝液希釈液を加えた。

例えば１：60の力価を有するベーリングベルク
社のチトメガリー（cyto megaly）−抗原／対照
抗原。２単位の0.25ml抗原希釈液を１ml反応剤混
合物中古典CFT中で使用した。そうしてこのテ
ストで100μのCFT緩衝液は凍結製品の再調整
後250／30＝8.33μの不希釈溶解抗原を含んでい
る。対照抗体の濃度も同様である。

この系を37℃で180分間置換した。最後にこの
系の実測補体活性の測定はCH−50％−溶解時間
分析によつて行なつた。このテスト系にCFT−
緩衝液中ヒツジ赤血球サスペンジヨン100μを
加えることにより0.4なる吸光値が得られた。

異なる抗原と対照抗原の結果 チトメガリー−抗原（ベーリングベルグAG） チヤージ１ チヤージ２ チヤージ３ 抗原 315〃 340〃 330〃 対照抗原 320〃 340〃 310〃 ロテルン抗原（ベーリングベルクAG） チヤージ１ チヤージ２ チヤージ３ 抗原 310〃 315〃 310〃 対照抗原 314〃 312〃 311〃 トキンプラスモーゼ抗原（ビオメリウツクス社） 抗原 355〃 360〃 440〃 対照抗原 315〃 310〃 320〃 （バルク値） 註：トキンプラズマ病−抗体生物測定はマウスの
腹水病から得られた。そのためコントロール抗
原はなくコントロール系があるだけである。コ
ントロール抗原の代りにCFT−緩衝液を使用
した。

判定：適正可視補体結合テストの原理は試薬を簡
単に混合しただけでは現実できず例外的な場合
だけ可能であることは簡単に分かる。

試薬を混合しただけの場合は、高度に精製した
高純度高品質の試薬（抗原／コントロール抗原ま
たは疾疫血清およびコントロール血清）であつ
て、試薬混合物の実際の補体活性に最小の非特異
作用しか及ぼさないか全く同一の非特異作用しか
及ぼさないものを用いてはじめて可能である。

実施例中では、そのことはベーリングベルク
A.Gのローテルン−CFT−抗原を用いて初めて
可能である。これは組織培養から作られた最純度
の抗原である。

その他の場合にはすべての抗原／コントロール
抗原系の再同期化を保証するために適正な工程を
必要としている。

例えば、サイトメガリーチヤージNo.１のように
わずかな偏りのある場合は、主温置の完了後抗原
系にヒツジ赤血球サスベンジヨンを加えて、正確
に５秒後に指示反応を開始する場合に起こりう
る。こうすることによつて、ネガテイブなコント
ルール系において同期化溶血反応の開始を確保す
ることができる。

同期化の別の方法は、一連の実験においてどれ
だけ多くの補体を、例えばサイトメガリーチヤー
ジNo.３の抗原系が必要としているかを決定するこ
とである。そうすることにより、20秒というCH
−50％溶解時間を同期化する。この目的のため
に、その分析系に補体を徐々に増量して加えるテ
ストが、１mlの試薬混合物中50／55／60／65μ
等の補体を用いて行なわれる。理想的な補体活性
が主温置の完了後に得られるように50μ補体を
有するコントロール系に対応して、抗原系に
57.5μ補体量なる値が決められる。

別に、希釈フアクターの決定でにより、系中の
実際の補体活性の同期化することもできる。

この目的のために、トキンプラズマ秒−CFT
−テストにおいては、コントロール系は主温置の
開始前にCFT−緩衝液を次第に増量して希釈を
する。すなわち凍結乾燥試薬は再調整のあとすぐ
に希釈されている。コントロールシステム（１
ml）に100／200／300／400／500／600／μ
CFT−緩衝液を加え、よく攪拌し次いで適当量
を移す。こうして高い実際補体活性を有する系の
百分率希釈液が得られる。実施例においては0.5
（＝50％）なるフアクターが決められた。そのこ
とは１mlの反応剤に0.5mlのCFT−緩衝液を加え
なければならないこと、さらに50％希釈を意味し
ている。すなわち主温置の完了後（37℃、180分）
抗原の非特異的な抗原活性にかかわらず、二つの
系が同一の補体活性を持ち適正な可視CFTの原
理が実現できるのである。

なお、この発明は上に詳細に説明された方法な
らばいにテストパツケイズに限定されるものでは
ない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種補体希釈率での潜在時間および
溶解曲線を示すグラフである。第２図は、抗原／
抗体標準曲線を示すグラフである。第３図は、補
体の消費によるシグマ字状曲線を示すグラフであ
る。第４図は、反応剤１ml当りのHPL−抗体濃
度の自然対数値の変化を示すグラフである。第５
図は、CH50％−溶解時間（秒）に対する既知の
濃度を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 補体結合反応テスト（CFT）の原理により
   血清学的検査を実施するための方法であつて、 抗原と抗体を反応させて免疫コンプレツクスを
   形成し； 免疫コンプレツクスとの反応に関して過剰量の
   補体を免疫コンプレツクスに加え； 免疫コンプレツクスと補体を反応させ； それに赤血球を加え；そして 免疫コンプレツクスと補体の反応後に残る過剰
   の補体を、カイネチツクメソド法により決定する
   ことを特徴とする方法。 ２ 試薬中および対照試料中の補体量を互いに均
   衡させることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ３ (a) 実測補体活性に影響を及ぼさない高純度
   の試薬を使用するか、 (b) 補体起源とは別の試薬による分析系およびテ
   スト系中の非特異効果ができるだけ小さいか、
   両系において同じであるか、 (c) 系にさらに補体を加えることにより、一つの
   試薬中のより高い抗補体活性を補うか、あるい
   は (d) 温置のはじめで抗原と抗体との結合以前に同
   一の実測補体活性になるように適当な緩衝剤を
   用いて補体活性のより高い系を薄めて、試薬中
   および対照試料中の補体量を互いに均衡させる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４ 自然対数値や抗原・抗体の濃度に対し得られ
   た溶解時間をグラフ化し、これらの数値を標準曲
   線と比較し、補対溶血の潜在相の許容量を持つ
   CH50％溶解時間分析によつて、様々な系の残存
   補体活性を逆滴定評価することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 56℃、15〜30分間の普通の温置後またはその
   間に、ある量のヒツジ赤血球またはヒツジ赤血球
   膜の抽出物で、補体起源とは別の試薬による分析
   系およびテスト系中の非特異性両受容体の活性が
   減少させられているプロバンド血清を使用するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項
   のいずれかの項記載の方法。 ６ 赤血球に特異的な両受体、補体、および抗原
   または赤血球に非特異的な抗体を含む即時使用テ
   ストパツケイジ中の補体結合テスト用試薬であつ
   て、上記の両受体、補体、および抗原または抗体
   の全てが固形状であり、かつ上記補体が免疫コン
   プレツクスとの反応に関して過剰量含まれている
   ことを特徴とする試薬。