JPH01148192A - カルニチンの製造法 - Google Patents
カルニチンの製造法Info
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- JPH01148192A JPH01148192A JP62305830A JP30583087A JPH01148192A JP H01148192 A JPH01148192 A JP H01148192A JP 62305830 A JP62305830 A JP 62305830A JP 30583087 A JP30583087 A JP 30583087A JP H01148192 A JPH01148192 A JP H01148192A
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
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- Analytical Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はカルニチンニトリルを加水分解してカルニチン
を製造する方法に関するものである。
を製造する方法に関するものである。
本発明により製造されるカルニチンは脂肪酸代謝に関連
する物質としてビタミンＢＴ と呼ばれたことがあり
、従来ＤＬ体が健胃剤などに使用されてきたが、最近で
は特に５体が注目され、心臓疾患や脂肪血症の治療剤と
して有用でありまた高カロリー輸液としても用いること
ができることが知られている。
する物質としてビタミンＢＴ と呼ばれたことがあり
、従来ＤＬ体が健胃剤などに使用されてきたが、最近で
は特に５体が注目され、心臓疾患や脂肪血症の治療剤と
して有用でありまた高カロリー輸液としても用いること
ができることが知られている。
従来の技術
従来ＤＬ−カルニチンの製法としては・古くから合成法
が知られているが、合成法は、加熱、鉱酸、アルカリや
有害物質の使用などエネルギー的、公害的に不利であり
、まな生成するカルニチンがＤ′Ｌ体である欠点がある
。最近生化学的方法として４Ｎ−トリメチルアミノ酪酸
の水酸化反応（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５６巻
、１２４７Ｉｉ、１９８１ｆｌ、３−デヒドロカルニチ
ンの還元反応（Ａｐｐ’１．Ｂｎｖｉｒｏｎｍ、ＭｉＯ
ｒＯｂｉＯｌ、１３９巻、３２９貞、１９８０年）、４
−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを経由する方法
（公開特公昭５９−１１８０９３号）、クロトンベタイ
ンを基質とする方法（公開特公昭５９−１８５６９４号
、同５９−１１８０９！１号）、ＤＬ−〇−アシルカル
ニチンのエステラーゼによる加水分解法（Ｅｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、、 ２６巻、９１１頁、１９
８４年）が研究された。しかし、これらの方法は、原料
が高価であった〕、酵素が不安定であったシ、高価な補
酵素の補給を必要とするなど工業的に不満足なものとい
わざるをえない。カルニチンニトリルを鉱酸などの使用
により化学的に加水分解することに従来知られていたが
、生化学的加水分解については全く知られていなかった
。
が知られているが、合成法は、加熱、鉱酸、アルカリや
有害物質の使用などエネルギー的、公害的に不利であり
、まな生成するカルニチンがＤ′Ｌ体である欠点がある
。最近生化学的方法として４Ｎ−トリメチルアミノ酪酸
の水酸化反応（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５６巻
、１２４７Ｉｉ、１９８１ｆｌ、３−デヒドロカルニチ
ンの還元反応（Ａｐｐ’１．Ｂｎｖｉｒｏｎｍ、ＭｉＯ
ｒＯｂｉＯｌ、１３９巻、３２９貞、１９８０年）、４
−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを経由する方法
（公開特公昭５９−１１８０９３号）、クロトンベタイ
ンを基質とする方法（公開特公昭５９−１８５６９４号
、同５９−１１８０９！１号）、ＤＬ−〇−アシルカル
ニチンのエステラーゼによる加水分解法（Ｅｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、、 ２６巻、９１１頁、１９
８４年）が研究された。しかし、これらの方法は、原料
が高価であった〕、酵素が不安定であったシ、高価な補
酵素の補給を必要とするなど工業的に不満足なものとい
わざるをえない。カルニチンニトリルを鉱酸などの使用
により化学的に加水分解することに従来知られていたが
、生化学的加水分解については全く知られていなかった
。
発明が解決しようとする問題点と問題点を解決するため
の手段 本発明者らに、カル−チンの有用性、特にその光学活性
体の有用性に着目し、エネルギー的、及び公害的に有利
な生化学的加水分解法が、力、ルニチン合成の中間体で
あるカル−チンニトリルに対して適用できれば、工業的
に有利なカルニチンの製法となりうると考え、七のり能
性を、保存微生物、広く自然界から分離した微生物の検
討によって追求した結果、本発明を完成するに至った。
の手段 本発明者らに、カル−チンの有用性、特にその光学活性
体の有用性に着目し、エネルギー的、及び公害的に有利
な生化学的加水分解法が、力、ルニチン合成の中間体で
あるカル−チンニトリルに対して適用できれば、工業的
に有利なカルニチンの製法となりうると考え、七のり能
性を、保存微生物、広く自然界から分離した微生物の検
討によって追求した結果、本発明を完成するに至った。
作用
本発明は、安価に簡単に合成しうるカルニチンニトリル
に、これを加水分解してカルニチンを生成せしめる酵素
（ニトリラーゼの１種）もしくは該酵素を含有する製剤
、生体標品（微生物、細胞）、固定化酵素、固定化菌体
を作用せしめてカルニチンニトリルする方法である。勿
論、生化学的方法の常としてカルニチンニトリルにその
非毒性の塩、例えばクロライドの形でも使用でき、カル
ニチンも塩の形でも製造しうる。
に、これを加水分解してカルニチンを生成せしめる酵素
（ニトリラーゼの１種）もしくは該酵素を含有する製剤
、生体標品（微生物、細胞）、固定化酵素、固定化菌体
を作用せしめてカルニチンニトリルする方法である。勿
論、生化学的方法の常としてカルニチンニトリルにその
非毒性の塩、例えばクロライドの形でも使用でき、カル
ニチンも塩の形でも製造しうる。
本発明方法によれば、常温かつ中性附近という温和な条
件で反応を行なうことができるので、エネルギー的、公
害抑制の面からも従来法に比して有利であり、従来の生
化学的方法のようなカル−チンから誘導した化合物を＠
料とするので框なく、カルニチン甘酸の中間体でｓｂ光
学不活性（ＤＬ体）のカルニチンニトリルかう光学活性
のカルニチンをえることに本発明の方法によって始めて
可能となった。
件で反応を行なうことができるので、エネルギー的、公
害抑制の面からも従来法に比して有利であり、従来の生
化学的方法のようなカル−チンから誘導した化合物を＠
料とするので框なく、カルニチン甘酸の中間体でｓｂ光
学不活性（ＤＬ体）のカルニチンニトリルかう光学活性
のカルニチンをえることに本発明の方法によって始めて
可能となった。
本発明に使用する酵素に、一般名でニトリラーゼと呼ば
れ、国際的な酵素分類の命名記号によると、加水分解酵
素の中で鎖状アミド結合に作用するもの（分類＆５．５
）に属するものである。トリメチルアミ基を構造に有す
るカルニチンニトリルのような化合物に作用するニトリ
ラーゼの存在については従来全く知見がなく、本発明の
研究で始めて見出されたものでおる。
れ、国際的な酵素分類の命名記号によると、加水分解酵
素の中で鎖状アミド結合に作用するもの（分類＆５．５
）に属するものである。トリメチルアミ基を構造に有す
るカルニチンニトリルのような化合物に作用するニトリ
ラーゼの存在については従来全く知見がなく、本発明の
研究で始めて見出されたものでおる。
カルニチンニトリルをカルニチンに変換する酵素を生産
する微生物框、自然界より、カルニチンニトリルからカ
ルニチンを生成する能力に基いて選択分離することがで
きる。具体的には本発明者らが分離した菌株であるｌａ
菌１株６Ｎ−２３，１１Ｎ−２６，６Ｎ−２９，６Ｎ−
４９’ｉ９けることができる。これらの菌株に本発明者
らが分離し、本発明に使用しうるものの代表株として微
生物工業技術研究所に寄託したものであり、その分類学
的性質は次のとおりでらる。
する微生物框、自然界より、カルニチンニトリルからカ
ルニチンを生成する能力に基いて選択分離することがで
きる。具体的には本発明者らが分離した菌株であるｌａ
菌１株６Ｎ−２３，１１Ｎ−２６，６Ｎ−２９，６Ｎ−
４９’ｉ９けることができる。これらの菌株に本発明者
らが分離し、本発明に使用しうるものの代表株として微
生物工業技術研究所に寄託したものであり、その分類学
的性質は次のとおりでらる。
これらの分離菌は、何れも好気性で、ダラム陽性であり
、胞子をつくらぬコリネ形の細菌でアリ、パーゼーズ・
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓＭａｎｕａｌ Ｏｆ ８ｙａｔｅ
ｍａｔｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７ ）第２巻（１
９８，６年）に従うと、分類セクション１５の、異常、
非胞子形成、グラム陽性桿菌に属する。さらに何れの菌
も細胞壁中にメソ−ジアミノピメリン酸を有し、またマ
イコール酸をふくむのでコリネパクテリウＡ （（！ｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属に属するものと考え
られる。
、胞子をつくらぬコリネ形の細菌でアリ、パーゼーズ・
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓＭａｎｕａｌ Ｏｆ ８ｙａｔｅ
ｍａｔｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７ ）第２巻（１
９８，６年）に従うと、分類セクション１５の、異常、
非胞子形成、グラム陽性桿菌に属する。さらに何れの菌
も細胞壁中にメソ−ジアミノピメリン酸を有し、またマ
イコール酸をふくむのでコリネパクテリウＡ （（！ｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属に属するものと考え
られる。
従来コリネ形細菌の分類の困難性が指摘されてきたが上
記した新しい分類書では化学的分類をとシ入れた結果、
比較的明確な区別が属の間でにできるようになっている
。しかしなお困難な点があることを述べておきたい。化
学的分類に従うと、上の分離菌に、メノージアミノピメ
リン酸を細胞壁に有することと、マイコール酸の比較的
短鎖のもの（クロマトグラフィーから判断）ｔ−含むこ
とからコリネバクテリウム属、カゼトパクタ−（０ａａ
ｅｏｂａｃｔｅｒ ）属およびロドコッカス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕａ ）属が分類の候補となる。事実、上記
分類書にもこれら３属の間の区別の困難なことが述べら
れている。本発明者らに、ロドコッカス属は、ノカルジ
ア形を示すと記載されているが、上の分離菌ではコリネ
形は通常みられるがノカルジア形はみられないので区別
されると判定した。また、カセオパクター属は１菌種の
み記載されており、絶対好気性とされ、分離源がチーズ
であることが記載されている。一方コリネパクテリウム
属菌に通性嫌気性のものが大部分であるが絶対好気性の
菌もふくみ、また士から分離され九菌が含まれている。
記した新しい分類書では化学的分類をとシ入れた結果、
比較的明確な区別が属の間でにできるようになっている
。しかしなお困難な点があることを述べておきたい。化
学的分類に従うと、上の分離菌に、メノージアミノピメ
リン酸を細胞壁に有することと、マイコール酸の比較的
短鎖のもの（クロマトグラフィーから判断）ｔ−含むこ
とからコリネバクテリウム属、カゼトパクタ−（０ａａ
ｅｏｂａｃｔｅｒ ）属およびロドコッカス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕａ ）属が分類の候補となる。事実、上記
分類書にもこれら３属の間の区別の困難なことが述べら
れている。本発明者らに、ロドコッカス属は、ノカルジ
ア形を示すと記載されているが、上の分離菌ではコリネ
形は通常みられるがノカルジア形はみられないので区別
されると判定した。また、カセオパクター属は１菌種の
み記載されており、絶対好気性とされ、分離源がチーズ
であることが記載されている。一方コリネパクテリウム
属菌に通性嫌気性のものが大部分であるが絶対好気性の
菌もふくみ、また士から分離され九菌が含まれている。
このようなことから本発明者らに上の分離菌ヲコリネバ
クテリウム属の菌と同定した。
クテリウム属の菌と同定した。
以下、分離株の性質の共通性に基いて、若干のグループ
に分けて分類学的性質を記載する。
に分けて分類学的性質を記載する。
先ず全分離株に共通する性質を述べると、上記した“と
おり、何れもダラム陽性、好気性のコリネ形の桿菌であ
り、胞子をつくらず、抗酸性も運動性もない。肉汁寒天
培養でコロニーに小さく、周縁に金縁、隆起に半レンズ
−凸状、表面に平滑で光沢に半透明で拡散性の色素につ
くらない。肉汁液体培養で、表面に環状に生育し、中等
度に濁った生育ｔする。ゼラチンを液化せず、ｖＰテス
ト、インドールの生成、でん粉の加水分解に倒れも陰性
である。無機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）の
利用はグルコース培地で何れも陽性である。カタラーゼ
、脱窒反応、ウレアーゼにともに陽性であり、オキシダ
ーゼに陰性である。Ｏ−ＦテストＩｄ ）ｌｕｇｈＬθ
１ｆ８０ｎ法で酸の生成から発酵性と判定されるが、ガ
スの生成に認めない。クエン酸の利用はＫｏａｅｒの培
地で何れも陽性である。ＩＪ Ｉ−マスミルクの反応の
変化はほとんどなく、還元、凝固、液化にない。塘から
の酸生成に第１表に示した以外に、何れも、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フラクトース、イックトール、Ｄ−マニトー
ル％りＩＪセリンに対して陽性であり、Ｄ−ガラクトー
ス、シュクロース、ラクトース、マルトース、テン粉に
対して陰性である。ガスの発生は認められない。２６〜
４０℃で生育し、２０℃でに生育しないか、極めて僅か
な生育しがしない。何れも細胞壁中にメソ−ジアミノピ
メリン酸を有し、また細胞中に比較的短鎖のマイコール
酸をふくむ。
おり、何れもダラム陽性、好気性のコリネ形の桿菌であ
り、胞子をつくらず、抗酸性も運動性もない。肉汁寒天
培養でコロニーに小さく、周縁に金縁、隆起に半レンズ
−凸状、表面に平滑で光沢に半透明で拡散性の色素につ
くらない。肉汁液体培養で、表面に環状に生育し、中等
度に濁った生育ｔする。ゼラチンを液化せず、ｖＰテス
ト、インドールの生成、でん粉の加水分解に倒れも陰性
である。無機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）の
利用はグルコース培地で何れも陽性である。カタラーゼ
、脱窒反応、ウレアーゼにともに陽性であり、オキシダ
ーゼに陰性である。Ｏ−ＦテストＩｄ ）ｌｕｇｈＬθ
１ｆ８０ｎ法で酸の生成から発酵性と判定されるが、ガ
スの生成に認めない。クエン酸の利用はＫｏａｅｒの培
地で何れも陽性である。ＩＪ Ｉ−マスミルクの反応の
変化はほとんどなく、還元、凝固、液化にない。塘から
の酸生成に第１表に示した以外に、何れも、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フラクトース、イックトール、Ｄ−マニトー
ル％りＩＪセリンに対して陽性であり、Ｄ−ガラクトー
ス、シュクロース、ラクトース、マルトース、テン粉に
対して陰性である。ガスの発生は認められない。２６〜
４０℃で生育し、２０℃でに生育しないか、極めて僅か
な生育しがしない。何れも細胞壁中にメソ−ジアミノピ
メリン酸を有し、また細胞中に比較的短鎖のマイコール
酸をふくむ。
以下分離株の性質から更に共通の性質をもつものを群別
して、Ｉ、ＩＩ、Ｉｎ、ｆＶの群に分けて、以上に述べ
た以外の分類的性質を第１表に記載する。
して、Ｉ、ＩＩ、Ｉｎ、ｆＶの群に分けて、以上に述べ
た以外の分類的性質を第１表に記載する。
第１表
骨 −０により−のものもある。
鰻 酢酸鉛試験紙法でに十と判定されるものもめるが、
Ｔｆ９工培地（ｔｒｉｐｌｅ ｓｕｇａｒ １ｒｏｎ
ａｇａｒ ）では±以上のような性質を有する菌は夫々
の群について数珠づつ分離された。これらの菌の性質を
前記した分類書の記載と比較するとコリネバクテリウム
属として記載されている何れの菌種とも一致するものは
なかった。そこでこれらの菌ヲコリネパクテリウム属ｍ
種（０ｏｒｙｎｅｂａａｔｅｒｉ −ｕｍ ａｐ、 ）
と同定して＠Ｉ詳の代表様６Ｎ−２５、第■群の代表様
１１Ｎ−２６、第厘詳の代表様６Ｎ−２９、第■群の代
表様＜Ｓ、Ｎ−４９ｔ−微生物工業技術研究所（以下微
工研と省略す）に寄託した。
Ｔｆ９工培地（ｔｒｉｐｌｅ ｓｕｇａｒ １ｒｏｎ
ａｇａｒ ）では±以上のような性質を有する菌は夫々
の群について数珠づつ分離された。これらの菌の性質を
前記した分類書の記載と比較するとコリネバクテリウム
属として記載されている何れの菌種とも一致するものは
なかった。そこでこれらの菌ヲコリネパクテリウム属ｍ
種（０ｏｒｙｎｅｂａａｔｅｒｉ −ｕｍ ａｐ、 ）
と同定して＠Ｉ詳の代表様６Ｎ−２５、第■群の代表様
１１Ｎ−２６、第厘詳の代表様６Ｎ−２９、第■群の代
表様＜Ｓ、Ｎ−４９ｔ−微生物工業技術研究所（以下微
工研と省略す）に寄託した。
微工研に寄託した菌株名と微工研の寄託番号を対応して
示すと次のとおりである。
示すと次のとおりである。
６］１−２５ ・・・微工研菌寄第９７／λ号１１Ｍ
−２６・・・微工研菌寄第？デ３１号６Ｎ−２９・・・
微工研°菌寄第９７２デ号６Ｎ−４９・・・微工研菌寄
第２２ノＯ号これらの微生物は、野生株、変異株の何れ
も使用でき、微生物またはその培養液から抽出した酵素
も本発明に使用できる。さらに、この酵素活性を有する
固定化酵素、固定化微生物も勿論使用できる。
−２６・・・微工研菌寄第？デ３１号６Ｎ−２９・・・
微工研°菌寄第９７２デ号６Ｎ−４９・・・微工研菌寄
第２２ノＯ号これらの微生物は、野生株、変異株の何れ
も使用でき、微生物またはその培養液から抽出した酵素
も本発明に使用できる。さらに、この酵素活性を有する
固定化酵素、固定化微生物も勿論使用できる。
これらの微生物を培養して必要なアミダーゼ活性をふく
む標品をえるには、通常の培養法によればよく、特に説
明を要しないが、基質として用いるカルニチンニトリル
を含有する培地に生育せしめ九場合にニトリラーゼ活性
の高い培養物をえることができる。また固形培地、液体
培地の何れも使用可能である。
む標品をえるには、通常の培養法によればよく、特に説
明を要しないが、基質として用いるカルニチンニトリル
を含有する培地に生育せしめ九場合にニトリラーゼ活性
の高い培養物をえることができる。また固形培地、液体
培地の何れも使用可能である。
上記のようにしてつくったニトリラーゼ活性を含む微生
物またにそれによシつくった酵素標品をカルニチンニト
リルに作用せしめる方法は、基質をふくむ溶液に酵素標
品を加えて反応が進行するまで培養すればよいが、微生
物を酵素標品とする培＃は微生物の培養液に基質を加え
て反応せしめてもよく、また、微生物の培養液から分離
しｆｃ酵素標品、菌体、洗浄菌、凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体など物理化学的、生化学的に処理した菌体、
抽出液、精製物、固定化処理標品などの形でも基質と接
触せしめることができる。
物またにそれによシつくった酵素標品をカルニチンニト
リルに作用せしめる方法は、基質をふくむ溶液に酵素標
品を加えて反応が進行するまで培養すればよいが、微生
物を酵素標品とする培＃は微生物の培養液に基質を加え
て反応せしめてもよく、また、微生物の培養液から分離
しｆｃ酵素標品、菌体、洗浄菌、凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体など物理化学的、生化学的に処理した菌体、
抽出液、精製物、固定化処理標品などの形でも基質と接
触せしめることができる。
基質濃度框、バッチ式、連続式の何れによるかによって
も異るが、バッチ式では一般に媒質中Ｉ１１〜３０％、
好ましくｑａ５〜１０％程度で、連続式でにこれよりや
＼濃度を低下させた方がよい。
も異るが、バッチ式では一般に媒質中Ｉ１１〜３０％、
好ましくｑａ５〜１０％程度で、連続式でにこれよりや
＼濃度を低下させた方がよい。
反応に、普通５〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃附近
、ｐＨ４〜１０附近で行われる。灰石時間は、静置、攪
拌、流下等の手段、あるいに酵素標品の形態、力価によ
って異ってくるので一様でにないが、パッチ法でに通常
１〜１５０時間程度でおる。
、ｐＨ４〜１０附近で行われる。灰石時間は、静置、攪
拌、流下等の手段、あるいに酵素標品の形態、力価によ
って異ってくるので一様でにないが、パッチ法でに通常
１〜１５０時間程度でおる。
反応の進行に、薄層クロマトグラフィーによりカルニチ
ンの生成を追跡して、あるいはペアンンらの酵素法によ
るＬ−カルニチンの分析により行なう。総カルニチン中
に占めるＬ体と９体と比率あるいは光学純度に、反応液
からシリカゲルのクロマトグラフィーによりカルニチン
ヲ分離し、Ｌ−フェニルアラニンのカルニチンアミドに
変換し友後、高速液体クロマトグラフィーでＬ−フェニ
ルアラニンのＬ−カルニチンアミドとＬ−フェニルアラ
ニンのＤ−カルニチンアミドの両者の面積比で決定する
ことができる。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂の
カラムにかけ、稀塩酸で溶出、濃縮することによりＬ−
カルニチンクロライドとして回収される。
ンの生成を追跡して、あるいはペアンンらの酵素法によ
るＬ−カルニチンの分析により行なう。総カルニチン中
に占めるＬ体と９体と比率あるいは光学純度に、反応液
からシリカゲルのクロマトグラフィーによりカルニチン
ヲ分離し、Ｌ−フェニルアラニンのカルニチンアミドに
変換し友後、高速液体クロマトグラフィーでＬ−フェニ
ルアラニンのＬ−カルニチンアミドとＬ−フェニルアラ
ニンのＤ−カルニチンアミドの両者の面積比で決定する
ことができる。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂の
カラムにかけ、稀塩酸で溶出、濃縮することによりＬ−
カルニチンクロライドとして回収される。
次に本発明の実施例を示す。
実施９１Ｊ１
グルコースα５％、ペプトン（Ｌ２５９６、肉エキｘ１
１５％、酵母エキスα１５ Ｔｏ、 Ｎａ（！４１１２
５％、ＤＬ−カルニチンニトリル・クロライド１．０憾
の組成の培地（ｐＨ７，２）を３０−入れた５００−の
三角フラスコに、１１ｔ２表に示した゛菌株を植菌して
２６℃で７２時間培養したものを遠心分離して菌体をえ
る。これを水にけん濁して遠心分離し九後、ＤＬ−カル
ニチンニトリル・クロライドをふくむ１００ｍＭりん酸
ナトリウムー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＥ７．０）に
加えてもとの生育培養の濃度とし、同時にＤＬ−カルニ
チンニトリル・クロライドの濃度は５優としたものを調
製する。この液５〇−をふくむ３００−三角フラスコを
２６℃で７２時間靜装置応させたとき反応液中には左旋
性の光学活性カルニチンが生成して−た。酵素法による
分析結果は第２表に示したＬ−カルニチン濃度であり、
生成カルニチン中のＬ−カルニチンの含ｆｉ（１体の比
率は第２表に示したとおりであった。
１５％、酵母エキスα１５ Ｔｏ、 Ｎａ（！４１１２
５％、ＤＬ−カルニチンニトリル・クロライド１．０憾
の組成の培地（ｐＨ７，２）を３０−入れた５００−の
三角フラスコに、１１ｔ２表に示した゛菌株を植菌して
２６℃で７２時間培養したものを遠心分離して菌体をえ
る。これを水にけん濁して遠心分離し九後、ＤＬ−カル
ニチンニトリル・クロライドをふくむ１００ｍＭりん酸
ナトリウムー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＥ７．０）に
加えてもとの生育培養の濃度とし、同時にＤＬ−カルニ
チンニトリル・クロライドの濃度は５優としたものを調
製する。この液５〇−をふくむ３００−三角フラスコを
２６℃で７２時間靜装置応させたとき反応液中には左旋
性の光学活性カルニチンが生成して−た。酵素法による
分析結果は第２表に示したＬ−カルニチン濃度であり、
生成カルニチン中のＬ−カルニチンの含ｆｉ（１体の比
率は第２表に示したとおりであった。
＠２表
実施ｆ１２
菌株として６Ｎ−４９を用い、生育培養の培地として、
グルコース１％、ＩＵＨ＠０１ （Ｌ １％、ペプト
ンα５鳴、ＭａＯ２１５％、Ｋ、ＨＰＯ，（Ｌ ７５Ｓ
％ ＫＢＩＰＯ＠ ｌ ２ ５
％、 Ｍｇ８０４ ・ ７Ｈ１０１０５
％。
グルコース１％、ＩＵＨ＠０１ （Ｌ １％、ペプト
ンα５鳴、ＭａＯ２１５％、Ｋ、ＨＰＯ，（Ｌ ７５Ｓ
％ ＫＢＩＰＯ＠ ｌ ２ ５
％、 Ｍｇ８０４ ・ ７Ｈ１０１０５
％。
ｌＰｅ８０４ ＠ ７ ＨｇＯα０１％、ＤＴＪカルニ
チンニトリル・クロライド１係の組成の培地（ｐＨ７，
２）を用−る他は実施例１と同様に実施した。反応７２
時間で反応液中に左旋性のカルニチンが生成し、Ｌ−カ
ルニチンのａ度に１ａ１ｑ／−、カル−チン中のＬ−カ
ルニチンの率は６（Ｌ５鳴でめった。反応１２０時間で
［Ｌ−カルニチンの生成量は２２．１７ｑ／−であった
。
チンニトリル・クロライド１係の組成の培地（ｐＨ７，
２）を用−る他は実施例１と同様に実施した。反応７２
時間で反応液中に左旋性のカルニチンが生成し、Ｌ−カ
ルニチンのａ度に１ａ１ｑ／−、カル−チン中のＬ−カ
ルニチンの率は６（Ｌ５鳴でめった。反応１２０時間で
［Ｌ−カルニチンの生成量は２２．１７ｑ／−であった
。
反応１２０時間の反応液を強酸性陽イオン交換樹脂（ナ
トリウム型）カラムに通して、カル−チンとカルニチン
ニトリルを吸着させ、ついで酢酸アンモニウムの稀薄溶
液ｆ：流してカルニチンをカルニチンニトリルよシ分け
てカルニチン分画ｔ−ａ縮し、アルコール添加冷却する
ことによシ、左旋性カルニチンを回収しな。
トリウム型）カラムに通して、カル−チンとカルニチン
ニトリルを吸着させ、ついで酢酸アンモニウムの稀薄溶
液ｆ：流してカルニチンをカルニチンニトリルよシ分け
てカルニチン分画ｔ−ａ縮し、アルコール添加冷却する
ことによシ、左旋性カルニチンを回収しな。
実施ガ３
使用菌株として６Ｎ−４９ｔ−用い、生育培地としてグ
リセリン３％、ペプトン１５％、肉エキスｃＬ３％、酵
母エキスα５％、ＮａＣｊ（Ｌ２５係の組成の培地（ｐ
Ｈ７，２）を用いる他は、実施例１と同様に実施した場
合、反応４８時間のＬ−カルニチン生成＠Ｂ２ｔａｑ／
−でめった。
リセリン３％、ペプトン１５％、肉エキスｃＬ３％、酵
母エキスα５％、ＮａＣｊ（Ｌ２５係の組成の培地（ｐ
Ｈ７，２）を用いる他は、実施例１と同様に実施した場
合、反応４８時間のＬ−カルニチン生成＠Ｂ２ｔａｑ／
−でめった。
実施例４
実施列１の如く培養してえた菌株６Ｎ−４９の一体を２
ｏｏｑ／−の濃度になるよう生理食塩水に懸濁した液１
０−に４％アルギン酸ナトリウム液１Ｏ−ｔ−加え混合
した後、１５ｇＩの塩化カルシウム溶液にこの混合液を
徐々に滴下して、粒状の固定化菌体をえた。この固定化
菌体全１ｉｉＤＬ−カルニチンニトリル・クロライド１
４をふくむｐＨ７，０の燐酸緩衝液２０ｄに加え、３０
℃で１６時間反応させたところ、−−カルニチン（塩酸
塩）がｔ６ｑ／−の濃度に生成してい念。
ｏｏｑ／−の濃度になるよう生理食塩水に懸濁した液１
０−に４％アルギン酸ナトリウム液１Ｏ−ｔ−加え混合
した後、１５ｇＩの塩化カルシウム溶液にこの混合液を
徐々に滴下して、粒状の固定化菌体をえた。この固定化
菌体全１ｉｉＤＬ−カルニチンニトリル・クロライド１
４をふくむｐＨ７，０の燐酸緩衝液２０ｄに加え、３０
℃で１６時間反応させたところ、−−カルニチン（塩酸
塩）がｔ６ｑ／−の濃度に生成してい念。
発明の効果
本発明は上述したようにカルニチン合成の中間体で安価
に合成されるＤＬ−カル−チンニトリルに微生物まｆｃ
はその生産する酵素を作用させて、カルニチン、特に光
学活性のＬ−カルニチンを収率よく生成せしめるもので
、工業的な光学活性カルニチンの判決を提供する−ので
ある。
に合成されるＤＬ−カル−チンニトリルに微生物まｆｃ
はその生産する酵素を作用させて、カルニチン、特に光
学活性のＬ−カルニチンを収率よく生成せしめるもので
、工業的な光学活性カルニチンの判決を提供する−ので
ある。
特許出願人 パイオール株式会社
代表者 中白 清
手続補正書（自発）
平成瓦年２月ＩＯ日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カルニチンニトリルを加水分解してカルニチンを生
成せしめる活性を有する酵素（ニトリラーゼ）もしくは
、該酵素を有する微生物をカルニチンニトリルに作用せ
しめてカルニチンを生成せしめることを特徴とするカル
ニチンの製造法。 ２、生成するカルニチンが光学活性体である特許請求の
範囲第１項記載の製造法。 ３、使用する微生物が好気性でグラム陽性であり胞子を
つくらぬコリネ形の細菌である特許請求の範囲第１項記
載の製造法。 ４ 使用する微生物が菌株６Ｎ−２３（微工研菌寄第９
７１２号）、１１Ｎ−２６（微工研菌寄第９７３１号）
、６Ｎ−２９（微工研菌寄第９７２９号）、６Ｎ−４９
（微工研菌寄第９７３０号）で代表される分類学的性質
を有する細菌である特許請求の範囲第１項記載の製造法
。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305830A JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
| US07/279,004 US5041375A (en) | 1987-12-04 | 1988-12-02 | Method of producing carnitine |
| KR1019880016137A KR890010206A (ko) | 1987-12-04 | 1988-12-03 | 카르니틴의 제조방법 |
| DE8888311489T DE3878421T2 (de) | 1987-12-04 | 1988-12-05 | Verfahren zur herstellung von carnitin. |
| EP88311489A EP0319344B1 (en) | 1987-12-04 | 1988-12-05 | Method of producing carnitine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305830A JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148192A true JPH01148192A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH0669381B2 JPH0669381B2 (ja) | 1994-09-07 |
Family
ID=17949887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62305830A Expired - Lifetime JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5041375A (ja) |
| EP (1) | EP0319344B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0669381B2 (ja) |
| KR (1) | KR890010206A (ja) |
| DE (1) | DE3878421T2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5210031A (en) * | 1989-07-20 | 1993-05-11 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the production of R(-)-4-halo-3-hydroxybutyronitrile |
| JP2684238B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1997-12-03 | 旭化成工業株式会社 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
| US6060265A (en) * | 1996-12-18 | 2000-05-09 | Cytec Technology Corporation | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US5863750A (en) * | 1996-12-18 | 1999-01-26 | Cytec Tech Corp | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US6368804B1 (en) * | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| US20240228429A1 (en) * | 2023-01-04 | 2024-07-11 | Hubei Xujie Pharmaceutical Co., Ltd | Process for producing l-carnitine |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2294999A1 (fr) * | 1974-12-18 | 1976-07-16 | Anvar | Procede de preparation d'amides par hydrolyse biologique |
| IT1142201B (it) * | 1980-06-24 | 1986-10-08 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina |
| US4366250A (en) * | 1980-09-24 | 1982-12-28 | Anvar | Preparation process of optically active α-aminated acids by biological hydrolysis of nitriles |
| US4642290A (en) * | 1982-12-06 | 1987-02-10 | Sih Charles J | Process for preparing a compound for use in the production of L-carnitine |
| JPS59183694A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-18 | Hamari Yakuhin Kogyo Kk | 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 |
| ZA852808B (en) * | 1984-04-20 | 1985-11-27 | Wisconsin Alumni Res Found | Process for preparing l-carnitine |
| DK261685A (da) * | 1985-06-11 | 1986-12-12 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af optisk aktive, organiske forbindelser |
| GB2195630B (en) * | 1986-08-26 | 1990-07-18 | Chuo Kaseihin Co Inc | Method for producing carnitine, l-carnitineamide hydrolase and method for producing same |
-
1987
- 1987-12-04 JP JP62305830A patent/JPH0669381B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-02 US US07/279,004 patent/US5041375A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-03 KR KR1019880016137A patent/KR890010206A/ko not_active Ceased
- 1988-12-05 DE DE8888311489T patent/DE3878421T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-05 EP EP88311489A patent/EP0319344B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3878421T2 (de) | 1993-06-03 |
| JPH0669381B2 (ja) | 1994-09-07 |
| KR890010206A (ko) | 1989-08-07 |
| EP0319344B1 (en) | 1993-02-10 |
| DE3878421D1 (de) | 1993-03-25 |
| US5041375A (en) | 1991-08-20 |
| EP0319344A2 (en) | 1989-06-07 |
| EP0319344A3 (en) | 1990-05-30 |
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