JPS5831992A - 新規生理活性物質ｋ−４およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な生理活性物質およびその製造法に関する
。

本発明者らは、有用な医薬品またはその中間体となり得
る新規生理活性物質を提供するという目的のもとに、天
然界より入手した数多くの微生物の生産物について研梵
を行なった。

その結果、アクチノマデユラ属に属する微生物の培養物
中に降圧作用を有する生理活性物質が生産される事実を
見い出した。ついで該培養物から該物質を単離、精製し
、その理化学的性質を調べたところ新規生理活性物質で
あることが判明した。以下核物質をに−４と称し、その
物性ならびにその製造法について詳述する。

本発明の生理活性物質の生産には放線菌アクチノマデユ
ラ属に属する微生物が用いられる。

具体的に好適な菌株の一例として、本発明者らが、鹿児
島系の鹿児島市内の土壌試料よシ単離され九に一４株が
あげられる。

以下に、シアーリング等によって工ｎｔθｒｎ、Ｊ。

Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６　３１３
−３４０　（１９６６）に詳述された方法に従って得ら
れた上記菌株の形態、培養、生理における特徴を記述す
る。

■、形態的特徴 グルコース・アスパラギン寒天培地、スターチ・無機塩
寒天培地など合成培地では本菌株はほとんど生育せず、
一方酵母エキス・麦（３） 芽エキス寒天培地、グルコース・酵母エキス寒天培地な
ど天然培地で）ま旺盛な生育を示し、白色の気中菌糸を
よく着成する。基生圀糸は比較的短かく又分枝も見られ
、０．４〜（１，６μｍの直径を有し、先端部分で時々
分断が観察される。気中菌糸はよく伸長し又分枝も見ら
れ、０．６〜０．８μｍの直径を治している。

胞子は気中菌糸より単純分枝した胞子柄に鎖叙 状に形成され、その−目、１０個以下であり、鉤状、ラ
セン状又は粘液状物質でおおわれ類似胞子ノウ様を示す
。胞子の形は卵形を示し、その大きさは０．６〜０．７
μｍＸ０．８〜ｉ、ｏμｍであり、表面はとげ状で、鞭
毛を有さない。胞子ノウ胞子及び菌核などの形成＃″ｉ
ｉ観察なかった。

■・各種培地上での生育収約 各槙培地上で２８℃、２週間培養した時の生育及び色の
特徴を下記に示す。同色の表示はＣｏ１ｏｒ　ｌａｒｍ
ｏｎｙ　Ｍｏｎｕａｌ（（３ｏｎｔａｊ、ｎθｒ　ｃｏ
ｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　）によ
る色の分類に従っ（４） た。又使用したどの培地においても可溶性色素＃ｉ認め
られなかった。

１、　グルコース・アスパラギン寒天培地生育　：　不
良 ２　グリセルール・アスパラギン寒天培地生育　：　不
良 ３　スターチ・無機塩寒天培地 生育　：　不良 ４、　卵・アルブミン寒天培地 生育　：　不良 ５、　シュクロース・硝酸塩寒天培地 生育　：　貧弱 基土菌糸の表面・裏面の色ニライト・ アイポリ−（２ｃａ） 気中菌糸：貧弱、パール・シェル・ティント（３ｂａ） ６、　グリセロールーカルシヱウムマレイト寒天培地生
育　：　貧弱 基土菌糸の色：無色 気中菌糸；非常に貧弱、白色（−） （５） ７、栄養寒天培地 生育　：　普通 基土菌糸の表面の色：メロン・イエロー（３ｇａ） 基土菌糸の１に面の色：アンバ−（３１ｃ）気中菌糸：
なし ８、酵母エキス・麦芽エキス寒天培地 生育　：　良好 基土菌糸の表面・裏面の色ニライト・ アンバー（３１−ｃ） 気中菌糸；普通ないし豊富、白色（ｏ）９、　オートミ
ール寒天培地 生育　：　普通 基土菌糸の表面・裏面の色ニジイト・ フィート（２θａ） 気中菌糸：非常に貧弱、白色（ａ） １０、ベネット氏寒天培地 生育　：　普通 基土菌糸の光面・裏面の色ニライト・ ゴールド（２１ｏ） （６） 気中菌糸：普通、白色（ａ） １１．　　エマーンン氏寒天培地 生育　：　良好 基中菌糸の表面の色ニブライト・イエロー（３１ａ、） 基中菌糸の裏面の色：アンバ−（３ｎｃ）気中菌糸：貧
弱、白色（ａ） １ｚ　　グルコース・酵母エキス寒天培地生育　：！ｉ
、好 基中菌糸の表面・裏面の色：アンバ＝ （３ｎｃ） 気中菌糸：豊富、白色（ａ） １３　　ヒツキー・トレスナー氏寒天培地生育　：　良
好 基中菌糸の表面・裏面の色；マスタード・ゴールド（２
ｎθ） 気中菌糸：豊富、白色（ａ） １４、ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地生育　二　貧
弱 基中菌糸の表面・裏面の色：アンバー （３ｎｃ） 気中菌糸：な　１゜ １５　　チロシン寒天培地 生育　：　貧弱 基中菌糸の表面・裏面の色ニライト・ アイポリ−（２ｃａ） 気中菌糸：非常に貧弱、白色（ａ） ■、生理的性質 に−４号菌株の生理的諸性質を以下に示す。

温度は５目間、ミルク、ゼラチン及び繊維素については
１ケ月後その他は２″ＸＪ間後の結果を記述する。伺本
菌株はシリトノ・ムーゴットリーブの無機培地（ＩＳＦ
９号）での生育が貧弱であるので、ループマンの培地（
Ｎ、　Ｙ。

Ａｃａａ、　ｓｃｊ、、］」２０７．１９７１）での炭
素源の資化性試験を参考とした。

１、炭素源の資化性：Ｌ−及びＤ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−７ラクトース、Ｌ−
ラムノース、Ｄ−ガラクトース、シュクロース、マンノ
ース、リボース、ｆ）ｌｌ、Ｄ−マンニト−ルをよ〈資
化するが、ラフィノース、メリチトース、グリセロール
を資化しない。メリビオース、イノシ１−−ル、ラクト
ースの資化性は弱い。

λ　ゲラチンの液化作用：な　し ３　　ミルクに対する作用：＃固も液化もしない。

４、繊維素の分解作用：弱いながらある。

５、澱粉の加水分解作用：あ　シ ロ、至適生育ｐＨ：６．５〜７．８ ７、至適生育温度：２８℃〜３７℃ ８、チロシナーゼの生成：な　し ９、　メンノイド色素の生成：な　し ■・細胞壁組成 細胞壁中のアミノ酸としてメンジアミノピメリン酸、ア
ラニン及びグルタミン酸を含有するが、ＬＬ−ジアミノ
ピメリン酸及びグリシンを含まない。一方Ｌｅｃｈ＠ｖ
ａｌｉｅｒらの方法（Ｔｈｅ　ＡｃｔｉｒＯｍｙａａｔ
ａｌｅｓ、　（）ｕａｔａｖ　ｐｉａｈｅｒＶｅｒｌａ
ｇ、　、Ｔｅｎａ、　３１１−３１６頁、１９７０　）
で全菌体中の糖を分析すると、リボース、グル”−４＋
　ガ９り）−ス、マジュロースナトカ（９） 検出されるが、アラビノース及びキシロースは検出され
ない。ＬθｃｈθＶａ１．ｉｅｒらの分類（工ｎｔｅｚ
°ｎ、　Ｊ、　Ｂｙｅｔｅｒｎ、　Ｂａ、ｃｔｅｒｌｏ
ｌ、　ｌｌ４３５−４４３．１９７０）によれば、Ｋ　
、−４−菌株はＩ型の細胞壁及び全菌体中にＢパターン
の糖を有する。

以上気中菌糸上に形成される胞子鎖及び細胞壁の型など
から、本菌株は放線菌の中でアクチノマデユラ（Ａｃｔ
ｌ、ｎｏｍａｄｕｒａ　）　Ｊｇに分類される。

アクチノマデユラ属の菌株は近年数多く報告されてきて
いる。細菌学名承認リスト（工ｎｔｅｒｎ、　Ｊ、　Ｓ
ｙｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔθｒｔｏ１．３０　２２５−４
２０．１９８０　）の２４株と、とげ状の表面の胞子を
有し、白色の気中菌糸を形成し、黄色系の基中菌糸であ
り、又可溶性色素を産生じない本菌株とを比較した。本
菌株はほとんどの菌株とは明らかに異なり強いてあげれ
ば、アクチノマデュラクレメア（ＡｃｔｉｎＱｍａｄｕ
ｒａｃｒθｍｅａ）と似ている。しかし、アクチノマデ
（１０） ニラ・クレメアは胞子表置が粗と報告されているが、本
菌株はとげ状で、あきらかに両法は異なる。従って本発
明者らはに一４株をアクチノマデユラ・スピキュロソス
ポーラに−４（４ｃｔｉｎｏｍａａｕｒａ　５ｐｉｃｕ
ｌｏｓｏθｐｏｒａ　ｎＯＶ、　Ｂｐ。

本菌株は、他の放線菌の場合にも見られるごとく、例え
ば紫外線、Ｃｏ６０照射、エックス線種々の変異肪起薬
品などを用いる人工的変異手段で変更し得るものであり
、このような変異性があってもに一４物質の生産能をも
つ株はすべて本発明において使用できるものである。

Ｋ−４号菌株の培養 本発明のに一４生産菌株の培養においては通常の放線菌
の培養法が一般に用いられる。

培養のための栄養源としては、いろいろのものが用いら
れる。炭素源としてはグルコース、デン粉、マンノース
、フラクト−ス、シュクロース、糖蜜などが単独またれ
１組み合わせて用いられる。さらに菌の資化性によって
は、炭化水素、アルコール類、有機酸なども用い得る。

無機及び有機窒素源としては、ｔｌＡ化アンモニウム、
尿素、硝酸°ｒンモニウＪ９、硝酸す）　ＩＪウノ・な
どが、また天然窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵
母エキス、乾燥酵匍、コーンスチーブリカー、大豆粉、
カザミノ酸、ソリュ、プル・ベジタブル・プロディンな
どが単独オたは組み合わせて用いられる。その＃１か必
要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、燐酸塩な
どの無機塩類を加えるほか、本菌の生育やに−４の生産
を促進する壱機物や無機物を適宜添加するととができる
。培養法としては液体培養、とくに深部攪拌培養法が最
も適している。培養温度は２５〜４０“Ｃ１１）Ｈけ中
性付近で培養することが望ましい。

液体培養で通常３日ないし５日培養を行なうとに−４が
培養液中に生成蓄積される。培養液中の蓄積が最大に達
したときに培養を停止し、菌体を炉別して得られる培養
Ｆ液中より目的物質を単離、精製する。

Ｋ−４の単離、精製 培養涙液からのに−４の単離、精製には微生物代謝意物
をその培養ｐ液から単離するために通常用いられる方法
が利用される。すなわち、活性炭、ダイヤイオンＨＰ−
１０（三菱化成工業■）などによる吸脱着法、シリカゲ
ル、セルロース、イオン交換樹脂などを用いたカラムク
ロマトグラフィーなどの方法を適当に組み合わせて行な
うｎ製法を挙げることができる。次にその一例を示す。

培養炉液を塩酸でｐＨ７に調整した後、ダイヤイオン）
ＩＰ−１０を充填し九カラムに通塔する。Ｋ−４を樹脂
に吸着させた後、水洗し、５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール
水溶液で溶出する。Ｋ−４を含む両分を集め減圧下で濃
縮後、凍結乾燥することによシ、粗粉末を得る。次にセ
ルロース粉末を７ｏ％（Ｖ／’１（１３） イソプロパツール水溶液にＭ濁し、充填したカラムに、
得られ九に−４の粗粉末をチャージし、同一溶媒で溶１
１トする。Ｋ−４を含む両分を集め、減圧下に絨縮して
、イソゾ１１パノールを除いた後、Ｉ）Ｈを希水酸化す
トリウム水溶液などを用いて７．５に調整する。０．０
１モル、ｐ　Ｈ７，５の燐酸緩衝液で平衡化されたＤＥ
ＡＦｉ−セファデックスＡ−２５（ファーマシア・ファ
インケミカル社、スウェーデン）を充填したカラムの上
端に、ｐ　ＩＩを調整した濃縮液をのせ、Ｋ−４を吸着
させた後、同緩衝液で洗う。その後、０．５モルの燐酸
緩衝液で溶出する。Ｋ−４を含む両分を集め、ダイヤイ
オンＨＰ−１０を充填したカラムに通塔して、水洗した
後、５０　％　（Ｖ　／　Ｖ　）メタノール水溶液で浴
出する。Ｋ−４を含む両分を冷室（４℃）に放置すると
、Ｋ−４の微結晶状粉末が析出する。上記精製工程中、
Ｋ−４の検出はライドンスミスならびにヨウ素反応に陽
性を指標にして行なった。

（１４） かくして得られたに−４の理化学的性質は以下に示す通
りである。

（１）性状二白色微結晶状粉末。

（２）旋光度：〔α〕２０−−８３°（ｃ＝ｏ、１．　
ｏ、ｔｎＮａｏａ）（３１Ｍ！Ｉｔ点：３００℃までは
融点を示さない。

（４）溶剤に対する溶解性： ０．１規定水酸化ナトリウム水溶液に可溶；水、メタノ
ールに僅溶：クロロホルム、ｎ−へキサンに不溶 （５）呈色反応：ライドン−スミス反応、ヨウ素反応お
よび、ニンヒドリン反応に陽 性。エールリッヒ反応に陰性。

（６）構成アミノ酸：６規定塩酸、１１０℃、２０時間
の加水分解後、アミノ酸自動 分析計により、フェニルアラニン及び 未同定のニンヒドリン反応陽性物質 （比は約１：１である）を検出した。

（刀　ヒト２ジン分解：ヒドラジ／分解法によるＣ末端
分析で、前述の未同定のニン ヒドリン反応陽性物質を検出した。

（８）紫外部吸収スペクトル：第１図 （９）赤外部吸収スペクトル：第２図 Ｑ１　ｐＭＲスペクトル：第３図 （ＩＩ）　　”Ｏ−Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトル＝８ｇ４図０
２　　各種展開剤によるに−４の薄層クロマトグラフィ
ーのＲｆ値を第１表に示す。

第　　１　　表 に−４の薄層クロマトグラフィー 展　　　開　　　剤　　　　　　　　　Ｒｆ値１゜ｎ−
ブタノール：酢酸：水（４：１：Ｉ　Ｖ／Ｖ）　　　　
　　　０．３７１７０優（′ｖ／′ｖ）インプロパツー
ル水溶液　　　　　０．３９３、ｎ−ブタノール：ｎ−
ブＷシール：水２　：　１　：　３　（Ｖ、／’Ｖ）上
層　０．１８注）薄層：　５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　（Ｍ
ａｒｃｉｃ　Ａｒｔ　５７２１）展開：室温、上昇法、
４時間 検出：ライドン・スミス反応による呈色Ｑ３に−４の酸
加水分解中に含まれるニンヒドリン反応陽性物質の薄層
クロマトグラフィーのＲｆ値を第２表に示す。

８２表 １、フェニルアラニン　　　　　　　　　０．６８２イ
ンロイシン　　　　　　　　　　　０・７３３、チ目シ
ン　　　　　　　　ｏ、４２４、未同定ニンヒドリン陽
性物質　　　　０．３３酔！嘩−一　　　　　　　−！
１−−１１エ　　　　　　　　　−、７２１．１．ア１
１．工、。１１４１．、、工、□注）薄層：アビセルＳ
Ｆ（フナコシ薬品■）展開剤：ｎ−フ゛タノール：酢酸
：水４：１：ｔ（ｖ／Ｖ）展開：室温、上昇法、５時間 検出：ニンヒドリン反応 以上のに−４の諸性質と、Ｋ−４が降圧作用を有するこ
とから本発明微生物の産生ずる生理活性物質に−４は新
規化合物であると見做した。

以下に本発明を実施例にょシ詳しく説明する。

実施例 種菌として、アクデノマデュ２・スピキュロソスポーラ
（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　８ｐｉＯｕｌＯ＋３０８
ｐＯｒａ　ｎＯＶ、　ｓｐ。

Ｋ−４）（微工研菌寄第　６１０／号）を用い、第（１
７） 一種培地として、グルコース１チ、可溶性でんぷん１％
、牛肉エキス０．３　％、酵母エキス０．５チ、バクト
ドリプトン０，５チ、炭酸カルシウム０．２％（殺菌前
ｐＨ７，２）の培地を用いる。種菌−白金耳を５０１１
１容大型試験管に入れた上記の種培地１０ｊに植菌し、
３０℃で５日間培養する。この種培養液３−を３００−
容エルレンマイヤーフラスコ中に入った３０ｍ１の第二
種培地に種菌する。第二種培地の組成は第一種培地と同
じである。第二種培養は３０℃で２日間振盪培養する。

この種培養液３０１１７を２１バツフル付エルレンマイ
ヤーフ：１７ス：ＩＫ人ツ７’ｃ３００−の第三種培地
に植菌する。第三種培地の組成は第一種培地の組成と同
じである。第三種培養は３０℃で３日間振盪培養する。

この第三種培地０．９　ｔ　（フラスコ３本分）を３（
ｌ容ステンレススチール製ジャーファーメンタ−中の主
醗酵培地１５／に植菌する。主醗酵培地の組成は。

可溶性でんぷん４％、ソイビーンミール３チ、コーンス
チープリカ−０，５％　、燐酸二カリウム（１８） ｏ、　ｏ　ｓ　％、硫酸マグネシウム（七水塩）Ｏ，Ｏ
Ｓチ、塩化カリウム０．０３％、炭酸カルシウム０．３
チ（殺菌前Ｉ）Ｈ７，８）である。この主醗酵培養は３
０℃で５日間通気攪拌方式（回転数３００　ｒｐｍｅ通
気量１５　ｚ　／ｍｉｎ　）によシ行なう。

かくして得られた培養液に、約１ｋｆの濾過助材ラジオ
ライト４６００　（昭和化学工業■）を加え、減圧下で
ν遇し、１４／のＰ液を得る。このｖ−Ｔ液をｐ　Ｈ７
，０に壌酸で調整し、１１のダイヤイオンｕｐ−ｔｏ（
三菱化成工業■〕を充填し九カラムに通塔する。Ｋ−４
はＨＰ−１０に吸着され、水洗後５０％（Ｖ／Ｖ　）メ
タノール水溶液で溶出する。Ｋ、　−４を含む両分を減
圧下で濃縮し、メタノールを除去した後凍結乾燥をする
とに−４の褐色粗粉末１３．Ｃｌを得る。かくして得ら
れ九に−４の粗粉末１３．０ｇをあらかじめ７ｏ％（ｖ
／ｖ）イソプロパツール水溶液に懸濁しカラムに均一に
充填したアビセル（セルロース、フナコシ薬品■）の約
１１のカラムにチャージする。ついで同一溶媒で溶出す
る。Ｋ−４を含む両分を集め、減圧下で濃縮して、イソ
プロパツールを除去する。かくして得られた濃縮液を力
七イソーダでｐＨを７５に調整する。この濃縮液をあら
かじめ０．０１モル、ｐ　Ｈ７，５の燐酸緩衝液で平衡
化したＤ　Ｆ、’　Ａ　Ｅ　−セファデックスＡ−２５
（ファーマシア・ファインケミカル社、スウェーデン）
を充填したカラム５００ｄにチャージする。Ｋ−４を吸
着させた後、同じ緩衝液で洗滌する。その後、０５モル
の緩衝液で溶出する。

Ｋ−４を含む両分を合わせ、ｐＪ（を７．０に塩酸で調
整した後、１００Ｍ１のダイヤイオンＩ　Ｐ　−１０を
充填したカラムに通塔し、水洗後、５０％（Ｖ／Ｖ）メ
タノール水溶液で溶出する。Ｋ−４を含む両分を冷室（
４℃）に放電すると、Ｋ−４の微結晶状白色粉末が析出
する。かくしてに、−４の白色微結晶状粉末６．５叩を
得る。

該に−４は前記の理化学的性質を示す。

なお、上記精製工程中Ｋ−４の検出は、ライドンスミス
ならびにヨウ素反応に隣性を指標にして行なつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明化合物Ｋ−４の紫外部吸収スペクトルで
ある。伺曲線■はＫ−４の０．１規定水酸化ナトリウム
溶液、曲線■は０，１規定塩酸溶液（濃度２００μｇ／
ｗｌ　）のスペクトルである。 第２図は、化合物に−４の赤外部吸収スペクトルである
。 第３図は、化合物に−４のＰＭＲスペクトルである。 第４図は、化合物に−４の”Ｏ−Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトル
である。 （２１） 第１図 ：［′

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有する新規生活活性物質Ｋ−
   ４。 （１）性　状：白色微結晶状粉末。 （２）旋光度：〔α〕τに一８３°（０＝０．１，０．
   ｌＮＮａ０Ｈ）（３）融　点：３００’Ｃまでは融点を
   示さない。 （４）溶剤に対する溶解性： ０．１規定水酸化す）ＩＪウム水溶液に可溶；水、メタ
   ノールに僅溶；クロロホルム、ｎ−ヘキサノに不溶。 （５）呈色反応：ライドン・スミス反応、ヨウ素反応お
   よびニンヒドリ／反応に陽性、エールリッヒ反応に陰性
   。 （６）構成アミノ酸二６規定塩酸、１１０’Ｃｌ２Ｏ時
   間の加水分解後、アミノ酸自動分析計によシ、フェニル
   アラニン及び未同定のニンヒドリン反応陽性物質（約１
   ＝１）を検出。 （７）　　ヒドラジン分解；ヒドラジン分解法にょるＣ
   末端分析で前述の未同定ニンヒドリン反応陽性物質を検
   出。 （８）紫外部吸収スペクトル：第１図 （９）赤外部吸収スペクトル：第２図 αｌ　　ＰＭＲスペクトル　　：第３図Ｑｌ）　　”Ｏ
   −ＮＭＲスペクトノＬ弓第４図２　Ｋ−４生産能を有す
   るアクチノマデユラ属に属する微生物を栄養培地にｔ＠
   譬し、培養物中にに−４を生成蓄積せしめ、該培養物か
   らに−４を採取することを％徴とする新規生理活性物質
   に−４の製造法。 ３、新規微生物アクチノマデユラ・スピキユロンスポー
   ラ。