JPS5832599B2 - 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法 - Google Patents
乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法Info
- Publication number
- JPS5832599B2 JPS5832599B2 JP51120301A JP12030176A JPS5832599B2 JP S5832599 B2 JPS5832599 B2 JP S5832599B2 JP 51120301 A JP51120301 A JP 51120301A JP 12030176 A JP12030176 A JP 12030176A JP S5832599 B2 JPS5832599 B2 JP S5832599B2
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- JP
- Japan
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- ldh
- activity
- lactate dehydrogenase
- isozyme
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
近年臨床検査の分野では種々の疾患と、細潰などの体液
中の酵素活性との解明が進み、ある特定の疾患では油清
中のある特定の酵素活性が異常に高くなったり、また消
失したりすることが知られるようになってきた。
中の酵素活性との解明が進み、ある特定の疾患では油清
中のある特定の酵素活性が異常に高くなったり、また消
失したりすることが知られるようになってきた。
例えばヒ１ｌｆｉ］清甲の乳酸脱水素酵素（以下ｒＬＤ
Ｈｊと略称する）活性は正常人では非常に少ないが、悪
性腫瘍、心筋硬塞、肝炎などで著しく上昇する。
Ｈｊと略称する）活性は正常人では非常に少ないが、悪
性腫瘍、心筋硬塞、肝炎などで著しく上昇する。
また各種疾患の悪化、好転などに伴って特徴的に変化す
るので、疾患の経過観察や、治療効果の判定に太いに役
立つ。
るので、疾患の経過観察や、治療効果の判定に太いに役
立つ。
さらに同種の酵素の中のアイソザイム組成が疾患の種類
によって特徴的な異変を示す例も知られている。
によって特徴的な異変を示す例も知られている。
前述のヒトのＬＤＨはＨ型（心筋型）およびＭ型（骨格
筋型）の２種の酵素（サブユニット）からなり、通常の
状態ではこのサブユニットの４量体として存在すること
が知られている。
筋型）の２種の酵素（サブユニット）からなり、通常の
状態ではこのサブユニットの４量体として存在すること
が知られている。
サブユニットが２種類あるので４量体を作る組合わせは
５種類存在する。
５種類存在する。
その重合はランダムな結合であって、重合体の組成はＨ
型とＭ型の存在量によって決まると言われている。
型とＭ型の存在量によって決まると言われている。
油清中のＬＤＨが上昇するのは疾患のある臓器からＬＤ
Ｈが溶出されるためであり、肝炎の場合に油清中に溶出
するＬＤＨは肝臓起源のＭ型アイソザイムが大部分を占
め、心筋硬塞の場合は心臓起源のＨ型アイソザイムが大
部分を占める。
Ｈが溶出されるためであり、肝炎の場合に油清中に溶出
するＬＤＨは肝臓起源のＭ型アイソザイムが大部分を占
め、心筋硬塞の場合は心臓起源のＨ型アイソザイムが大
部分を占める。
従って油清中に溶出されるＬＤＨのアイソザイムを分別
定量することにより、疾患のある臓器を推定することが
できる。
定量することにより、疾患のある臓器を推定することが
できる。
ＬＤＨのアイソザイムを分別定量する方法として、従来
電気泳動によって分離した後定量する方法、イオン交換
体によって分離した後定量する方法、熱安定性の差を利
用して熱に不安定な方のアイソザイムを失活させて定量
する方法などがある。
電気泳動によって分離した後定量する方法、イオン交換
体によって分離した後定量する方法、熱安定性の差を利
用して熱に不安定な方のアイソザイムを失活させて定量
する方法などがある。
しかしこれらの方法では分離のプロセスが必要で手数と
時間がかかる問題があったり、処理条件の設定が微妙で
精度が劣る、などの難点がある。
時間がかかる問題があったり、処理条件の設定が微妙で
精度が劣る、などの難点がある。
本発明はＬＤＨのアイソザイムを分離することなく、そ
れらの共存した状態のまま梅漬を直接迅速、簡便に分別
定量する方法に関するものである。
れらの共存した状態のまま梅漬を直接迅速、簡便に分別
定量する方法に関するものである。
すなわち本発明は、
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ｒ
ＮＡＤＨＪと略称する）を補酵素としてＬＤＨ活性を測
定する際の反応液中に、ＮＡＤＨより生ずるＬＤＨ活性
阻害物質を含有させることを特徴とするＬＤＨアイソザ
イムの分別定量法を提供する。
ＮＡＤＨＪと略称する）を補酵素としてＬＤＨ活性を測
定する際の反応液中に、ＮＡＤＨより生ずるＬＤＨ活性
阻害物質を含有させることを特徴とするＬＤＨアイソザ
イムの分別定量法を提供する。
ここでいうＬＤＨ活性阻害物質はＮＡＤＨ粉末または水
溶液を長期間保存した場合に、ＮＡＤＨから生成される
ニコチンアミド補酵素類似の構造を特つ物質である。
溶液を長期間保存した場合に、ＮＡＤＨから生成される
ニコチンアミド補酵素類似の構造を特つ物質である。
（第４６回日本生化学会大会：山内他ｒＮＡＤＨ中のＬ
ＤＨ反応阻害物質について」）０該阻害物質がＬＤＨ活
性に対する非常に強力な阻害作用を示すことは広く知ら
れている。
ＤＨ反応阻害物質について」）０該阻害物質がＬＤＨ活
性に対する非常に強力な阻害作用を示すことは広く知ら
れている。
（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ。
Ａｃｔａ。
Ｖｏｌ、 ５４． ｐ、 ２１０（１９６１）； ５
ｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ１
１ｎｉｃａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇ
ａｔｉｏｎ、 Ｖｏｌ、 ３３． Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ（１９７４）） 起源の異なるＬＤＨに対しては該阻害物質の阻害作用の
程度が異なることも知られているが、（Ｑｕａｌｉｔｙ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａ
ｌＣｈｅ、 Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、 ６ｔｈ
；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｎｉｄｏ、 Ｖａｎ Ｋａｍ
ｐｅｎ。
ｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ１
１ｎｉｃａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇ
ａｔｉｏｎ、 Ｖｏｌ、 ３３． Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ（１９７４）） 起源の異なるＬＤＨに対しては該阻害物質の阻害作用の
程度が異なることも知られているが、（Ｑｕａｌｉｔｙ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａ
ｌＣｈｅ、 Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、 ６ｔｈ
；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｎｉｄｏ、 Ｖａｎ Ｋａｍ
ｐｅｎ。
Ｒｏｓａｌｋｉ ； ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、 Ｂｅ
ｒｌｉｎ、 ｐａ ２９１゜（１９７５））活性阻害度
とＬＤＨアイソザイムのパターンとの関係についての解
明はなされていないＯ 本発明者等は該阻害物質がＬＤＨアイソザイムの活性に
及ぼす阻害度には以下に述べるような規則性があること
を見い出し、この新規な知見に基づいて本発明を完成し
た。
ｒｌｉｎ、 ｐａ ２９１゜（１９７５））活性阻害度
とＬＤＨアイソザイムのパターンとの関係についての解
明はなされていないＯ 本発明者等は該阻害物質がＬＤＨアイソザイムの活性に
及ぼす阻害度には以下に述べるような規則性があること
を見い出し、この新規な知見に基づいて本発明を完成し
た。
ここでＬＤＨアイソザイムの混在するサンプルについて
種々の活性因子を次の表のように表記することにする。
種々の活性因子を次の表のように表記することにする。
すなわちＡＨ、ＡＭ、Ａは活性測定の際に上記阻害剤を
含有しない通常の反応液を用いた場合の活性を表わし、
Ａ′Ｈ２ＸＭ、Ａ′はそれぞれ一定量の上記阻害剤を反
応液中に共存させた場合のＬＤＨ活性を表わす。
含有しない通常の反応液を用いた場合の活性を表わし、
Ａ′Ｈ２ＸＭ、Ａ′はそれぞれ一定量の上記阻害剤を反
応液中に共存させた場合のＬＤＨ活性を表わす。
また
ＲＨ＝ＡＨ／Ａ
ＲＭ＝ＡＭ／Ａ
Ｐ ＝ Ａ７Ａ
ＰＨ＝Ａ’Ｈ／ＡＨ
ＰＭ＝Ａ’Ｍ／ＡＭ
とすると、
ＰとＲＨの間に次のような関係が成立する。
Ｐ＝Ａ７Ａ
＝（Ａ′Ｈ＋ＡＭ）／Ａ
＝（ＰＨＡＨ＋ＰＭＡＭ）／Ａ
＝ＰＨＲＨ＋ＰＭＲＭ
＝ＰＨＲＨ十ＰＭ−ＰＭＲＨ
＝（ｐＨ−ＰＭ ）ＲＨ＋ＲＭ ・・・・・・・・・
（１）一式この関係は、第１図のノモグラフに示すよう
に縦軸にＰをとり、横軸にＲＨをとるとＰ輪切片がＰＭ
で勾配が（ＰＨＰＭ）の直線で表わされる。
（１）一式この関係は、第１図のノモグラフに示すよう
に縦軸にＰをとり、横軸にＲＨをとるとＰ輪切片がＰＭ
で勾配が（ＰＨＰＭ）の直線で表わされる。
Ｐは反応阻害物質を一定量添加した場合の活性比であり
、ＲＨは全ＬＤＨ活性中に占めるＨ型ＬＤＨの活性であ
る。
、ＲＨは全ＬＤＨ活性中に占めるＨ型ＬＤＨの活性であ
る。
これにより、活性阻害物質を含有しない反応液（反応液
１）及びある一定濃度のＬＤＨ活性阻害物質を含む反応
液（反応液２）と、あらかじめアイソザイムの組成のわ
かっている二種のＬＤＨサンプルとを用いて標準線を作
る一方、同様の方法で未知のＬＤＨサンプルを測定し、
得られた活性比Ｐ（Ａ７Ａ）を標準線にあてはめれば、
そのアイソザイム組成を分別定量することができる。
１）及びある一定濃度のＬＤＨ活性阻害物質を含む反応
液（反応液２）と、あらかじめアイソザイムの組成のわ
かっている二種のＬＤＨサンプルとを用いて標準線を作
る一方、同様の方法で未知のＬＤＨサンプルを測定し、
得られた活性比Ｐ（Ａ７Ａ）を標準線にあてはめれば、
そのアイソザイム組成を分別定量することができる。
ＰはＬＤＨ活性阻害物質の濃度によって変化するが、又
、反応の基質であるピルビン酸の濃度、ＮＡＤＨの濃度
及びｐＨなどによっても大きな影響を受ける。
、反応の基質であるピルビン酸の濃度、ＮＡＤＨの濃度
及びｐＨなどによっても大きな影響を受ける。
従って精度の高いＲＨを求める為にはＰＭとＰＨとの差
ができるだけ大きくなるような条件を設定するのが望ま
しい。
ができるだけ大きくなるような条件を設定するのが望ま
しい。
臨床検査においてはＰＭとＰＨの差は５０％以上である
ことが望ましい。
ことが望ましい。
測定方法は通常のＬＤＨ活性の測定方法でよく、何ら特
殊な装置又は操作は必要としない。
殊な装置又は操作は必要としない。
以上述べたように本発明方法によれば、通常のＬＤＨ活
性を測定するのと同じ操作で容易にＬＤＨアイソザイム
の分別定量をすることができる。
性を測定するのと同じ操作で容易にＬＤＨアイソザイム
の分別定量をすることができる。
実施例 １
サンプルとして精製された豚ＬＤＨ，（サブユニット：
ＨＨＨＨ）（ベーリンガー社製）、豚ＬＤＨ５（サブユ
ニット：ＭＭＭＭ）（ベーリンガー社製）及びこれらを
第１表のような比率で混合したものを用いた。
ＨＨＨＨ）（ベーリンガー社製）、豚ＬＤＨ５（サブユ
ニット：ＭＭＭＭ）（ベーリンガー社製）及びこれらを
第１表のような比率で混合したものを用いた。
反応液は０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） 、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１６ｍＭ ＮＡＤＨ及び０．
３ ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む反応液（反応液１
）および反応液１にＬＤＨ活性阻害物質とじてＮＡＤＨ
−インヒビター−■（オリエンタル酵母工業株式会社製
）を１．１ｕｎｉｔ／−添加したもの（反応液２）を用
いた。
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１６ｍＭ ＮＡＤＨ及び０．
３ ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む反応液（反応液１
）および反応液１にＬＤＨ活性阻害物質とじてＮＡＤＨ
−インヒビター−■（オリエンタル酵母工業株式会社製
）を１．１ｕｎｉｔ／−添加したもの（反応液２）を用
いた。
但しここでインヒビター活性の１ユニツトとはＬＤＨ反
応を５０多阻害するインヒビターの１ｒｎｌ当りの濃度
である。
応を５０多阻害するインヒビターの１ｒｎｌ当りの濃度
である。
前記反応液それぞれ３ｒｎｌに対し、第１表に示すよう
な酵素標品（蛋白］−００μり／−）を５μ加え、２５
°Ｃで反応を開始し、３４０ｎｍの吸収の減少を分光々
変針により測定した。
な酵素標品（蛋白］−００μり／−）を５μ加え、２５
°Ｃで反応を開始し、３４０ｎｍの吸収の減少を分光々
変針により測定した。
結果を第２図の黒丸で示す。
これは豚ＬＤＨ。（Ｈ型１００多）及び豚ＬＤＨ５（Ｍ
型１００多）とから（１）式によって求めたノモグラフ
（図中の直線）とよく一致した。
型１００多）とから（１）式によって求めたノモグラフ
（図中の直線）とよく一致した。
第１図はＬＤＨ活性阻害度からＨ型アイソザイムの分率
を求めるノモグラフである。 第２図はアイソザイム組成の既知の種々のサンプルにＬ
ＤＨ活性阻害物質を作用させた時と作用させない時の活
性比Ｐを求め、Ｈ型アイソザイムの分率に対してプロッ
トしたグラフである。
を求めるノモグラフである。 第２図はアイソザイム組成の既知の種々のサンプルにＬ
ＤＨ活性阻害物質を作用させた時と作用させない時の活
性比Ｐを求め、Ｈ型アイソザイムの分率に対してプロッ
トしたグラフである。
Claims (1)
- １ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補
酵素として乳酸脱水素酵素活性を測定する際の反応液中
に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドより
生ずる乳酸脱水素酵素活性阻害物質を含有させることを
特徴とする乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51120301A JPS5832599B2 (ja) | 1976-10-08 | 1976-10-08 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51120301A JPS5832599B2 (ja) | 1976-10-08 | 1976-10-08 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5346090A JPS5346090A (en) | 1978-04-25 |
| JPS5832599B2 true JPS5832599B2 (ja) | 1983-07-14 |
Family
ID=14782839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51120301A Expired JPS5832599B2 (ja) | 1976-10-08 | 1976-10-08 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5832599B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63191295A (ja) * | 1987-02-04 | 1988-08-08 | 富士電機株式会社 | 鉄道車両の走行距離管理装置 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5982398A (ja) * | 1982-11-01 | 1984-05-12 | Toyobo Co Ltd | 補酵素の安定化法 |
| JPS61217287A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-09-26 | Nippon Columbia Co Ltd | 光情報記録媒体 |
-
1976
- 1976-10-08 JP JP51120301A patent/JPS5832599B2/ja not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROCEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE OF USA=1972 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63191295A (ja) * | 1987-02-04 | 1988-08-08 | 富士電機株式会社 | 鉄道車両の走行距離管理装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5346090A (en) | 1978-04-25 |
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