JPS5838300A - 発現因子、それを含有するエシエリヒア属細菌および実質的に純粋なｄｎａセグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝工学の分野１：＄Ｐいて、異質蛋白質の発現を原核
ｖｌ澹体により達成するためにふつうに使用さｊる技術
は、ｆｆｌ望の異質蛋白質を特定する遺伝情報を含有す
るＪう１：修飾さｎ大プラスｉドを用いて、前記儒掬体
を転換することである。種々の真核遺伝子は首尾工〈プ
ラスミド中１−挿入さ１ｒｌ−′Ｃきたが、原核上１ａ
俳中４：挿入されると、原核儒榛体（−異質蛋白質を発
現させる。こうして、ヒトのインターフェロン、ヒトの
成長ホルモン、ヒトのインジュリン、ニワトリのオバル
ブミン、ソマトスタチｙ　（ｓｏｍａｔｏａｔａｔｉｎ
）などの大腸１１ｉ　Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉｃｏｌｔの
一般的に修飾さｔ′１六株による導入が報告さｎた。Ｔ
ａｎｌｇｕｉｃｈｉ　＋Ｔ、＋ｅｔａ１．＋Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７、５２３０−５２３３
（１９８０）　：Ｖｌｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ＋Ｌ、
　＋ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ　。

ＵＳＡ、７５．３７２７−３７３１（１９７８）；およ
びＧｏｅｄｄｅｌ。

Ｄ、Ｖ、　、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２８１　、５
４４（１９７９）。

Ｉ４貴蛋白質を発現できる儒橢偽の構成は、ある数の工
程を含む。１ず第１（：、所望蛋白質の生合成のための
指令含有する遺伝子を同定し、Ｊ＄熱する。遺伝子の同
定お工び単離の手順は刀）彦り変化するが、所望の遺伝
子を実質的に純粋な形で得ることができるい刀Ｉなる手
１−をも用いることができる０ 真核遺伝子を得るためにふつう＜：　０１！用さする１
つの方法は、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）を
用いて始める。蛋白質の合成は細胞内で転写法（ニエリ
開始さする。この転写法はＤＮＡｍ型（：相当するＲＮ
Ａ＠の＃索合成を含む。このように形作用して蛋白質を
生成する。特定の遺伝子により特定さｒ＋六（こうしＣ
％定の蛋白質を特定する）ＲＮＡＦｉ、メツセンジャー
ＲＮＡと呼ばわる。細胞が蛋白質を生成しているとき、
ｍＲＮＡは蛋白質合成情報を有する遺伝子エリも非μ４
＝高い濃度で存在する。さらに、ｍＲＮＡは、染色体の
ＤＮＡ１りも、“単１１訃よび精製Ｃニ一般に有効な形
愈（二あゐ。ふつうの精製技術穴とえは密度勾配沈降、
アフイニテイフロ！トグラ２イーおよび電気泳動−を用
いてｓ　ｍ　ＲＮ　Ａを細胞の溶解愉′！良はホモジネ
ートρ）ら単離することができる。ζｎらの技術は、六
とえは、膵臓細胞η１らインシュリンｍＲＮＡ（Ｖｌｌ
ｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ、Ｌ、　ｓｅｔ　ａｌ、　＋５
ｕｐｒａ）お工ひヒトの白血球からのインターフェロン
ｍＲＮＡ（Ｇｏｅｄｄｅｌ＋Ｄ、Ｖ、＋ｅｔ　ａｌ、、
Ｎａｔｕｒｓ＋２８７＋４１１（１９８０））お２び繊
維芽細胞系統（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ。

Ｔ、＋ｅｔ　ａｌ、５ｓｕｐｒａ）の回収に使用’ｇｎ
てき六。

（の１うにし１得らｎ六ｍＲＮＡを次いで使用して一本
鎖ＤＮＡ分子（相補的ＤＮＡ、ζａＤＮＡ）としても知
ら１ている）を！！ｉ造するために使用できる（ＬＩｌ
ｌｒｉｃｈ、ｅｔ　ａｌ、＋５ｃｉｅｎｃｅｅ１９６．
１３１３（１９７７））。牛する一本鎖ＤＮＡ分子は３
′−大端ヘヤーピン構造をもち、酵素のＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる第２ＤＮＡストランドの引き続く合成のた
めのブライマーを提供する。次いで２本のＤＮＡ鎖を結
合するループを破萌しＣ（たとえば、酵素の８１ヌクレ
アーゼを用いて）もとの遺伝子と同一のｃ　ＤＮＡセグ
メントを生成する。得らｎるＣＤＮＡセグメントは、一
般（＝、たとえば、ゲルの電気泳動にエリ単離お工び稍
製し、（シ″Ｃ七の構造を連続する分析または地図作成
にエリ評価できる。この方法Ｃ二おいて得らｎたＤＮＡ
セグメントの端は、前述の工う１：修飾して、転移因子
中への挿入を促進することができる。

遺伝子は転移因子を介して原核細胞中へ導入することが
できる。転移因子は、一般に、問題の遺伝子が挿入さ１
ているプラスミド１には〕（クテリオファージである。

遺伝子をおる有機体中（二導入する目的が遺伝子を増幅
すること（すなわち、使用可能な量の遺伝子をクロニン
グにエリ得ること）であるとき、転移因子は閥々１クロ
ニング因子１と呼ばｎる。遺伝子をある有機体中に導入
する目的が蛋白質の発現を得ることであるとき、転移因
子は閥々Ｉ発現因子１と呼ばｊる。本発明は新規が転移
因子、と＜（ニブラスずド発現因子（二関する。

プラスミドは比較的小さい閉じたループのＤＮＡである
。制限工ンドヌグレアーゼ酵素の作用の理解が増大し、
（してある数のこの１うな酵素が発見さｒ＋ρ）つ単離
さｆｌ六結果、分子生物学者はプラスミド類を特性づけ
、ヤし′Ｃａｒｔらを修飾し１転移因子としての利用を
改良できる１つ（：なった。

六とえは、望１力いＤＮＡを削除し、こうしてプラスミ
ドの大Ｉさを減少することができ、制限部位を遺伝子の
挿入（：適合する１うＣ：調製することができ、（して
選択可能な遺伝子、たとえば、抗生物質抵抗性遺伝子を
プラスミド中Ｉ：挿入できる。

遺伝子をプラスミド中に卑Ｃ二結合したのでは、蛋白質
の発現は保証さｎない。蛋白質の合成は、遺伝子に近接
し″ＣＣ青々制御信号の存在を必要とする。Ｇｕａｒｅ
ｎｔｅ、Ｌ、＋ｅｔ　　ａｌ、　、Ｃｅ１ｌ＋　２０　
＋　５４３−５５３　（１９８０）ｏこ１らの信号はｍ
ＲＮＡの転写お工ひｍＲＮＡの翻訳の両者（すなわち、
蛋白質の合成〕を開始し、ｖｊ４整し、そして停止する
。細菌による特定蛋白質の合成に関連する制御信号を、
細菌による異質蛋白質の合成の制御（＝使用できること
が発見さｆ′ｌた。この発見は、多能のプラスミド発現
因子の構成に有利（：　（ｉ２用さｆ′Ｉ″Ｃきた。Ｒ
ｏ−ＴＪＳＡ、７６＋７６０−７６４（１９７９）；Ｇ
ｕａｒａｎｔｅ＊ｅｔ　　ａｌ、ａｕｐｒａ。

蛋白質合成に関連する制御信号を、第１図にグラフで示
す。この図面は、トリプトファン（ｔｒｐ）の住合ｒｆ
ｉ、に参加する酵素の制御に関連する二本鎖ＤＮＡのセ
グメントを表わす。′Ｐ″はプロモーター領域として知
らｎる塩基対の配列を表わす。蛋白質の合成の間、プロ
モーター領域はｍＲＮＡ転写の開始の信号を与える。′
０１は、オペレーター領域として知らする塩基対の配列
を表わす。この領域は、リブレツ勺−と組み合つχ、ｍ
ＲＮＡ転写の量を制御する。たとえば、トリプトファン
牛合成において、過剰のトリプトファンはりブレツヤ−
と相互作用し、ｔｒｐｍＲＮＡ転写のレベルを減少する
。プロモーター領域とオペレーター領域はグラフで分離
して示さｎているが、いくつかのオペレーター領域はプ
ロモーター配列内の部分配列であることができる。’８
−Ｄ”はシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ）配夕１ｊとして知ら１ている塩基対配列であ
る。この配列は、蛋白質合成＠ｌ（リボーソーム）がｍ
ＲＮＡを認識できる工うにさせる信号である。こうＬ’
ｔ、シャインーダルガルノ配列＃′ｉｍ　ＲＮ　Ａ合成
４＝不必要であるが、蛋白質合成には必要である。”Ａ
ＴＧ’はメチオニンすなわち開始コドンを表わす。この
コドンは細菌中の蛋白質合成の開始のための信号である
。

ζ１らの信号は、大部分、異なる有機体が異なるコード
を利用するという意味におい″Ｃ１特異性である。この
理由で、真核調節領域を含有する真核遺伝子をプラスミ
ド中に挿入し、次いで原核細胞中に挿入するとき、七の
細胞は、要求さｎる制御配列を認識しないので、蛋白質
を、またはｍＲＮＡさえも、発現しないであろう。他力
において、原核有機体中の特定蛋白質の合成に関連する
プロモーターオペレーター領域を真核遺伝子へ結合する
ことができ、（シχこのような組み合わせを金物するプ
ラスミドのクロンはこの工うな原核有機体の蛋白質合成
装置を利用して、異質蛋白質を発現することができる。

分子生物学名は、この発見の利益を得χいわゆる１ボー
タプル・プロモー　ター（ｐｏｒｔａｂｌｅｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ）”　　を合成した（　Ｒｏｂｅｒｔｓ＋Ｔ、Ｍ
、＋ａｔ　ａｌ、＋５ｕｐｒａ　）　ｏこのようなプロ
モーターは、第２図に示さ１ており、特定の宿主有機体
にエリ認鐵さすることができる、プロモーター、オペレ
ーターお工びシャインーダｈガルノの領域を含有する。

（１らは各端で特異制限酵素ｇ＊配列に１り結合さ１て
いる。前記領域は、前記認識配列の存在のため、適当な
酵素で処置した後、切除し、とζ刀１に（う入すること
ができる。好１しくは、この工うなポータプル・プロモ
ーターの両端は、異危る制限酵素に相当する塩基対の配
列を有する。

第２図において、こｊらの端はＸお工びＹで表示し、異
カる制限酵素、任意Ｃ：Ｘお工びＹ″′Ｃ′Ｃ表示当す
る。この１うな構造は１発現すべき遺伝子に関するポー
タプル・プロモーターの適切な配向を保証し、（しＣ′
！た生ずるプラスミド中の単一の挿入部位を提供する（
後述する）０ポータプル・プロモーターの各端（：相当
する制限部位Ｘお工びＹを有する、１１Ａ３図に示す工
うな、プラスミドは、適当な制限酵素を用いる消化じ１
って開き、ヤしてポータプル・プロモーターを七の中に
、たとえば酵素Ｔ４リガーゼを用い″ｃ１挿入すること
ができる。得らｊるプラスミド（第４図）は、発現因子
とし″′Ｃ使用できる。

この１うシ発現因子を使用するために、所望の遺伝子を
、前述のよう（＝、単一し、七Ｌ″′Ｃ（の端をＹ制限
酵素１：対応する配列をもつ工うに化学的に修飾する。

遺伝子が開始コドンと終止コドンを持六ないとき、各端
祉このよう々コドンを含む工うに修飾しなく又はならな
い。プラスミドを制限酵素で開い六のち、修飾遺伝子を
挿入し″Ｃ所望のプラスミドを生成することができる（
第５図）。

このようなプラスミドを用いる適当々原核有機体の転換
Ｃｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ口ｏｎ）ａ、）リブトンフン制
御信号の制御下に異質蛋白質を発現することができる。

この目的に、事実上いη１なる細菌のプロモーター−オ
ペレーター−シャインーダルガｈノ領斌をも使用できる
。

前述の工うに、従米知らｆまた転移因子中へ挿入さｆ′
Ｉ六遺伝イは、開始信号と終止信号とを持つべきである
。終止信号の場合において、この景件は煩わしいもので
は々い。力ぜ々ら、遺伝子を単離するとき、制限酵素は
終止コドンを含むように選択することができ、そして追
加のＤＮＡ　（終止コドンの後に）も得らｎるかどうか
はほとんど問題ではないη）らである。

他力において、シャインーダルガルノ配列と開始コドン
との間の間隔は非常に重要であることがある（　Ｇｕａ
ｒｅｎｔｅ＋Ｌ、　ｎｅｔ　ａｌ、　＋５ｕｐｒａ）ｏ
Ｄ　Ｎ　Ａの不都合に長い１リーダー（１ｅａｄｅｒ、
）”部分が得らｆ１々いようにして開始コドンを得るよ
う彦方法で、長いＤＮＡ鎖から遺伝子を切除する制限酵
素を発見することは、偶然性を伴う。Ｘり頻繁には、遺
伝子は、開＃Ｉ：２トンと遺伝子の一部分が失なわする
よう力方法で切断さｊる。失なわｎたＤＮＡ、開始コド
ンおよび適当なリーダーは、通常酵素的１大は化学的Ｃ
：加えもどさなくてはならない。

本発明によｎば、遺伝子を原核有機体へ導入するための
新規が発現因子が提供さｎる。発現因子は、原核宿主細
胞中の複製を可能とする信号を有し、ヤしてさらシ： （ａ）原核宿主細胞（：よってＩｊｌ！ｅｍさｎること
ができルフロモーター、オペレーターおよび翻訳開始の
配列、 （ｂ）Ｉ１１３記翻訳開始配列内のシャインーダルガル
ノ配列および開始コドン、および （ｃ）前記開始コドンに近接し、（して開裂し大とき、
前記翻訳開始配列内に、前記開始コドン、１大は（の補
体を残す、制限エンドヌクレアーゼのための認識配列。

を含む、ＤＮＡの閉じたループからなる。

本発明の新規力発現因子は、第６図に示さｔ′１″Ｃい
る。第６図は、プロモーター　、オペレーター、お工び
シャインーダルガルノの領域とメチオニン（ＡＴＧ）開
始コドンを儒する円形プラスミドを示す。制限エンドヌ
クレアーゼの大めの部位（任意（二ｚで表示する）は、
開始コドンに近接する。

このよう彦転移因子は非常（：融通性をもつことができ
る。々ぜ々らは、制限エンドヌクレアーゼ２を用いてプ
ラスミドを開き、ヤして遺伝子を挿入すると、プラスミ
ドはｍＲＮＡの転写および所望の異質蛋白質を暗号化す
る遺伝子の翻訳−のために必要々信号のすべてを儒する
であろうからである。

本発明のプラスミド発現因子において、シャインーダル
ガルノ配列と開始コーンとの間のセグメントの組成お１
び長さを精確（：刀）つ再現性をもって制御できる。こ
うして、このセグメントは用いる特定のプロモーター−
オペレーター系に適合するように調製Ｌ”（、遺伝子の
発現を最適化することができる。（の上、発現因子は、
適当な制陣エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを開
裂したとき、翻訳開始配列中に開始コドンな残すようじ
位賀した、挿入部位を有する。こうして、遺伝子の挿入
のための発現因子の操作は翻訳開始配列を乱さず、（し
てこの配列は挿入さｎる遺伝子に無関係に無傷の１１で
ある。ここで使用するとき、１翻訳開始配列１は、シャ
イ、ンーダルガルノ配列（ゾボソーム結合部位）、開始
コドン（通常ＡＴＧ）、＞よび（ｎらの２つの配列の間
のＤＮＡセグメントを含む。

本発明の発現因子は、野生型プラスミド類１大は七１ら
の修飾物から誘導することができる。刹利には、出発物
質として選択するプラスミドは引き続く操作により影響
を受は彦い＊ｒＭ機能をもつ。

ζｎらの複製機能に１す、最後の転移因子は所望の様式
の複製制御にさら’ａｒｔ、すなわち、細胞当り多数の
複写１穴は単一の複写中４＝、あるいは細胞当り制御可
能な数の複写中に存在するであろう。

このようなプラスミド出発物質は、１大好１しぐは大き
さが小さい。小さいことにエリ、プラスミドは大きい遺
伝子の挿入部分を愛は入ｊることができ、細胞の転換は
促進さ１、そしてプラスミドは不必要に大きい量の細胞
エネルギーおよび栄養を、望１ない高分子の生産に転向
しない９．有利には、プラスミドは約１０キロ塩Ｊ　（
Ｋ１１ｏｂａｓｅ）より小さく、好１しぐは約２キロ塩
−〜約５キロ塩基の範囲である。

本発明の発現因子を製造するためには、ＲＮＡの転写お
Ｌひ翻訳に関連する制御信号を出発プラスはド中に挿入
する。このような制御信号は意図する宿主真機体にＪり
認識さｎることができるい刀１彦る形態であることがで
きるが、ある抑の系は好フしい。原核蛋白質合成（：関
連するプロモーター−オペレーター領域は、効率が変化
する。一般１ｍ、４度に効率よい糸は、高いレベルの蛋
白質の発現を生ずるので、好ましい。本発明の新規な転
移因子を合成するときとくに有用力既知のプロモーター
−オペレーター系は、ラクトース（ｌａｃ）お１ひトリ
プトファン（ｔｒｐ）　　の代謝を制御するニジファー
ジλのプロモーター−オペレーター領域（ＰＬ）である
。ｌａｃおよびｔｒｐ系は１本発明の発現因子の合成に
一般に好ツしい。

ζｊらの制御信号は、（ｊらを含有するＤＮＡからの切
除４：よって得ることができる。切除の男性は、へ千司
能々制限酵素、お２び系を結合する有用な制限部位の存
在に依存する。プロモーター、オペレーターおよびシャ
インーダルガルノ領域は、好１しくはＤＮＡの１つの無
傷のセグメントとして回収さする。所望の制御信号を含
有する切除さｆｌｆｔ−ＤＮＡセグメントを１次に、ふ
つうの遺伝子挿入手順を用いて、プラスミド中へ挿入す
る。

別法として、所望の制御信号をすて（：含有するプラス
ずドを、本発明の発現因子の合成の出発物質とＬ″Ｃ（
ｉｉ！用できる。とくに好ましいプラスミド出発物質は
、ｐＧＬ１０１トｆｉ示さｎ　％　Ｇｕａｒｅｎｔｅ＋
Ｌ、ｌｅｔ　ａｌ、Ｉａｕｐｒａに記載さｊｌいる。ｗ
４７図シ：プラスで示すプラスミドは、酵素ＥｃｏＲＩ
　　お工びＥｃｖｕｌｌの各々のための制限部位を含有
し、おしτアンビミリン抵抗のための遺伝子を有する。

また、このプラスミドは大腸菌Ｅ、ｃｏｌｌ　　ｌａｃ
　　オペロンのプロモーター−オペレーター−シャイン
ーダルガルノ配列を含有する。この系はｌａｃ　ＵＶ５
突然変異体からＡｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼを用い
る消化にエリ誘導嘔ｆ１六。ＵＶ５突然変異は、ｚａｃ
プロモーターを分解性（ｃａｔａｂｏｌｉｃ）　　遺伝
子活性化蛋白質（ＣＡＰ　）にエリ分解性抑制に刻して
不感受性とする。プロモーター−オペレーター−シャイ
ンーダルガルノのセグメントのＡ１ｕＩ端を修飾し’Ｃ
ＥｃｏＲＩ　　およびＢａｍＩ（Ｉ　　の結合力を牛む
端を形成し、そしてこのセグメントをプラスミ　　ド　
ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌ　　１ｖａｒ　　、Ｆ、　　＊　
　ｅｔａｌ　　、　　＋Ｇｅｎｅ　　、　　２　　。

７４（１９７７））にＥｃｏＲＩお工びＢａｍＨＩを用
いる消化後挿入し、ζ１（：よってプラスミドｐＧＬ　
１０１を住戚する。

ｐＧＬｌｏｌのようなプラスミド、１六はプラスずドｐ
ＧＬ１０１を構成するために用いる工うなプロモーター
−オペレーター−シャインーダルメＪルノのセグメント
は、有利に修飾して１本発明の発現因子の開始コドン−
制限部位の立体配置を金物する２つにすることができる
。この修飾を達成するために、認識配列の一部分として
開始コドン（例、ＡＴＧ）を含有する制限酵素部位を、
プロモーター−オベレーター−シヤインーダルガルノ配
列を含有するセグメントに加えることができる。別法と
して、認識配列が切断位置からある数の非特異ヌクレオ
チド塩基対により分ＩＩＩさｊている型の酵素のための
認識配列を、利用できる。この配列の非特異部分は、こ
の場合開始コドンを含有するであろうりたとえば、制限
酵素ＨｇａＩは配列ＧＡＣＧＣから５および１０の塩基
対しをいて切断し、（ｎゆえ、この酵素のための制限部
位は非特異性の５〜１０の塩基対のセグメント中に開始
コドンを含有するであろう。制限部位は有利には開始コ
ドンの３つの塩基対の範囲内に存在し、ヤシて好１しく
は、制限部位は、制限エンドヌクレアーゼで開裂し六と
き、開始配列が開始コドンまたは十の補体で終るように
、位置する。

開始コドンを含有する配列は、好都合に、プラスミド中
に挿入するか、あるいは鈍い（ｂｌｕｎｔ）端をもつ合
成リンカ−（１ｉｎｋｅｒ）、すなわち個々のヌクレオ
チド力）ら合成し＊ＤＮＡのセグメント、として線状の
ＤＮＡセグメントへ刃口えることができる。たとえば、
プラスミドｐＧＬ１０１の場合において、プラスミドは
ＰｖｕＩＩを用いてシャインーダルガルノ配列に隣接す
る認識部位において開くことができ、ヤして合成リンカ
−を鈍い端の結合に工り挿入することができる。（注：
　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉエ　は平担々端の切断をつくる。） 好ましい制限酵素の認識配列は、酵素５ｐｈｌのｋめの
ものである。この認識配列は、ＡＴＧＩＪ始コドン全コ
ドンるヘキャヌクレオテドである。この酵素の六めの認
識配列は第８図１＝示さｎ″Ｃおり、（して切断部位は
破線で描かｊている。

この新規カ制限部位−開始コトンの立体配ｆｌは。

いくつ刀１の顕著々利点を提供する。独特の挿入部位が
プラスミド中に導入さｎ、開始プラスミドの存在が保証
さｎ、そしてシャインーダルガルノ配列と開始コドンと
の間の距離を精確（＝制御できる。

シャインーダルガルノ配列と開始コドンとの間の距離の
意味は工く理解さｔ′１々いが、効率２い蛋白質の発現
にとって非常に重要であると考えらする。好１しくは、
この距離は使用するプロ１．モーター−オペレーター系
の天然の距離に近似シ、一般に約θ〜約２２の塩Ｓ対、
好１しぐは約３〜約７の塩基対の範囲である。この距離
は、開始コドンの付加に使用する合成リンカ−の大きさ
の調節に１す、好都合に制御できる。ぴいで、配列の長
さは、質化子る長さの配列を有するプラスミドを含有す
る有機体の挙動に基づいて選択することによって、最適
化することができる。

遺伝子は七のコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）配列の開１
に特定の制限部位をめった（＝もたないので、（ｎを発
現因子中に挿入できるようにする罰に、遺伝子の多少の
修飾は一般に必要である。所望の制限部位が遺伝子の開
始付近お１び遺伝子の終りにまたはおの後に生ずる場合
、制限酵素の消化は東際の遺伝子１りも多少長いかある
いは短刀）いＤＮＡセグメントを回収させる。切除さｆ
また遺伝子は発現因子中へ好都合に挿入できるが１発現
因子が挿入さｎる有機体にＩり発現さｎる蛋白質は、天
然の蛋白質と多少異なるであろう。典型的には、−ｔｎ
は天然（＝産出する蛋白５ｉよりも短η１い刀１あるい
は長いアミノ酸配列をもつであろう。多くの場合におい
て、こ１らの差異は、牛する蛋白質が貢質的に等しい活
性をもつ六め、意味をもｆＣ々いであろう。他力におい
て、蛋白質の構造が臨界的であるとき、切除さｆ１穴遺
伝子はそのもとの構造を１！！ｌ伽する工うに有利に修
飾することができ、あるいは、生ずる蛋白質を修飾して
天然の蛋白質を惨敗することができる。

工り頻繁に、異質遺伝子は発現因子の独特な制限挿入部
位に対応する便利な制限部位を％穴ないであろう。この
場合、広いで遺伝子は、一般（：、遺伝子の初めと終り
付近の便利な位置で切断する１禎′！なは＋７１以上の
制限酵素を用いて切除する。

広いで、遺伝子の端をエキソヌクレアーゼで１そしやく
し戻す（ｃｈｅｗｉｎｇ　ｂａｃｋ）”ことにエリ過剰
のＤＮＡを除去し、刀１つ発現因子の制限挿入部位に対
応する塩基対配列を含有するリンカ−を付加することに
１つχ、修飾する。遺伝子の単離におい″Ｃ１遺伝子の
セグメント自体を除去する場合、七１らのセグメント中
に含有ちｎる遺伝情報（既知の場合）を、必要に応じて
、合成リンカ−を用いて付加し戻すことができる。

所望の制限酵素部位を含有するりンカーを遺伝子の各端
に加えようとする六めには、４！ｒ端を有利には鈍くす
る、すカわち、−重鎖の延長部を除去する。前述の端の
修飾にエリ鈍い端が得ら１ない場合、端は既知の手順（
二より鈍くすることができる（Ｕ１１ｒｌｃｈ＊、ｅｔ
　ａｌ、＋５ｕｐｒａ）　ｏ鈍い端の遺伝子がいつ六ん
得らｔまたならば、前もつ１合成したリンカ−を、たと
えば、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、鈍い端の結合
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）にエリ加えることができる。次い
で２　リンカ−中じ會自さする部位に対応する制限酵素
を用いる修飾遺伝子の消化にエリ、過剰のリンカ−を除
去し、そして結合力をもつ端を有する遺伝子を得る。次
いで、修飾さまた遺伝子は、制御！ａ酵素で開刀）また
転移因子中へ便利に挿入することができる。本発明の発
現酵素中への遺伝子の挿入は、開始コドンをリフォーム
する。

ここく：記載する発現因子は非常に融通性があることは
、明ら刀１である。（ｎらは、広節力種類の臭核遺伝子
を原核１尭体中に導入する六め１：０２用できる。この
よう力儒轡体による異質蛋白質の発現は、効率よいプロ
モーター−オペレーター系の制御下で発揮さｎうる。そ
のうえ、プロモータ−オペレーター−シャイン−タルガ
ルノー開始コドン配列を含狗するプラスミドがいつ大ん
得らｎると、既知の遺伝工学技術を用いて、配列全体位
好都合にクロニングさｎ、他の因子中への挿入のため切
除さ１うる。こうして、特異化転移因子を特殊の場合に
適合するように調製することができる。

ぴの’ｉｌｉ！ｍ例（＝エリ、本発明をさらに費明する
。

実施例Ｉ この実施例に記載する実験の目的は、大腸菌４姐具のｇ
ａｌ　Ｋ　（ガラクトキナーゼ）遺伝子な用オペレータ
ー／プロモーターの制御下に１本発明に従って構成した
発現因子を用いて配置することである。簡単に述べると
、原案（ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）を３つの操作に分割した
： （１）因子ｐＧＬ１０１　　（Ｔａｎｉｇｕｉｃｈｉ　
ｅｔ、　ａｌ、、　ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　Ｕ８Ａ　７７：　
５２３０．１９８０　）を、エンドヌクレアーゼ５ｐｈ
Ｉ　ｇ識部位を暗号化する合成りＮＡ配列が畢リポソー
ム結合部位に対して遠位の独立のＰｖｕｉｌ　部位オペ
レーターにおいて結合されるように、修飾し、これによ
って次の反応図に従って、ＡＴＧコドンを含むノ・イブ
リド翻訳開始部位をつくる（注：新規な因子はｐＧＸ９
５１で表示する）； ｐｖｕＩＩ　開裂部位 −− （２）　ｇａｌ　Ｋ’　（ガラクトキナーゼ）遺伝子を
含有する制限断片は、そのＮ−末端配列が新しく・ＡＴ
Ｇ開始コドンおよび新しい第２コドンに対して補体を発
生する結合された５ｐｈＩＩＪンカーを含み、修正読み
枠中にすべての引き続くもとの配列を保持するよ５Ｋ、
修飾した。次の反応図は、ｇａｌＫ遺伝子の修飾を示す
： もとのＮ−末端コドン （３）次め゛反応図に従つ（２）および（１）の結合は
、完全な翻訳開始部位を再構成し、ガラクトキナーゼの
相内合成を可能とする： 挿入　　　　　　　　＋　　　ＣＴＴＡＧＴＣＴＧＡ　
１娃玉・φ・ＣＴＡＣＧＡＡＴＣＡＧＡＣＴ 部位 央験の′手順 １、因子ｐＧＸ９５１の調製 プラスミドｐＧＬ１０１をＴａｎｉｇｕｉｃｈｉ、　ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　　７７：　５２３０．（１９８０）に記載される
ようＫして調製した。透明化された細胞溶解物（Ｈｅｒ
ｓｈｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７１：　３４５５．
（１９７４Ｊから、２つの連続するＣｓＣＩ勾配中の団
結（ｂａｎｄｉｎｇ　）　Ｋより、精製されたプラスミ
ドＤＮＡを調製した。５０μｔの体積をもち、そして１
５μｍのプラスミドｐＧＬＰｖｕｉＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）および緩衝塩。

最終濃度５０ミリモルのＮａＣ１、６ミリモルのトリス
（Ｔｒｉｓ　）　−Ｈｅｌ　ｐＨ７，４、６ミに％ｋＦ
）、ＭｇＣｌ２゜１０ミリモルのメルカプトエタノール
および１ｍｅ当りに１００μｉのクシ血清アルブミンを
含有する反応混合物を調製した。この緩衝配合物をここ
で”　５０　ミＩＪモルの塩類緩衝液ξ騙ぶ。３７℃で
１時間培養した後、０．８単位の子牛の腸のアルカリ性
ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ　）を加え、そして培養を６５℃で３０分間続けた
。

この混合物を１％のアガ巳−ス中の電気泳動（Ｓｅａ−
Ｐ１ａｑｕｅ＊　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　）
により標準法（５ｅｌｋｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｌｏｌ、＊　１２９：　３８Ｌ　（１９７７
））に従い分解した。電気泳動後、線状プラスミドを負
化エチジウムの着色により可視化し、ゲルから切断し、
そして抽出した（　Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０鼾２６４．　（１９８０）の
方法に従う〕。合成オリゴヌクレオチド（ＧＣＡＴＧＣ
）（’＋）ｙカー勺　をトＧＴＡＣＧ ジエステル法により調製した（　Ｉｔａｋｕｒａ、　ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｊ−、５ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２５０：　４５９２
．　（１９７５））。この合成リンカ−は、５μ？のリ
ンカ−１１ミリモルのニナトリウムＡ　Ｔ　Ｐ　（Ｐ　
−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）、１０単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐ−ｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、　　５９４９モルのト
リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，６，１０ミリモルのＭｇＣｌ２
．５ミリモルのジチオスレイトール、０．１ミリモルの
スパーミジン（Ｓｉｇｍａ　）および０．１ミリモルの
ニナトリウムＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含
有する２０μ沼の反応体積において、キナーゼ処置した
。この反応混合物を３７℃で１時間、次いで６５℃で５
分間培養した。この混合物の４μ形の部分を、次の成分
を含有する２０μにの体積の溶液に加えた：鞄用エンド
ヌクレアーゼで切断したプラスミドｐＧＬ１０１　（前
述のもの）の４μｍ０部分、１ミリモルのニナトリウム
ＡＴＰ、１０ミリモルのジチオスレイトール、１ｍｍ歯
当１００μノのウシ血清アルブミン、３００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ｇｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓ　）　、５０ミリモルの）　ＩＪ　ス−ＭＣＩ　ｐ
Ｈ７，６オヨｔ）Ｃ５ミＩＪ　モルノＭｇｃｉ２゜この
反応混合物を１２℃で１４時間培養した。次いで、この
混合物を使用して大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｎ１００を転換
した。これらの細胞を転換について競合（ｃｏｍｐｅｔ
ｅｎｔ　）させた（　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｒｏｃ。

−噛□→□□−□□□□□□□Ｖ□□１□Ｎａｔ１．　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｅ　Ｕ８Ａ＊　６９：　２１１０
．　（１９７２）の方法による〕。この結合（ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ）混合物の１０μｍを０．２ｍ１Ｊの水冷細胞
懸濁液に加え、氷上で１時間培養した。この混合物を４
２℃で２分間熱攻−し、２４℃で１０分間放置した。３
　ｍ−ｅのＬＢ肉汁（１１当り１０？のトリプトン、５
？の酵母エキス、１０？のＮａＣ１）を加え、そして細
胞を３７℃で１時間培養した。Ｏａｌｔｙｔｇの体積を
、１．５−の寒天、ＬＢ肉汁、および１００μＶ−のア
ンピシリンを含有する板上に配置した。１６時間の培養
後、はぼ２００のコロニーが数えられ、これに対してリ
ンカ−を含有しない対照混合物におけるコロニーは１０
である。これらのコロニーのうちの１０ｖｋ、　　１０
　ｍ１３のＬＢ肉汁中で一夜生育した。溶解物を前述の
ように調製した。単離されたＤＮＡは硅Ｉエンドヌクレ
アーゼにより１回切断され、そしてｐｖ、ｕＩＩｌｃよ
っては切断交れていないことが示され、これに対して出
発プラスミドｐＧＬ１０１はＳ煎Ｉ　　Ｋより切断され
ず、そして川により１回切断された。新らしいプラスミ
ドをｐＧＸ９５１と表示した。５０μ？の精製されたＤ
ＮＡ調製物を、前述のようにシ助−上により゛切断し、
そして子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼで処置した
。

２　調製し１こｇａｌ　Ｋ含有断片への合成リンカ−の
結合 ｇａｌＫ源は、前述のように精製したプラスミドｐＫｏ
　−Ｉ・ＤＮＡであった。このプラスミドおよび制限デ
ータは、ケイス、マツケネー博士（ＭｃｘｅｎｎｅＹｍ
　Ｋ−ｔ　ｅｔ　ａｌ、、　　　　　）から得た。亀１
−影遺伝子は、ａｉｎｄｉＩ−Ｉおよび榎ｆ−１の部位
で結谷された制限断片から得た（第９図）。反応混合物
は、１２５μ石の体積中に、１５０４９モルの塩類”緩
衝液（前述のもの）、５０μ？のｐＫｏ　−１プラスミ
ドＤＮＡおよび７０単位のＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレ
アーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｓ　）を含有した。３７℃で２時間後、ＤＮＡを２体積
のエタノールで沈殿させ、遠心分離により集め、乾燥し
。

そして５５μ石のＨ２Ｏ中に再溶解した。２０μ石の緩
衝塩（５Ｘ濃”　５０　ミＩＪモルの塩類緩衝液″）を
、２５μ！のエンドヌクレアーゼＡｃｃ　Ｉ　（１。

単位、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｍｂ）と−緒
に加えた。培養を３７℃で２．５時間１次いで６５℃で
５分間行った。このＤＮＡを再び前述のように沈殿させ
、そして乾燥した。次いで部分的消化をエンドヌクレア
ーゼＨｉｎｆＩを用いて実施した。これを行った理由は
、ｇａｌＫのＮ−末端における特定のＨｉｎｆＩ部位に
加えて、無傷で残しておかなくてはならない内部の１（
ｉｎｆＩが存在したことにある。２４０ｔｔＪ３の反応
混合物は、５．７単位のＨｉｎｆＩ　（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ）、９．６　ｔｔｆの）ｌ
ｉｎｄＩＩＩ−ＡｃｃＩ−断片ＤＮＡおよび”５０ミリ
モル塩２緩衝液を含有した。培養を３７℃で２．５分間
、次いで６５℃で１５分間実施した。このＤＮＡを５０
μぶのフェノールで抽出し、残留フェノールをエーテル
で除去し、そしてＤＮＡを２体積のエタノールで沈殿さ
せた。このペレットを４体積の７０チエタノールで洗浄
し、真空乾燥した。次いで、この１部分的”混合物をＤ
ＮＡポリメラーゼにより１充填（ｆｉｌ１６ｄｉｎ）″
して粘着性制限端をリンカ−結合用の鈍い端Ｋｆえた。

４０μ看の反応混合物は、前述の３．２　ｔｔｆｆの１
ｉｎｆ　−Ｉ″部分的′″ＤＮＡ、４μ沼のポリメラー
ゼ緩衝液（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｓｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）、１
０ミリモルのＭｇＣ＋　２．４ｊ４ｉ位のＤＮＡポリメ
ラーゼ′″Ｋｌｅｎｏｗ″（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ　−Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）および０．２ミリモルのｄＡＴＰ　。

ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよび（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　）を含有し１こ。この混合
物を２３℃で２０分間、次いで６５℃で１５分間培養し
た。合成オリゴヌクレオチド（Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＡ　Ｔ　
Ｇ　ＣＴ　Ｔ　）の結合を、前ＴＴＣＧＴＡＣＧＡＡ 述のリンカ−のキナーゼ処置に従い実施した。４０μｐ
の反応混合物は上の（１）のよりな１５０４９モルの塩
類”緩衝液、３μ２のＤＮＡｆｔｌｊ分的消化物２μ９
のキナーゼ処置したリンカ−および１５００単位のＴ４
　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ　）を含有した。これを２０℃で２０時間１次い
で６５℃で１５分間培養した。この冷却した混合物［２
０単位の町曳１エンドヌクレアーゼを加え、そして培養
を３７℃で１時間続けた。この混合物を２０μ２のフェ
ノールで抽出し、残留フェノールをエーテルで除去し、
そして２体積のエタノールを用いてｐＮＡを沈殿させた
。７０チのエタノールで洗浄し、そして真空乾燥した後
、　ＤＮＡを、２．５μｍのプラスミドｐＧＸ９５１　
（前述のようＫ　ｓｐｈ　Ｉで切断し、そしてホスファ
ターゼ処置したもの）、１０００単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）お
よび０．５ミリモルのＡＴＰを含有する２０μ！のりガ
ーゼ緩衝液（前述のもの）中に再溶解した。この混合物
ｖｋ２０℃で１６時間、次いで６５℃で１５分間培養し
た。冷却したとき、１０単位のエンドヌクレアーゼ眼Ｉ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　）
を加えて、叶鱒曳部位とＨｉｎｆＩ部位との間に配列を
含有する分子を［４ｉ化した（第９図）。培養を３７℃
で１時間行った。６５℃で１５分後、冷却した混合物を
用いて、前述のように、２００μ！の大腸薗Δチーリ１
株Ｎ　１００　ｇａｌ　Ｋを転換し、競合性とし、そし
て転換し１こ。この細胞を１％のガラクトースと１００
μ’／／ｍＡのアンビミリンとを含有するマコンキ−（
Ｍｃ（：：ｏｎｋｅｙ）　５１！天上に置いた。１６時
間の培養後、コロ＝−を観察した・ここでｇａｌ　Ｋ遺
伝子を発現できる赤色コロニーを、前述のように、精製
し、そしてＤＮＡＩｍ製物をつくった。Ｄ　？ｊＡを制
限分析して１期待したパターンを評価した。ｇａｌＫ領
域中のプラスミドｐＫｏ　−Ｉ　の制限地図を、第９図
に示す。第９図における数字は、塩基対中の距離を表わ
す。

自己号：Ｅ−エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩ　、　Ｈ＝
ＨｉｎｄｌｌＬ　　ＨＦ＝ＨｉｎｆＩ　Ｉ　Ａ＝ＡＣＣ
Ｌ　ＳｍＳｍａ　ＩＯ″ｇａＩＫ″　　で表示する縁は
、ｇａｌ　Ｋ　（ガラクトキナーゼ）遺伝子の位置を示
す。この手順によって調製したガラクトキナーゼ−生成
法は、ｐＧＸ９５１で表示し、そしてアメリカン・タイ
プ・カルチャ−コレクション（Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎｓ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ　）に、ＡＴＣＣＮｏ、　３１９１７　　として保
管されている。

【図面の簡単な説明】

ＩＩＬ１図は、特定蛋白質の合成に関連する制御信号の
グラフである。 第２図は、ボニタブル・プロモーターのグラフである。 ｗＪｓ図は、プラスミドのグラフである。 第４図を１、発現因子のグラフである。 第５図は、プラスミドを制限酵素Ｙで開き、修飾遺伝子
を挿入して、所望のプラスミドを生成する工程を示す。 第６図は、本発明の発現因子を示す。 ｗ、７図は１本発明の発現因子の合成において出発物質
として用いる好ましいプラスミドを示す。 第８図は、ｉ！識配列のグラフである。 第９図は、制限断片を示すグラフである。 Ｐ・・・ブロモ−゛ター領域、Ｏ・・・オペレータ領域
。 Ｓ−Ｄ・・・シャインーダルガルノ配列、Ａ　Ｔ　Ｇ　
＝−開始コドン、Ｘ、Ｙ・・・制限酵素、制限部位、２
・・・制限エンドヌクレアーゼ、　ｐＧＬｌｏｌ・・・
プラスミド出発物質、ＥｃｏＲＩ−酵素、ＥｃｖｕＩＩ
　−酵素、ＣＶ５・・・突然変異体、ｇａｌＫ・・・ガ
ラクトキナーゼ遺伝子、Ｅ・・・エンドヌクレアーゼＥ
Ｃ０ＲＩ　、Ｈ・・・ＨｉｎｄＩＩＩ　％ＨＦ　−Ｈｉ
ｎｆＩ、Ａ　・・ＡｃｃＩ　％Ｓ　”−ＳｍＡｌ。 特Ｆｌｆ出１ａ人シエネツクス・コーポレーション図面
の浄書（内容（こ変更なし） ＦＩＧ＋ ＩＧ２ ＦＩＧ　６　　　　　　　　　　　　ＦＩＧ　７ＦＩＧ
　Ｂ ＦＩＧ　９ １ｌｌＩＫ 第１頁の続き ０発　明　者　バーマン・チュー アメリカ合衆国２０７６０メリーラ ンド州ゲイサーズバーグ・リッ ジライン・ドライブ１０２５２ 手続補正帯（自発） 昭和５７Ｔ−１０，ｉｌ目 特許庁長官殿 ２　発明の名称　発現因子、それを含有するエシェリヒ
ア属細菌および実質的に純粋なりＮＡ上セグメント、　
補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 住　　所 氏　名（名称）　ジエネツクス・コーポレーション４、
代理人 １１　　所　〒１５１東京都渋谷区代々木２ｒ目１１番
１２号木村ビル７階別紙の通り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ、原核宿主細胞中の横裂を可能とする信号を有し、そ
   してさらに （ａ）原核宿主細胞Ｎ：工つｔｇｍさすることができる
   プロモーター、オペレータおよび翻訳開始の配夕り、 （ｂ）前記翻訳開始配列内のシャインーダｈガルノ配列
   お１び開始コドン、および （ｃ）前記開始コドンに近接して開裂し１、前記翻訳開
   始配列内（−１前記開始コドン、または七の補体を残す
   、制限エンドヌクレアーゼのための認識配列、 を含む、ＤＮＡの閉じたループルらなることを特徴とす
   る、遺伝子を原核有機体中へ導入するための発現因子。 ２、前記制限エンドヌクレアーゼはｒＭ４始コドンまた
   は（の補体の３つの塩基対の範囲内で開裂する、特許請
   求の範囲＃１１１１項記載現因子。 ３、制限エンドヌクレアーゼは、翻訳開始配列が開始コ
   ドンまたは七の補体で終るＩうな方法で、開裂する特許
   Ｉ′ｌＩ求の範囲４１項記載の発現因子。 ４、開始コドンは前記制限エンドヌグレアーゼのための
   認識配列内に含有さｎ″Ｃいる特許請求の範ｖ！Ａ第１
   項記載の発現因子。 ５、前記開始コドンは制限エンドヌクレアーゼ８ｐｈＩ
   の大めのｇ識配列内に含有さｆ１″Ｃいる特許請求の範
   囲第１項記載の発現因子。 ６．１ｖｌ記制限エンドヌクレアーゼの大めの認識配列
   は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位力１ら複数の非特異
   ヌクレオチド塩基対にエリ分離さｊている特許請求の範
   囲ｗ４１．２または３項記載の発現因子０ ７、制限エンドヌクレアーゼはＨｇａＩである特許請求
   の範囲第６項記載の発現因子。 ８、開始コドンはシャインーダルガルノ配列からＯ〜約
   ２２の塩基対（：より分離さｆ′Ｉ″Ｃいる特許請求の
   １囲第１．２，３．４’ｆｆｉ六ｔ′ｉ５項記載の発現
   因子・ ９開始コドンはシャインーダルガルノ配列η１ら約３〜
   １１７の塩基対により分離さｎている特許請求の範囲第
   ８頂記載の発現因子。 １０、ｉｉｌ記遺伝子は、原核遺伝子、真核遺伝イ、１
   六は特異ポリペプチドの遺伝情報を指定する合成りＮＡ
   配列である特許請求の範囲第１項記載の発現因子。 １１、原核宿主細胞は大腸”菌Ｅｓ　ｃ　ｈ　ｅ−ｒ、
   ｉ　（坂１−今刻月　であり、おしてプロモーター、オ
   ペレーターおよびシャインーダルガルノの配列は大腸菌
   Ｅ、ｃｍ目。 のＩ−ａｃ−１７’ｊ：はｔｒｐオペロンから誘導さす
   る特許請求の範囲第１．２，３．４または５項記載の発
   現因子。 う誘導さｎ、そしてプロモーター、オペレーターお工び
   シャインーダルガルノの配列はバクテリオファージから
   誘導さｎる特許請求の範囲ｍ１．２゜３．４または５項
   記載の発現因子。 １３、％許ｔｌＩ！求の範囲第１１項記載の発現因子を
   含有するエシェリヒアＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　属の細
   菌。 １４特許請求の範囲第Ｉ２項記載の発現因子を含有する
   エシェリヒアＥ＠ｃｈａｒｉｃｈｌａ　属の細菌。 ｌＳ、（ａ）原核宿主有′Ｗｓ体に工って認識さするこ
   とができるプロモーター、オペレーターおよび翻訳開始
   配列。 （ｂ）前記翻訳開始配列内のシャインーダルガルノ配列
   および開始コドン：お工び （ｃ）前記翻訳開始配列内で、開＃３コドン１六はその
   補体に近接して開裂する、制限エンドヌクレアーゼのた
   めの認識配列、 から本質的に成ることを特徴とする、実質的に純粋々Ｄ
   ＮＡセグメント。 １６、前記制限エンドヌクレアーゼは開始コドンまたは
   七の補体の３つの塩基対の範囲内で開裂する、特許請求
   の範囲第１５項記載のＤＮＡセグメント。 １７、制限エンドヌグレアーゼは、翻訳開始配列が開始
   コドンまたは（の補体で終る工う々方法で、開裂する特
   許請求の範囲第１５項記載のＤＮＡセグメント。 １８開始コドンは前記制限エンドヌクレアーゼのための
   認識配列内に含有さｆ′ｌ″Ｃいる特許請求の範囲第１
   ５項記載のＤＮＡセグメント。 １９、前記開始コドンは制限エンドヌグレアーゼ５ｐｈ
   ｌ　のための認識配列内に含有さｎ″′Ｃいる特許請求
   の範囲ｗＪ１５項記戦のＤＮＡセグメント。 ２０Ｊ　ｉｅ　制限エンドヌクレアーゼのための認識配
   列は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位から検数の非特異
   ヌクレオチド塩基対にエリ分離さｎている％許稍求の範
   囲第１５．１６’！たは１７頓記軟のＤＮＡセグメント
   。 ２１、制限エンドヌクレアーゼはＨｇａＩ　である特許
   請求の範囲第２０項記載のＤＮＡセグメント。 ２２開始コドンはンヤインーダルガルノ配列からＯ〜約
   ２２の塩層対にエリ分ＩＩＩさｆ′ｌ″Ｃいる特許請求
   の範囲第１５．１６，１７．１８’！たは１９項鱈己載
   のＤＮＡセグメント。　。 ２３開始コドンはシャインーダルガｈ）配列力１ら約３
   〜約７の塩基対しエリ分離さｎ″Ｃいる特許請求の範囲
   ｌＩ４２２項記歇のＤＮＡセグメント。 ２４、プロモーター、オペレーターおよびシャインーダ
   ルガｈノの配列は大ｗＪ菌Ｅ、ｃｏ１１．のｌａｃ　’
   ！大は一す」−オペロンから誘導さｎる特許ｔｐｔ’ｔ
   の範囲第１５．１６，１７．１８’！大は１９項記載の
   ＤＮＡ−にグメント。 ２５、プロモーター、オペレーターお工びシャインーグ
   Ａ　ｔ！／Ｌ、ノの配列はバクテリオファージ刀１ら誘
   導さする特許ｎ求（７）範ｉ！！１Ｍ１５　、１６　、
   １７，１８また拡１９項記載のＤＮＡセグメント。