DD210070A5

DD210070A5 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids

Info

Publication number: DD210070A5
Application number: DD80244147A
Authority: DD
Inventors: David V Goeddel; Herbert L Heyneker
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-07-04
Publication date: 1984-05-30
Also published as: IT1131393B; ATE82324T1; NL930114I2; AR244341A1; JPH0612996B2; ES8105386A1; EP0022242A3; US4604359A; US4658021A; NO167674C; JP2622479B2; FR2518572B1; DK97381A; SG56984G; AU533697B2; JPH02478A; NO167673C; AU5949880A; US5795745A; CA1202256A

Abstract

Die Erfindung betrifft die mikrobielle Expression von quasi-synthetischen Genen ueber die Herstellung eines sich replizierenden klonierenden Vektors. Die Erfindung stellt ein genetisches Verfahren zur Herstellung von medizinisch einsetzbarem menschlichem Wachstumshormon dar. Erfindungsaufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Polypeptids. Es werden Verfahren und Mittel fuer die Konstruktion und mikrobielle Expression quasi-synthetischer Gene beschrieben, die aus der Kombination von organischer Synthese und enzymatischer, reverser Transkription von Boten-RNA-Sequenzen hervorgehen, die vom Standpunkt des gewuenschten Proteinprodukts unvollstaendig sind. Bevorzugten Produkten der Expression fehlen bioinaktivierende Fuehrersequenzen, die in eukaryotischen Expressionsprodukten ueblich sind, jedoch problematisch in bezug auf das mikrobielle Schneiden, das erst das bioaktive Material liefert. Eine bevorzugte Ausfuehrungsform ist naeher erlaeutert, bei der ein Gen, das fuer menschliches Wachstumshormon codiert(welches beispielsweise fuer die Behandlung von hypophysaerem Zwergenwuchs benoetigt wird), konstruiert und exprimiert wird.

Description

9 L L 1/7 S Berlin, den 11,4.1983

Ausscheidung II aus AP G 07 G/222 413

Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft die mikrobielle Expression von quaai-synthetischen Genen über die Herstellung eines sich replizierenden klonierenden "Vektors· Es gelingt dadurch die Bereitstellung eines menschlichen Wachstumshormons, das in der Medizin bei der Behandlung von hypophysärem. Zwergenwuchs eingesetzt werden kann*

Bekannte technische Losungen

Die DHA oder DNS (Desoxyribonucleinsäure) aus der Gene bestehen, enthält "sowohl Protein codierende oder "Struktur"-Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche (sites) für die R2T3-Polymerase-3indung, Information für r.ibosomale Bindestellen usw· bereitstellen. Codiertes Protein wird von der korrespondierenden 'DHA innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exprimiert, wobei:

1. das Enzym R2iA-?olymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promotor" genannt) aktiviert wird und sich'an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Beton-(Messenger)-Ribonucleinsäure (mHUA) transkribiert wird, bis. die Transkription bei einem oder mehreren "3top"-Codons beendet wird;

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2, die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird),

In Obereinstimmung mit dem genetischen Code spezifiziert da DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A_ä T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-{"Duplex")-0NA auf, dessen bleibender oder "komplementärer¹; Strang aus Nucleotiden ("Basen") gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Basen im codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist komplementär zu T, und C ist komplementär zu G, Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich·diskutiert in Benjamin Levvin, Gene Expression, 1, 2 (1974) und 3 (1977) Dohn Wiley und Sons, N. Y, Diese und andere Veröffentlichungen, die hier angesprochen sind, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.

Schneiden und Verbinden von DNA

Es steht eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfügung, nach denen aneinandergrenzende Enden separater DNA-F ragtnen te auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen

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aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4-DNA-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbruckenbindungen die jeweiligen Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden

Solche Einzelstränge, als kohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen Endes mit einem Enzym wie Jl -Exonuclease abgeknabbert wird, Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonucleasen (im folgenden "Restriktionsenzyrae"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleotidsequenzen, die eine. Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle"), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt

Siehe z, B, R. D. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976)· Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangsequenzen an den Enden eines an sich doppelst rängigen Fragments entstehen. Als komplementäre .Sequenzen können die überstehenden oder "kohäsiven" Enden durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül» Durch die Verwendung von Ligase, die die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung,

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Restriktionsenzyine, die an geschnittener doppelsträngiger DNA "stampfe" Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4-I>igase*

Klonierende Vektoren und rekombinante DHA

Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "klonierender Vektor" genannt: ein nichtchomosomsles Stück einer doppelsträngigen DHA, dasein intaktes Replikon enthält, so daß der Vektor repliziert v/erden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht wird» Sin auf diese Weise transformierter Organismus wird "Transformante" genannte Derzeit sind die klonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DIiA, genannt "Piasaide"»

Die Sortschritts in. der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" klonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DUA enthält, bestehen« In besonderen Beispielen kann die Hekombinante "heterologe" DNA einschließen, wobei damit eine DUA gemeint"ist, die für Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, weicher empfindlich ist für die Transformation durch den rekombinanten Vektor,,- Ss werden somit Plasmide mit Restriktionaenzymen geschnitten, um lineare DUA, die verbindbare Enden hat, zur Verfügung su stellen« Diese werden an ein esogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen,.das ein intaktes Replikon und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benutzt werden kann,

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um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einem Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist, große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für'welches das Gen codiert. Ober die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium Series 10; Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N. Y. (1977).

Expression von rekombinanter DNA

Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-Pr'omoters in einem E, coli Bakterium exprimiert (K. Itakura et al., Science,.198, 1055 (1977)). Kürzlich gelang auf dfese gleiche Weise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D. V. Goeddel et al,, Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA, 76, 106 (1979)). In jedem Fall wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall wurden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. h. als Tandem mit einem

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anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden veröffentlichten englischen Patentschriften des Anmelders der vorliegenden Anmeldung beschrieben: GB-PS 2.007 675 A, 2 007 670 A, 2 007 676 A und 2 008 123 A.

Wahrend sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z. B. Wachstumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da dia Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser, für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.

In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cONA für die komplette gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Koraaroff et al, eine cONA für Ratten-Proinsulin erhalten,

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ί³"?

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der die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat'l Acad. Sei., USA, 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert v/erden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryotischen Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakterisnzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die Le_ader-Sequenz der Vorläuferform enthalten als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff _t a. a. O, (Ratten-Proinsulin); P. H. Seeburg et. al., Nature* 275, 795 (1978) (Rattenvvachstumshormon)),

Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z. 8, Villa-Komaroff, a. a. O, (Penicillinsse-Proinsulin); Seeburg, a. a. O, ,(ß-Lactamase-Wachstumshormon) *

Menschliches Wachstumshormon

Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist mit einem Molekulargewicht von etwa 21,500 mehr als dreimal so groß wie Insulin. Bis zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen v/erden - der

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Hypophyse aus menschlichen Leichen» Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Punktionsstorung der Hypophyse verursachtem hypophysärem Zwergenwuchs begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht' mehr als 50 % der Betroffenen damit behandelt werden können,

Ziel der Erfindung

Zusammengefaßt besteht daher eine Hotwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in großen Mengen herzustellen« Diese Notwendigkeit ist besonders akut in dem Pail, wenn Polypeptide zu groß' sind, um organische Synthese anzulassen oder, aus diesem Grund, mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen, Die Expression von Säugetierhormonen von mRlA-Tranakripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten, die des synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits gedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Koajagaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können«

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Eolypeptids zu entwickeln mit Hilfe eines sich replizierenden klonierenden Vektors_o

Erfindungsgemäß bereitgestellt wird somit ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon mit Hilfe eines sich replizierenden klonierenden Vektors, der in einem mikro-

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biellen Organismus zur Expression von menschlichem Wachstumshormon fähig ist, wobei ein für menschliches Wachstumshormon codierendes Gen in einen klonierenden Vektor inseriert und unter die Kontrolle sines Expressionspromotora gestellt ist· Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß

- ein erstes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, wobei das besagte fragment einen Seil der codierenden Sequenz für das genannte menschliche Wachstumshormon enthält und das genannte erste Fragment für weniger als alle -Aminosäuren der .Aminosäuresequenz des genannten Wachstumshormons codiert,

- ein zweites Genfragment zur Verfügung gestellt wird, das für den Rest der Aminosäuresequenz', des menschlichen Wachstumshormons codiert, wobei das genannte zweite Genfragment für mindestens den .Ämino-Snde-Be stand teil des menschlichen Wachstumshormons codiert,

- die genannten Genfragmente in einem sich replizierenden klonierenden Vektor in richtiger Lesephase relativ zueinander und unter die Kontrolle eines Sxpressionspromotors angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der .Aminosäuresequenz des genannten menschlichen Wachstumshormons ohne anhängende Fremäprotein fähig ist,

- und daJ3 die Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons exprimiert wird·

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Die Fragmente werden so ausgebildet, daß sie als wesentlichen Bestandteil cDHA oder eine Replikation davon enthalten·

Als klonierenden Vektor wird ein Plasmid selektiert und das Plasmid gegenüber mindestens einem Antibiotikumresistent gemacht wird* Erfindungagemaß wird ein Plasmid gebildet ,. dem der tet-Promotor fehlt und das dennoch gegenüber Tetracyclin resistent ist·

Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekannzeichnet, daß das für das menschlichs Wachstumshormon codierende Gen unter die Kontrolle eines lae-Promotors in Tandem-Struktur gestellt wird und daß der sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid pHGH 107 ist»

Der sich replizierende klonierende Vektor kann, auch das Plasmid pHGH 107-1 sein_e

Das Verfahren zum Herstellen von menschlichem Wachstumshormon ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur des mikrobiellen Organismus in einem Permentationsgefäß, das mit Belüftungs- und Schutteleinrichtungen ausgestattet ist, in einer wäßrigen, Nähissubstrate ent-

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haltenden Fermentationsbrühe behandelt wird, daß die Kultur unter Belüften und Schütteln gezüchtet wird, während zusätzliche Nährsubstrate zugeführt werden, die erforderlich sind, um ein starkes Wachstum aufrecht zu erhalten, daß die dabei erhaltene Zellmasse von der Fermentationsbrühe abgetrennt wird, daß die Zellen lysiert werden um ihren Inhalt freizulegen, daß die Zellbruchstücke von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt werden und daß das in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Polypeptid isoliert und gereinigt wird.

Erfindungsgemäß wird eine Transformante von S. coli mit einer bakteriellen Selektionseigen3chaft ausgewählt und ein Selektionsdruck ausgeübt, um das konkurrierende Wachstum von E« coli-Wildtyp zu behindern*

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, indem'ein sich replizierender klonierender "Vektor konstruiert wird, ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß Funktionsgene für .Ampicillin- 'und letraeyclin-Resistena enthält, sowie einen lac-Promotor in Tandem-Struktur, der zwischen den genannten Genen liegt, und so orientiert ist, daß die Expression in Richtung des Gens für 'Tetracyclin Resistenz in Gang setzt, und daß ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungsstellen enthalten

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sind, die stromabwärts vom genannten Promotorsystem liegen, wobei die genannten Restriktionserkennungsstellen jeweils cohäsive and stampfe Enden nach dsm Schneiden liefern., wodurch richtiges Einfügen von heterologer DNA zwischen den genannten Brkennungsstelien ermöglicht wird, so daS diese unter die Kontrolle des genannten Promotor-Systems gelangt, und die durch die DHA codierte Aminosäuresequenz exprimiert wird©

Der sich replizierende klonierende Vektor ist erfindungsgemäß das Plaamid pGH 6,

Die vorliegend« Erfindung stellt Methoden und Mittel sur Expression quasi-synthetischer Gene zur Verfügung, wobei durch reverse Transkription ein wesentlicher Bestandteil, vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequenz, zur Verfugung gestellt wird, ohne den arbeitsaufwendigen Umweg der

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vollständigen synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Restes der codierenden Sequenz ein komplettes Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden Leader-Sequenzen oder anderem Fremdprot'ein« Alternativ dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, daß das Schneiden des Freradproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist, wodurch die bioaktive Form erhalten wird. Die Erfindung stellt folglich Methoden und Mittel für die mikrobielle Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige Extraktion aus Gewebe hergestellt werden konnten, und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren. In ihrer am meisten bevorzugten Form stellt die Erfindung die erste Möglichkeit dar, mit der ein medizinisch signifikantes Polypeptidhormon (menschliches Wachstumshormon) bakteriell experimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kompartimentierung der bioaktiven Form mit Fremdprotein bis zum extrazellulären Schneiden vermieden werden» Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen reichen Vorrat des Hormons für de Behandlung von Zwergenwuchs, zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität des Hormons lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschließlich diffusem Magenbluten, Pseudoarthrose, der Therapie von Brandwunden, Wundheilung Dystrophie und der Heilung von Knochenbrüchen.

Der generelle Weg der Erfindung ist ds Kombination mehrerer Genfragmente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei

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diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet ist, welches aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A. Ullrich et al«₄ Science, 196, 1313 (1977), Die cONA stellt einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons, für das gewünschte Produkt zur Verfugung, während restliche Teile des Gens synthetisch erhalten werden» Die synthetischen und die mRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Korabinationsschritt zur Verfugung zu stellen»

Eine. Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, z, B, zwischen synthetischer

und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxaaa und Gilbert/.Prop. Nat'l«, Acad. Sei,, USA, 74, 560 (1977). Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens eine Carboxylendgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso v/ie anders, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-Stopsignalen, benachbart zura Carboxylende liegende Codons für nichttranslaterte raRNA. Die Anwesenheit von DNA für nichttranslatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z, B₉ durch Schneiden rait Restriktionsenzymen entfernt werden können, ura zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für'das angestrebte Produkt benötigt wird. In besonderen Fällen werden die cDNA-Codons für die vollständige gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärts

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vom Aminoende des angestrebten Produkts, Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise beim Transport zur Zellwand beteiligt ist. Während der Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt. so daß das Hormon in seiner freien bioaktiven Form in den periplasmatischen Raum eindringt. Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mRNA-Transkript zu entfernen. Im Verlauf dieses Entfernungsvorgangs geht auch das Translations-Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations-Startsignal zur Verfügung, wobei der Vektor, in dem,, sich das Hybridgen letztlich entwickeln wird,, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist.

Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshormon-cONA v/ird begünstigt durch das Zurverf ügungstellen einer Rest riktionserkennungsstelle innerhalb des das Wachstumshormon codierenden Teils des Gens. Die Erfindung kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungsstelle, die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptide liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht von mRNA abgeleitet ist. In jeder cDNA, die

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für das gewünschte Polypeptid and eine Leader- oder andere bioinaktivierende Sequenz; codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteren und denen dea reifen Polypeptide an der Aminosäuresequenz des reifen Polypeptids zeigen. Man kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren, und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen Wenn daher beispielsweise eine cDNA folgender Struktur gegeben ist:

c .·_{etc β}

AATTCGGGACTAGCA ο_Οβ

wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann- eine Reaktionsbedingung^für eine Exonuclease-Yerdauung gewählt werden, um die oberen Sequenzen "a" und "b" zu entfernen, wonach eine S1-Nuclease-Verdauung automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d" eliminiert» Alternativ dazu und präziser kann man DHA-PoIymerase-Verdauung in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphatsn ("d(A,T,CjG)TP") einsetzen« Im obengenannten Beispiel wird, daher MA-Pölymerase in Gegenwart von dGTP die Sequenz "c¹-¹ entfernen (und bei "G¹¹ anhalten), daraufhin wird Si-Huclea.se "a" verdauen; DNA-Polymer as e in Gegenwart von dTTP wird "d""entfernen (und bei "T" anhalten), und 31-Uuclease wird dann "d" herausschneiden üsw« Siehe allgemein A, Kornberg, DSA-Syntheais, S. 87 bis 88, W₀ H₀ Preenian und Co,, San Francisco (1974)*

4 4 14 7 5. -17 - - ²⁰-⁸·¹⁹⁸²

Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktionserkennungsstelle an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" (mismatch) Reparatursynthesetechnik von A, Razin et al,, Proc. Nat'l, Acad. Sci₄, USA, 75, 4268 (1973). Bei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte Restriktionsenzyrae erkannt, das sind AGCT (AIuI), CCGG (HpaII), CGCG (Thal), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (Haelll) und TCGA (Taql)-, Wenn die cDNA-Sequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle in nur einer einzigen Base unterscheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete substituierte Base enthält und damit die gewünschte Restriktionserkennungsstelle, Durch einen Schnitt wird die DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptids benötigt werden«

11.4.1983 61 114/12

Zum Beispiel

Leader·

Codon für gewünschtes Produkt"

-4

GAGG

"mismat ch"Reparat ar synthese

CGGG

Synthese "a"

Codons für gewünschtes Produkt

c DH A

quasisynthetische DUA

Es ist natürlich offensichtlich, daß längere Restriktionserkennungssteilen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Reparatur 4-Basenpaare-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, wo lediglich zwei Basen gemeinsam mit der Brkennungsstelle am gewünschten Punkt erscheinen

Es werden sich Anwendungsmöglichkeiten zeigen, bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge freistes, aber speziell hergestelltes Protein zu exprimieren«

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Vier derartige Anwendungen v/erden durch Beispiele erwähnt werden, Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zusätzlichen Protein übertragen wird, so daß eine Vaccine produziert wird (siehe allgemein GB-PS 2 008 123 A), Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut ist, daß extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Form zu erhalten« Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. Schließlich kann eine Fremdverbindung verwendet werden, .die so gebaut ist, daß ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mikrobiellen Wirts, Zumindest in den letzten . drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird,· ura die codierende Sequenz des mRNA-Transkripts zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut haben für Aminosäuresequenzen, die spezifisch geschnitten werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung. Beispielsweise schneidet Trypsin oder Chymotrysin bei Arg-Arg oder Lys-Lys usw. (siehe GB-PS 2 008 123 A),

Aus dea bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Er-. findung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigsten Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen:

/ 1

Lx ί

1 4 / · Ö - 20 -

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- Es wird ein mRNA-Transkript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten^Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das jedoch, falls es allein exprimiert wird, ein₄ vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;

- Protein codierende Codons für andere als solche Aminosäuren, die im angestrebten Produkt enthalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt;

- organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz codieren; und

- das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragraent(e) werden zusammengefügt und in einen einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird.

Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations-Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin). Man kann erwarten, daß diese Aminosäure intrazellulär ent-, fernt wird oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt«

Obwohl die Erfindung ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschließlich Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfugung

4 14 7 6 si ²⁰·⁸·¹⁹⁸²

stellt, ist die Erfindung im besonderen auf die Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung gerichtet, z. 8, Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide, Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotropin, ß-Endorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren* menschliches Albumin usw,

Ausführunqsbeispiel

Die Erfindung "wird nachstehend durch Beispiele näher erläutert. In der dazugehörigen Zeichnung, die sich auf bevorzugte Beispiele bezieht, zeigen:

Fig. 1: das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Clonen verwendet werden. Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;

Fig. 2: die Verbindungen der "U"- und "L^u-Oligonucleotide für die Bildung des Genfragments aus Fig, I und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendera Vektor;

Fig. 3: die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines Haelll-Restriktionsenzyrafragments eines HypophysenmRNA-Transkript3 mit den numerierten Aminosäuren

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^? I <H / Q 22 -

des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren; Schlüssel restriktionserkennungssteilen sind bezeichnet, ebenso DNA (auf "Stop" folgende) für nichttranslatierte mRNA;

Fig. 4: die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DNA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;

Fig. 5: die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnend mit den Plasmiden der Fig. und 3,

Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert, beschrieben, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codert, konstruiert, geclont und mikrobiell exprimiert wird,

Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors für menschliches Wachstumshormon

1. Clonieren des Haelll-Fragments des mRNA-Transkripts (Fig. 3 und 4)

Polyadenylierte mRNA für menschliches Wachstumshormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzieren-

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den Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A. Ullrich et al«, Science, 196, 1313 (1977). 1,5 pg von Doppelstrang-("ds")-cDNA werden prägniert aus 5 pg dieser RNA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al., O. Biol. Chem., 253, 2483 (1978), mit der Ausnahme, daß die RNA-Polymerase "Klenow-Fragment", (H. Klenow, Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA, 65, 168 (1970)) für die DNA-Polyraerase I in der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktionsmuster von HGH ist derartig, daß Haelll-Restriktionserkennungsstellen in der 3* nichtcodierenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fig. 3. Eine Behandlung der ds-HGH-cDNA mit Haelll gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren ("bp"), die für die Aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren. 90 ng der cDNA werden mit HasIII behandelt, in einem 8%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die R_egion bei 550 bp eluieri. Man erhält annähernd 1 ng cDNA,

pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al,, Gene 2 (1977) 95 bis 113, wird als clonierender Vektor für die cDNA ausgewählt, pBR322 ist vollständig charakterisiert (D. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium, 43, 70 1978)), und ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) replizierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracylin-Resistenz aufweist, die auf den Einschluß

R R

der korrespondierenden Gene ("Ap " bzw. "Tc " in Fig_e 4) zurückzuführen sind., wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyije Pstl, EcoRI und Hindlll enthält, wie in der Figur gezeigt.

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Die Schneideprodukte von Haelll und Pstl haben stumpfe Enden, Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang A, C, Y₄ et al., Nature, 275, 617 (1978) angewendet werden, um die stumpfendigen Produkte der Pstl-Schnitte von pBR322 mit der Haelll-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden, so daß das cDNA-Fragment in die Pstl-Erkennungsstelle von p8R322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die Haelll-Restriktionserkennungsstellen (GG^CC) auf der cDNA und die Pstl-Restriktionserkennungsstellen (CTGCA^G) an jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden»

Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase (TdT) veraendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3'-Ende anzufügen, wie bereits früher beschrieben, Chang A. C, Y₄, a» a, O, Auf ähnliche Weise werden an das 3'-Ende von 60 ng Pstl-behandeltem p8R322 etwa 10 dG-Reste angehängt, Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-ergänztsn Vektor-DNA wird in 130 ^uI von 10 raM Tris-HCl (pH a 7,5), 100 mM NaCl und 0,25 raM EDTA durchgeführt, Die Mischung wird auf 70 ⁰C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37 ⁰C abgekühlt und schließlich auf 20 °C (6 Stunden) abgekühlt, ehe sie zum Transformieren von E, coli χ 1776 verwendet wird. Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der Methode von Maxarn und Gilbert, Proc, Nat'l, Acad« Sei,, USA, 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasraids in χ 1776, .stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein, wie in. Fig, 3 gezeigt.

Der Stamm E. coli K-12 χ 1775 hat den Genotyp F"tonA53, Q3pD8_t minAl, supE42, A 4Q(gal-uvrB), _tx~_t miη82, rfb-2,

7 δ

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nalA25, oms-2, thyA57*« metC65, oma-1, Δ29(bioH-asd), cycB2, cyoA1, hsdR2« x1776 wurde vom National Institutes of Health als ein £K2-Wirts-Vektor-System bescheinigt.

χ177δ hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolancolonie)-säure synthetisieren«, Die Zelle unterliegt daher dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in. denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend. Hährsubstrat vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder Thymidin-bedürftig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod mit Abbau der DNA, wenn ihvmin und Thymidin in der Umgebung fehlen, jedoch genügend Hährsubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten» si776 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, de h_o unfähig, eine Passage durch den Intestinaltrakt von Hatten zu überleben« xi77S ist hochgradig empfindlich gegen Detergenzien, Antibiotika, Arzneimittel und Chemikalien. χ177β kann weder die Dunkelreparatur noch die Photo-Reaktivierung -s-on UY-induzierten Schaden durchführen und ist daher um mehrere Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als der Wildtypstamm von S₀ coli, xi776 ist resistent gegen viele transduzierende Phagen und läßt bei der Konjugation nur mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden zu, was auf die Any/esenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist. x177o ist resistent gegen Halidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim» Diese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das überprüfen des Stamms zu ermög-

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lichen und eine Transformation von Kontaminanten während der Transformation auszuschließen«

χ177δ wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min. sowohl in L-Nährmedium (1-broth) als auch Penassay-Mediura (Penassay broth)^ wenn diese mit 100 ^g DAP/rnl und 4 ug Thymidin/ml supplementiert v/erden, und erreicht

eine Enddichte von 8 bis 10 χ 10 Zellen/ml in der stationären Phase, Vorsichtiges kreisförmiges Hin- und Herschutteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100 %* Zusätzliche Details bezüglich xl776 sind zu finden bei R. Curtis et al_4J Molecular Cloning of Recombinant DNA₁ 99 bis 177, Scott und Werner, eds., Academic Press (N, Y, 1977). xl776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3, OuIi 1979 unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt«

2, Konstruktion und Cionieren des

synthetischen Genf ragments (Bq. 1 und 2)

Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH-quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen aufweist, die. an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft werden soll Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH erhält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende Haelll-Schneideerkeanungsstelle, Das distale Ende des synthetischen Fragments wi'rd mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker") ver-

i.iWi»

, . , , . £ 20.8.1982

sehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dam Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und das synthetische Fragment letztlich eingebaut werden sollen.

Wie in Fig, 1 gezeigt, haben die 5'-Enden des doppelsträngigen Fragments einzelsträngige kohäsive Enden für de EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonucleasen, um die Plasmid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codpn für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfügung. Es werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, ds in ihrer Größe von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach Cres, R. Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide, U_± bis U

und L. bis L_ , sind durch Pfeile bezeichnet, ι ο

10 pg Substanz von U₂ einschließlich U und L„ einschließlich L werden unter Venvendung der T.-Poly-

nucleotidkinase und (-f* -P)ATP phosphoryliert, und zwar nach dera veröffentlichten.Verfahren von Goeddel, D. V» et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei., USA, 76, 106 (1979).

Es werden drei getrennte T4-Ligase-katalysierte Reaktionen durchgeführt: 10 ^g des 5'-0H-Fragments U werden mit phosphoryliertem U₂, L und L vereintjphosphoryliertes U,, U , L und L. werden vereint; weiterhin werden 10 ^jg des 5'-GH-Fragments L mit phosphoryliertem L_?, U und Ug vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4 ⁰C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 pl von 20 ir.M Tris-HCl (pH = 7,5), 10 rnM MgCl ,

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10 ml Dlthiothreitol und 0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Iigase verwendet werden., Die drei Verknüpfungsffiischungen werden dann vereint, 100 Einheiten T4-Ligase augegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20 ⁰C ablaufen läßt. Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einein 10%igen Polyacrylainid-Gel einer Elektrophorese unterworfen· Die Bande, die bis zqr84-Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert« pBR322 (1 /Ug) wird mit EcoRI und Hindill behandelt, das große fragment wird durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DNA.verknüpft«, Diese Mischung wird, verwendet, um den Stamm S,. coli K-12-294 (end Ä» thi", hsr", harn,"¹") zu transformieren« Der Stamm 294 wurde am 30· Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Hummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt, Eine Sequenzanalyse nach der Maxam- und Gilbert-Technik, a_e a? 0», bei, der SeoRl - Hin.dlll-Insertion von einem Piasaid pHGH3 einer Tranaforaante bestätigte das in ;, 1 Dargest eilte *

3· Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH (Pig* 5)

Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRHA-Transkript in pHGH31 wird ein zur Replikation fähiges Plasmid konstruiert, das beide Pragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Pig, 5 gezeig Das Espressionsplasmid, das einen lac-Promotor als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert, Ein 285-Basenpaare-langes EgoEI-Fragment,

A L 1 A 7 fi OQ 20.8.1982

das zwei 95-Basenpaare-lange UV5-lac-Pro(noter-Fragmente enthält, welche durch ein 95-Basenpaare~langes, heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pi<B268 isoliert, siehe K, Backman et al,, Cell. Vol. 13, 65 bis 71 (1978). Das 285-bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGHl isoiert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungsstelle wird durch teilweise EcoRI-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden werden mit DNA-PoIymerase I repariert, und das Plasmid vlrd durch stumpfendige Verbindung wieder in Ringforra gebracht. Das resultierende Plasmid (pGH6) enthält eine einzige EcoRI-Erkennungsstelle, die passend liegt im Hinblick auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH eingebaut werden kann«

Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RNA-Transkript fertigzustellen, werden 10 ^g von pHGH3 rait EcoRI- und Haelll-Res.triktionsendonucleasen geschnitten, und das 77-Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.

Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 {5 ^g) mit Haelll geschnitten. Die 551-bp-HGH-Sequenz und ein mitgewandertes 540-bp-HaeIII-Fragment von p3R322 werden durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Eine anschließende Behandlung mit Xmal schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3'-nichtcodierenden Region entfernt

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werden· Das resultierende 512-bp-j?ragment wird von dem 540-bp-pBR322-HaeIII~Stück durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt* 0,3 /ng des- 77-bp-EcoRI-Haelll-Jragments werden mit T4-Ligase in einer 16/Ul-Heaktion 14 Stunden lang bei 4 ⁰C polymerisiert₀ Die Mischung wird dann für 5 Minuten auf 70 ⁰C erhitzt, um die Ligase zu. inaktivieren₉ anschließend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu. schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Srkennungssteilen dimerisiert haben), weiterhin-mit Smal behandelt (um Saal-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591-bp-Pragment mit einem EcoEI-Snde, das kohäsiv ist, und einem Smal-Snde_s das stumpf ist, erhalten wird« Hach der Reinigung auf einem 6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses fragments· Es sollte bemerkt werden, daß das Expressionsplasmid pGH6 keine 2kaI-Srkennungsstelle enthält« Smal erkennt., jedoch die gleiche Srkennungsstelle wie 2iaal, aber schneidet genau durch die Mitte, .so daB stumpfe Enden erhalten werden₀ Das Smal-geschnittene Ende des !Fragments, das von pHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGHo gebunden werden«

Das Expressionsplasmid pGHö, das den lac-ÜY5-Promotor in Tandemform enthält, wird sukzessive mit Hindlll, Huclease Sl und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt» 50 ng des resultierenden Vektors, der ein kohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591-bp-HGH-DlA verbundene Diese Yerbindungsmischung wird verwendet, um'E« coli xi776 zu transformieren« Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (i2,5/Ug/ml) selektiert. Es ist'bemerkenswert, daß-die Insertion des hybriden.HGH-Gens in .

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pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen der Strukturgene für Tetracycli/i-Resistenz erlaubt und auf diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibte Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der Grunstein-Hogness-Methode, Proc, Nat'l. Acad, Sei,, USA, 72, 3961 (1975), wurden durch Filterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben · das erwartete Restriktionsmuster, wenn sie mit Haelll, PvuII und Pstl geschnitten wurde.n. Von einem Clon (pHGH107). wurde die DNA-Sequenz bestimmt,

Menschliches Wachstumshormon, das von Transformanten produziert wird, kann ohne weiteres durch direkten Radioimmunoassay nachgewiesen werden, welc-her aus Verdünnungsreihen des Oberstands lysierter Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Phadebas HGH PRIST kit (Farmacia)*

Um aufzuzeigen, daS die HGH-Expression unter der Kontrolle des lac-Promoters steht, wird pHGH107 in einen £» coli-Stamm D1210 (lac+(i~0+z y-f)), einem Stamm, der den lac-Expres.sor überproduziert, t ransf orräert, Bis zur Zugabe des Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosidolipoid) kann keine nennenswerte Menge von HGH-Expression nachgewiesen 'werden.

Ein Entfernen der EcoRI-Erkennunsstelle in pHGH107 hätte zur Folge, daß das ATG-Startsignal von den Codons der An- _satzstelle für die Ribosomen des lac-Promoters de'n gleicher. Abstand hätte, den dies'e Codoris natürlicherweise vom Startsignal für ß-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob die Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands

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zu steigern ist, wurde pHGH107 in pHGHl07-l überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einzelstrangenden mit Sl-Endonuclease verdaut wurden und das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit T4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde. Obwohl sich zeigte, daß das erhaltene Plasmid in. ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als pHGH107, wie durch direkten Radioimmunoassay gezeigt werden konnte,

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist-, sondern ausschließlich auf den Schutzberech der Patentansprüche, Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-cl-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Proraoter. iVirtsorganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteriaceae, z, B_e die Stämme Escherichia coli und. Saisonella; aus der Familie der 3acillaceae, z« B, Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haenophilus Influenzae, Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der.Richtlinien für rekombinante DNA des National Institutes of Health, 43 Fed, Reg, 60 OSO (1978) durchgeführt werden sollen.

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Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labormaßstab eignet s£h der Stamm E, coli xl776 besonders gut, es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung im großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden* Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung, eher als biologischer, kennen für die Arbeit im großen Maßstab auch solche Organismen wie E, coli K-12 Stamm 294, a. a« 0», und E_# coli Stamm RRl, Genotyp: Pro"Leu~Thi~R_B-recA Str Lac y" verwendet werden, E, coli RRl wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HSlOl (H, IV. Boyer et al, 3. Mol. Bio, 41, 459 bis 472 (1969)) mit dem Stamm E, coli' K-12, Stamm KL16 als H.fr-Donor erhalten. Siehe auch 0. H, Miller,· Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, NeW York, 1972). Eine Kultur von E. coli RRl wurde am 30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31343 hinterlegt« Auf ähnliche Waise wurde eine Kultur von xl775 am 3. OuIi 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt. Am 3, Juli 1979 wurden bei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pHGH107 (ATCC 40011); Plasmid pGH5 (ATCC 40012); der Stamm xl776,. der mit pHGH107 transformiert wurde (ATCC 31538), und E, coli K-12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31539).

Nach der Erfindung hergestellte Organismen können für die in industriellem Maßstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anvvendungs-

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gebiete erhalten wird, wie es bisher unerreichbar war. Beispielsweise können transformierte E, coli-Kulturen gezüchtet werden in wäßrigem Medium in einem Stahl- oder einem anderen Ferme.ntationsgef äß, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in wäßrigem Medium bei beispielsweise 37 C und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH = 7 + 0,3), ergänzt mit geeigneten Nährsubstraten (beispielsweise Kohlenhydrat oder Glycerin), Stickstoffquellen (z. B, Ammoniumsulfate Kaliumquellen (z, 3, Kaliumphosphat), Spurenelementen, Magnesiumsulfat und ähnlichem, Transformante Organismen weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selektionscharakteristika auf, beispielsweise Antibiotika-Resistenzen, so daß ein Selektionsdruck ausgeübt werden kann, um konkurrierendes -Wachstum von Wildtyp E, coli zu behindern. Für den Fall eines gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistenten Organismus kann beispielsweise das Antibiotikum zum Fermentationsmedium gegeben werden, so daß Wildtyp-Organismen ausselektiert werden,, die nicht gegen diese Antibiotika resistent sind« Nachdem vollständig fermentiert wurde, wird die bakterielle Suspension zentrifugiert oder die Zellaasse auf andere Weise aus der Kulturbrühe gesammelt, daraufhin wird mit physikalischen oder chemischen Mitteln lysiert. Die Zelltrümmer werden vom Oberstand getrennt, und das lösliche Wachstumshormon wird isoliert und gereinigt.

Menschliches Wachstumshormon kann aus Bakterienextrakt gereinigt werden, indem man eine der folgenden Methoden oder eine Kombination dieser.anwendet:

1) Polyethylimin-Fraktionierung;

2) Gel-Filtrierungs-Chromatographie auf Sephacryl S-200;

3) Ionenaustausch-Chromatographie auf Biorex-70 Harz oder CH Sephadex; .

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4) Ammoniumsulfat und/oder ph-Fraktionierung; und

5) Affinitäts-Chromatographie, wobei Antikorper-Harze verwendet werden, die aus anti-HGH IgG hergestellt werden,, welches aus immunosensitivierten Tieren oder Hybridgeweben (hybridomas) isoliert wurde; das Hormon wird unter sauren oder mild denaturierenden Bedingungen herausgelöst.

Claims

Erfindungsanspruch

Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon, indem ein sich replizierender klonierender Vektor konstruiert wird, der fähig ist, in einem mikrobiellen Organismus menschliches Wachstumshormon zu exprimieren, wobei ein für menschliches Wachstumshormon codierendes Gen in einen klonierenden Vektor inseriert und unter die Kontrolle eines Expressionspromotors gestellt ist, gekennzeichnet dadurch, daß

- ein erstes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, wobei das besagte Pragment einen Teil . der codierenden Sequenz für das genannte menschliche Wachstumshormon enthält und das genannte erste Pragment für weniger als alle iminosäuren der Aminosäuresequenz des genannten Wachstumshormons codiert,

- ein zweites Genfragment zur Verfügung gestellt wird,

das für den Rest der .Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codiert, wobei das genannte zweite Genfragment für mindestens den imino-Snde-Bestandteil des menschlichen Wachstumshormons codiert,

- die genannten Genfragmenta in einem sich replizierenden klonierenden Vektor in richtiger Lesephase relativ zueinander und unter die Kontrolle eines Sxpressionspromotors angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der-...Aminosäuresequenz des genannten menschlichen Wachstumshormons ohne anhängende Presdprotein fähig ist,
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fragmente so ausgewählt werden, daß sie als wesentlichen Bestandteil cDHA oder eine Replication davon enthalten«
·,., 3. Verfahren nach mindestens einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß als klonierender Vektor ein Plasmid selektiert wird und das Plasmid gegenüber mindestens einem Antibiotikum resistent gemacht wird.
4. Verfahren nach Punkt 3» gekennzeichnet dadurch, daß ein Plasmid gebildet wird, dem der tet-Promotor fehlt und das dennoch gegenüber Tetracyclin resistent ist,
5« Verfahren nach mindestens einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das für das menschliche Wachstumshormon codierende Gen unter die Kontrolle ^v-'-' . eines lac-Promotors in Tandem-Struktur gestellt wirdo
6. Verfahren nach Punkt 5_f gekennzeichnet dadurch, daß der .sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid pHGH 10? ist*

7β Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß der sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid pHGH 107-1

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- und daß die Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons esprimiert wird,
8, Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon nach mindestens einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch} daß eine Xultur dea mikrobiellen Organismas in einem Fermentationsgefaß, das mit Belüftungs- und Schütteleinrichtungen ausgestattet ist, in einer wäßrigen» Mhrsubstrate enthaltenden ^ermentationsbrühs behandelt wird, daß die Kultur unter Belüften und Schüttein gezüchtet wird, während zusätzliche lährsubstrate zugeführt werden, die erforderlich sind, um ein starkes Wachstum aufrecht zu erhalten, daß die dabei erhaltene Zellmasse von der fermentation3brühe abgetrennt wird, daß die Zellen lysiert werden, um ihren Inhalt freizulegen, daß die Zellbruchstücke von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt werden und daß das in der überstehenden flüssigkeit enthaltene Polypeptid isoliert und gereinigt wird,
9. "Verfahren nach Punkt 8^ gekennzeichnet dadurch, daß eine Transformante von I₀ coli mit einer bakteriellen Selekti©nseigenschaft ausgewählt wird und daß ein Selektionsdruck ausgeübt wird, um das konkurrierende Wachstum von E, coli-Wildtyp zu behindern«
10, Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach

Punkt 1, indeia ein sich replizierender klonierender Vektor konstruiert wird, gekennzeichnet dadurch, daß Punktionsgene für Mpicillin- und letracyciin-Eesistenz " enthält, sowie einen lac-Promotor in Tandem-Struktur, der zwischen den genannten Genen liegt, und 30 orientiert ist, daß die Expression in Richtung des Gens für

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Tetracyclin Resistenz in Gang setzt_} und da3 ferner sins Mehrzahl" von Hsstriktionsericennungssteilen enthalten sind, die stromabv/ärta vom genannten Promotorsyatea liegen, wobei die genannten B-estriktionserkennungsstslien jeweils cohäsive und stumpfe Enden nach dsm Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von heterologer MA. zwischen den genannten Srkennungsstellen ermöglicht wird j so da3 diese unter die Kontrolle des genannten Promoter—Systems gelangt, und die durch die DIiA codierte iminosäuresequenz exprisiert wird«
11, Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch,, dai3 der sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid υGH 6 ist«