JPS5846100A - ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 - Google Patents
３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法Info
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- JPS5846100A JPS5846100A JP56143520A JP14352081A JPS5846100A JP S5846100 A JPS5846100 A JP S5846100A JP 56143520 A JP56143520 A JP 56143520A JP 14352081 A JP14352081 A JP 14352081A JP S5846100 A JPS5846100 A JP S5846100A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝標識として宿主にテトラサイクリン耐性
、アンピシリン耐性及びトリメトプリム耐性を付与する
ための遺伝子を有するプラスミドベクター及びその製造
方法に関するものである。
、アンピシリン耐性及びトリメトプリム耐性を付与する
ための遺伝子を有するプラスミドベクター及びその製造
方法に関するものである。
近年、遺伝子工学の発展を背景に、遺伝子組替え手法、
例えば大腸菌などの細菌に異種ＤＮＡを導入し、その遺
伝子を発現させるなどの手法によって有用な物質を生み
出す方法が脚光を浴びつつあり、最近では、この遺伝子
組替え手法により、インターフェロン、インシュリン、
ヒト成長ホルモン、グルタチオンなどの極めて有用な物
質の実用化に向けて研究開発が行われている。
例えば大腸菌などの細菌に異種ＤＮＡを導入し、その遺
伝子を発現させるなどの手法によって有用な物質を生み
出す方法が脚光を浴びつつあり、最近では、この遺伝子
組替え手法により、インターフェロン、インシュリン、
ヒト成長ホルモン、グルタチオンなどの極めて有用な物
質の実用化に向けて研究開発が行われている。
上記の異種ＤＮＡを導入し、その遺伝子を発現させるた
めの手段として、一般にプラスミドと呼ばれる環状ＤＮ
Ａが利用されているが、このプラスミドのうち、外来性
遺伝子を宿主細胞に移入し、その中でこれを増やす役割
をもつように改造されたものがプラスくドベクターであ
って、このものは、宿主に導入された場合、導入されて
ない宿主と識別しうるように宿主に薬剤などに対する抵
抗性を与える遺伝子、すなわち遺伝標識（以下マーカー
と略す）を有することが必要である。例えばプラスミド
ベクターｐＢＲ３２２はテトラサイクリン耐性（以下Ｔ
ｃ耐性と略す）及びアンピシリン耐性（以下Ａｐ耐性と
略す）を、ｐＭＢ ９はＴｃ耐性及びコリシンＥＩ免疫
性を、またｐＡＣＹｏ １８４はクロラムフェニコール
耐性及びＴｃ耐性を、それぞれ宿主に付与する遺伝子を
マーカーとして有している。
めの手段として、一般にプラスミドと呼ばれる環状ＤＮ
Ａが利用されているが、このプラスミドのうち、外来性
遺伝子を宿主細胞に移入し、その中でこれを増やす役割
をもつように改造されたものがプラスくドベクターであ
って、このものは、宿主に導入された場合、導入されて
ない宿主と識別しうるように宿主に薬剤などに対する抵
抗性を与える遺伝子、すなわち遺伝標識（以下マーカー
と略す）を有することが必要である。例えばプラスミド
ベクターｐＢＲ３２２はテトラサイクリン耐性（以下Ｔ
ｃ耐性と略す）及びアンピシリン耐性（以下Ａｐ耐性と
略す）を、ｐＭＢ ９はＴｃ耐性及びコリシンＥＩ免疫
性を、またｐＡＣＹｏ １８４はクロラムフェニコール
耐性及びＴｃ耐性を、それぞれ宿主に付与する遺伝子を
マーカーとして有している。
ところで、プラスミドベクターに異種遺伝子を挿入する
方法として、適当な制限酵素によってプラスミドベクタ
ーを切断し、直鎖状となったＤＮＡの両端に直鎖状の異
種ＤＮＡを連結して再び環状化する方法が、一般に行わ
れている。この異種ＤＮＡを挿入する際に、プラスミド
ベクターのマーカーな不活性化することによって異種Ｄ
ＮＡ挿入の成否な検討することができる。例えば、プラ
スミドベクターｐＢＲ３２２における制限酵素ＢａｍＨ
Ｉの切断部位へ異種ＤＮＡを導入することにより、Ｔｃ
耐性マーカーが不活性化する。このような部位は挿入失
活部位と呼ばれ、この挿入失活部位へ異種ＤＮＡを挿入
すればマーカーが１個失われることになる。したがって
、プラスミドベクターは、なるべく多くの種類のマーカ
ーを有することが望ましい。
方法として、適当な制限酵素によってプラスミドベクタ
ーを切断し、直鎖状となったＤＮＡの両端に直鎖状の異
種ＤＮＡを連結して再び環状化する方法が、一般に行わ
れている。この異種ＤＮＡを挿入する際に、プラスミド
ベクターのマーカーな不活性化することによって異種Ｄ
ＮＡ挿入の成否な検討することができる。例えば、プラ
スミドベクターｐＢＲ３２２における制限酵素ＢａｍＨ
Ｉの切断部位へ異種ＤＮＡを導入することにより、Ｔｃ
耐性マーカーが不活性化する。このような部位は挿入失
活部位と呼ばれ、この挿入失活部位へ異種ＤＮＡを挿入
すればマーカーが１個失われることになる。したがって
、プラスミドベクターは、なるべく多くの種類のマーカ
ーを有することが望ましい。
本発明者らは、このような事情に鑑み、多種のマーカー
を有するプラスミドベクターを得るべく鋭意研究を重ね
た結果、プラスミドベクターｐＢＲ３２２はＴｃ耐性及
びＡｐ耐性の２種のマーカーを有していること、ジヒド
ロ葉酸還元酵素はトリメトプリムによって強力に阻害さ
れるが、その遺伝子を細胞内において増幅させることに
よりトリメトプリム耐性（以下’ｒｐ耐性と略す）を獲
得できること、さらにこの遺伝子はｉ ｏｏｏ塩基対以
下の大きさであって有利であることなどに着目し、プラ
スミドベクターｐＢＲ３２２にジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子を含むＤＮＡを挿入することによってＴｃ耐性、Ａ
ｐ耐性及びＴｐ耐性の３種のマーカーを有するプラスミ
ドベクターが得られることを見出し、この知見に基づい
て本発明を完成するに至った。
を有するプラスミドベクターを得るべく鋭意研究を重ね
た結果、プラスミドベクターｐＢＲ３２２はＴｃ耐性及
びＡｐ耐性の２種のマーカーを有していること、ジヒド
ロ葉酸還元酵素はトリメトプリムによって強力に阻害さ
れるが、その遺伝子を細胞内において増幅させることに
よりトリメトプリム耐性（以下’ｒｐ耐性と略す）を獲
得できること、さらにこの遺伝子はｉ ｏｏｏ塩基対以
下の大きさであって有利であることなどに着目し、プラ
スミドベクターｐＢＲ３２２にジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子を含むＤＮＡを挿入することによってＴｃ耐性、Ａ
ｐ耐性及びＴｐ耐性の３種のマーカーを有するプラスミ
ドベクターが得られることを見出し、この知見に基づい
て本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はマーカーとしてＴｃ耐性遺伝子。
Ａｐ耐性遺伝子及び’ｒｐ耐性遺伝子を有するプラスミ
ドベクター及びプラスミドベクターｐＢＲ３２２にジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮＡを挿入することに
よって上記３種のマーカーを有するプラスミドベクター
を製造する方法を提供するものである。
ドベクター及びプラスミドベクターｐＢＲ３２２にジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮＡを挿入することに
よって上記３種のマーカーを有するプラスミドベクター
を製造する方法を提供するものである。
本発明に用いるプラスミドベクターｐＢＲ３２２’４゜
分子量が２．６ＸＩ Ｃ１’ダルトンでＴｃ 耐性及
びＡｐ耐性の２種のマーカーを有し、そのＴｃ耐性遺伝
子上に制限酵素Ｈｉｎｄ ｎＬＢａｍＨＩ及び５ａｌｌ
によってそれぞれ認識される挿入失活部位を、またＡ、
ｐ耐性遺伝子上に制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＰｖｕ Ｉに
よってそれぞれ認識される挿入失活部位を有しており、
これまで開発されたベクターのなかで、最も広く利用さ
れているベクターである。
分子量が２．６ＸＩ Ｃ１’ダルトンでＴｃ 耐性及
びＡｐ耐性の２種のマーカーを有し、そのＴｃ耐性遺伝
子上に制限酵素Ｈｉｎｄ ｎＬＢａｍＨＩ及び５ａｌｌ
によってそれぞれ認識される挿入失活部位を、またＡ、
ｐ耐性遺伝子上に制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＰｖｕ Ｉに
よってそれぞれ認識される挿入失活部位を有しており、
これまで開発されたベクターのなかで、最も広く利用さ
れているベクターである。
ところでトリメトプリムはジヒドロ葉酸還元酵素の強力
な阻害剤であり、例えば大腸菌などの細菌においては、
トリメトプリムによってジヒドロ葉酸還元酵ｌ″−阻害
され、その生成物であってアミノ酸及び核酸の生合成反
応に必須なテトラヒドロ葉酸の供給が止められる。この
ことからトリメトプリムは抗細菌剤として用いられる。
な阻害剤であり、例えば大腸菌などの細菌においては、
トリメトプリムによってジヒドロ葉酸還元酵ｌ″−阻害
され、その生成物であってアミノ酸及び核酸の生合成反
応に必須なテトラヒドロ葉酸の供給が止められる。この
ことからトリメトプリムは抗細菌剤として用いられる。
上記の理由から、このトリメトプリムに対する抵抗性を
宿主に付与させるためには、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子をプラスミドベクターに組み込んで宿主に挿入し、細
胞内におけるこの遺伝子の含量を高めてジヒドロ葉酸還
元酵素を多量に生産させればよい。
宿主に付与させるためには、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子をプラスミドベクターに組み込んで宿主に挿入し、細
胞内におけるこの遺伝子の含量を高めてジヒドロ葉酸還
元酵素を多量に生産させればよい。
したがって、本発明の宿主にＴｃ耐性、Ａｐ耐性及びＴ
ｐ耐性を付与するためのプラスミドベクターを得るには
、Ｔｃ耐性及びＡｐ耐性の２種のマーカーを有するプラ
スミドベクターｐＢＲ３２２の挿入失活部位以外の制限
酵素切断部位へジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮ
Ａを挿入すればよい。
ｐ耐性を付与するためのプラスミドベクターを得るには
、Ｔｃ耐性及びＡｐ耐性の２種のマーカーを有するプラ
スミドベクターｐＢＲ３２２の挿入失活部位以外の制限
酵素切断部位へジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮ
Ａを挿入すればよい。
また、ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量（ま約２万ダルト
ン程度であることが知られている。したが塩基対以下で
あると考えられ、このことは、Ｔｐ耐性遺伝子をマーカ
ーとすることが有利であることを意味する。しかしなが
ら、現在まで’ｒｐ耐性遺伝子をマーカーとしたプラス
ミドベクターはまだ開発されていなかった。
ン程度であることが知られている。したが塩基対以下で
あると考えられ、このことは、Ｔｐ耐性遺伝子をマーカ
ーとすることが有利であることを意味する。しかしなが
ら、現在まで’ｒｐ耐性遺伝子をマーカーとしたプラス
ミドベクターはまだ開発されていなかった。
次に本発明の実施態様について説明する。
まず、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に、大腸菌に１
２株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む約
９２００塩基対より成るＤＮＡ断片を、制限酵素Ｂａｍ
ＨＴ及びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて挿入し混成プラ
スミドを得る。ｐＢ、Ｒ３２２の制限酵素ＢａｍＨＴに
よる切断部位は、Ｔｃ耐性遺伝子上の挿入失活部位であ
るため、得られた混成プラス゛ミドは宿主に’ｒｐ耐性
及びＡｐ耐性を付与する。この混成プラスミドを大腸菌
に１２株に導入し、その菌体をアンピシリンナトリウム
及びトリメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて培養し
、成長した菌体から約１３．６ キロ塩基対の大きさの
プラスミド（ｐＴＰ［と呼称する）を分離する。このプ
ラスミドは宿主にＡｐ耐性及び’ｒｐ耐性を与える遺伝
子を有しており、また、第１図に示すように制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩＨｉｎｄｊｌｌ 、 ＢａｍＨＩ、 ５ａｌＩ
、Ｐｓｔｌ： イＢｓｔＥＩ［，５ｓｔＨ１ＸｈｏＩ
、によって切断される部位を有している。
２株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む約
９２００塩基対より成るＤＮＡ断片を、制限酵素Ｂａｍ
ＨＴ及びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて挿入し混成プラ
スミドを得る。ｐＢ、Ｒ３２２の制限酵素ＢａｍＨＴに
よる切断部位は、Ｔｃ耐性遺伝子上の挿入失活部位であ
るため、得られた混成プラス゛ミドは宿主に’ｒｐ耐性
及びＡｐ耐性を付与する。この混成プラスミドを大腸菌
に１２株に導入し、その菌体をアンピシリンナトリウム
及びトリメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて培養し
、成長した菌体から約１３．６ キロ塩基対の大きさの
プラスミド（ｐＴＰ［と呼称する）を分離する。このプ
ラスミドは宿主にＡｐ耐性及び’ｒｐ耐性を与える遺伝
子を有しており、また、第１図に示すように制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩＨｉｎｄｊｌｌ 、 ＢａｍＨＩ、 ５ａｌＩ
、Ｐｓｔｌ： イＢｓｔＥＩ［，５ｓｔＨ１ＸｈｏＩ
、によって切断される部位を有している。
次に上記プラスミドｐＴＰＩを制限酵素ＢａｍＨＩによ
って２か所切断し、次いで２本鎖ＤＮＡに特異的に働い
て両端から核酸を分解する酵素ヌクレア究ＢＡＬ３１を
作用させ、Ｔｐ耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡの断片を
得る。この直鎖状ＤＮＡの両端は平滑末端である。
って２か所切断し、次いで２本鎖ＤＮＡに特異的に働い
て両端から核酸を分解する酵素ヌクレア究ＢＡＬ３１を
作用させ、Ｔｐ耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡの断片を
得る。この直鎖状ＤＮＡの両端は平滑末端である。
一方、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に制限酵素ｊ占
ＥｃｏＲＩ、を作用させ、挿入失格部位以外の部位を切
断して直鎖ＤＮＡとし、次いで一本鎖ＤＮＡに特異的に
働く酵素ヌクレアーゼｓｔを作用させ、直鎖ＤＮＡの両
端に突出している一本鎖部分を消去として平滑末端とす
る。この際、ＥｃｏＲＩ切断部位は消去される。
断して直鎖ＤＮＡとし、次いで一本鎖ＤＮＡに特異的に
働く酵素ヌクレアーゼｓｔを作用させ、直鎖ＤＮＡの両
端に突出している一本鎖部分を消去として平滑末端とす
る。この際、ＥｃｏＲＩ切断部位は消去される。
このようにして得られた直鎖状ＤＮＡと、前記のｐ’ｒ
ｐ ■から得られた’ｒｐ耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮ
Ａ断片とを、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて平滑末端連
結を行い、環化して混成プラスミドを得る。この混成プ
ラスミドを大腸菌に１２株に導入し、その菌体をアンピ
シリンナトリウム、塩酸テトラサイクリン及びトリメト
プリムを含む栄養寒天培地を・用いて培養し、成長した
菌体からプラスミドを分離して分子量の最も小さい約６
．３キロ塩基対の大きさのプラスミドを選び、目的のプ
ラスミドベクター（、ｐＴＰ３０−５と呼称する）を得
る。
ｐ ■から得られた’ｒｐ耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮ
Ａ断片とを、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて平滑末端連
結を行い、環化して混成プラスミドを得る。この混成プ
ラスミドを大腸菌に１２株に導入し、その菌体をアンピ
シリンナトリウム、塩酸テトラサイクリン及びトリメト
プリムを含む栄養寒天培地を・用いて培養し、成長した
菌体からプラスミドを分離して分子量の最も小さい約６
．３キロ塩基対の大きさのプラスミドを選び、目的のプ
ラスミドベクター（、ｐＴＰ３０−５と呼称する）を得
る。
このようにして得られたプラスミドベクターｐＴＰ３０
−５は、宿主に謝して’ｒｃ耐性、Ａｐ耐性及び’ｒｐ
耐性を付与し、また第２図に示すように制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ 、旧ｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨｒ １Ｓａｌ Ｉ １
Ｐｓｔ Ｉ、ＢｓｔＥＩＩによって切断される部位を有
している。
−５は、宿主に謝して’ｒｃ耐性、Ａｐ耐性及び’ｒｐ
耐性を付与し、また第２図に示すように制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ 、旧ｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨｒ １Ｓａｌ Ｉ １
Ｐｓｔ Ｉ、ＢｓｔＥＩＩによって切断される部位を有
している。
また、次の方法によっても本発明のプラスミドベクター
は得られる。
は得られる。
すなわち、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に制限酵素
ＥｃｏＲＩ を作用させ、挿入失透部位以外の部位を切
断して直鎖状ＤＮＡとし、次いで酵素ヌクレアーゼＳＩ
を作用させ、両端に突出している一本鎖部分を消去して
平滑末端とする。一方、大暢菌に１２ 株から得られ
たジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む約９２００塩基対
より成るＤＮＡ断片を酵素ヌクレアーゼＢＡＬ３１によ
って短縮する。この短縮されたＤＮＡの両端は平滑末端
となっており、このものと、前記のｐＢＲ３２２にＥｃ
ｏＲＩ 及びヌクレアーゼｓｒを作用させて得られた平
滑末端を有する直鎖状ＤＮＡとを、Ｔ ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて平滑末端連結を行い、環化して混成プラス
ミドを得る。
ＥｃｏＲＩ を作用させ、挿入失透部位以外の部位を切
断して直鎖状ＤＮＡとし、次いで酵素ヌクレアーゼＳＩ
を作用させ、両端に突出している一本鎖部分を消去して
平滑末端とする。一方、大暢菌に１２ 株から得られ
たジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む約９２００塩基対
より成るＤＮＡ断片を酵素ヌクレアーゼＢＡＬ３１によ
って短縮する。この短縮されたＤＮＡの両端は平滑末端
となっており、このものと、前記のｐＢＲ３２２にＥｃ
ｏＲＩ 及びヌクレアーゼｓｒを作用させて得られた平
滑末端を有する直鎖状ＤＮＡとを、Ｔ ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて平滑末端連結を行い、環化して混成プラス
ミドを得る。
この混成プラスミドを大腸菌に１２株に導入し、その菌
体をアンピシリンナトリウム、塩酸テトラサイクリン及
びトリメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて培養し、
成長した菌体からプラスミドを分離し、分子の大きさに
ついてスクリーニングして約６．３キロ塩基対の大きさ
のプラスミドをベクターとして得る。このプラスミドベ
クターは宿主に、対してＴｃ 耐性、Ａｐ耐性及び’ｒ
ｐ耐性を付与する。
体をアンピシリンナトリウム、塩酸テトラサイクリン及
びトリメトプリムを含む栄養寒天培地を用いて培養し、
成長した菌体からプラスミドを分離し、分子の大きさに
ついてスクリーニングして約６．３キロ塩基対の大きさ
のプラスミドをベクターとして得る。このプラスミドベ
クターは宿主に、対してＴｃ 耐性、Ａｐ耐性及び’ｒ
ｐ耐性を付与する。
本発明のプラスミドベクターは、これを含む宿主細胞を
容易に識別しうるマーカーを３種、すなわちＴｃ耐性、
Ａｐ耐性及び’ｒｐ耐性のマーカーを有し、かつ多種の
制限酵素による切断部位を有しているため、外来性ＤＮ
Ａ断片を負荷する能力が大きく、そのうえ分子量が小さ
くて不必要な遺伝情報をもたらすことの少ない極めて優
れたベクターである。
容易に識別しうるマーカーを３種、すなわちＴｃ耐性、
Ａｐ耐性及び’ｒｐ耐性のマーカーを有し、かつ多種の
制限酵素による切断部位を有しているため、外来性ＤＮ
Ａ断片を負荷する能力が大きく、そのうえ分子量が小さ
くて不必要な遺伝情報をもたらすことの少ない極めて優
れたベクターである。
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
なお、実施例における菌体からのプラスミドの分離はＴ
ａｎａｋａ及びＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ 、 Ｔａ
ｎａｋａ 。
ａｎａｋａ及びＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ 、 Ｔａ
ｎａｋａ 。
Ｂ、Ｗｅｉｓ’ｂｌｕｍ ； Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ、 １２１ 、３５４ ｔ（１９７５））に従っ
た。“ 実施例 ５ａｉｔｏ及びＭｉｕｒａの方法（Ｈ，５ａｉｔｏ 、
Ｋ、ＭｉｕｒａＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、 ７２＋ ６１９ （１９６３）、）に従
って、Ｋｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ’Ｋ １２
株から得たジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ約
１μ２とプラス汁ドベクターｐＢ、Ｒ’３２２約１μり
を、７５μｔの反応液（７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐ
Ｈ７，４，７ｍＭＭｇＣ１２ｔ ７ ｍ Ｍ ２−メル
カプトエタノール、６０ｍＭＭａｉｌ）中で、１〜５ユ
ニツトのＢａｍＨ１金用いて隻り７℃、１時間消化させ
た。さらに６５℃で５分間保ってＢａｍＨＩを失活させ
たのち、水中に保ち、１５μｔの５０ ｍＭ ＭｇＯ１
２＋ １５ μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（以下
ＤＴＴと略す）、１５μｔの５ｍＭＡＴＰ、７μｔのｌ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｍｏｌ ｐＨ７，４，２３μｔの水及
び１〜２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１８時間反応させることによってＢａｍＨｌで消化した
ＤＮＡ混合物を連結した。この連結混合物をＮｏｒｇａ
ｒｄらの方法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄ、に、Ｋｅｅｍ
＋Ｊ、Ｊ、Ｍｏｎａｈａｎ； Ｇｅｎｅ、 ３ 、２７
９ 、 （１９７８））に従ってＦＪ８ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｋ １２ Ｃ６００株に取り込ませた
。この処理した菌体を２０μｙ／ｍｔアンピシリンナト
リウム及び２μ？／ｍＬトリメトプリムを含む栄養寒丙
培地上にまき、生長する菌体（Ａｐ耐性及びＴｐ耐性菌
）を得だ。この菌体から約１３．６キロ塩基対の大きさ
のプラスミドを分離した。このプラスミドをプラスミド
ｐＴＰＩ （以下ｐＴＰｌと略す）と呼称する。
ｏｇｙ、 １２１ 、３５４ ｔ（１９７５））に従っ
た。“ 実施例 ５ａｉｔｏ及びＭｉｕｒａの方法（Ｈ，５ａｉｔｏ 、
Ｋ、ＭｉｕｒａＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、 ７２＋ ６１９ （１９６３）、）に従
って、Ｋｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ’Ｋ １２
株から得たジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ約
１μ２とプラス汁ドベクターｐＢ、Ｒ’３２２約１μり
を、７５μｔの反応液（７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐ
Ｈ７，４，７ｍＭＭｇＣ１２ｔ ７ ｍ Ｍ ２−メル
カプトエタノール、６０ｍＭＭａｉｌ）中で、１〜５ユ
ニツトのＢａｍＨ１金用いて隻り７℃、１時間消化させ
た。さらに６５℃で５分間保ってＢａｍＨＩを失活させ
たのち、水中に保ち、１５μｔの５０ ｍＭ ＭｇＯ１
２＋ １５ μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（以下
ＤＴＴと略す）、１５μｔの５ｍＭＡＴＰ、７μｔのｌ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｍｏｌ ｐＨ７，４，２３μｔの水及
び１〜２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１８時間反応させることによってＢａｍＨｌで消化した
ＤＮＡ混合物を連結した。この連結混合物をＮｏｒｇａ
ｒｄらの方法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄ、に、Ｋｅｅｍ
＋Ｊ、Ｊ、Ｍｏｎａｈａｎ； Ｇｅｎｅ、 ３ 、２７
９ 、 （１９７８））に従ってＦＪ８ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｋ １２ Ｃ６００株に取り込ませた
。この処理した菌体を２０μｙ／ｍｔアンピシリンナト
リウム及び２μ？／ｍＬトリメトプリムを含む栄養寒丙
培地上にまき、生長する菌体（Ａｐ耐性及びＴｐ耐性菌
）を得だ。この菌体から約１３．６キロ塩基対の大きさ
のプラスミドを分離した。このプラスミドをプラスミド
ｐＴＰＩ （以下ｐＴＰｌと略す）と呼称する。
ｐＴＰｌの制限酵素ＦｌｉｃｏＲ１，Ｈｉｎｄｌ 、
ＢａｍＨｌ ｒＳａｌ ｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、 Ｂｓ
ｔＥｌｌ 、 ５ｓｔＩｌ、Ｘｈｏｌによる切断切回を
第１図に示す。
ＢａｍＨｌ ｒＳａｌ ｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、 Ｂｓ
ｔＥｌｌ 、 ５ｓｔＩｌ、Ｘｈｏｌによる切断切回を
第１図に示す。
このｐＴＰＩをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ０６００株に導入１するとＡｐ耐性及びＴｐ耐性
菌に変態すること、ｐＢＲ３２２のＴｃ耐性遺伝子はＢ
ａｍＨＩによって切断されること、及びｐＢＲ３２２は
宿主にＡｐ耐性及びＴｃ耐性を付与することから％ｐＴ
ＰＩのＴｐ耐性は、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ切断部位
へＦｉｓｃｈｅｒ−ｉｃｈｉａ ｃｏｒｉ Ｋ １２株
から得たＤＮＡのＢａｍＨｌによって切りとられた断片
が挿入されることによって得られたものであると結論さ
れる０ 上記ｐＴＰ１約５μｒを４ｏｏｐｔの反応液（７ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，４、７ｍ、Ｍ ＭｇＣｌ
２．７ｍＭ ２ − メ メルカプトエタノール、
６０ｍＭ Ｎａ１ｌ）中で、５−１０ユニツトのＢａｍ
ＨＩを用いて３７℃１時間ｌ肖イヒさせたのち、８ｐｔ
のＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ！１’ ｐＨ８、４μｔのｊ
’Ｍ ＭｇＯ１２、５ｐＬのＩ Ｍ ＣａＣｌ２．８μ
ｔの５ Ｍ ＮａＣ１及び１μｔの０．２５ＭＥＤＴＡ
を加えて２５℃に保った。この反応液に１μｔのヌクレ
アーゼＢＡＬ３１を２ユニット加え、５．’１０．’１
５，２０．２５＋３０分後に各５０μｔずつとり、これ
に５０μｔの水飽和フェノールを加えて５分間かきまぜ
たの・ち、水層を集めた。このようにして得た水層をす
べてまとめて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＩ ｐＨ７，
４に透析した。透析されたＤＮＡ混合物は後述の処理に
用いる〇 一方、ｐＢＲ３２２約１μ２を１００μｔの反応液（７
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，４、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６０ ｍ
、Ｍ Ｎａ１ｌ ）中で、１〜５ユニツトのＫｃｏＲｌ
を用いて３７℃、１時間消化させたのち、１８℃に保ち
、あらかじめ１８℃に保持された２４ｍＭＺｎＳ○４及
び６０ｍＭＮａ０１を含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ５，０を１００ Ｐｌ 加工１．次イで１００
ユニツトのヌクレアーゼＳ１を１時間作用させて、Ｅｃ
ｏＲ’ｌの消化によって生じた両端の一本鎖部分を除去
した０次に２ｏｏｐｔの水飽和フェノールを加えてヌク
レアーゼＳ１による消化を停止させ、さらに５分間力１
きまぜたのち、遠心分離により水層とフェノール層とに
分け、水層を分取して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＩｐＨ
７，＞；’ｆ、町透析した。このようにして得られた液
４０ｐｔと肇１．前述のｐＴＰｌ ｆ：ＢａｍＨｌで消
化したのち、ヌクレアーゼＢＡＬ３１で処理して得た液
５０μｔとを混ぜ、さらに１５ｐｔの５０ｍＭ ＭｇＯ
１２、１５μｔの０．１ＭＤＴＴ、１５／ｌｊｔの５ｍ
Ｍ ＡＴＰ 、 ７ｐｔのＩ ＭＴｒｉｓ−）（Ｃ１ｐ
Ｈ７，４、８μｔの水及び１０〜２０ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間反応させて混合Ｄ
ＮＡを連結した。
１２ ０６００株に導入１するとＡｐ耐性及びＴｐ耐性
菌に変態すること、ｐＢＲ３２２のＴｃ耐性遺伝子はＢ
ａｍＨＩによって切断されること、及びｐＢＲ３２２は
宿主にＡｐ耐性及びＴｃ耐性を付与することから％ｐＴ
ＰＩのＴｐ耐性は、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ切断部位
へＦｉｓｃｈｅｒ−ｉｃｈｉａ ｃｏｒｉ Ｋ １２株
から得たＤＮＡのＢａｍＨｌによって切りとられた断片
が挿入されることによって得られたものであると結論さ
れる０ 上記ｐＴＰ１約５μｒを４ｏｏｐｔの反応液（７ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，４、７ｍ、Ｍ ＭｇＣｌ
２．７ｍＭ ２ − メ メルカプトエタノール、
６０ｍＭ Ｎａ１ｌ）中で、５−１０ユニツトのＢａｍ
ＨＩを用いて３７℃１時間ｌ肖イヒさせたのち、８ｐｔ
のＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ！１’ ｐＨ８、４μｔのｊ
’Ｍ ＭｇＯ１２、５ｐＬのＩ Ｍ ＣａＣｌ２．８μ
ｔの５ Ｍ ＮａＣ１及び１μｔの０．２５ＭＥＤＴＡ
を加えて２５℃に保った。この反応液に１μｔのヌクレ
アーゼＢＡＬ３１を２ユニット加え、５．’１０．’１
５，２０．２５＋３０分後に各５０μｔずつとり、これ
に５０μｔの水飽和フェノールを加えて５分間かきまぜ
たの・ち、水層を集めた。このようにして得た水層をす
べてまとめて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＩ ｐＨ７，
４に透析した。透析されたＤＮＡ混合物は後述の処理に
用いる〇 一方、ｐＢＲ３２２約１μ２を１００μｔの反応液（７
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，４、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６０ ｍ
、Ｍ Ｎａ１ｌ ）中で、１〜５ユニツトのＫｃｏＲｌ
を用いて３７℃、１時間消化させたのち、１８℃に保ち
、あらかじめ１８℃に保持された２４ｍＭＺｎＳ○４及
び６０ｍＭＮａ０１を含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ５，０を１００ Ｐｌ 加工１．次イで１００
ユニツトのヌクレアーゼＳ１を１時間作用させて、Ｅｃ
ｏＲ’ｌの消化によって生じた両端の一本鎖部分を除去
した０次に２ｏｏｐｔの水飽和フェノールを加えてヌク
レアーゼＳ１による消化を停止させ、さらに５分間力１
きまぜたのち、遠心分離により水層とフェノール層とに
分け、水層を分取して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯＩｐＨ
７，＞；’ｆ、町透析した。このようにして得られた液
４０ｐｔと肇１．前述のｐＴＰｌ ｆ：ＢａｍＨｌで消
化したのち、ヌクレアーゼＢＡＬ３１で処理して得た液
５０μｔとを混ぜ、さらに１５ｐｔの５０ｍＭ ＭｇＯ
１２、１５μｔの０．１ＭＤＴＴ、１５／ｌｊｔの５ｍ
Ｍ ＡＴＰ 、 ７ｐｔのＩ ＭＴｒｉｓ−）（Ｃ１ｐ
Ｈ７，４、８μｔの水及び１０〜２０ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間反応させて混合Ｄ
ＮＡを連結した。
この連結混合物をＮｏｒｇａｒｄらの方法に従って、Ｋ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ Ｉ ２０６００
株に取り込ませた。この処理菌体を２０μｙ／ｍｔナン
ピ／リンナトリウム、１０μｆ ７ｍ ｌ塩酸テトラサ
イクリン及び２μｙ／ｍｔト’）メトプリムを含む栄養
寒天培地上にまき、生長する菌体（Ａｐ耐性、ＴＣ耐性
及び’ｒｐ耐性菌）を数１０株得た。これらの菌体から
プラスミドを分離したところ、 １３．６キロ塩基対
から６．３キロ塩基対の大きさに分布していた。このプ
ラスミドのなかから分子量の最も小さい６．３キロ塩基
対の大きさのプラスミドをベクターとして選んだ０この
ものをプラスミドベクターｐＴＰ３０−５と呼称する。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ Ｉ ２０６００
株に取り込ませた。この処理菌体を２０μｙ／ｍｔナン
ピ／リンナトリウム、１０μｆ ７ｍ ｌ塩酸テトラサ
イクリン及び２μｙ／ｍｔト’）メトプリムを含む栄養
寒天培地上にまき、生長する菌体（Ａｐ耐性、ＴＣ耐性
及び’ｒｐ耐性菌）を数１０株得た。これらの菌体から
プラスミドを分離したところ、 １３．６キロ塩基対
から６．３キロ塩基対の大きさに分布していた。このプ
ラスミドのなかから分子量の最も小さい６．３キロ塩基
対の大きさのプラスミドをベクターとして選んだ０この
ものをプラスミドベクターｐＴＰ３０−５と呼称する。
ｐＴＰ３０−５の制限酵素ＫｃｏＲ１、Ｈｉｎｄ ｌ
、 ＢａｍＨｌ 、 ５ａｌｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、
ＢｓｔＫ［ｌによる切断地図を第２図に示す。
、 ＢａｍＨｌ 、 ５ａｌｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、
ＢｓｔＫ［ｌによる切断地図を第２図に示す。
このｐＴＰ３０−５をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｒ
ｉ Ｋ１２Ｃ６００株に導入すると、アンピシリン、テ
トラサイクリン及びトリメトプリムの３種の薬剤に対し
て抵抗性に変態しだ。
ｉ Ｋ１２Ｃ６００株に導入すると、アンピシリン、テ
トラサイクリン及びトリメトプリムの３種の薬剤に対し
て抵抗性に変態しだ。
また、ｐＴＰ３０−５のＥｃ ｏＲｌ切断部位に異種Ｄ
ＮＡを挿入したプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｒｉＫ１２ Ｃ６００株に導入すると、もはやトリ
メトプリムに対する抵抗性は失われた。
ＮＡを挿入したプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｒｉＫ１２ Ｃ６００株に導入すると、もはやトリ
メトプリムに対する抵抗性は失われた。
ｐＴＰｌ又はｐＴＰ３０−５を導入したＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ １２０６００株から得たジヒド
ロ葉酸還元酵素の量は、これらプラスミドをもたないＥ
ｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２０６００株
から得た量の約１０倍であった。したがって、Ｔｐ耐性
はジヒドロ葉酸還元酵素が細胞内で増産されたため、ト
リメトプリムによる同酵素への阻害が解除又は緩和され
たためと考えられる。
ｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ １２０６００株から得たジヒド
ロ葉酸還元酵素の量は、これらプラスミドをもたないＥ
ｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２０６００株
から得た量の約１０倍であった。したがって、Ｔｐ耐性
はジヒドロ葉酸還元酵素が細胞内で増産されたため、ト
リメトプリムによる同酵素への阻害が解除又は緩和され
たためと考えられる。
第１図はｐＴＰｌの制限酵素による切断地図、第２図は
ｐＴＰ３０−５の制限酵素による切断地図であり、図中
符号は制限酵素を表わし、ＥはＫＣＯＲＩＩＨ３はＨｉ
ｎｄ ｌ 、 ＢはＢａｍＨｌ 、 Ｓａ’ｌは５ａｌ
ｌ、ＢｓｔＦｉｌはＢｓｔＦｌｉ［、ＰθｔはＰｓｔｌ
、Ｅ１８ｔｌｌは５ｓｔｌ及びｘｈｏ）はＸｈｏｌを
示す。また、数字の単位はキロ塩基であり、内部の円弧
はプラスミドベクターｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡを
示す。 特許出願人 工業技術院長 石 坂 誠 −指定代
理人 工業技術院繊維高分子材料研究所間 太
昭 第１図 第２図
ｐＴＰ３０−５の制限酵素による切断地図であり、図中
符号は制限酵素を表わし、ＥはＫＣＯＲＩＩＨ３はＨｉ
ｎｄ ｌ 、 ＢはＢａｍＨｌ 、 Ｓａ’ｌは５ａｌ
ｌ、ＢｓｔＦｉｌはＢｓｔＦｌｉ［、ＰθｔはＰｓｔｌ
、Ｅ１８ｔｌｌは５ｓｔｌ及びｘｈｏ）はＸｈｏｌを
示す。また、数字の単位はキロ塩基であり、内部の円弧
はプラスミドベクターｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡを
示す。 特許出願人 工業技術院長 石 坂 誠 −指定代
理人 工業技術院繊維高分子材料研究所間 太
昭 第１図 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 遺伝標識としてテトラサイクリン耐性遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子及びトリメトプリム耐性遺伝子を有
するプラスミドベクター。 ２ プラスミドベクターｐＢＲ３２２にジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子を含むＤＮＡを挿入することを特徴とする
テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子
及びトリメトプリム耐性遺伝子を有するプラスミドベク
ターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56143520A JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56143520A JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5846100A true JPS5846100A (ja) | 1983-03-17 |
| JPS6135831B2 JPS6135831B2 (ja) | 1986-08-15 |
Family
ID=15340644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56143520A Granted JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5846100A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198979A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Agency Of Ind Science & Technol | 特定プラスミドを含む宿主菌体の安定化 |
| JPH09117293A (ja) * | 1986-07-19 | 1997-05-06 | Behringwerke Ag | ヒトアンチトロンビンｉｉｉ（ａｔｉｉｉ）の製造 |
-
1981
- 1981-09-11 JP JP56143520A patent/JPS5846100A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198979A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Agency Of Ind Science & Technol | 特定プラスミドを含む宿主菌体の安定化 |
| JPH09117293A (ja) * | 1986-07-19 | 1997-05-06 | Behringwerke Ag | ヒトアンチトロンビンｉｉｉ（ａｔｉｉｉ）の製造 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6135831B2 (ja) | 1986-08-15 |
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