JPH09117293A - ヒトアンチトロンビンｉｉｉ（ａｔｉｉｉ）の製造 - Google Patents
ヒトアンチトロンビンｉｉｉ（ａｔｉｉｉ）の製造Info
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- JPH09117293A JPH09117293A JP8273823A JP27382396A JPH09117293A JP H09117293 A JPH09117293 A JP H09117293A JP 8273823 A JP8273823 A JP 8273823A JP 27382396 A JP27382396 A JP 27382396A JP H09117293 A JPH09117293 A JP H09117293A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明によれば、価格的に血清を節約でき、
最後の産生段階が血清非存在下で行われる場合にはＡＴ
III の回収量を著しく高めることもできる。本発明によ
り得られる組換えＡＴIII は十分な生物学的活性を有
し、薬剤の製造にも適する。 【解決手段】 下記のベクター及び宿主細胞。 ＳＶ４０プロモーター配列及びＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位を有しかつスプライス部分を有さないｐＢＲ３
２２配列及びＡＴIII ｃＤＮＡ含有発現ベクター。 プラスミドｐＳＶ２ ＳＴＯＰ及びｐＳＶＡ ＳＴ
ＯＰ１。 プラスミドｐＳＶＡＴIII 。 ＤＨＦＲ遺伝子がｐＢＲ３２２ｏｒｉ領域に下流で
結合せしめられている、マウス ＤＨＦＲ遺伝子含有ベ
クター。 プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及びｐＳＶＯＡｄｈ
ｆｒ。 一方では上記〜のいずれかのベクターでかつ他
方では上記又はのベクターで共形質感染された哺乳
動物細胞。
最後の産生段階が血清非存在下で行われる場合にはＡＴ
III の回収量を著しく高めることもできる。本発明によ
り得られる組換えＡＴIII は十分な生物学的活性を有
し、薬剤の製造にも適する。 【解決手段】 下記のベクター及び宿主細胞。 ＳＶ４０プロモーター配列及びＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位を有しかつスプライス部分を有さないｐＢＲ３
２２配列及びＡＴIII ｃＤＮＡ含有発現ベクター。 プラスミドｐＳＶ２ ＳＴＯＰ及びｐＳＶＡ ＳＴ
ＯＰ１。 プラスミドｐＳＶＡＴIII 。 ＤＨＦＲ遺伝子がｐＢＲ３２２ｏｒｉ領域に下流で
結合せしめられている、マウス ＤＨＦＲ遺伝子含有ベ
クター。 プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及びｐＳＶＯＡｄｈ
ｆｒ。 一方では上記〜のいずれかのベクターでかつ他
方では上記又はのベクターで共形質感染された哺乳
動物細胞。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】公開番号第０，０９０，５０
５号の欧州特許出願は、ＡＴIII をコードするｃＤＮＡ
の製造及び特徴並びに大腸菌中でのヒトＡＴIII の製造
に関して開示する。この出願は、どのようにしてＡＴII
I が哺乳動物細胞培養物中で産生され得るかについても
詳細に述べている。適当なベクターは、大腸菌（Escher
ichia coli）の複製源と一緒に大腸菌における選択マー
カーを有するｐＢＲ３２２誘導体である、と述べられて
いる。ベクターは、（３４２ｂｐ ＰｖｕII‐Ｈｉｎｄ
III断片から誘導される）ＳＶ４０複製源を有している
とも述べられている。
５号の欧州特許出願は、ＡＴIII をコードするｃＤＮＡ
の製造及び特徴並びに大腸菌中でのヒトＡＴIII の製造
に関して開示する。この出願は、どのようにしてＡＴII
I が哺乳動物細胞培養物中で産生され得るかについても
詳細に述べている。適当なベクターは、大腸菌（Escher
ichia coli）の複製源と一緒に大腸菌における選択マー
カーを有するｐＢＲ３２２誘導体である、と述べられて
いる。ベクターは、（３４２ｂｐ ＰｖｕII‐Ｈｉｎｄ
III断片から誘導される）ＳＶ４０複製源を有している
とも述べられている。
【０００２】これとは異なり、本発明は、特に有利な方
法、すなわち使用される宿主細胞が全く又は不十分にし
かジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を産生し得な
い哺乳動物細胞であって、かつこの宿主細胞が一方がＡ
ＴIII 遺伝子を有し他方がジヒドロ葉酸レダクターゼ産
生を生じる２種の発現ベクターで共形質感染（cotransf
ect)される、という方法、に関する。
法、すなわち使用される宿主細胞が全く又は不十分にし
かジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を産生し得な
い哺乳動物細胞であって、かつこの宿主細胞が一方がＡ
ＴIII 遺伝子を有し他方がジヒドロ葉酸レダクターゼ産
生を生じる２種の発現ベクターで共形質感染（cotransf
ect)される、という方法、に関する。
【０００３】このように、本発明はＡＴIII ｃＤＮＡを
有する発現ベクターを用いた哺乳動物細胞培養物中にお
けるＡＴIII の製造方法に関するものであるが、この方
法は上記ベクターのみならずＤＨＦＲ遺伝子を有する別
のベクターによっても共形質感染されるｄｈｆｒ- 細胞
を哺乳動物細胞として使用することを特徴とするもので
ある。本発明の他の側面及びその好ましい態様は、以下
で詳細に説明されておりかつ特許請求の範囲において規
定されている。
有する発現ベクターを用いた哺乳動物細胞培養物中にお
けるＡＴIII の製造方法に関するものであるが、この方
法は上記ベクターのみならずＤＨＦＲ遺伝子を有する別
のベクターによっても共形質感染されるｄｈｆｒ- 細胞
を哺乳動物細胞として使用することを特徴とするもので
ある。本発明の他の側面及びその好ましい態様は、以下
で詳細に説明されておりかつ特許請求の範囲において規
定されている。
【０００４】本発明の共形質感染系は２種の発現ベクタ
ーを使用するものであって、第一のベクターは例えばｐ
ＢＲ３２２のようにいかなる望ましいベクターであって
もよく、このベクターにおいてＡＴIII 遺伝子は自体公
知の方法で真核細胞中で活性なプロモーターの制御下に
存在下し、一方ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする
とともに遺伝子を増幅させることができる第二のベクタ
ーにおいては、ＤＨＦＲ遺伝子の発現はｐＢＲ３２２ｏ
ｒｉ領域のＤＮＡ配列によって制御されている。
ーを使用するものであって、第一のベクターは例えばｐ
ＢＲ３２２のようにいかなる望ましいベクターであって
もよく、このベクターにおいてＡＴIII 遺伝子は自体公
知の方法で真核細胞中で活性なプロモーターの制御下に
存在下し、一方ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする
とともに遺伝子を増幅させることができる第二のベクタ
ーにおいては、ＤＨＦＲ遺伝子の発現はｐＢＲ３２２ｏ
ｒｉ領域のＤＮＡ配列によって制御されている。
【０００５】ＡＴIII 遺伝子を有する第一ベクターのみ
ならず、ＤＨＦＲ遺伝子を有する第二ベクターも、ｐＢ
Ｒ３２２誘導体を構成しているならば、好都合である。
このタイプのベクターは、それらが大腸菌中において増
幅され得ると同時に、真核細胞中において“シャトルベ
クター”として使用され得るという利点を有する。選択
マーカーとしてｐＢＲ ３２２ＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII断
片に含まれるアンピシリン耐性遺伝を用いることは有利
である。勿論、自体公知の方法によって、別の又は追加
のマーカーを組込みかつ不必要な領域を修正又は切除す
ることも可能である。
ならず、ＤＨＦＲ遺伝子を有する第二ベクターも、ｐＢ
Ｒ３２２誘導体を構成しているならば、好都合である。
このタイプのベクターは、それらが大腸菌中において増
幅され得ると同時に、真核細胞中において“シャトルベ
クター”として使用され得るという利点を有する。選択
マーカーとしてｐＢＲ ３２２ＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII断
片に含まれるアンピシリン耐性遺伝を用いることは有利
である。勿論、自体公知の方法によって、別の又は追加
のマーカーを組込みかつ不必要な領域を修正又は切除す
ることも可能である。
【０００６】更に好ましい態様のベクターは、構造遺伝
子の下流に位置するｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来翻訳停止
配列〔エム・ブレーカー及びイー・アマン、アプライド
・マイクロバイオロジカル・バイオテクノロジー、第２
３巻、第２９４−２９６頁、１９８６年（M. Broeker a
nd E. Amann, Applied Microbiological Biotechnolog
y, 23 (1986) 294-296)〕を有する。三つのすべての読
取り枠における翻訳停止コードンはこのＤＮＡ部分上に
位置しており、自らの翻訳停止コードンを有さない修正
遺伝子の発現が可能となる。
子の下流に位置するｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来翻訳停止
配列〔エム・ブレーカー及びイー・アマン、アプライド
・マイクロバイオロジカル・バイオテクノロジー、第２
３巻、第２９４−２９６頁、１９８６年（M. Broeker a
nd E. Amann, Applied Microbiological Biotechnolog
y, 23 (1986) 294-296)〕を有する。三つのすべての読
取り枠における翻訳停止コードンはこのＤＮＡ部分上に
位置しており、自らの翻訳停止コードンを有さない修正
遺伝子の発現が可能となる。
【０００７】
【従来の技術】全く又は不十分な程度でしかジヒドロ葉
酸レダクターゼを産生し得ない哺乳動物細胞（ｄｈｆｒ
- ）及びこの欠陥を補い得る適当なベクターは一般的に
公知である〔エルンストーエル・ウィンナッカー「遺伝
子及びクローン、遺伝子操作概論」、ＶＣＨフェルラー
クスゲゼルシャフト・ワインハイム、１９８４年、第２
６７、２６８、２８２、２８９頁（Ernst-L. Winnacke
r，Gene und Klone, eineEinfuehrung in die Gen-tech
nologie, VCH Verlasgesellschaft Weinheim，1984, pa
ges 267/268, 282, 289)〕。例えば、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ活性が欠乏したＣＨＯ細胞変異株の単離法に関
しては、ジー・ウルラウプ及びエル・エー・チェーシ
ン、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシーズ ＵＳＡ、第７７巻、１９８
０年、第４２１６−４２２０頁〔G. Urlaub and L. A.C
hasin, Proc. of Natl. Acad. Sci., USA. 77 (1980) 4
216-4220〕に記載されている。ｄｈｆｒ- 型細胞系はこ
の方法によって得られる。同様に、再現可能な方法で他
の哺乳動物細胞系を製造することもできる。変異株は三
成分栄養要求株であって、増殖のためにグリシン、ヒポ
キサンチン等のプリン系ヌクレオチド及びチミジンを必
要とする。
酸レダクターゼを産生し得ない哺乳動物細胞（ｄｈｆｒ
- ）及びこの欠陥を補い得る適当なベクターは一般的に
公知である〔エルンストーエル・ウィンナッカー「遺伝
子及びクローン、遺伝子操作概論」、ＶＣＨフェルラー
クスゲゼルシャフト・ワインハイム、１９８４年、第２
６７、２６８、２８２、２８９頁（Ernst-L. Winnacke
r，Gene und Klone, eineEinfuehrung in die Gen-tech
nologie, VCH Verlasgesellschaft Weinheim，1984, pa
ges 267/268, 282, 289)〕。例えば、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ活性が欠乏したＣＨＯ細胞変異株の単離法に関
しては、ジー・ウルラウプ及びエル・エー・チェーシ
ン、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシーズ ＵＳＡ、第７７巻、１９８
０年、第４２１６−４２２０頁〔G. Urlaub and L. A.C
hasin, Proc. of Natl. Acad. Sci., USA. 77 (1980) 4
216-4220〕に記載されている。ｄｈｆｒ- 型細胞系はこ
の方法によって得られる。同様に、再現可能な方法で他
の哺乳動物細胞系を製造することもできる。変異株は三
成分栄養要求株であって、増殖のためにグリシン、ヒポ
キサンチン等のプリン系ヌクレオチド及びチミジンを必
要とする。
【０００８】ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を動物細
胞中に挿入し得るベクターは、例えばエフ・リーら、ネ
ーチャー、第２９４巻、１９８１年、第２８８頁〔F. L
ee et al., Nature 294 (1981) 288〕に記載されてい
る。そのためには、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼを
コードするｃＤＮＡの使用が必要とされる〔エー・シー
・ワイ・チャン（A. C．Y. Chang）ら、ネーチャー、第
２７５巻、１９７８年、第６１７−６２４頁〕。同様の
方法で、哺乳動物細胞中で機能するジヒドロ葉酸レダク
ターゼの他の遺伝子を用いることができる。
胞中に挿入し得るベクターは、例えばエフ・リーら、ネ
ーチャー、第２９４巻、１９８１年、第２８８頁〔F. L
ee et al., Nature 294 (1981) 288〕に記載されてい
る。そのためには、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼを
コードするｃＤＮＡの使用が必要とされる〔エー・シー
・ワイ・チャン（A. C．Y. Chang）ら、ネーチャー、第
２７５巻、１９７８年、第６１７−６２４頁〕。同様の
方法で、哺乳動物細胞中で機能するジヒドロ葉酸レダク
ターゼの他の遺伝子を用いることができる。
【０００９】系はＣＨＯ ｄｈｆｒ- 細胞及びマウスＤ
ＨＦＲ遺伝子であることが好ましい。
ＨＦＲ遺伝子であることが好ましい。
【００１０】好ましいＡＴIII 用発現ベクターでは、Ｓ
Ｖ４０複製源ＤＮＡ領域由来の初期プロモーター、即ち
ヒトメタロチオネインIIプロモーター〔エム・カリン
（M. Karin）及びアール・アイ・リチャーズ（R. I. Ri
chards）、ネーチャー、第２９９巻、１９８２年、第７
９７−８０２頁〕、ＨＣＭＶ〔ヒトサイトメガロウイル
ス、エム・ボシャートら、セル、第４１巻、１９８５
年、第５２１−５３０頁（M. Boshart et al., Cell 41
(1985) 521-530)〕由来早初期（immediate early）遺
伝子のエンハンサー‐プロモーター領域又はショウジョ
ウバエ熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ ７０）プロ
モーター〔ホルムグレン（Holmgren）ら、セル、第１８
巻、１９７９年、第１３５９−１３７０頁〕を利用す
る。ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現は、例えばＭＭＴ
Ｖ‐ＬＴＲ〔マウス乳がんウイルス‐ＬＴＲ配列（long
terminal repeat）、エフ・リー（F. Lee）ら、同上〕
のような哺乳動物細胞系において弱い活性を有するプロ
モーターの制御下で生じることができるが、真核細胞プ
ロモーターのない場合も本発明の一態様をなす。後者の
場合、ＤＨＦＲ遺伝子はｐＢＲ ３２２ＤＮＡ配列のす
ぐ上流に位置するが、哺乳動物細胞においてはこの配列
は弱いプロモーターとして明らかに認識されている〔ケ
ー・ディー・ラングナー（K. D. Langner ）ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズ ＵＳＡ、第８３巻、１９８６年、第１
５９８−１６０２頁〕。
Ｖ４０複製源ＤＮＡ領域由来の初期プロモーター、即ち
ヒトメタロチオネインIIプロモーター〔エム・カリン
（M. Karin）及びアール・アイ・リチャーズ（R. I. Ri
chards）、ネーチャー、第２９９巻、１９８２年、第７
９７−８０２頁〕、ＨＣＭＶ〔ヒトサイトメガロウイル
ス、エム・ボシャートら、セル、第４１巻、１９８５
年、第５２１−５３０頁（M. Boshart et al., Cell 41
(1985) 521-530)〕由来早初期（immediate early）遺
伝子のエンハンサー‐プロモーター領域又はショウジョ
ウバエ熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ ７０）プロ
モーター〔ホルムグレン（Holmgren）ら、セル、第１８
巻、１９７９年、第１３５９−１３７０頁〕を利用す
る。ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現は、例えばＭＭＴ
Ｖ‐ＬＴＲ〔マウス乳がんウイルス‐ＬＴＲ配列（long
terminal repeat）、エフ・リー（F. Lee）ら、同上〕
のような哺乳動物細胞系において弱い活性を有するプロ
モーターの制御下で生じることができるが、真核細胞プ
ロモーターのない場合も本発明の一態様をなす。後者の
場合、ＤＨＦＲ遺伝子はｐＢＲ ３２２ＤＮＡ配列のす
ぐ上流に位置するが、哺乳動物細胞においてはこの配列
は弱いプロモーターとして明らかに認識されている〔ケ
ー・ディー・ラングナー（K. D. Langner ）ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズ ＵＳＡ、第８３巻、１９８６年、第１
５９８−１６０２頁〕。
【００１１】適当な発現系は、米国特許第４，３９９，
２１６号及び第４，５７６，８２１号、並びに公開第
０，１００，５２１号及び第０，１１７，０５８〜第
０，１１７，０６０号の欧州特許出願の明細書にも記載
されている。
２１６号及び第４，５７６，８２１号、並びに公開第
０，１００，５２１号及び第０，１１７，０５８〜第
０，１１７，０６０号の欧州特許出願の明細書にも記載
されている。
【００１２】本発明の他の態様では、イントロン又はス
プライス部位を有さないベクターを用いる。このような
ベクターが非常に有効であるというのは驚くべきことで
ある。というのは、ＲＮＡスプライス部位が欧州特許出
願第Ａ２，０９０，５０５号明細書において細胞培養物
中でのＡＴIII 発現用ベクターには必要であると述べら
れているからである。
プライス部位を有さないベクターを用いる。このような
ベクターが非常に有効であるというのは驚くべきことで
ある。というのは、ＲＮＡスプライス部位が欧州特許出
願第Ａ２，０９０，５０５号明細書において細胞培養物
中でのＡＴIII 発現用ベクターには必要であると述べら
れているからである。
【００１３】ジヒドロ葉酸レダクターゼはメソトレキセ
ートで阻害されることが知られている。このため、グリ
シン、ヒポキサンチン及びチミジン非含有培地中で増殖
する細胞は、メソトレキセートでそれらの増殖が阻害さ
れるか又は殺滅せしめられる。培地中のメソトレキセー
ト濃度及び細胞密度を変えることにより、メソトレキセ
ート存在下で増殖する細胞を選択することができる。こ
れらの細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅及びそれに関連し
たＤＨＦＲ酵素の産生増加に起因して、選択されたメソ
トレキセート濃度に対し耐性となる。生存細胞は再度よ
り高いメソトレキセート濃度に接触せしめられ、しかる
後更に多数のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞系に変わる。
ートで阻害されることが知られている。このため、グリ
シン、ヒポキサンチン及びチミジン非含有培地中で増殖
する細胞は、メソトレキセートでそれらの増殖が阻害さ
れるか又は殺滅せしめられる。培地中のメソトレキセー
ト濃度及び細胞密度を変えることにより、メソトレキセ
ート存在下で増殖する細胞を選択することができる。こ
れらの細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅及びそれに関連し
たＤＨＦＲ酵素の産生増加に起因して、選択されたメソ
トレキセート濃度に対し耐性となる。生存細胞は再度よ
り高いメソトレキセート濃度に接触せしめられ、しかる
後更に多数のＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞系に変わる。
【００１４】遺伝子増幅は、下記の二つの異なる技術に
よって行なうことができる。
よって行なうことができる。
【００１５】１． 細胞を、これを漸増メソトレキセー
ト濃度に単に通すことにより増幅させる。その結果、異
なる増幅度をもつ細胞からなる遺伝的異種細胞群とな
る。
ト濃度に単に通すことにより増幅させる。その結果、異
なる増幅度をもつ細胞からなる遺伝的異種細胞群とな
る。
【００１６】２． 各々のメソトレキセート濃度レベル
において遺伝的均一細胞クローンが単離され、分析され
るが、各レベルで最大の発現性をもつ細胞系のみが次の
より高いレベルに移し替えられる。
において遺伝的均一細胞クローンが単離され、分析され
るが、各レベルで最大の発現性をもつ細胞系のみが次の
より高いレベルに移し替えられる。
【００１７】本発明に従い共形質感染された細胞系にお
いて、メソトレキセートによる遺伝子増幅の結果として
ＤＨＦＲ遺伝子が増加したのみならずＡＴIII 遺伝子も
増幅した。
いて、メソトレキセートによる遺伝子増幅の結果として
ＤＨＦＲ遺伝子が増加したのみならずＡＴIII 遺伝子も
増幅した。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】動物細胞を培養増殖さ
せるためには、血清が増殖培地中に存在することが通常
要求される。ＡＴIII 産生細胞系は血清含有培地及び無
血清培地で交互に培養され得ることが見出されたが、そ
の間にＡＴIII 発現速度の低下は数回の移し替えに際し
てもみられなかった。
せるためには、血清が増殖培地中に存在することが通常
要求される。ＡＴIII 産生細胞系は血清含有培地及び無
血清培地で交互に培養され得ることが見出されたが、そ
の間にＡＴIII 発現速度の低下は数回の移し替えに際し
てもみられなかった。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明の方法のこの態様
は、価格的に血清を節約できることから有利であるのみ
ならず、最後の産生段階が血清非存在下で行なわれる場
合にはＡＴIII の回収量を著しく高めることもできる。
は、価格的に血清を節約できることから有利であるのみ
ならず、最後の産生段階が血清非存在下で行なわれる場
合にはＡＴIII の回収量を著しく高めることもできる。
【００２０】本発明により得られる組換えＡＴIII は十
分な生物学的活性を有する。これは、ヒト血漿から単離
される天然産物の場合と全く同様に、ヘパリンによって
刺激される。したがって、天然産物と同様に、薬剤の製
造にも適している。
分な生物学的活性を有する。これは、ヒト血漿から単離
される天然産物の場合と全く同様に、ヘパリンによって
刺激される。したがって、天然産物と同様に、薬剤の製
造にも適している。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明は下記の諸例において詳細
に説明されている。ベクターの構築は図１〜図４で更に
説明されているが、一般に図面はスケール的に正確では
ない。特に、小断片及びポリリンカー配列の表示は原則
として“伸長”されている。例１ ａ）動物細胞用発現ベクターの構築 プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ（図１）（リーら、同上）
をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ４０初期
プロモーターを有する２．６５ｋｂベクター断片を単離
した。ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来の６７ｂｐ Ｈｉｎｄ
III ‐ＥｃｏＲＩ断片 （ブレーカー及びアマン、同
上）をこの方法で前処理されたベクターに組込み、プラ
スミドｐＳＶ２ ＳＴＯＰを得た。翻訳停止コードン
は、ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来６７ｂｐ断片の３種すべ
ての読取り枠に存在している。ｐＳＶ２ＳＴＯＰをＳａ
ｃＩで直鎖化し、得られる３′突出端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を利用して
切除した。次いでＥｃｏＲＩ切断を行なった。初期転写
用のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するｐＢＢ３
（図２）〔ビー・ブーラショら、ＥＭＢＯジャーナル、
第１巻、１９８２年、第８９５−９００頁（B. Bourach
ot et al., EMBO Journal, 1 (1982) 895-900 〕の１３
３ｂｐ ＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ断片に結合させた後、発
現ベクター ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１を得た。
に説明されている。ベクターの構築は図１〜図４で更に
説明されているが、一般に図面はスケール的に正確では
ない。特に、小断片及びポリリンカー配列の表示は原則
として“伸長”されている。例１ ａ）動物細胞用発現ベクターの構築 プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ（図１）（リーら、同上）
をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ４０初期
プロモーターを有する２．６５ｋｂベクター断片を単離
した。ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来の６７ｂｐ Ｈｉｎｄ
III ‐ＥｃｏＲＩ断片 （ブレーカー及びアマン、同
上）をこの方法で前処理されたベクターに組込み、プラ
スミドｐＳＶ２ ＳＴＯＰを得た。翻訳停止コードン
は、ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来６７ｂｐ断片の３種すべ
ての読取り枠に存在している。ｐＳＶ２ＳＴＯＰをＳａ
ｃＩで直鎖化し、得られる３′突出端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を利用して
切除した。次いでＥｃｏＲＩ切断を行なった。初期転写
用のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するｐＢＢ３
（図２）〔ビー・ブーラショら、ＥＭＢＯジャーナル、
第１巻、１９８２年、第８９５−９００頁（B. Bourach
ot et al., EMBO Journal, 1 (1982) 895-900 〕の１３
３ｂｐ ＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ断片に結合させた後、発
現ベクター ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１を得た。
【００２２】ポリアデニル化部位はベクターｐＩＧ６
（ブーラショら、同上）から単離することもできる。
（ブーラショら、同上）から単離することもできる。
【００２３】ＢａｍＨＩ切断部位を埋填しかつＥｃｏＲ
Ｉリンカーを結合させるために、同様の方法でＳＶ４０
ゲノムから１３３ｂｐ ＢａｍＨＩ‐ＨｐａＩ断片を単
離することもできる。
Ｉリンカーを結合させるために、同様の方法でＳＶ４０
ゲノムから１３３ｂｐ ＢａｍＨＩ‐ＨｐａＩ断片を単
離することもできる。
【００２４】このように、ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１は、Ｓ
Ｖ ４０初期（early ）プロモーターと初期転写用 Ｓ
Ｖ４０ポリアデニル化シグナルとの間に、三つの独特な
制限部位（ＨｉｎｄIII ‐ＳａｌＩ‐ＸｂａＩ）をもつ
クローニング用ポリリンカー及び３種すべての読取り枠
の翻訳停止コードンをもつ配列を有している。 ｂ）ＡＴIII 発現ベクターの構築 ＡＴIII ｃＤＮＡは、欧州特許出願第Ａ２０，０９０，
５０５号（又は米国特許第 ４，５１７，２９４号）明
細書に開示されており、そこの記載通りに製造すること
も又は常法に従って合成することもできる。西独特許出
願Ｐ３６ １８６３８．４号明細書は、プラスミドｐＵ
Ｃ１３のＳｍａＩ切断部位にＡＴIIIｃＤＮＡを有する
プラスミドｐβＡＴ６（図１）を提案している。
Ｖ ４０初期（early ）プロモーターと初期転写用 Ｓ
Ｖ４０ポリアデニル化シグナルとの間に、三つの独特な
制限部位（ＨｉｎｄIII ‐ＳａｌＩ‐ＸｂａＩ）をもつ
クローニング用ポリリンカー及び３種すべての読取り枠
の翻訳停止コードンをもつ配列を有している。 ｂ）ＡＴIII 発現ベクターの構築 ＡＴIII ｃＤＮＡは、欧州特許出願第Ａ２０，０９０，
５０５号（又は米国特許第 ４，５１７，２９４号）明
細書に開示されており、そこの記載通りに製造すること
も又は常法に従って合成することもできる。西独特許出
願Ｐ３６ １８６３８．４号明細書は、プラスミドｐＵ
Ｃ１３のＳｍａＩ切断部位にＡＴIIIｃＤＮＡを有する
プラスミドｐβＡＴ６（図１）を提案している。
【００２５】ＡＴIII ｃＤＮＡのサブクローニング用プ
ラスミドｐβＡＴ６（図３）を唯一のＥｃｏＲＩ部位で
切断することにより直鎖化した。形成される５′突出末
端は、相補鎖をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
に埋填することによりブラント末端化し、次いでＳａｌ
Ｉリンカー： ５′ｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ）３′ と結合させた。次のＸｂａＩ切断により、大きさが約１
４００ｂｐであってかつ単離されるべき完全プレＡＴII
I をコードするＤＮＡ断片を得た。ｐＳＶＡIIIは、Ｓ
ａｌＩ及びＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＳＶＡ
ＳＴＯＰ１にこの断片を結合させることにより得た。
ラスミドｐβＡＴ６（図３）を唯一のＥｃｏＲＩ部位で
切断することにより直鎖化した。形成される５′突出末
端は、相補鎖をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
に埋填することによりブラント末端化し、次いでＳａｌ
Ｉリンカー： ５′ｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ）３′ と結合させた。次のＸｂａＩ切断により、大きさが約１
４００ｂｐであってかつ単離されるべき完全プレＡＴII
I をコードするＤＮＡ断片を得た。ｐＳＶＡIIIは、Ｓ
ａｌＩ及びＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＳＶＡ
ＳＴＯＰ１にこの断片を結合させることにより得た。
【００２６】ｐＳＶＡＴIII 上のＡＴIII 転写単位はｍ
ＲＮＡスプライス部位を有していない。 ｃ）共形質感染用ＤＨＦＲ発現ベクターの構築 共形質感染のために用いられるＤＨＦＲベクターの出発
点はプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ（リーら、同上）であ
った。ｐＭＴＶｄｈｆｒ（図４）をＢａｌIIで切断し、
ＤＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノ
ウ断片）で埋填した。ＥｃｏＲＩで切断後、４．４７ｋ
ｂ断片を単離し、ｐＢＢ３（ブーラショら、同上）の１
３３ｂｐ ＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ断片と結合させた。新
規プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒは、ＭＭＴＶ‐ＬＴＲ
が外接したマウスＤＨＦＲｃＤＮＡ及び初期転写用ＳＶ
４０ポリアデニル化部位を有する。
ＲＮＡスプライス部位を有していない。 ｃ）共形質感染用ＤＨＦＲ発現ベクターの構築 共形質感染のために用いられるＤＨＦＲベクターの出発
点はプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ（リーら、同上）であ
った。ｐＭＴＶｄｈｆｒ（図４）をＢａｌIIで切断し、
ＤＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノ
ウ断片）で埋填した。ＥｃｏＲＩで切断後、４．４７ｋ
ｂ断片を単離し、ｐＢＢ３（ブーラショら、同上）の１
３３ｂｐ ＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ断片と結合させた。新
規プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒは、ＭＭＴＶ‐ＬＴＲ
が外接したマウスＤＨＦＲｃＤＮＡ及び初期転写用ＳＶ
４０ポリアデニル化部位を有する。
【００２７】ｐＳＶＯＡｄｈｆｒは、大きさが１４５０
ｂｐでＭＭＴＶ‐ＬＴＲを有するＨｉｎｄIII 断片の切
除によって、ｐＭＴＶＡｄｈｆｒから得た。
ｂｐでＭＭＴＶ‐ＬＴＲを有するＨｉｎｄIII 断片の切
除によって、ｐＭＴＶＡｄｈｆｒから得た。
【００２８】ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及びｐＳＶＯＡｄｈｆ
ｒは、いずれもｍＲＮＡスプライス部位を有していな
い。例２ プラスミドｐＳＶＡＴIII 及びｐＭＴＶＡ ｄｈｆｒも
しくはｐＳＶＯＡｄｈｆｒをリン酸カルシウム沈降法
〔グレアム及びフォン・デル・エブ、バイロロジー、第
５２巻、１９７３年、第 ４５６−４６７頁（Graham a
nd von der Eb,Virology 52 (1973) 456-467)〕により
ＣＨＯ ｄｈｆｒ- 細胞に導入した。このために、プラ
スミドｐＳＶＡＴIII ２０μｇをＤＨＦＲ発現プラス
ミドｐＭＴＶｄｈｆｒ又はｐＳＶＯＡｄｈｆｒ５μｇと
混合し、共沈降させた。プラスミド混合物の共沈降物を
上記のようにＣＨＯ ｄｈｆｒ- 細胞中に形質感染させ
た（２５cm2 培養フラスコ中０．５×１０6 細胞）。３
日後、細胞をトリプシン処理し、数個の６０mmペトリ皿
に移し替え、これに選択培地（グリシン、ヒポキサンチ
ン及びチミジン不含）を加えた。これらの条件下で生存
する細胞のみが、ＤＨＦＲ遺伝子により安定な形質感染
をうけた細胞である。
ｒは、いずれもｍＲＮＡスプライス部位を有していな
い。例２ プラスミドｐＳＶＡＴIII 及びｐＭＴＶＡ ｄｈｆｒも
しくはｐＳＶＯＡｄｈｆｒをリン酸カルシウム沈降法
〔グレアム及びフォン・デル・エブ、バイロロジー、第
５２巻、１９７３年、第 ４５６−４６７頁（Graham a
nd von der Eb,Virology 52 (1973) 456-467)〕により
ＣＨＯ ｄｈｆｒ- 細胞に導入した。このために、プラ
スミドｐＳＶＡＴIII ２０μｇをＤＨＦＲ発現プラス
ミドｐＭＴＶｄｈｆｒ又はｐＳＶＯＡｄｈｆｒ５μｇと
混合し、共沈降させた。プラスミド混合物の共沈降物を
上記のようにＣＨＯ ｄｈｆｒ- 細胞中に形質感染させ
た（２５cm2 培養フラスコ中０．５×１０6 細胞）。３
日後、細胞をトリプシン処理し、数個の６０mmペトリ皿
に移し替え、これに選択培地（グリシン、ヒポキサンチ
ン及びチミジン不含）を加えた。これらの条件下で生存
する細胞のみが、ＤＨＦＲ遺伝子により安定な形質感染
をうけた細胞である。
【００２９】形質感染細胞からなるコロニーは、１〜３
週間後にペトリ皿中で目に見えるようになる。この場合
に下記形質感染率を達成することができた： ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ ５×１０-6 ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ １×１０-5 単一のコロニーを単離し、グリシン、ヒポキサンチン及
びチミジン不含培地中で増殖させた。
週間後にペトリ皿中で目に見えるようになる。この場合
に下記形質感染率を達成することができた： ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ ５×１０-6 ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ １×１０-5 単一のコロニーを単離し、グリシン、ヒポキサンチン及
びチミジン不含培地中で増殖させた。
【００３０】これら新規細胞系（ＣＨＯ ＳＶＡＴIII
）の培養上澄をヒトＡＴIII 検出のための特異的ＥＬ
ＩＳＡ法により組換えＡＴIII に関して試験した。この
試験により、被験ＣＨＯ ｄｈｆｒ+ 細胞系の２０％が
培地中にヒトＡＴIII を検出可能量分泌していることが
判った。ＡＴIII 産生系の発現速度を定量するため、下
記標準試験操作を行い、細胞０．５×１０6 個を２５cm
2 培養フラスコ内の培地５ml中で培養した。培地を２４
時間後変更した（５ml）。更に２４時間後培地をＥＬＩ
ＳＡ用に回収し、細胞をトリプシン処理し、計数した。
報告した数値は少なくとも３回の移し替えの平均値を表
わしており、発現速度は±２５％の範囲内で一定であっ
た。以下で報告するすべての発現（μｇ／１０6 細胞／
２４hr）に関し、試験の最後における２５cm2 フラスコ
当りの細胞数は１±０．２５×１０6 個の細胞であっ
た。下記表は、上記方法で試験された基本的クローンの
発現速度を示すものである。 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ クローン１：０．１４μｇ／１０6 細胞／２４hr クローン２：０．１１μｇ／１０6 細胞／２４hr ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１：０．０８μｇ／１０6 細胞／２４hr クローン２：０．１４μｇ／１０6 細胞／２４hr例３ 組込みＡＴIII 配列の増幅 ａ）個々のクローンを単離しない増幅 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＡｄｈｆｒ（クローン１及
び２）及びＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ
（クローン１及び２）を漸増メソトレキセート（Mtx ）
濃度中に連続的に移し替えた。上記標準法で定量された
発現速度（μｇ／１０6 細胞／２４hr）は下記のとおり
であった。 Ｍｔｘ ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１ クローン２ クローン１ クローン２ ０ ０．１４ ０．１１ ０．０８ ０．１４ ０．０５ ０．３４ ０．５４ − − ０．１５ − ０．６０ ０．６４ ２．７ ０．３ ０．５５ １．１５ − ３．３ ０．６ １．１８ ２．００ ０．８６ − １ − − １．５ − ５μＭ − ４．００ − ８．５ ｂ）個々のクローンを単離する増幅 用いられるＭｔｘ濃度レベルは０．１〜１μＭであっ
た。０．１μＭ Ｍｔｘに耐性のクローンは、ＣＨＯ
ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ（クローン２）（図５
中“Ｂ”）から出発した場合８個、ＣＨＯ ＳＶＡＴII
I ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ （クローン１）（図５中
“Ａ”）から出発した場合１１個が単離され、それらの
発現速度に基づき特徴づけられた（図５）。縦座標はＡ
ＴIII 収量μｇ／１０6 細胞／２４hrを示す。これらす
べてのクローンは、関連出発クローンの場合よりも多量
のＡＴIII を産生する（上記参照）。０．１μＭ Ｍｔ
ｘ中で増殖するクローンの発現速度は、ＣＨＯ ＳＶＡ
ＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ（クローン２）から出発した
場合に０．１５〜０．８μｇ／１０6 細胞／２４hr
（１．４〜７倍の増量に相当する）及びＣＨＯ ＳＶＡ
ＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ（クローン１）から出発した
場合に０．３５〜３．２μｇ／１０6 細胞／２４hr（４
〜４０倍の増量に相当する）であった。サザーンブロッ
ト法〔サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、第９８巻、１９７５年、第５０３頁（Sout
hern, Journal of Molecular Biology, 98 (1975) 50
3)〕により、形質感染 ＡＴIII ｃＤＮＡの特定の１４
００ｂｐ ＢａｍＨＩ‐ＨｉｎｄIII 断片は０．１μＭ
Ｍｔｘ中で増殖するすべての分析クローンにおいて増
殖せしめられていることが示された。
）の培養上澄をヒトＡＴIII 検出のための特異的ＥＬ
ＩＳＡ法により組換えＡＴIII に関して試験した。この
試験により、被験ＣＨＯ ｄｈｆｒ+ 細胞系の２０％が
培地中にヒトＡＴIII を検出可能量分泌していることが
判った。ＡＴIII 産生系の発現速度を定量するため、下
記標準試験操作を行い、細胞０．５×１０6 個を２５cm
2 培養フラスコ内の培地５ml中で培養した。培地を２４
時間後変更した（５ml）。更に２４時間後培地をＥＬＩ
ＳＡ用に回収し、細胞をトリプシン処理し、計数した。
報告した数値は少なくとも３回の移し替えの平均値を表
わしており、発現速度は±２５％の範囲内で一定であっ
た。以下で報告するすべての発現（μｇ／１０6 細胞／
２４hr）に関し、試験の最後における２５cm2 フラスコ
当りの細胞数は１±０．２５×１０6 個の細胞であっ
た。下記表は、上記方法で試験された基本的クローンの
発現速度を示すものである。 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ クローン１：０．１４μｇ／１０6 細胞／２４hr クローン２：０．１１μｇ／１０6 細胞／２４hr ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１：０．０８μｇ／１０6 細胞／２４hr クローン２：０．１４μｇ／１０6 細胞／２４hr例３ 組込みＡＴIII 配列の増幅 ａ）個々のクローンを単離しない増幅 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＡｄｈｆｒ（クローン１及
び２）及びＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ
（クローン１及び２）を漸増メソトレキセート（Mtx ）
濃度中に連続的に移し替えた。上記標準法で定量された
発現速度（μｇ／１０6 細胞／２４hr）は下記のとおり
であった。 Ｍｔｘ ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１ クローン２ クローン１ クローン２ ０ ０．１４ ０．１１ ０．０８ ０．１４ ０．０５ ０．３４ ０．５４ − − ０．１５ − ０．６０ ０．６４ ２．７ ０．３ ０．５５ １．１５ − ３．３ ０．６ １．１８ ２．００ ０．８６ − １ − − １．５ − ５μＭ − ４．００ − ８．５ ｂ）個々のクローンを単離する増幅 用いられるＭｔｘ濃度レベルは０．１〜１μＭであっ
た。０．１μＭ Ｍｔｘに耐性のクローンは、ＣＨＯ
ＳＶＡＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ（クローン２）（図５
中“Ｂ”）から出発した場合８個、ＣＨＯ ＳＶＡＴII
I ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ （クローン１）（図５中
“Ａ”）から出発した場合１１個が単離され、それらの
発現速度に基づき特徴づけられた（図５）。縦座標はＡ
ＴIII 収量μｇ／１０6 細胞／２４hrを示す。これらす
べてのクローンは、関連出発クローンの場合よりも多量
のＡＴIII を産生する（上記参照）。０．１μＭ Ｍｔ
ｘ中で増殖するクローンの発現速度は、ＣＨＯ ＳＶＡ
ＴIII ‐ＭＴＶＡｄｈｆｒ（クローン２）から出発した
場合に０．１５〜０．８μｇ／１０6 細胞／２４hr
（１．４〜７倍の増量に相当する）及びＣＨＯ ＳＶＡ
ＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ（クローン１）から出発した
場合に０．３５〜３．２μｇ／１０6 細胞／２４hr（４
〜４０倍の増量に相当する）であった。サザーンブロッ
ト法〔サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、第９８巻、１９７５年、第５０３頁（Sout
hern, Journal of Molecular Biology, 98 (1975) 50
3)〕により、形質感染 ＡＴIII ｃＤＮＡの特定の１４
００ｂｐ ＢａｍＨＩ‐ＨｉｎｄIII 断片は０．１μＭ
Ｍｔｘ中で増殖するすべての分析クローンにおいて増
殖せしめられていることが示された。
【００３１】１μＭ Ｍｔｘでの次の増殖過程は、０．
１ μＭ Ｍｔｘに耐性である最大産生細胞系の一つ
（ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ、クローン
１ Ａ２、２．２μｇ／１０6 細胞／２４hr、図５では
“Ａ２”として示されている）において行なわれた。こ
の場合に、順次９個のクローンを試験して、約１０μｇ
／１０6 細胞／２４hrを産生する細胞系（ＣＨＯ ＳＶ
ＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１ Ａ２７）を
単離することができた。例４ 無血清培地中でのＡＴIII の合成 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒクローン１
Ａ２７（１μＭ Ｍｔｘ）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児
血清存在下１７５cm2 培養フラスコ中のＨａｍＦ１２選
択培地（グリシン、チミジン及びヒポキサンチン不含）
中において集密率（confluence）約８０％まで培養し、
しかる後無血清イスコブズ（Iskoves ）培地で洗浄し、
次いでＡＴIII を産生させるためにこの培地中で４８時
間培養した。培養後における培地中のＡＴIII 濃度は５
〜６μｇ／mlであった。次いで細胞を、別の４８時間産
生過程が無血清培地中で開始されるまで、血清含有培地
中で２４〜４８時間培養し、ＡＴIII 発現速度の低下を
招くことなく数回にわたり上記産生サイクルを繰返すこ
とができた。例５ 動物細胞由来ＡＴIII の精製及び特徴 ＡＴIII をヘパリン‐セファロース(SEPHAROSER ）アフ
ィニティークロマトグラフィーにより血清含有及び無血
清培地の双方から回収した〔ミラー‐アンダーセンら、
トロンボシス・リサーチ、第５巻、１９７４年、第４３
９−４５２頁（Miller- Anderssen et al., Thrombosis
Reseearch, 5 (1974) 439-452) 〕。回収された物質
は、オクテルロニー免疫拡散試験法〔プログレス・オブ
・アレルギー、第５巻、１９５８年、第１頁（Progress
of Allergy, 5 (1958) 1)〕によるとヒト血清から得ら
れたＡＴIII と免疫学的に同一であることを示した。Ａ
ＴIII 特異的抗体とのウエスターンブロット法でも、ヒ
ト血漿由来ＡＴIII と ＣＨＯ細胞由来組換えＡＴIII
との同一性を示した。ＣＨＯ細胞から分泌されるＡＴII
I は、十分な程度にまで、ヘパリンコファクター〔ヘン
セン及びレーリガー、トロンボシス・エト・ジアセシス
・ヘモラギカ、第９巻、１９６３年、増刊第１号、第１
８−１９頁(Hensen and Loeliger, Thrombo-sis et Dia
thesis Haemorrhagica, 9 (1963) Suppl. 1, 18-29)〕
及び進行性インヒビター活性〔シュラダーら、Aerztl.
Lab., 第２９巻、１９８３年、第３５−３９頁〕の双
方を有する。
１ μＭ Ｍｔｘに耐性である最大産生細胞系の一つ
（ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ、クローン
１ Ａ２、２．２μｇ／１０6 細胞／２４hr、図５では
“Ａ２”として示されている）において行なわれた。こ
の場合に、順次９個のクローンを試験して、約１０μｇ
／１０6 細胞／２４hrを産生する細胞系（ＣＨＯ ＳＶ
ＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒ クローン１ Ａ２７）を
単離することができた。例４ 無血清培地中でのＡＴIII の合成 ＣＨＯ ＳＶＡＴIII ‐ＳＶＯＡｄｈｆｒクローン１
Ａ２７（１μＭ Ｍｔｘ）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児
血清存在下１７５cm2 培養フラスコ中のＨａｍＦ１２選
択培地（グリシン、チミジン及びヒポキサンチン不含）
中において集密率（confluence）約８０％まで培養し、
しかる後無血清イスコブズ（Iskoves ）培地で洗浄し、
次いでＡＴIII を産生させるためにこの培地中で４８時
間培養した。培養後における培地中のＡＴIII 濃度は５
〜６μｇ／mlであった。次いで細胞を、別の４８時間産
生過程が無血清培地中で開始されるまで、血清含有培地
中で２４〜４８時間培養し、ＡＴIII 発現速度の低下を
招くことなく数回にわたり上記産生サイクルを繰返すこ
とができた。例５ 動物細胞由来ＡＴIII の精製及び特徴 ＡＴIII をヘパリン‐セファロース(SEPHAROSER ）アフ
ィニティークロマトグラフィーにより血清含有及び無血
清培地の双方から回収した〔ミラー‐アンダーセンら、
トロンボシス・リサーチ、第５巻、１９７４年、第４３
９−４５２頁（Miller- Anderssen et al., Thrombosis
Reseearch, 5 (1974) 439-452) 〕。回収された物質
は、オクテルロニー免疫拡散試験法〔プログレス・オブ
・アレルギー、第５巻、１９５８年、第１頁（Progress
of Allergy, 5 (1958) 1)〕によるとヒト血清から得ら
れたＡＴIII と免疫学的に同一であることを示した。Ａ
ＴIII 特異的抗体とのウエスターンブロット法でも、ヒ
ト血漿由来ＡＴIII と ＣＨＯ細胞由来組換えＡＴIII
との同一性を示した。ＣＨＯ細胞から分泌されるＡＴII
I は、十分な程度にまで、ヘパリンコファクター〔ヘン
セン及びレーリガー、トロンボシス・エト・ジアセシス
・ヘモラギカ、第９巻、１９６３年、増刊第１号、第１
８−１９頁(Hensen and Loeliger, Thrombo-sis et Dia
thesis Haemorrhagica, 9 (1963) Suppl. 1, 18-29)〕
及び進行性インヒビター活性〔シュラダーら、Aerztl.
Lab., 第２９巻、１９８３年、第３５−３９頁〕の双
方を有する。
【図１】図１は、ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII断
片、複製源のＨｉｎｄIII ‐ＰｖｕII断片及び初期・後
期転写用プロモーター、並びにＳＶ４０ゲノムＢａｍＨ
Ｉ‐ＨｐａＩ断片のポリアデニル化部位及びプラスミド
ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰの翻訳停止コードンを有するベク
ターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１の構築（前半）を示す説明図
である。
片、複製源のＨｉｎｄIII ‐ＰｖｕII断片及び初期・後
期転写用プロモーター、並びにＳＶ４０ゲノムＢａｍＨ
Ｉ‐ＨｐａＩ断片のポリアデニル化部位及びプラスミド
ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰの翻訳停止コードンを有するベク
ターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１の構築（前半）を示す説明図
である。
【図２】図２は、ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII断
片、複製源のＨｉｎｄIII ‐ＰｖｕII断片及び初期・後
期転写用プロモーター、並びにＳＶ４０ゲノムＢａｍＨ
Ｉ‐ＨｐａＩ断片のポリアデニル化部位及びプラスミド
ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰの翻訳停止コードンを有するベク
ターｐＳＴＰＯ１の構築（後半）を示す説明図である。
片、複製源のＨｉｎｄIII ‐ＰｖｕII断片及び初期・後
期転写用プロモーター、並びにＳＶ４０ゲノムＢａｍＨ
Ｉ‐ＨｐａＩ断片のポリアデニル化部位及びプラスミド
ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰの翻訳停止コードンを有するベク
ターｐＳＴＰＯ１の構築（後半）を示す説明図である。
【図３】図３は、ＡＴIII をコードするＤＮＡ配列のベ
クターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１への組込み方を示す説明図
である。
クターｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１への組込み方を示す説明図
である。
【図４】図４は、ベクターｐＭＴＶＡｄｈｆｒ（ＭＭＴ
Ｖ‐ＬＴＲプロモーターを有する）及びｐＳＶＯＡｄｈ
ｆｒ（真核細胞又はウイルスのプロモーターを有してい
ない）の構築を示す説明図である。
Ｖ‐ＬＴＲプロモーターを有する）及びｐＳＶＯＡｄｈ
ｆｒ（真核細胞又はウイルスのプロモーターを有してい
ない）の構築を示す説明図である。
【図５】図５は、最後に述べた二つのベクターのうちの
一つを各々有しかつメソトレキセート存在下遺伝子増幅
により得られた細胞系のＡＴIII 発現速度を示す説明図
である。
一つを各々有しかつメソトレキセート存在下遺伝子増幅
により得られた細胞系のＡＴIII 発現速度を示す説明図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘルマン、ラッグ ドイツ連邦共和国ケルクハイム（タウヌ ス）アム、キルヒプラッツ、14
Claims (11)
- 【請求項１】ＳＶ４０プロモーター配列及びＳＶ４０ポ
リアデニル化部位を有しかつスプライス部分を有さない
ｐＢＲ３２２配列及びＡＴIII ｃＤＮＡ含有発現ベク
ター。 - 【請求項２】ポリアデニル化部位が実質的に１３３ｂｐ
ＢａｍＨＩ‐ＨｐａＩ断片である、請求項１記載のベ
クター。 - 【請求項３】ｐＵＣ１２ ＳＴＯＰ由来の翻訳停止配列
を有する、請求項１又は２記載のベクター。 - 【請求項４】プラスミドｐＳＶ２ ＳＴＯＰ（図１）及
びｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１（図２）。 - 【請求項５】プラスミドｐＳＶＡＴIII （図３）。
- 【請求項６】ＤＨＦＲ遺伝子がｐＢＲ３２２ｏｒｉ領域
に下流で結合せしめられている、マウス ＤＨＦＲ遺伝
子含有ベクター。 - 【請求項７】ＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する、請
求項６記載のベクター。 - 【請求項８】スプライス部位を有さない、請求項６又は
７記載のベクター。 - 【請求項９】プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及びｐＳＶ
ＯＡｄｈｆｒ（図４）。 - 【請求項１０】一方では請求項１〜５のいずれか１項に
記載されたベクターでかつ他方では請求項６〜９のいず
れか１項に記載されたベクターで共形質感染された哺乳
動物細胞。 - 【請求項１１】メソトレキセートを用いて選択された、
請求項１０記載の細胞。
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
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-
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