JPS58501819A - リポソ−ム複合体及びそれを用いた診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リボゾーム複合体及びそれを用いた診断法発明の分野 本発明は一般にリポソーム複合体、特に凝集能の増大した、赤血球、リンパ球及 び白血球のような細胞を迅速かつ感度よく凝集しうる、血液型の決定のような用 途に有用なリポソーム複合物に関する。

本発明は１９８０年３月１２日に出願した米国特許願第１２９、６５４号の一部 継続出願に係る。

発明の背景 リポソームは細胞毒剤又は他の細胞の挙動を変性しうる高分子のような治療剤の 生体内への運搬に有用であることは現在よく認められている。たとえば、１９７ ６年１１月２６日に発行された米国特許第３，９９３，７５４号にけ制癌剤をリ ポソーム内に包封し、包封された薬品を含むす、ｙ（ソームを動物又は人間に注 射する悪性腫瘍の化学療法の改良方法が開示されている。

目標の、すなわち生体内における特異性は、特異性の抗不又ハ植物疑集素との結 合によりリポソームに与えられることが示唆された。抗体とリポソームとの結合 について記述する。それは一般に２つの群、すなわち非特異性結合及び共有結合 に分けられる。

非特異性結合は、脂質二層の疎水性領域に対する抗体のＦｃ部分の親和性に依存 すると思われる。しかしながら、非特異性結合は脂質１マイクロモル当り約１５ 乃至３０μり以上結合することは不可能であると巴われる。また、リポソームは 包封された内容物より過過性がよく、非特異性結合したリポソーム−たんばく質 の形成中にたんばく贋の凝集が生ずるので非特異性結合は実際にはほとんどない 。

米国特許願第１２９．６５４号に記載されているカップリングしたたんばく質の 共有結合たんばく質の調製以前には、たんばく質をリポソームに共有結合させる 試みは不満足であった。たとえば、先行技術の試みのうちにはたんばく質を変化 する傾向のあるたんばくａの変性も含まれていだが、生物活性が実質的に失われ ることが確められた。たんばく質をリポソームに共有結合させるその他の試みに おいても特異性結合は極少量しか得られなかった。

これに対し、米国特許願第１２９，６５４号により活性化されたリポソームは種 々の生物活性たんばく質と容易にかつ能率的に共有結合し、脂質１マイクロモル 当り少くとも約４０μ２のたんばく質と結合する。たとえば、活性化リポソーム を使用すると脂質１マイクロモル当り約２００μ７以下のＦ（ａｂ″：Ｊ２との カップリングが得られる。更に、カップリングしたリポソーム−たんばく質は、 それが誘導されたもとの可溶性の抗体に比べ血球凝集タイターが改良される。

返電、たんばく質をリポソームにカップリングさせる別の有効な方法が報告され ており、ジスルフィド交換反厄を経て燐脂質１マイクロモル当り６００μ７以下 のＴａｂ’がカップリングする。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）らによるバイオケミ ストリー（Ｂｉ　ｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ）第２０巻第４４２９乃至４４３８頁 （１９８１年７月）参照。

一方、凝集法は公知であり、血液型の決定のような用途に有用である。しかしな がら、多くのかかる方法は間接的に実施しなければならないか、又は比較的感度 が低い。たとえば、クームス（Ｃｏｏｍｂｏ）試験は第二の、すなわち中間体の 抗体を使用しなければならないという意味で間接的な凝集法である。更に、特異 性の抗原と結合した場合に正の凝集（たとえば肉眼で見える凝集）を生じない抗 体の検出は、血液交叉試験のような用途には困難である。かかる血清学的に「不 完全な」抗体は十分に官能性の二価のＩｇＧ分子とされているが、２つの細胞を 橋かけすることはできないので正の凝集を生じない。

発明の要約 それ故、赤血球の凝集能が改良された血球凝集試薬を提供することが本発明の目 的である。

赤血球抗原の分析に有用な、迅速かつ感度のよい凝集法を提供することも本発明 の目的である。

通常肉眼で見える血球凝集を生ずることのできない、人間の赤血球表面抗原を凝 集させ、凝集塊を検出することも別の目的である。

本発明の一面では、細胞表面抗原を分析するのに有用な凝集法が、□リポソーム ーたんばく質複合体のたんぼ、く質が少なくとも大部分の複合体に抗原結合能を 供給するような複合体を多量提供し、リポソーム−たんばく質複合体と実質的に 凝集していない細、抱とを接触させて混合物を形成し、混合物について細胞の凝 集を調べることを含む。リポソーム−たんばく質複合体は脂質１マイクロモル当 り少くとも約４３１１ｆのたんばく質を有する。

本発明の別の面では、血球凝集に有用な試薬がリポソームに共有結合している抗 体と、抗体と特異性の抗原を表面に支持している赤血球に対して抗原結合能とを 有するリポソーム〜たんばく質複合体を含む。試薬は、リポソーム−たんばく質 複合体が誘導されたも、との抗体の血球凝集活性に比べて改良された血球凝集活 性を有する。

リポソーム−たんばく質複合体及び本発明の方法は、凝集分析に関してかなシ改 良された感度を提供する。たとえば、リポソーム−たんばく質複合体の使用によ る赤血球の凝集では、数秒の間に大きな、明らかに肉眼で見える細胞の凝集塊が 生ずる。これに対し、もとの可溶性の抗体を用いる凝集分析では、裸眼で見える 凝集を生ずるのに数分を必要とし、細胞の塊はずっと小さい。かくして、一層大 きく、肉眼で見やすい塊を生ずる本発明によるリポソーム−たんばく質複合体の 能力は、観察及び種々の診断の用途に特別な゛、光学的装置を必要としない簡単 な肉眼で見える斑点試験の可能性を示唆する、好ましい実施例の詳細な説明 大ざっばに言えば、本発明の一面はリポンームーリガント複合体をリガンドと結 合する分子と接触創せ−て゛混合物を生成し、混合物についてのりホソームーリ カンド複合体及びリガンドと結合する分子間の結合、すなわち相互作用を調べる 診断法である。リガンドと結合する分子は少くとも一表面、更に好ましくは不連 続な粒子により郭成された複数個の弐面、最も好ましくは細１抱表面により支持 されている。リホ゛ソームーリカンドのりガントは脂質１マイクロモル当り少く とも約４０μ？あり、好ましくは抗原結合能を有するたんばく質である、たとえ ば。

だんばく貿が抗体で、リガンドと結合する分子が細胞表面に支持されている抗原 である場合には、接触工程後の混合試験では、典型的には結合した抗体及び細胞 上に支持された免疫学上のパートナ−１すなわち特異性の抗原間の組合せにより 伝達される細胞凝集を測定することを含む。リガンドがたんばく質の場合には、 以後本明細書中では複合体をリポソーム−たんばく質複合体と呼ぶ。

少くとも一表面に支持されているりガントと結合する分子は天然の多価抗原でも よいが、生命のない合成物質により形成してもよい。たとえば、適する非ＭＩ胞 物質の中には閤標名「工ｍｍ＋ユｎｏｂｅａｄ　Ｊとしてバイオ・ラド（Ｂｊｏ −Ｒａ、ｄ、　）実１験室から市販されている、直径約５乃至１０μのポリアク リルアミドビーズの表面にγ−グロブリンが固定されている、すなわち共有結合 しているもの、及び商標名ｒｃｏｖａｓｐｈ、ｅｒｅｓ　Ｊとしてコーノζレン ト・テクノロジー・コーポレーション（Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から市販されている直径約１μのホリスチレン球 の表面に工ｇＧのようなγ−グロブリンが結合、）シているものがある。

本明細書中では、リカン１Ｆ及びリカン・ドと結合する分子は互いに特異的では あるが非共有的に相互作用しうる部分を意味する。かかる部分の対の−１は、抗 原−抗体相互作用であり、ホルモン−受容体相互作用、炭水化物−植物凝集素相 互作用もある。

本発明に有用なリポソーム−たんばく質複合体は種々の方法により調製しうる。

たとえば、適する調製法の−は、共有結合させる前に前駆物質であるリポソーム を酸化剤により活性化する、活性化リポソーム前駆物質を経る方法である。この 方法の変法は、ガングリオシドのような脂質をまず酸化し、次いで前駆物血のリ ポソームを形成する方法である。別の適する調製法として、は、前にマーチンら により記述されているようなジスルフィド結合を経る方法がある。

いずれにしても、たんばく質はリポソーム前駆物刹と脂″ｉ′ｉ１７子クロモル 当シ少くとも約４ｏμ？共有結合することが必要である。リホソームーたんばく 質複合体の適する調製法及び性質について更に十分に記述しよう。

活性化リポソームは、一般に単層小胞又は多層小胞と特徴づけられる出発小胞か ら調製しつる。いずれのりボソーム構造でも適する。特に好ましい調製法は、米 国特許第４，２３５，８７１号に開示され、「プロシージャー・フォア・プレバ レージョン・オブ・リポソームズ・ウィズ・ラージ・インターナル・アクウニイ アウス・スは−ス・アンド・へイ・キャプチャー・バ′イ・リバース・フェイズ ゛エバポレーション（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｆｏｒ　ｐｒｅｐａｒａｔ：ｔｏｎ 　ＯｆＬｊｐｏｓｏｍｅｓ　Ｗｉｔｈ　Ｌａｒｇｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ａｑｕ ｅｏｕｓ　５ｐａｃｅ　ａｎｄＨｊｇｈ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓ ｅ　Ｐｈａｓｅ　Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）Ｊと題するスゾカ・ジュニア（Ｓｚ ｏｋａ、　、Ｔｒ、）及びパパハジョプーロス（Ｐａｐａｈａｄ　ｊ　０ｐＯｕ １０８　）によるブロク・ナトル・アカアト・サイ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ）第７５巻第９号第４１９ ４乃至４１９８頁（１９７８年）に記載されているような逆相蒸発小胞（ＲＥＶ ）法である。かかる文献の内容は本明細書中に参考にされている。

当業者には公知であるが、所望であれば広範囲の物質が前駆物質リポソームによ シ包封される。たとえば、前駆物質リポソームは細胞毒剤、核酸、及び種々のた んばく質を包封しうる。

いずれにしても、本発明に適する前駆物’！　ＩＪボソームは極性頭部領域にお いて被酸化性基を有するホスファチジルグリセロール（以後「ＰＧ」と呼ぶ）か ら、単一脂質として、又は二種以上の異なる脂質の混合物から形成しうる。

二種以上の異なる脂質から形成する場合には、少くとも一種の脂質が脂質分子の 極性頭部領域に沿って隣接アミノ基又は隣接ヒドロキシル基のような被酸化性の 基を含む。たとえば、隣接アミノ基の場合には、ガラクトースアミン又はグルコ ースアミン残基を有する糖脂質が適する被酸化性脂質である。更に通常は、少く とも一種の脂質が極性頭部領域に隣接ヒドロキシル基を有する。脂質混合物中の 脂質の−（すなわち、被酸化性脂質）として特に好ましいのは、ラクトシルセラ ミド、ガラクト−スレプロシト、ガングリオシド、及びトリへキソシルセラミド のような糖脂質、及びホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシト ールのような燐脂質である。

かかる被酸化性基を有する脂質（一般に本明細書中では「被酸化性脂質」と呼ぶ ）の量は前駆物質リポソームを形成する脂質の総量に関して変化しうる。しかし ながら、被酸化性脂質のモルチは脂質混合物の総量に関して少くとも約１０モル チであるのが好ましい。

脂質の総量に対する被酸化性脂質の特に好ましい量は以下の第１表に示す。

ラクトシルセラミド　約１０ トリへキソシルセラミド　約１０ ガラクト−スレプロシト　約２０ ホスフアチジルグリセロール　約３３〜４０ホスフアチジルイノシトール　釣２ ゜ ガングリオシド　約１０ 好ましい被酸化性脂質の構造は公知である。しかしながら明らかにするために、 以下に示す第１図は極性頭部領域と非極性尾部領域とを有する被酸化性脂質の代 表的な一般構造としてＰＧを示す。

第１式は極性頭部領域と非極性尾部領域を郭成する前駆物質リポソームを形成す るように混合されたすべての脂質の代表例である。特に第１式の構造は、その極 性頭部領域に隣接ヒドロキシル基を有する被酸化性脂質の代表例である。

公知のように、前述の脂質分子の混合物は、１八ポソームの外部表面を形成する 単一の二分子層（単層）又は複数個の二分子層のいずれかに脂質分子を配置して 前駆物質リポソームを形成する。水溶液においては、脂質分子の極性頭部領域は 外部表面に関して一般に半径方向外側に配向して水溶液系に露出、すなわち延在 している。非極性尾部は外部表面に関して半径方向内側に延在し、実質的に連続 した二分子層の炭化水素相を形成する。この実質的に連続した炭化水素相は比較 的不透過性で、前駆物１リポソームの内部に物質を包封するように作用する。

それにもかかわらず、前駆物質リポソームを形成する脂質の混合物は小さな分子 を透過する傾向があるので、前駆物質リポソームの透過性を減少させるためにこ れらの脂質混合物にコレステロールを添加することが望ましい。コレステロール は二分子層内で配向する傾向がある。

＋Ｊ　、＋Ｏソームの透過性を減少させるだめにコレステロールの代わりに他の 成分も使用しうる。たとえば、（卵黄から得られる通常不飽和の１６乃至１８の 炭素鎖よりむしろ）脂肪酸の飽和脂肪族鎖、すなわち非極性尾部が１８の長さの ホスファチジルコリンを使用しうる。しかしながら、スフィンゴミエリンを被酸 化性脂質と混合する場合には、その前駆物質リポソームはもともと小さな分子に 対して全く不透過性である。

かくして前駆物質リポソームの溶液は前述のようにして提供される。この溶液は 、好ましくけ水溶液のような極性溶液であるが、非極性溶液でもよい。前、駆物 質リポソームを、活性化リホノームを生ずるのに十分な量の比較的穏和な酸化剤 と接触させる。リポソームに使用される脂質が非極性溶液中にある場合には、酸 化剤は四酢酸鉛でもよい。好捷しい憾性溶液中では、接触工程の酸化剤は過よう 素酸塩、通常過よう素酸ナトリウムであり、このものは被酸化性脂質の極性頭部 領域において隣接アミン又はヒドロキシル基を切断する。

溶液が極性で酸化剤が過よう素酸塩の場合には、リポソーム溶液のｐＨ及び浸透 圧重量モル濃度及び過よう素酸塩の添加Ｍ′は実質的に同一である。ｐＨは典型 的には約６０乃至約８５である。酸化試薬（ｄ、被酸化性脂質の隣接ヒドロキシ ル基又はアミン基のような被酸化性基を酸化して、被酸化性脂質の極性頭部領域 にアルデヒド部分を生成することにより活性化リポソームを生成する。十分な量 の過よう素酸塩試薬とは、通常脂質分子の総量に関するモル比が約１．５：１乃 至約６：１であろう。接触工程の酸化反応は、氷上では約１時間捷での進行が可 能であるけれども、室温においては通常約半時間で進行する。次いで過よう素酸 塩試薬を、約７５，０００ダルトンの除外限界を有するテキストラン高分子ビー ズのカラムを通してゲル沢過により除去する。

反応スキー７ム■、■及び■ば、被酸化性脂質が各々ホスファチンル゛グリセロ ール、ホスファチジルイノン）　−ル及びラクトシルセラミドの場合の前駆物質 リポソームの活性化を式で表わす。

１ ＣＨ２−０−Ｐ−０−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ−＋−Ｈ２Ｃ＝００θ １ 活性化リポソームの外部表面内の実質的に全ての物質は、前述の過よう素酸塩を 用いた酸化中に包封される。反応式■乃至用から判るように、被酸化性脂質の極 性頭部領域において被酸化性脂質が酸化・、すなわち変性されることにより形成 されるアルデヒド部分が、結合、すなわちカンプリングされるたんばく質との共 有結合サイトを郭成する。

活性化リポソームには広範囲のたんばく質が結合、すなわちカッシリングしうる 。カンプリングの機溝は、たんばく質の第−又は第二アミノ基と活性化リポソー ムのアルデヒド部分との間に結合が生じ、たとえばリシル部分の第一アミノ基と シック塩基を形成するとされている。

かかる機購を、単純化のために（ラクトシルでラミドの変性後の）末端力ラクト ースのみを示す反応式■により式で表わす。

反応式　■ カンプリングは穏和な還元剤、好ましくはシアン水素化はう素ナトリウムにより 完成して、たんばく質と活性化リポソーム間に安定な共有結合が形成される。た とえげ、十分な量のシアン水素化はう素ナトリウムを添加すると前述の反応スキ ーム■のシッフ塩基は、以下の反応スキームＶにより一般に示されるように結合 が完成する。

（１ 前述の反応式■及びＶば、酸化によりアルデヒド部分を含むように変性されたラ クトシルセラミドとたんハ＜質のカンプリングを式で示す。その他の被酸化性脂 質を使用しても同様にして進行する。変性ラクトシルセラミドの場合には、たん ばく質を活性化リポソームに共有結合させる第ニアミン部分がシアノ水素化はう 素ナトリウムの存在下で更に一層安定な第三アミンの形となる。

たんばく儒と活性化リポソームのカンプリングの還元剤としてシアン水素化はう 素ナトリウムが好ましいけれども、特定の環境に依存してその他の還元剤も使用 しうる。たとえば、水素化はう素も使用しうる。しかしながら、カップリング反 応は、カップリングされるたんばく賃を変性する傾向のある比較的アルカリ性の ｐＨにおいて通常実施される。

十分なカップリングに適するたんばく質は、少くとも１個の第−又は第二アミノ 基、好ましくけ複数個の第−又は第二アミノ基を有する。分子当り少くとも約２ ０個のリシル部分を有するたんばく質が更に好ましい。約６０個のり、ル部分を 有する工ｇＧが特によくカップリングすることが見出された。活性化リポソーム とカップリングするのに好ましい別の抗体にばＦ［ａｂ’］２がある。

各々が約１ｏ乃至約４ｏミクロモル／ｄの脂質を含む４種のリポソーム水溶液を 前述のようにして活性化した。

ＲＥＶ手順により前駆物質リポソームを調製し、ポリカーボネートフィルターよ り押出して直径約０．２μのリポソームを得た。溶液を約６０乃至約８５のｐＨ において緩衝した。被酸化性脂質が酸化されていない５番目のリポソーム溶液を 対照標準として調製した。本発明による４種の活性化リポソーム溶液及び第５の 対照標準溶液を第■表に示した。

第　■　表 脂質の総量 溶液番号　脂質組成　モル比　ミクコモル　容量−１ＰＣ／ラクトシルセラミド 、１０：１　９．２１　２．８２　ＰＣ／）リヘキソシルセラミド、１０：１　 １６．４４　４．５３　ＰＣ／ＰＧ、１　：　１　９．５　３．１５　ＰＣ／ラ クトシルセラミド、　１０：１　７．１１　２．８■対照標準溶液、リポソーム は活性化されていない第■表の５種の溶液を以下のようにして処理した。５乃至 １０＋ｌ１ｇのＩｇＧをリポソーム溶液と同一の緩衝液として、それぞれのリポ ソーム溶液（活性化リポソームを実質的に塊がないように溶液中に懸濁した）に 添加した。十分な量のシアノ水素化はう素ナトリウムを添加して釣２゜ミリモル の濃度とし、溶液を室温において約２乃至約６時間放置した。ＩｇＧと共有結合 したリポソームを、カラムゲル濾過又は葎心分離のような従来の方法により精製 した、カップリングの量を以下の第ｍ５に示す（小胞当りの分子数は、脂質１ミ クロモル当り約１．８Ｘ　１０１２（７）　小胞が存在し、直径０２μであると 仮定して算出した）。

第　■　表 １扉ツー、添加シた　たんはり質：脂η比　ＩｇＧ分溶液溶液　工ｇＧ（’ｇ） 　（μ９／ｆＪし）　、（／’ｆ／［１９脂質）　子／］・胞１　２０　１１２ 　１４７　２５１ ２　１４　５７　７５　１２８ ３　１４　４７　６２　１０６ ４　１０　９６　１２６　２１６ ５”　２０　１１　１４　２５ 活性化されたＩＪ　、＋Ｏソームへの工ｇＧの結合によって典型的には１マイク ロモルの脂質につき釣５０−２００マイクログラムの工ｇＧの結合が得られた。

対照リポソームには実習的に結合は見られなかった。たんばくａの活性化リポソ ームへの結合で結合を決定するのに用いるたんばく質効力検定の限界より下のも のは見られなかった。

活性化ＩＪ　、＋５ソームに共有結合できるたんばく質はかなりの大きさの生物 学的活性を保持する。このことは以下のように免疫学的に純化された兎のアンチ フルオレセイン抗体を用いて説明する。

アンチフルオレセインＩｇＧは特にイソチオンアン酸フルオレセインとカルボキ シフルオレセインに結合スる。抗体に結合するとフルオレセインの螢光は哨える 。これを抗体の結合活性の測定に用いた。抗体をカルボキシフルオレセイン溶液 に引き続き加えると、抗体に結合して発螢光団が消滅することにより螢光が減少 した。消滅がだんばく質の濃度に比例する線型範囲における種々の特定のたんば く鋼濃度に対して螢光の減少のノ々−センテーンを相関させることによシリ下の 表■に示すようにリポソームに結合した抗体の抗原結合能力を比較した（ここで 元の抗体、すなわち対照線型範囲は約７８／１−３０／４であった。結合された 抗体で活性化されたリポソームは示された全範囲にわたって線型てあった）。

７８／１　８５／１　９５／１　。

６０／２　７５／２　９０／２ ４０／３　６２７／３　８５／３ ３０／４　５０／４　７８／４ １８１５　４０１５　７０１５ １２１６　３５／６６５／６ ８／７　３０／７　、　６０／７ ８／８　２０／８　５８／８ １５／９　５０／９ 」二記の表■に示されているように、元の抗体の調製物（対照）と結合過程から 回復された抗体とによるカルホギシルフルオレセインの螢光消滅は活性化された リポソームに結合された抗体と比較することができる。元の対照調製物の活性度 を１０口％にセットすると、活性化されたリポソームに結合された抗体は約６６ ％で、回復された抗体のそれは約７０％である。したがって抗原の結合能力は本 発明の結合法によっては部分的に阻止されるだけであり、結合声れたたんばく質 はかなりの大きさの抗原結合能力を示すまたは保持する。

血球凝集反応 本発明のり千′ソームーたんばく質複合体は赤血球を凝集させる能力を持つ。上 記のようにして調製された活性化リポソームは抗原−抗体と結合され、インチオ ンアン酸フルオレセインと結合された赤血球で培養した。その結果赤血球が凝集 し、血球凝集反応価（凝集を起こさせる最小濃度で表わす）はリポソーム−たん ばく質複合体が導出された元の可溶抗体に関して約１．５の因子で改善された。

血球凝集反応価が小さいことはもっと効果的な凝集能力があることを示す。この ことを次の表Ｖに示す。

表　Ｖ 兎のアンチフルオレセインＩｇＱによるＦＩＴｔ：”人体赤血球の凝集反に、 調　製　物　価（マイクログラム／ミリリットル）本発明のリポソーム−たんば くａ複合体の赤血球を凝集させる改良された能力は活性化されたリポソーム先堅 物質によるリホソームーたんばく質複合体の他の調製物によっても次のように示 される。

１０ミリグラムのＦ　（ａ　ｂ”１２を１０マイクロモルの小胞脂質に（酸化と 脱塩との後）、さらに１ミリリツトルのポラテアスリン（ｐＨ８，４）に添加し 、それから１０マイクロリツトルの１モルナトリウムチアノポロヒドリドを加え た。室温で１８時間の後、小胞を不連続テキストランこう配（１０−２０％重量 ／体積）において浮遊選別で不結合たんばく質から分離した。細胞への結合の定 量のために小胞は５Ｈ標識月さバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ； 　１０マイクロＣ］／マイクロモル）と１４Ｃ標識付きショ糖（１マイクロＣｊ ／マイクロモル）とを含んだ。「標的」小胞は人間の赤血球に結合した兎のＦ［ ａ、ｂ’）２を持つものであり、「対照」小胞は塊のガンマグロフリンからペプ シン消化およびブドウ球菌の第１金懸濁液への吸収によって調製されたＦ［ａｂ ’］２に結合されたものであった。

標的・］・胞と対照小１吃とはｐ三７４のホスフェート緩衝食塩ｒｐ　（ＰＢＩ Ｅ）　０．２　ミ’）　’）　ソ）　ル中ノ１ｏ６−ｉｏａ個の人間の赤血球で ３７℃において１時間別々に培養した。細胞を洗浄して不結合小胞を除去し、細 胞を直接１０ミＩＪ　ＩＪットルのトリトン−トルエンのシンチレーション発生 物質に入れて（”Ｈ：］　ＤＰＰＣ（１０”−１０７細胞）を計数するかまたは １０８個の細胞を洗浄した後抽出したつクロロホルム相を蒸発させて〔己亀ＤＰ ＰＣ含イｊ量を語数し、水相を６０’Ｃで一晩培養してメタノールを除去し、〔 １４Ｃ］ンヨ糖含有量につき計数した。

小胞（約１−５００ナノモルの脂質を含む）を１０８個の細胞で培養したとき標 的結合と対照結合との間に著しい差があり、小胞の８０褒が約２０−５００マイ クロモルの脂質において結合した。一般のＦ［ａｂ’］２と結合した小胞との対 照結合はきわめて低く（１％以下）、１００ナノモルと５０口ナノモルの脂質の 間ではそれほど増加しなかった。小胞脂質とキャプセルで己まれたショ糖とけ両 方ともａ胞にほとんど同じ比率で結合する。このことは、細胞結合は小胞含有量 に何の損失も起こさず、抗体に結合したリポソーム調製物は脂質、キャプセルに 包まれた水性標識、および抗体に関してかなり均質であることを示す。小胞が１ ０７個の赤血球で培養されたときには標的および非標的試料の間に結合の著しい 差があった。全小胞の小部分が結合したが、各細胞に結合した小胞の数は増加し た。１０６個の細胞で培養された小胞も結合性を示した（図示しない）。６ナノ モルの特別の抗体を持つ小胞と２ナノモルの一般の小胞とは、１００ナノモルの 脂質が細胞で培養されたとき結合した。培養中に血ａ（２５％の胎児の子牛）を 加えても結合に実ａ的な効果はなかった。

Ｆ（ａｂ’）２が９０．０００の分子量を持ち、小胞調製物が１マイクロモルに つ＠１．８Ｘ１０１２個の小胞を含んでいた（０２ミクロンの直径の単層小胞に 対して）と仮定して小胞調製物は１小胞につき１４３個の分子を含んでいた。

ここで用いられるような免疫学的に純化されていない抗体は細胞抗原に特に反応 性の分子の１−５％だけを含むであろう。したがってこの調製物はおそらく１小 胞にっさおよそ１−５個の分子を含むから、たいていの小胞は標的細胞に対して 特性的なものであった。免疫学的に純化されない抗体を１小胞につきこぐ少数の 抗体分子を結合させるだけの結合法とともに用いると、多くの小胞は標的に対し て特殊性を持た々い。

４０口ナノモルの脂質を１０８個の人間の赤血球と結合させると組ゴχ膜、つワ 又含頁量より３倍大きい脂質量が得られる。小胞は直径が０．２ミクロンで単層 であると仮定すると、１つの細胞に結合された小胞の数は８００口で、それらの キャプセルに包１れた体積は細胞の体積の０３６である。したがって、標的小胞 の約８０矛が人間の赤血球と結合した。

小胞に結合しだＦＩ：ａｂ’）’２の血球凝集価を測定して元の抗体調製物と比 較した。一般の可溶性Ｆ［ａｂ’）２とそれから誘導した対照小胞とは１ミリリ ツトルにつき１ミリグラム０Ｆ（ａｂ’）２までの濃度において血球凝集反応は なかった。人間の赤血球Ｆ［ａｂ’］２に対して可溶性の抗体は血球凝集反応価 が４マイクログラム／ミリリツトルで、元の可溶性抗体から誘導されたリポソー ム−たんばく質結合物の価は約２．７の改良因子に対して１．５マイクログラム ／ミリリツトルであった。

可溶性ＩＪ　、＋６ソームーたんばく負結合物に対する血球凝集反応活性度の改 良度すなわち増大度は、結合中にいくらかの結合抗体が部分的に不活性化場れる ので、データ、たとえば表■からのものより大きい。活性化された方法によって 調製された、アンチフルオレセインに結合しだ＋）４ソームについて行なった他 の実験においては、免疫学的に純化されたアンチフルオレセインを正常な兎の工 ｇＧと混ぜてアンチフルオレセイン置換の程度を変えることにより種々の抗体調 製物が得られた。アンチフルオレセインの活性度を、前に説明して表■に示した ように、螢光の消滅によって計算し、この値をリポソーム−たんばく質結合物の １リポソームについての活性抗体分子数および補正された最小血球凝集反応濃度 の計算に用いた。

リポソーム−たんばく質複合体をフルオレセインで被覆した凝集しない赤血球と 接触させた。（補正されない最小血球凝集反応濃度（ＭＨＣ）は全たんばく質濃 度から計算する。）そのデータを次の表■に示す。

表　■ ６７　５．１０　１．６３’　２．３ １００　１．６０　０，７０　５．６ １８６　０．５７　、　０．３１　１２．６上の表■に示す改良因子はＩＪ　ホ ソームーたんばく質複合体の補正されたＭＨＣをリポソーム−たんばく質複合体 が導出された元の可溶性抗体のＭＨＣと比較する。改良因子は１リポソームにつ き２価結合した活性抗体分子の数に依存して約２．！１から約１２．６に変った 。

ＩＪ　、＋ｂソームーたんば〈質複合体の他の調製物においてはＩＪ　、＋Ｏソ ームーたんば〈質複合体は１マイクロモルのリポソーム燐脂質につき５０マイク ログラムの抗人赤血球Ｆａｂ’分（１リポソームにつき約５００抗人Ｆａｂ’分 ）を持っていた。先駆リポソームは１９８１年の生物化学雑誌（印刷中）のマー チンとパパハジョボウロスの論文［Ｍａｒｔｉｎ　ａｎｄ　Ｐａｐａｈａｄｊｏ ｐｏｕｌｏｓ、　、Ｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　（１９８１−Ｉｎ　Ｐｒｅｓ ｓ）〕の方法によってＰＣ：コレステロール：ＰＤＰ−ＰＫからつくり、Ｔａｂ ’に結合した。可溶性抗体に対する最小血球、疑集反応濃度（ＭＨＣ）は５２マ イクログラム／ミリリツトルで、リポソーム−たんばく質複合体に対するＭＨＣ は０１７マイクログラム／ミリリツトルであった。

すなわち、血球凝集反応の改良因子は約３０であった。

活性化リポソーム・プレカーサによるいま一つのパッチのり尿ソームーたんばく 質複合体を、調製し、下記のように可溶抗体と共に結合阻害の試験を行った。

脂質１ナノモル当り２０００カウント／分を与えるように微量の５Ｈジパルミオ イルフオスフエーチジルコリンを含んだフオスファチジルコリン：コレステロー ル二酸化ガングリオサイド（５：５：１）の混合物からプレカーサのリポソーム が調製された。この小胞を水素化シアンはう素ナトリウムの還元性アミノ化によ りモノクローンのマウス抗Ｈ２ＫＫ抗体と結合させた。生じたリホソームーたん ばく質複合体は抗体／脂質比６０μモルを有した。

いっぽう、６ｔＭのハトリ皿で融合性単分子層にした５Ｘ１０６Ｌ９２９繊維母 細胞を、５０％血清と２０ナノモルの脂質を含む０．２−の燐酸塩のバッファ（ 緩衝液ＸＰＢＳ）に１２μグの抗体を結合させた液で６７℃で６０分間培養した 。この搭養混合液は下記第■表に示すように、様々な量の可溶抗体をも含んでい た。培養後、細胞を燐酸塩で緩衝させた塩水で４回洗滌し、トリプシンで分解さ せて単分子層から離し、計数のためにシンチラントに採取された。

同様に５０％血清、１μｔの抗体と結合させた２０ナノモルの脂質および下記の 第１表に示されるような種々の量の可溶抗体を含む０．２　ｍ／　ＰＢＳＯ中に ２Ｘ１０６　Ｒｔ、　Ｉ　Ｔ−リンパ細胞を懸濁させた。３０分後、遠心分離と ＰＥＳ　５−液中での再懸濁とにより、４回洗滌された。最後に細胞を０５−の ＰＢＳ中に再懸濁させてシンチラントに採取された。

ＩＪ　、＋Ｏソームーたんばく質複合体と細胞との間（そしてより軽度ではある が可溶抗体と細胞との間）に生じた抗体−抗Ｈ２ＫＫ反応は成る種のマウスの緊 張状態のＲ２にとの反応を説明する。このだんばく質は大抵のマウスの細胞内に 高レベルで存在する薄膜抗原である。Ｌ９２９ｉｌｊ１！維母細胞およびＲ１， ｉ　Ｔ　−ＩＪンパ細胞はＨ２ＫＫ抗原を表わすマウスから採った培養細胞の系 列である。

第　■　表 可溶抗体による目標のリポソーム結合の阻害０１　１００％　１００％ ０．３　８６％　９７％ １　９７％　８１％ ３　１００％　６２％ １０　９５％　４４％ ３０　６６％　６１％ たとえば、上記第１表で説明されるように、Ｒ１，Ｉ　Ｔ−ＩＪンパ細胞との間 に約５０％の結合阻害を達成するのに、少くとも１０：１の可溶抗体／リポソー ム結合抗体比が必要であった。本発明による＋）４ソームーたんばく質複合体は 可溶抗体よりも大きな機能的親和力をもって、現在する免疫学の仲間と結合する ことを上記のデータは示している。この改良された凝集反応性はリポソーム−た んばく質複合体の多価特性、たとえば各小胞が多くの抗原結合サイトを含んでい ることによる。その反対に、たとえば自然のＩｇＧはたんに２価であるに過ぎな い。

広範な種類のだんケ＜鋼、特に抗体がＩＪ　ホソームと共有結合して本発明によ り使用される。下記の第１表は免疫診断」二の用途、特に適当な抗原の仲間との 組合せによシ仲介された細１胞の凝集反応に適した、数多くのリポソーム−たん ばく質複合体を示す。

１　常態うしＩｇＧ）　１００〜６００２　常態ラビノトエｇ０　６０〜３００ ６　常態ラビットＦ［：ａｂ’］２７０４　ラビット抗ＨＲＢＣＦ［ａｂ’：］ 　２　６０５　マウスエｇ０　９８ ６　ラビット抗ＣＶ工　１０７ ７　常態ラビットエｇａ　２７５ ８　抗ひつじＲＢＣ（２ａ）”　１５３９　抗Ｈ２に１（（２ａ）”　７２ １０　抗Ｔｈｙ　１．１（１）黄　５０１１　抗ひつじＲＢＣ（２ａ）”　１２ １１２　抗Ｈ２ＫＫ　（２ａ）”　７０ １３　常態ひとＩｇＧ　２３５ １５　マウスＩｇＧ（全部）≠　１２８１６　抗りリコフオリン（１）≠　２４ ０１７　抗ひつじＰ、ＢＣ（２ａ）　”　０００（″：括弧内の記号は抗体のＩ ｇ（）サブクラスを示す）上記の組成番号１〜１０は活性＋）　、？？ソーム法 （たとえばグリコスフインゴリピツドは過よう素酸塩で酸化され、抗体は水素化 シアンはう酸ナトリウムと還元性アミン化により共有結合される手法）によシア ンカーサのｌＪ、４ソームから調製された。組成番号１および２の脂質はラクト シルセルアミド、フオスファチンルグリセロール、フオスファチジルコリンおよ びコレステロールの１０：１４５：４５の割合から成る。組成番号３〜１０はフ オスファチシルコリン、コレステロールおよびガングリオサイドの５：５：１の 割合から成る。組成番号８〜１０の抗体（ｄモノクローン（マウス）のものであ る。

組成番号１１および１２はプレーカーサのリポソームから活性化リポソーム法の プレオキサイプ−ジョン修正法（たとえばガングリオサイドはプレオキサイプ− ジョンされ、それからプレカーサのリポソームが形成され、つぎに活性＋）７ソ ーム法と同様に抗体が共役結合される）により調製された。より具体的には、通 常はうしの脳からの混合体であるカングリオサイドが２０　記、Ｉの師５５の過 よう素酸塩のナトリウムの中に懸濁される。暗い室温の下で３０分経過後、ＩＤ ＱｒｎＭの最終コーンにエチレングリコールを加えて、溶液を６０分間放置する 。ゲル・クロマトグラフィにより反応生成物から酸化したカングリオサイドを分 離する。ガングリオサイドの小部分を集め、メタノールと混ぜ、窒素蒸気の下で 蒸発乾燥させる。

残留分をクロロフォルム：メタノール（１：　１）の混合液で採取し、たんばく 責との結合前に一４０℃のアルゴン雰囲気中で貯蔵する。脂質成分は上記の組成 番号６〜１０に記された通りである。抗体はモノクローン（マウス）テする。

組成番号１３〜１７は以下の如く調製された。Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェ ニール）フチリール〕フオスファチジールエタノールアミン（ＭＰＢ−Ｉ’Ｅ） はＭａｒｔｉｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓの手法、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 　Ｃｈｅｍ、　（１９８１年）により合成された。つぎにｐＨ６０−６，７の緩 衝液の中で１０：１０：１　ノ７オスファチンルコリン：コレステロール：　Ｍ ＦＢ”−ＰＥからリポソームがＳ　Ｚ　ｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊＯｐｏｕ ｌｏｓ（前記）の方法により調製された。適当な緩衝液は００５Ｍモルフオリノ ーエタンズルフオン酸、０．０９６　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ６４である。マレイミ ドの機能を最大限に安定させるために、１）Ｉ（７，０より下でヴエンクルを調 製することが大切である。Ｔｈ抗体はピ＋）　＞−ルチオール化されＣａｒｌｓ ｓｏｎ他Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１７３．　ｐｐ、　７２”ｌ−７３７（１ ９３Ｂ）の方法により還元される。たんばくη１モル当り１０モルのＮ−サタン ニミシール３−（２−ビリ〉−ルジチオール）プロプリオネー）　（ＳＰＤＰ） にたんばくηを反応させると、１モルのたんばくａ当り３−５モルのビリ７−ル ジチオール族の置換が生ずる１、ジチオスレイト−ルによる還元の後、アルゴン で酸素を排除した緩衝液、ｐＥ−Ｅ６Ｑ〜６５の中で平衡化されたボリアクリー ルアミｌ−のコラム（５０〜１００ノツシ）上でたんばく質を還元剤から分離す る。たんばく質の小部分を集め、アミコン型の濃縮器の中でアルゴンの雰囲気の 下で適当な容積に１で濃縮される。通常、たんばく質は約３ｍ？／ｌｔＬに濃縮 される。つぎに１ｍｌ当り５μモルの脂質を与えるように、攪拌しながらたんば く質溶液にリポ°ソームを添加する。夜通しの反応後に、ヴエシクルをアルトリ チオール（Ａｘａｒ］ｔｈｉ　０１）　４と反応させて、ノｌ−１）ズアミドの 勾配上で分離し、たんばく質と脂質とを定量する。たんばくａまたは抗体は組成 番号１６〜１７において、分子１個当り釣１．８乃至５１のチオールにより変形 される。

工業用途 リポソーム−たんばく質複合体の高められた凝集反応は阻害試合および１凝結試 験の如き種々の診断用途に役立つ。血球凝集反応阻害試合は可溶抗原が抗原増感 されたエリスロサイトを凝集させるために、特有の抗体の能力を阻害する程度を 測定する。リセソームーたんばく質複合体は血液１疑集反応阻害試金の感度を増 すことができる。

３１ 凝集反応にはかなり少量の抗体しか必要なくなるので、それに応じてより少量の 可溶抗原で凝集反応を阻害する。

すなわち可溶抗原は同じ抗原特性を持つエリスロサイト表面抗原と競合するから 、可溶抗原の存在はその抗原に特有のり、＋Ｃソームーたんばく質複合体によシ 生ずる凝集反応の量を減少させる。かくて、抗体−抗原の相互作用によシ仲介さ れる細胞の凝集反応を可溶抗原が阻害する程度を知ることができる。比較的感度 の良いＩＪ　、＋Ｏソームーだんばく質複合体により検知することのできるひと の血清抗原の中にはチロキシンの如きはプチッドホルモン、Ｃ反応性たんばく彊 、肝炎表面抗原１．ｈＣＧ、ヘテロフィル抗体、リューマチ抗体、チロキシン結 合たんばく質（Ｔ５）およびジゴキシンがある。

さらに、リポソーム−たんばく質複合体は凝結試験にも用いられる。たとえば、 リポソーム−たんばく質複合体がＩＪ　ホソームと共有結合された抗体を有する 場合には、リホソームーたんばく質複合体に接触する時に複合体を抽出する時よ りも高成度で凝結され、または凝集されるであろう肝炎Ｂ型ビールスのゾーン（ Ｄａｎｅ）粒子の如き粒子に対して抗体結合能力を有する抗体が選定される。

本発明を実施するために考えられる最良の態様は血液型判定にリポソーム−たん ばく質複合体を用いることである。そのような用途に望ましいリポソームのサイ ズは約０．１〜５．０ミクロンであり、よシ望ましいサイズは約０．１〜０．５ ミクロンである。

米国特許第４，２６３．４２　ｓ号、１９８１年４月２１０公告に記載されたよ うな直線孔型ポリカーボネイト・フィルタを通して押出すことにより、サイズを 制御することがもっとも望ましい。押出しは約０１〜０５ミクロンの選択された サイズの一様なヴエシクルの製造を可能にする。

抗体の調製はリポソームに共有結合されているから、抗体の量は少くとも脂質分 子の１マイクロモル当シ釣４０マイクログラムであり、さらにり旨質１マイクロ モル当り約４０〜９０マイクログラムがより望ましい、抗体は常態ノホリクロー ンの抗血清、まだはモノクローンの抗体から抽出される。つぎに不連続のメトリ ズアミドの勾配中での浮遊選別により可溶性未結合抗体からＩＪ　、４ソームー たんばく質複合体を分離する。回収されたリポソーム−たんばく質複合体を分析 してたんばく質と脂質の含有量を定量する。

凝集反応に必要なリポソーム−たんばく質複合体の最低量を決めるため唇、血液 凝集反応プレート上でリポソーム−たんばく質複合体の連続的な２倍稀釈液が調 製される（たとえば、Ｆ／’２　＋　１．／ａ　ｌ力＋　”Ａ６など）。っ諭で 、これらの稀釈液を等容積の２％のエリスロサイト歴濁液と混和して約１８時間 放置する。つぎにウェルの凝集を記録し、凝集を生ずる最も薄い溶液をもって最 少血液凝集濃度とする。

次に抗原附性細、抱の凝集を生ずるために、既知の濃度のリポソーム−たんばく 質を、抗原の発現を決、めるべ−きエリスロサイトと混和する。適当な期間の潜 伏期の後で、細胞の凝集を記録する。

特定の実施例によシ本発明を記載したけれども、さらに他の変形が可能であシ、 全体として本発明の原理に従い、まだ本発明が関係する当業界で公知まだは慣例 の実務の範囲に入って本発明の範囲に属しかつ添付特許請求の範囲に入るような 本発明の開示からの変更を含む、本発明の変形、使用または適応をすべて包含す ることが意図されていると理解される。

手−続　ンｍ　正　１ガ　（方式） ％式％ １　事件の表示 国際出願番号　ＰＣＴ、、／ＵＳ８２．、’０１５２４２　発明の名称 リポソーム複合体及びイれを用いた診断法３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ザ・リージェンッ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・住　所　東京都 千代田区永田町１丁目翁１番２８号特許法第１８４条の５第１項の規定による書 面中特許出願人の代表者の欄、タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲 の翻訳国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（１）　リポソームとリガンドを含むリポソー・ムーリガンド複合体であって 、前記リポソームが脂質分子を有し、前記リガンドが該リガンドと共有結合して おり、かつ脂質分子１マイクロモル当り少なくとも４０マイクログラムの量であ るリポソーム−リガンド複合体を提供し、 （２）前記リポソームーリカンド複合体を、少なくとも１つの表面で担持されて いるリガンド結合性分子と接触して混合物を形成し、 （３）前記混合物を、前記リポソーム−リガンド複合体のりカントと前記リガン ド結合性分子との相互作用に関して検査する、 各工程を含有する方法。 ２、請求の範囲第１項に記載の方法において、前記少なくとも１つの表面が分離 された粒子によって形成される複数の表面である方法。 ３、請求の範囲第１項に記載の方法において、前記リガンド結合性分子が細胞の 表面によって担持される方法。 ４、請求の範囲第２項又は第６項に記載の方法において、前記リポソーム−リガ ンド複合体の前記リガンドが抗原結合能を有する抗体であり、また前記リガンド 結合性分子が抗原である方法。 ５　請求の範囲第４項に記載の方法において、前記検査には抗原−抗体相互作用 により生じる細胞凝集反応を決定することが含まれる方法。 ６　請求の範囲第４項に記載の方法において、前記検査が抗原−抗体相互作用に より生ずる粒子１疑集反応を決定することを含む方法。 ７　細胞表面抗原を分析するのに有用な１疑集方法であって、 （１）リポソームとたんばく質を含むリポソーム−たんばく質複合体であって、 前記リポソームがリピド分子を有し、前記たんばく質が前記リポソーム−たんば く質複合体の少なくともほとんどに対して抗原結合能を有し、また前記たんばく 質がリピド分子１マイクロモル当り少なくとも約４０マイクログラムの量で存在 するリポソーム−たんばく濁複合体を提供し、（２）前記リポソーム−たんばく 質複合体を実質的に非凝集性細胞を接触して混合物を形成し、（３）前記混合物 の細胞凝集反応を検査する、各工程を含有する方法。 ８　請求の範囲第７項に記載の方法において、前記接触及び検査工程の細胞が赤 血球、リンパ球又は白血球である方法。 ９　請求の範囲第８項に記載の方法において、前記接触及び検査工程の細胞が赤 血球である方法。 １０請求の範囲第９項に記載の方法において、前記たんばく質が工ｇＣ）又はそ のフラグメントを含み、前記抗原結合能が前記ＩｇＧ又はそのフラグメントにと って特異である表面抗原を有する赤血球に対するものである方法。 １１　請求の範囲第７項又は第１０頂のいずれかに記載の方法において、前記検 査には抗原−抗体゛相互作用により生じる細胞凝集反応の決定が含まれる方法。 １２、リポソームと前記リポソームに共有結合している抗体とを含むリポソーム −たんばく賃複合体を含有する、赤血球凝集分析用試薬であって、前記リポソー ムが脂質分子を有し、前記抗体がその抗体にとって特異な表面抗原を有する赤血 球に対し抗原結合能を有し、前記抗体の量は脂質分子１マイクロモル当シ少なく とも約４０マイクログラムであり、前記リポソーム−たんばく質複合体が、該複 合体が由来する抗体の赤血球凝集活性に関して高い赤血球凝集活性を有する試薬 。 １３　請求の範囲第１２項に記載の試薬において、前記抗体がポリクロナル抗血 清より由来するか又はモノクロナル抗体であり、前記赤血球凝集活性が最少赤血 球凝集濃度として決定し得る試薬。 １４　請求の範囲第１２項に記載の試薬において、高い赤血球凝集活性が、前記 リポソーム−たんばく質複合体が由来する抗体のそれよりも少なくとも約１．５ 倍大きい試薬。 １５、請求の範囲第１２項に記載の試薬において、前記リポソーム−たんばく質 複合体のリポソームが約０．１〜５ミクロンの大きさである試薬。 １６　請求の範囲第１２項に記載の試薬において、前記リポソームが実質的に約 ０１〜０５ミクロンの均一な大きさである試薬、。 １７　請求の範囲第１５項又は第１６項のいずれかに記載の試薬において、前記 抗体が１ｇＧ又はそのフラグメントである試薬。 １８　請求の範囲第１７項に記載の試薬において、前記１ｇＧ又はそのフラグメ ントが脂質分子１マイクロモル当り、釣４０〜９０マイクログラムの量である試 薬。