JPS585039B2 - α−アスパルチル−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、α−アスパルチル−フェニルアラニンアルキ
ルエステルの製造方法に関するものである。

α−Ｌ−ア久パルチルーＬ−フェニルアラニンアルキル
エステルは蔗糖様の甘味を有することが知られており、
特にメチルエステルは砂糖の約２００倍の甘味を有し、
新しい甘味剤として注目されているものである。

従来、知られているα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニ
ルアラニンアルキルエステルの製造方法としては、たと
えば、次のようなものを例示することができる。

（１）アミン基の保護された又は保護されていないＬ−
アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンアルキル
エステルとの反応を経る方法（特公昭４９−１４２１７
、特開昭４８−７６８３５、特開昭４８−６１４５１、
特開昭５０−５８０２５、および特開昭５Ｏ−７１６４
２）。

（２）アミノ基およびβ−カルボキシル基を適当な置換
基で保護したＬ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水
物とＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとの反応を
経る方法（特開昭４８−９６５５７）。

（３）α〔３一置換−５−オキソオキサゾリジニル−（
４）〕−酢酸とＬ−フェニルアラニンアルキルエステル
との反応を経る方法（特開昭４９−３５３５２）。

これらの化学的合成法は、反応中にラセミ化やその他の
好ましくない副反応を起こし易く、また、多くの場合Ｃ
β−アスパルチル体が副生するという欠点があった。

本発明は、一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるフェニルアラニンアルキルエステル（式中Ｒは低
級アルコキシル基である）と式で表わされ、少なくとも
その一部はＬ−型の光学異性体であるＮ−ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸とを水性媒体
中蛋白分解酵素の存在下で反応させて、一般式 で表わされ、かつ、結晶水を含むことのあるＮ−ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ルーＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとフェニル
アラニンアルキルエステルとの１：１付加化合物（式中
Ｒは前記同様の意味である）を生成、析出させ、これを
反応液から分離し、分離させたこの１：１付加化合物を
液状媒体中に溶解し、酸で分解することを特徴とする一
般式 で表わされるα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラ
ニンアルキルエステル（式中Ｒは前記同様の意味である
）の製造方法を提供するものである。

本発明の出発物質として用いる一般式（Ｉ）で表わされ
るフェニルアラニンアルキルエステル及び式（ＩＩ）で
表わされるＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
アスパラギン酸は、いずれも少なくともその一部がＬ−
型の光学異性体でなければならない。

本発明の前段の反応である酵素反応でペプチド結合を形
成することができるのは両者のＬ一体だけである。

しかし、生成するＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル−α−Ｌ−アスパルチル−し一フェニルアラニン
アルキルエステルと結合して一般式（■）で表わされる
付加化合物を形成する反応にあずかるフェニルアラニン
アルキルエステルについては、そのＤ一体がより優勢に
この形成にあずかるほかは、その光学活性を問わない。

従って、Ｌ−型のフェニルアラニンアルキルエスチルを
用いると中間体としてＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラ
ニンアルキルエステルとＬ−フェニルアラニンアルキル
エステルとの付加化合物が得られ、Ｄ一体を含むフェニ
ルアラニンアルキルエステル、例えばラセミ体のフェニ
ルアラニンアルキルエステルを用いれば、Ｎ−ｐ−メト
キシベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
ーＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとＤ−フェニ
ルアラニンアルキルエステル又はＤ−及びＬ−フェニル
アラニンアルキルエステルとの付加化合物が生成する。

こうして得られる一般式（■）で表わされる付加化合物
は本発明の後段の反応でいずれも分解されて一般式（Ｉ
Ｖ）で表わされるα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニル
アラニンアルキルエステルを与える。

それ故、本発明では、出発物質のフェニルアラニンアル
キルエステルとしてそのＬ一体のみならず、ラセミ体の
様にＤ一体を含むものも同様に使用することができる。

また、一般式（Ｉ）中のＲはフェニルアラニンのカルボ
キシル基をエステル化している低級アルコキシル基を示
し、具体的にはメトキシル基、エトキシル基、プロポキ
シル基、ブトキシル基、アミルオキシル基等を例示する
ことができる。

他方の出発物質である一般式（■）で表わされるＮ−ｐ
−メトキシベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸で
反応にあずかることができるのはそのＬ−型の光学異性
体だけである。

しかし、そのＤ一体は全く反応を妨害せず、中間生成物
である一般式（■）で表わされる付加化合物中に取込ま
れることもなく反応液中に残留する。

そしてこの中間生成物を反応液から分離する際、除去さ
れるので出発物質中に共存しても無害である。

それ故、本発明では出発物質のＮ−ｐ−メトキシベンジ
ルオキシカルボニルアスパラギン酸としてそのＬ一体の
みならず、ラセミ体の様にＤ一体を含むものも使用でき
る。

用いる蛋白分解酵素としては活性中心に金属イオンを有
する酵素、即ち金属プロテアーゼが最も好ましい。

その例としては微生物起源のもの、例えば、放線菌起源
の中性プロテアーゼ、プロリシン、サーモライシン、コ
ラゲナーゼ、クロタルス・アトロツクス・プロテアーゼ
等をあげることができる。

粗製の酵素例えばサモアーゼなども使用できる。

その際、夾雑するエステラーゼ等の作用を避けるため、
ポテトインヒビターなどの阻害剤を併用してもよい。

パパインなどのチオールプロテアーゼ、又はトリプシン
などのセリンプロテアーゼも使用不能ではないが、エス
テラーゼ作用を併うので、エステルの加水分解が起きな
いよう注意して反応を行う必要がある。

反応は、水性媒体中、好ましくは水溶液中、使用する蛋
白分解酵素が酵素活性を示すｐＨ条件下で行う。

その範囲はｐＨ約４ないし約９、好ましくは約５ないし
８である。

従って用いるＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパラギン酸およびフェニルアラニンアルキ
ルエステルは遊離型であると塩であるとを問わないが、
この両成分を水性媒体中に溶解したとき、このｐＨ条件
に調整する必要がある。

ｐＨ調節剤としては塩酸、硫酸、酢酸のような慣用の無
機酸又は有機酸及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
のような水酸化アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムのようなア
ルカリ炭酸塩、アンモニア、トリメチルアミン、トリエ
チルアミン、エタノールアミンのような有機又は無機の
アミン等の慣用の無機又は有機の塩基を用いることがで
きる。

これらの調節剤は、反応の進行によりｐＨの変化が起き
たとき更に添加してよく、またｐＨ変動を抑えるため適
当な緩衝剤を使用してよい。

水性媒体に、反応生成物の析出を著しく阻害しない限度
で水に可溶の有機溶剤を添加することは可能である。

反応温度は１０℃ないし９０℃、酵素活性を維持する観
点から好ましくは２０℃ないし５０℃で行うものである
。

反応は通常約３０分ないし２４時間程度で完結するが、
この反応時間はなんら限定的でない。

反応の際のＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−アスパラギン酸とフェニルアラニンアルキルエス
テルの濃度は、それぞれ０．００１Ｍないし７Ｍ程度、
好ましくは０．１Ｍないし４Ｍ程度である。

この反応では、生成する本発明の中間生成物である付加
化合物の水に対する溶解度が非常に小さいことを利用す
るものであるのでこれらの濃度は比較的高い方が好まし
い。

この両成分は化学量論上１：２のモル比で反応するが、
実際上は１００：１ないし１：１００．好ましくは５：
１ないし１：５、最も好ましくは２：１ないし１：３程
度のモル比で用いる。

この反応では用いる酵素の量は必ずしも限定的ではない
が、一般的には基質１ミリモルに対して２ないし４００
ｍｇ（５×１０−５ないし１×１０−２ミリモル）程度
、好ましくは５ないし１００ｍｇ（１×１０−４ないし
３×１０−３ミリモル）程度である。

一般式（■）で表わされる付加化合物を溶解する液状媒
体としては、当然この化合物を溶解することのできる溶
媒を用いる。

このような溶媒としては有機溶媒、特にアセトンなどの
ケトン；ジオキサン、テトラヒドロフランなどの含酸素
有機溶媒；クロロホルム、メチレンジクロリド、エチレ
ンジクロリドなどの塩素化低級炭化水素；ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極
性有機溶媒；酢酸、ギ酸などの液状カルボン酸などを例
示することができる。

これらの溶媒は、勿論二種以上併用することができる。

酢酸エチルのようなエステル類、メタノール、エタノー
ル、プロパツールのようなアルコール類も使用不能では
ないが、このような溶媒を用いた場合には、エステル交
換反応あるいはカルボキシル基に対するエステル化反応
等の好ましくない副反応のため、目的化合物の収率が低
下することが多い。

またＮ−ｐ−メトキベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステ
ルとフェニルアラニンアルキルエステルとの１：１付加
化合物は、水に対する溶解度が低いので、水は単独では
本発明の液状媒体として適当なものではない。

しかし、用いる液状媒体の付加化合物に対する溶解度を
大きく害わない程度に添加しても不都合はない。

これら液状媒体の使用量は、液状媒体の種類により、付
加化合物に対する溶解能に差があるので変り得るが、通
常付加化合物１重量部につき１０重量部以上、好ましく
は、２０ないし１００重量部である。

付加化合物を分解するために用いる酸としては無機又は
有機のブロンステッド酸を用いる。

無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸
、過塩素酸等を挙げることができる。

有機酸の例としては、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエン
スルホン酸等を挙げることができる。

使用する酸の量は、本発明が酸により付加化合物のフェ
ニルアラニンアルキルエステル部分を電離させ、さらに
ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル部分を離脱させ
るものであるから、少なくとも化学量論量、即ち、付加
化合物１モルに対して２当量以上用いる。

液状媒体中の酸の濃度は、分解反応が反応時が反応温度
、酸の種類等にも依存するので、これらの反応条件を考
慮に入れて決定される。

一般的には０．１規定から１０規定、好ましくは１規定
から５規定程度である。

酸の濃度が高過ぎるとアルキルエステルの分解等の好ま
しくない副反応が起きる恐れがあるので、これ以上の濃
度は避けることが望ましい。

使用する酸は、水性あるいは無水の状態のいずれでもよ
い。

しかしながら、ハロゲン化炭化水素等のような水と混和
しない液状媒体を用いる場合には、水性で用いると、二
相を形成して反応が極端に遅くなるので、無水で使用す
ることが望ましい。

酸による分解反応の温度及び時間には格別の限定はない
が、通常温度２０ないし１００℃、反応時間１０分ない
し６時間程度で分解を行う。

用いる酸の濃度が低い場合には、反応時間を長くするか
、反応温度を高くする。

また、酸の濃度が高い場合には逆に反応時間を短くする
か反応温度を低くするのが適当である。

本発明で付加化合物を酸分解した後、その分解生成物で
あるα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンアル
キルエステル、アニスアルコール及びフェニルアラニン
アルキルエステルは、それぞれ例えば、次のような慣用
の手段により分離回収することができる。

例えば、反応終了後、必要に応じ、適量の水及びクロロ
ホルムやジエチルエーテルのような水と二相を形成し得
る溶媒を加えてアニスアルコールを溶媒相に抽出分離し
、水相は水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸
ナトリウム、アンモニア、トリエチルアミンのような塩
基性物質でｐＨを５〜６に調整し、析出したα−アスパ
ルチル−フェニルアラニンアルキルエステルを濾過など
の方法で分離採取する。

濾液を更に上記のような塩基性物質でｐＨ８〜１０に調
整して遊離したフェニルアラニンアルキルエステルをク
ロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチルのような溶
媒で抽出し回収することができる。

α−Ｌ−ア久パルチルーＬ−フェニルアラニンアルキル
エステル及びフェニルアラニンアルキルエステルについ
ては陽イオン交換樹脂を用いる慣用法によっても容易に
回収することができる。

このようにして回収されたフェニルアラニンアルキルエ
ステルは出発物質として用いた一般式（Ｉ）で表わされ
るフェニルアラニンアルキルエステルの光学活性により
、Ｌ一体の場合とＤ一体を含む場合とがある。

ラセミ体を原料とした場合は、実質的にほぼＤ一体に近
いフェニルアラニンアルキルエステルを回収することが
できる。

本発明の方法によればＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシ
カルボニル−アスパラギン酸のＬ一体とフェニルアラニ
ンアルキルエステルのＬ一体又はＬ一体から、一般の化
学的合成法によるとき夾雑を避けることの困難なＣβ−
アスパルチル体を含まないα−Ｌ−アスパルチルーＬ−
フェニルアラニンアルキルエステルを効率よく製造する
ことができる。

しかも出発物質として、一般の化学的合成法によるとき
使用することのできないラセミ体をそのまま使用できる
。

反応の途中で脱離させたフェニルアラニンおよび同じく
脱離したｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基から
生成するアニスアルコールはともに回収可能であり、前
者は必要に応じ、ラセミ化を行って出発物質として再使
用することができるし、後者はホスゲンと反応させてｐ
−メトキシベンジルオキシカルボニル化剤として循環使
用することができる。

また出発物質としてラセミ体のフェニルアラニンアルキ
ルエステルを用いる場合は、α−Ｌ−アスパルチルーＬ
−フェニルアラニンアルキルエステルの製造と同時に、
実質的にほぼＤ一体に近いフェニルアラニンアルキルエ
ステルを回収することができるので、ラセミ体フェニル
アラニンアルキルエステルの光学分割をも達成すること
ができる。

以下本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例 Ｉ Ｎ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸５．００ｇ（１６，８２ミリモル）及びＬ
−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩７．２６ｇ（
３３，６４ミリモル）を内容積約１００ｍ１のフラスコ
にとり、水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ）を加えて溶解し
、ｐＨ６，０に調整した。

この溶液にサーモアーゼ２．０ｇ、ポテトインヒビター
０．４ｇを加え、３８ないし４０℃で５時間攪拌した。

析出した沈澱を濾集し、水１００ｍ１で洗った後乾燥し
、融点８８ないし９２℃を示す結晶８．１１ｇを得た（
Ｎ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル−アスバ
ルチル−フェニルアラニンメチルエステルとフェニルア
ラニンメチルエステルとの１：１付加化合物としての収
率ニア５．６％）。

この物質は、以下のことからＮ−ｐ−メトキシ−ベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニンメ
チルエステルとの１：１付加化合物であることが確認さ
れた。

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；９０ないし９４℃ 〔α〕■；＋６．２（Ｃ＝１．メタノール）赤外吸収ス
ペクトルは第１図に示すように、３．２８０ｃｍ−１に
Ｎ−Ｈ伸縮に、３，０２０及び２．９３０ｃｍ−１にＣ
−Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルのＣ＝Ｏに
、ｌ、７００ｃｍ−１にウレタンのＣ＝Ｏに、１，６４
９ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５００〜１，５４
０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１．４３５ｃｍ−１に
Ｃ−Ｈ変角に、１，３８０ｃｍ−１にカルボキシレート
に、１，２１０〜１，２４０ｃｍ−１にＣ−０−Ｃ伸縮
およびアミド第■吸収に、１．０３０ｃｍ−１にフェニ
ル面内変角に６９０，７４０及び８１０ｃｍ−１にフェ
ニル面外変角にそれぞれ由来する吸収が見られる。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）２．７ｐｐｍ（２Ｈ）；（２）３．１ｐｐｍ（４
Ｈ）；（３）３．６ｐｐｍ（３Ｈ）および３．７ｐｐｍ
（３Ｈ）；（４）３．８ｐｐｍ（３Ｈ）；（５）４．０
ｐｐｍ（１Ｈ）；（６）４．５ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）
４．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（８）５．０ｐｐｍ（２Ｈ）；
（９）５．６５ｐｐｍ（３Ｈ）（１０）５．６５ｐｐｍ
（１Ｈ）（１１）６．２ｐｐｍ（１Ｈ）および（１２）
６．８〜７．３ｐｐｍ（１４Ｈ）に特徴があり、これら
は下式のそれぞれ相当する番号のプロトンに帰属させる
ことができる。

こうして得たＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの付加
化合物０．３ｇを内容積的２０ｍ１のフラスコにとり、
アセトン３ｍｌを加えて溶解したあと塩酸（２，４Ｎ）
２ｍｌを加え６０℃で１時間反応させた。

反応液に水、炭酸水素ナトリウム水溶液（１，２Ｎ）お
よび内部標準としてシクロヘキサノンを加えて検液を調
製し、高速液体クロマトグラフ分析でα−Ｌ−アスパル
チルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルへの転化を
確認した。

収率は７２．７％であった。

測定装置及び測定条件は下記のとおりである。

装 置：高速液体クロマトグラフ （東洋曹達工業株式会社製、 ＴＳＫ−ＨＬＣ８０１） カラム：内径７．５ｍｍ×長さ３００ｍｍ充填剤：デン
プン系ゲル粒径５μ （東洋曹達工業株式会社製、 ＴＳＫ−ＧＥＬ、ＬＳ−１７０，Ｐ５） 溶離液：酢酸ナトリウム水溶液（０，５重量％）流速：
０．８ｍｌ／ｍｉｎ 圧損失：２０Ｋｇ／ｃｍ２ 検出器：示差屈折率計 なお、以下の実施例の場合でも生成物の収率の測定には
別記のない限りすべてこの装置及び条件を用いた。

実施例 ２ 実施例１で得られたＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の付加化合物０．３ｇを内容積的２０ｍ１のフラスコに
とり、以下アセトンに代えてジオキサンを用いた以外は
実施例１と同様にして分解反応及び反応生成物の分析を
行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は７３．０％であった。

実施例 ３ ジオキサンの代りにメタノールを用いた以外は実施例２
と同様にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は６３．３％であった。

実施例 ４ ジオキサンの代りにＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを用
いた以外は実施例２と同様にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は２８．１％であった。

実施例 ５ ジオキサンの使用量を４ａとし、塩酸（２，４Ｎ）２ｍ
ｌの代りに塩化水素−ジオキサン溶液（５，３Ｎ）１ｍ
ｌを用い、また反応波中和剤として用いる炭酸水素ナト
リウム水溶液（１，２Ｎ）の代りにトリエタノールアミ
ンを使用した以外は実施例２と同様にして操作を行った
。

α−Ｌ−アスパルチルーＮ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は９８．６％であった。

実施例 ６ 分解反応の反応温度を９０℃に、反応時間を２０分に変
えた外は実施例５と同様にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は８８．５％であった。

実施例 ７ ジオキサンおよび塩化水素−ジオキサン溶液（５，３Ｎ
）の使用量をそれぞれ４．５ｍｌおよび０．５ａとし、
さらに反応温度を９０℃に変えた以外は実施例５と同様
にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は８４．４％であった。

実施例 ８ ジオキサンおよび塩化水素−ジオキサン溶液（５，３Ｎ
）の使用量をそれぞれ３ｍｌおよび２Ｍとし、反応温度
を３０℃に、さらに反応時間を１２０分間に変えた以外
は実施例５と同様にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は９８．６％であった。

実施例 ９ ジオキサンの使用量を４．５ｍｌとし、塩化水素−ジオ
キサン溶液（５，３Ｎ）１ｍｌを過塩素酸（６０％）０
．５ｍｌに変えた以外は実施例５と同様にして操作を行
った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は６５．５％であった。

実施例 １０ ジオキサンの使用量を４．８５ｍ１とし、塩化水素−ジ
オキサン溶液（５，３Ｎ）１ｍｌを濃硫酸０．１５ａに
変えた以外は実施例５と同様にして操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は８９．９％であった。

実施例 １１ 実施例１で得られたＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の１：１付加化合物０．３ｇをジオキサン２ｍｌに溶解
し、トリフルオロ酢酸３ｒｄを加えて、６０℃で１時間
反応させた。

反応液を減圧下で蒸発させた後、水、トリエチルアミン
および内部標準としてシクロヘキサノンを加えて検液を
調製した。

この液について高速液体クロマトグラフ分析を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は９６．４％であった。

実施例 １２ 実施例１で得られたＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の１：１付加化合物１，０００キ、ジオキサン１４ｍ１
および塩化水素−ジオキサン溶液（５，３Ｎ）４ｍｌを
内容積約５０ｍ１のフラスコにとり、６０℃で１時間攪
拌して反応させた。

反応液からジオキサンを減圧下で留去し、残った油状物
に水６ｍｌおよびジエチルエーテル２０Ｍを加えて攪拌
混合した後二層分離した。

水層にジエチルエーテル１０ｍ１を加えて同様に抽出す
る操作を３回くり返した。

ジエチルエーテル層は集めて炭酸水素ナトリウム溶液（
５重量％）５ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム
を添加分離して乾燥したのち、減圧下でジエチルエーテ
ルを留去し、粗アニスアルコール０．１７６ｇ（収率８
１．２％）を得た。

水層は水酸化ナトリウム溶液（７重量％）でｐＨ６に調
整し、約５℃に一夜間放置した。

析出した結晶を戸数し、水２ｍｌで洗浄後乾燥して粗し
一アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル
０．３１６ｇ（収率６８．５％）を得た。

この濾洗液に水酸化ナトリウム水溶液（７重量％）を加
えてｐＨを９に調整し、ジクロルメタン１５ｍ１で３回
抽出を行った。

ジクロルメタン層を集め、水５ｍｌで洗浄、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥後、減圧下でジクロルメタン層を留去
して粗孔−フェニルアラニンメチルエステル０．２３４
．９（収率８３．４％）を得た。

実施例 １３ Ｎ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パラギン酸１．１８９ｇ（４ミリモル）にＬ−フェニル
アラニンエチルエステル塩酸塩１．８３７ｇ（８ミリモ
ル）を内容積約３０ｍ１のフラスコに取り、水酸化ナト
リウム水溶液（ＩＮ）を加えて溶解し、ｐＨ６，０に調
整した。

水を加えて全容積を１５ｍ１にしたあと、この溶液にサ
ーモライシン０．１ｇを加え、３８ないし４０℃で７時
間攪拌した。

析出した沈澱を濾集し水３０ｍ１で洗った後乾燥し融点
６０ないし６５℃を示す結晶２．４０１ｇ（Ｎ−ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル−アスバルチル−フェ
ニルアラニンエチルエステルとフェニルアラニンエチル
エステルとの１：１付加化合物としての収率９０．２％
）を得た。

この物質は、以下のことからＮ−ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニンエチルエステルとＬ−フェニルアラニンエチルエ
ステルとの１：１付加化合物であることが確認された。

即ち、この物をメタノール−ジエチルエーテルの混合溶
媒から再結晶して得た物の物性および元素分析結果は、 赤外吸収スペクトルは第２図に示すように３．３００ｃ
ｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９００〜３，０５０ｃｍ−
１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７２０，１７３０および１．７
４０ｃｍ−１にエステルおよびウレタンのＣ＝Ｏ２に、
１，６５０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１，５１０〜
１．５４０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１，４４０ｃ
ｍ−１にＣ−Ｈ変角に、１，３９０ｃｍ−１にカルボキ
シレートに、１，２２０〜１，２８０ｃｍ−１にＣ−０
−Ｃ伸縮および第■吸収に、１，０３０ｃｍ−１にフェ
ニル面内変角に、ならびに６９０，７６０および８１０
ｃｍ−１にフェニル面外変角にそれぞれ由来する吸収が
見られる。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で、 （１）１．２ ｐｐｍ（６Ｈ）；（２）２．７ ｐｐｍ
（２Ｈ）；（３）３．１ ｐｐｍ（４Ｈ）；（４）３．
８ ｐｐｍ（３Ｈ）；（５）４．０ ｐｐｍ（４Ｈ）；
（６）４．１ ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）４．５ ｐｐｍ
（１Ｈ）；（８）４．７ ｐｐｍ（１Ｈ）：（９）５．
０ ｐｐｍ（２Ｈ）；（１０）５．５ ｐｐｍ（４Ｈ）
；（１１）６．１ ｐｐｍ（１Ｈ）；（１２）６．８〜
７．４ｐｐｍ（１４Ｈ）；に特徴があり、これらは下式
のそれぞれ相当する番号のプロトンに帰属させることが
できる。

こうして得たＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンエチルエステルとの１：
１付加化合物をＮ−ｐ−メトキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルとの１＝１付加付加物
に代えて用いて実施例５の分解反応をくり返した。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンエチルエ
ステルが得られ、その収率は９５．５％であった。

実施例 １４ Ｎ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸１．１８９１４ミリモル）およびＤＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステル塩酸塩１．７２５ｇ（８
ミリモル）を内容積約３０ｍ１のフラスコにとり、水酸
化ナトリウム溶液（１Ｎ）を加えて溶解し、ｐＨ６，０
に調整した。

水を加えて全容積を１５ｍ１としたあと、この溶液にサ
ーモライシン０．１ｇを加え３８ないし４０℃で５０分
間攪拌した。

析出した沈澱を濾集し水３０ｍ１で洗った後乾燥し、融
点１１９ないし１２８℃を示す結晶２．１０９ｇを得た
（Ｎ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−アスバ
ルチル−フェニルアラニンメチルエステルとフェニルア
ラニンメチルエステルとの１：１付加化合物の１／２水
塩としての収率８６．８％）。

これを酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から再結晶し
た。

得られた結晶を減圧下８０℃で７時間乾燥したところ、
下記物性および元素分析値を示す物質を得た。

またこの物質の赤外吸収スペクトルは実施例１で得たＮ
−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステルとの１：１付加化合物の
それと全く同じ特徴を示す。

核磁気共鳴吸収スペクトルは後述するように。

試料が結晶水を含むので、そのプロトンの吸収と、結晶
水の存在に起因する騒乱によりシフトした一ＮＨ−基お
よびＮＨ３＋一基のプロトンの吸収が４、ｌｐｐｍに現
われたほかは実施例１の上記付加化合物の場合と同一の
特徴を示した。

この化合物１．５０２４ｇをマイクロ波加熱器（２，４
５ＧＨｚ。

出力１．２Ｋｗ）中で１２分間マイクロ波照射により乾
燥したところ１．４８１５２ｇとなった（乾燥減量０．
０２Ｏ２０９１゜ マイクロ波乾燥後の物の元素分析結果は、で、その赤外
吸収スペクトルおよび核磁気共鳴吸収スペクトルは実施
例１で得たＮ−ｐ−メトキシベンジオキシカルボニル−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの１＝１付
加化合物と全く同一の特徴を示した。

またこうして得た化合物１．０ｇを水４ｍｌおよび塩酸
（ＩＮ）２ｄに加えて３分間６０℃でかきまぜ、得られ
たスラリーを濾過し、固相を水１０ｍ１で洗浄後乾燥し
たところ、Ｎ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルが得宴れ、一方濾液からはＤ−フェニルアラニンメ
チルエステルが得られた。

これらのことからマイクロ波乾燥による減量は結晶水の
飛散によるものであり、酵素反応により析出した生成物
はＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＤ
−フェニルアラニンメチルエステルとの１：１付加化合
物１分子に結晶水１／２分子の付加した物であることが
確認された。

こうして得た結晶水を含むＮ−ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルとＤ−フェニルアラニンメチルエス
テルとの１：１付加化合物０．３ｇを用いて、実施例５
に準じて操作を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルおよびＤ−フェニルアラニンメチルエステルの収
率は９５．９％であった。

実施例 １５ 実施例１で得られたＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の１：１付加化合物０．３ｇを塩化水素−クロロホルム
溶液（０，３１Ｎ）１０ｍｌに溶解し、６０℃で２時間
反応させた。

反応液を減圧下に蒸発し、残渣に水、トリエチルアミン
および内部標準としてシクロヘキサノンを加えて検液を
調製した。

この液について高速液体クロマトグラフ分析を行った。

α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの収率は９４．３％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明で中間体として経由するＮ
−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−ア
スパルチルーＬ−フェニルアラニンアルキルエステルと
フェニルアラニンアルキルエステルとの１：１付加化合
物の赤外吸収スペクトルを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
   であるフェニルアラニンアルキルエステル（式中Ｒは低
   級アルコキシル基である）と式で表わされ、少なくとも
   その一部はＬ−型の光学異性体であるＮ−ｐ−メトキシ
   ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸とを水性媒体
   中蛋白分解酵素の存在下で反応させて、一般式 で表わされ、かつ、結晶水を含むことのあるＮ−ｐ−メ
   トキシベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
   ルーＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとフェニル
   アラニンアルキルエステルとの１：１付加化合物（式中
   Ｒは前記同様の意味である）を生成、析出させ、これを
   反応液から分離し、分離されたこの１：１付加化合物を
   液状媒体中に溶解し、酸で分解することを特徴とする一
   般式 で表わされるα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラ
   ニンアルキルエステル（式中Ｒは前記同様の意味である
   ）の製造方法。 ２ 一般式中Ｒがメトキシ基である特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 ３ 一般式中Ｒがエトキシ基である特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 ４ 水性媒体が水溶液であり、かつ酵素の存在下での反
   応を約２０ないし約５０℃で行う特許請求の範囲第１項
   ないし第３項のいずれかの項記載の製造方法。 ５ 蛋白分解酵素が金属プロテアーゼであり、かつ酵素
   反応をｐＨ約５ないし約８で行う特許請求の範囲第１項
   ないし第４項のいずれかの項記載の製造方法。 ６ 液状媒体が有機溶媒である特許請求の範囲第１項な
   いし第５項のいずれかの項記載の製造方法。 ７ 有機溶媒がケトンである特許請求の範囲第６項記載
   の製造方法。 ８ 有機溶媒が含酸素有機溶媒である特許請求の範囲第
   ６項記載の製造方法。 ９ 有機溶媒が塩素化低級炭化水素である特許請求の範
   囲第６項記載の製造方法。 １０ 有機溶媒が非プロント性極性有機溶媒である特許
   請求の範囲第６項記載の製造方法。 １１ 有機溶媒が液状カルボン酸である特許請求の範囲
   第６項記載の製造方法。 １２ 液状媒体の使用量が、一般式 で表わされるＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
   ル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンアル
   キルエステルとフェニルアラニンアルキルエステルとの
   １：１付加化合物１重量部当り約１０ないし約１００重
   量部である特許請求の範囲第１項ないし第１１項のいず
   れかの項記載の製造方法。 １３ 酸が無機又は有機のブロンステッド酸である特許
   請求の範囲第１２項記載の製造方法。 １４ 酸の使用量が、一般式 で表わされるＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
   ル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニンアル
   キルエステルとフェニルアラニンアルキルエステルとの
   １：１付加化合物１モルに対し２当量以上である特許請
   求の範囲第１３項記載の製造方法。 １５ 液状媒体中の酸の濃度が約０．１ないし約１０規
   定である特許請求の範囲第１２項又は第１４項記載の製
   造方法。 １６ 酸による分解を温度約２０ないし約１００℃で行
   う特許請求の範囲第１項ないし第１５項のいずれかの項
   記載の製造方法。 １７ 出発物質として用いるフェニルアラニンアルキル
   エステル及びＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
   ルアスパラギン酸がいずれもＬ一体である特許請求の範
   囲第１項ないし第１６項のいずれかの項記載の製造方法
   。 １８ 出発物質として用いるフェニルアラニンアルキル
   エステル及びＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
   ルアスパラギン酸のいずれかの一方又は両方がＤ一体を
   含むものである特許請求の範囲第１項ないし第１６項の
   いずれかの項記載の製造方法。