JPS585191A - カリクレインの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカリクレインの精製方法に関する・さらに評Ｗ
ＡＫは、本発明は不溶型カリクレイン抗体を用いること
によってカリクレインを簡単に高純＆に精製する方法に
関する。

カリクレインは動物の尿、血清、唾液、汗。

涙、＊下線、膵臓、副性腺、腎臓などの生体内に広く分
布している蛋白分解酵素である。

またカリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプ
チドキニン管遊離させるキニン遊離酵素であり、近年、
儲濃器系疾患の治療剤として重要てあ）、臨床的に広く
用いられている。

カリクレインの精製法としては、従来、硫安塩析、溶媒
沈殿、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交換
クロマト、電気泳動法、１また阻害剤を利用するアフィ
ニティークロマトグラフィーを行う方法等があるが、こ
れらの方法にカリクレインと交雑蛋白との分離除来が困
難であり％異性に欠け、またかなりの時間と労力を要す
るという欠点【有している。

竣近ではこうした精製方法に代わって不溶■カリクレイ
ン抗体管用いたカリクレインの精製法が適用されつつあ
る。

しかしながら、不溶型カリクレイン抗体を用いる精製法
は抗原〜抗体反応の特異性を利用するため、その抗原−
抗体複合体の結合力が彊く、従来、溶離には線素及び塩
酸グアニジン等の変性溶離剤を用いざるｔ得なかつた。

（Ｂｌｏ＠ｈ＠ｍ、Ｊ、１８９，１５３−１５９．１９
８０および特開１１８５６−５０９５参照） ＋ＩＣ）結１これらの溶離ｇＫより、蛋白質の柳ａｔ変
化せしめ、溶出工程中でのカリクレインの失活は回避で
きず、また、溶出後、ただちにこれらの溶離剤として用
いた試ｖｓｔｒｉｋ＊することが必要であった。

本発ＷＡ＠は不溶型カリクレイン抗体を用いるカリクレ
インの端一方法について種々検討の結果、不溶型カリク
レイン抗体吸着物ｔアルカリ性水溶液で溶出することに
よプ、約９５％の回収率で、しかも高純度でかつ安定な
カリクレイン溶出液を取得する方法を見出した。

本発明においては、まず目的とする純度のカリクレイン
を動物に免疫することによりて得た抗体を不溶性担体と
化学的に共有結合させて不溶型カリクレイン抗体を調整
する。不溶性担体としては不活性であり、疎であり、不
溶性であろ担体、例えばアガロース、ガラスピーズ、デ
キストラン、ポリアクリルアミド等を用いることがで古
、前記抗体とは公知の方法で化学的に共有結合させて不
溶型カリクレイン抗体管調整することができる。

このような不溶型カリクレイン抗体を用いて粗製カリク
レイン溶液管処理することによシ、カリクレインを特異
的に吸着せしめたのち、洗浄によって不純物を完全Ｋ１
１ｌＩ＊シ、ついでアルカリ性水溶液、好ましくは０　
、２ＭＮ　Ｊ　ＣＯ＠水溶液により、カリクレイン管溶
離させることによって、高純度なカリクレイン【高収率
で得ることができる。

本発明で用いる粗製カリクレインは人會含む動物の尿、
血液、膵臓等の公知のカリクレイン含有原料から公知の
方法で調製することかで富る。

本発明書らは、カリクレインが溶液中、酸性側では不安
定であるが、アルカリ性側では比較的安定である事ｔａ
出し、その特性【利用し、木精製法ｔＳ立した。すなわ
ち、本発明で用いる溶出液、例えば０．２ＭＮａ、Ｃｏ
＠水溶液（ＰＨ１１，０〜１１　、５）中でｒｉ２５℃
で３時間処理１１４９フ襲以上の活性を残存することが
見出されている０さらに、本発明で用いるアルカリ性水
溶液は不溶性担体−抗体結合に何ら影響管与えず、ＰＨ
８付近の適当な緩衝液で再生することによ′す１半未久
的に繰り返し使用が可能であり、その吸着容量、活性回
収率及び純度に変化１ＪＦ−えることはない。

ｔたその溶離剤は安価でその後の脱塩及び廃棄が非常に
容易であると−う利点１に有している。

以上の点より不溶型カリクレイン抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液【用いるカリフレ１ンＯ精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。

次に実施例【挙げて本発明管説明するが、本発明はこれ
らの具体例により限定されるものではない。

る、これ會濾過し、濾液管限外濾過器によって濃縮して
全量１０００−とする。この濃縮液【抗カリクレイン抗
体を固定化したセファローズ４Ｂのカラム（２００ｓｇ
）に流下し、吸着（１時間〕させた後、０．１５Ｍ塩化
ナトリウム【含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液によ）充分
洗浄する６次に０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し、
これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥
する。

このｌ１ＢＩ珊によって表ＩＫ示される如く、比活性は
１０４倍上昇し、活性回収率は９４襲であったの 表１ 実施例２゜ 部分精製ヒト尿中カリクレイン溶液５０〇−（０，１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液Ｐ
Ｈ８，０を抗カリタレイン抗体【固定したセファローズ
４Ｂ（Ｄ鵞うム（２００ｍｇ）Ｋ滝下し、吸着（約３０
分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウム會含む０．０
５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液ＰＨ８，０で充分洗浄後、０
．２Ｍ炭酸す）　ＩＪウム溶液で溶出し、これｔセファ
デックスＧ−２！ｌにより脱塩後、凍結乾燥する・ 仁の４６理によって表２に示す如く、比活性は約８倍上
昇し、活性回収率は９７％であった。

表２ 実施例３ 部分精製カリクレイン溶液２００ａｇ　（０，１５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０５Ｍりン酸緩衝液ＰＨ８，０
）を抗カリクレイン抗体を固定化したガラスピーズのカ
ラム（２００ｓｄ）Ｋ流下し、吸着（約１０分）徒、０
．１５　Ｍ塩化ナトリウム【含むリン酸緩衝液ＰＨ８，
０で充分洗浄後、Ｑ、２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し
、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾
燥する・この処理によって表３に示す如く、比活性は７
．５倍上昇し、活性回収率は８５襲であった。

表３ 実施例４ 部分精製カリクレイン溶液Ｉｓ　ＯＯｇＩｔ（０，１５
アローズ４Ｂのカラム（２００ｍ）に流下し、吸着（約
３０分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｉ含む０
．０５　Ｍ　リン階緩働液ＰＨ８，０で充分洗浄後０．
１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１１，５
）で溶出し、−に７アデツクスＧ−２５にまり脱環後凍
結乾燥する。

この処理によって表４に示す如く、比活性は７．３倍上
昇し、活性回収率は８０襲であった。

表４ 実施例５ バンクレアチン１００ｆｔ冷水１０００１００Ｏ濁し、
約２時間攪拌抽出し、５０００回転１０分間達心分離稜
、上清を集め、０．ＩＮ水酸化ナトリウムでＰＨ８，Ｏ
Ｋ調節した後、抗カリクレイン抗体を固定したセファロ
ーズ４Ｂカラム（２００−）に流下し、吸着（約５０分
）場せた後０．１５Ｍ塩化ナトリウム【含もリン酸緩衝
液ＰＨ８，０で充分洗浄後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶
液で溶出し、セファデックスＧ−２５により脱塩後、凍
結乾燥する。この処理によって表５に示す如く、比活性
は３７００倍上昇し、活性回収率は９６襲であった。

表５ 実施例６ 豚膵ｌ１ｌＩＦＩＡ末１０ｏ９から実施例５と同様の操
作によって得た抽出液ｔＯ，ＩＮ水酸化ナトリウムテＰ
Ｈ８，０Ｋｌ１１節した稜、抗カリクレイン抗体を固定
化した竜７アローＸ４Ｂｔｙ’）ム（２００−）に流下
し、吸着（約５０分）さぜた螢、０．１Ｍグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液Ｐ）Ｉｌｌｉで溶出し、セファデ
ックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表６に示す如く、比活性は実施例７ 豚生膵臓５０１＋１−ミンチし、水１！５００５ｇ管加
え、自己消化させて抽出する。この抽出液管濾過して濾
液を取り、ｃｔ′Ｌを０．ＩＮ水酸化ナトリウムでＰＨ
８，０に調節した後、抗カリクレイン抗体を固定化した
ガラスピーズのカラムに流下し、吸着（約７０分）させ
た後、０．２Ｍ炭−ナトリウムにより溶出し、セファデ
ックスＧ　−２５により脱環後、凍結乾燥する。

この処理によって表７に示す如く、比活性は３５００倍
上昇し、活性回収率は８５′ｓであった・ Ｑ抗カリクレイン塾抗体固定化セファローズ４Ｂの調節
例 ＣＮＢｒ　活性化セファローズ４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍｅ
ｉａＦｉｎ＠Ｃｈ＠ｍ１ｃａｌｓ社製）　１００　ｆｌ
　ｔ　１ｍＭＭ（：ｔにて洗浄　ｍ＊管行ない、Ｏ，３
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液ＰＨ８，３中で１．５９の抗カリクレイン抗体と結
合させ、室温で２時間攪拌し、未反応の活性基１１Ｍの
エタノールアミンＰＨ８，０てブロッキング（２時間）
する。次に上記の炭酸水素ナトリウム緩衝液によｐブロ
ッキング試ａｔ−洗浄し、抗カリクレイン抗体固電化セ
ファローズ４Ｂとする。

０　抗カリクレイン抗体固定化ガラスピーズＯ調整径２
■のガラスピーズｚｏｏｐｔ十分に水洗した後、１５０
℃にて２４時間乾燥する。そのｖｋ２％ｒ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン−アセトン溶液２０〇−管加え
、４５℃にて２４時間還流する。次にビーズ【水洗１１
１１１グルタルアルデヒド２００ｍｔ加え４℃にて２４
時間振とうする・ そのｖｋ５０　ｖａＭ　　リン酸緩衝液ＰＨ７，ＯＫて
洗浄し、同緩衝液２００ｍｇ、抗カリクレイン抗体１４
０１９を添加し、４℃にて２４時間振とうする・次いで
０．１Ｍ炭醗ナトリウムに溶解した５０ｍＭエタノール
アミン２００ｍｔ添加し、４℃で２４時間振とうする・ このビーズを５０ｍＭ酢酸緩衝液ＰＩ（５，０で十分洗
浄徒、０．９％塩化ナトリウム、　　０．０５％アジ化
ナトリウム、０．３％牛血清アルブミン及び０．６襲ト
リトンＸ−４０５を含む５０　ｍ　Ｍ　トリス−塩酸緩
衝液ＰＨ５，０中に４℃にて保存する。

Ｐｒｏ−Ｐｈ＊−Ａｒｇ−ＭＣム活性測定法グロリルー
フェニルアラニルーアルギニンー４−メチル−クマリル
−７−アミドを基質とし、加藤らの方法（Ｊ　、　Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ、　８７．１１２７−１１３２．１９８０）
に基づいて行なった。

０．２−００．１５　Ｍ塩化ナトリウム管台ｔｒＯ，１
ｖトリス壌酸緩衝液ＰＨ８，０Ｋ　１０＾１の試料を加
え、３７℃５分間のブレインキ晶ベートの俵、１０ｍＭ
　Ｐｒｏ−Ｐｈ＊−ムｒｇ−ｍｃＡ溶液管加え、６０分
間の酵素反応を行なう。

０．１Ｍ　Ｉｖｉｌ緩１１１１ＰＨ４，５ｔ−２，５ｍ
　加、ｔ、反応を停止し、励起波長３８０ｎ■、螢光波
長４４０ｎｍにおける螢光管測定する。

カリクレイン活性は１分間当）１μモルの４−メチル−
クマリン−ツーアミンを遊離する酵素量管１ｕｎｌｔと
した０ 特許出脂人　杉　浦　　衛

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 入　粗製カリクレイン溶液管不溶型カリクレイン抗体で
   処理してカリクレインを特異的に吸着せしめ、吸着物を
   洗浄したのち、溶離剤としてアルカリ性水溶液！用いて
   カリクレイン管溶離すること管特徴とするカリクレイン
   の精製法。