JPS5838151B2 - カリクレインの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカリクレインの精製方法に関する。

さらに詳細には、本発明は不溶型カリクレイン抗体を用
いることによってカリクレインを簡単に高純度に精製す
る方法に関する。

カリクレインは動物の尿、血清、唾液、汗、涙、顎下腺
、膵臓、副性腺、腎臓などの生体内に広く分布している
蛋白分解酵素である。

またカリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプ
チドキニンを遊離させるキニン遊離酵素であり、近年、
循環器系疾患の治療剤として重要であり、臨床的に広く
用いられている。

カリクレインの精製法としては、従来、硫安塩析、溶媒
沈殿、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交換
クロマト、電気泳動法、また阻害剤を利用するアフイニ
テイークロマトグラフイーを行う方法等があるが、これ
らの方法はカリクレインと交雑蛋白との分離除去が困難
であり特異性に欠け、またかなりの時間と労力を要する
という欠点を有している。

最近ではこうした精製方法に代わって不溶型力リクレイ
ン抗体を用０）たカリクレインの精製法が適用されつつ
ある。

しかしながら、不溶型力リクレイン抗体を用いる精製法
は抗原一抗体反応の特異性を利用するため、その抗原一
抗体複合体の結合力が強く、従来、溶離には尿素及び塩
酸グアニジン等の変性溶離剤を用いざるを得なかった。

（ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８９，１５３−１５９．１
９８０および特開昭５６−５０９５参照） その結果、これらの溶離剤により、蛋白質の構造を変化
せしめ、溶出工程中でのカリクレインの失活は回避でき
ず、また、溶出後、ただちにこれらの溶離剤として用い
た試薬を除去することが必要であった。

本発明者は不溶型カリクレイン抗体を用いるカリクレイ
ンの精製方法について種々検討の結果、不溶型カリクレ
イン抗体吸着物をアルカリ性水溶液で溶出することによ
り、約９５％の回収率で、しかも高純度でかつ安定なカ
リクレイン溶出液を取得する方法を見出した。

本発明においては、まず目的とする純度のカリクレイン
を動物に免疫することによって得た抗体を不溶性担体と
化学的に共有結合させて不溶型カリクレイン抗体を調整
する。

不溶性担体としては不活性であり、疎であり、不溶性で
ある担体、例えばアガロース、ガラスビーズ、デキスト
ラン、ポリアクリルアミド等を用いることができ、前記
抗体とは公知の方法で化学的に共有結合させて不溶型カ
リクレイン抗体を調整することができる。

このような不溶型カリクレイン抗体を用いて粗製カリク
レイン溶液を処理することにより、カリクレインを特異
的に吸着せしめたのち、洗浄によって不純物を完全に除
去し、ついでアルカリ性水溶液、好ましくは０． ２
Ｍ Ｎ ａ ２ Ｃ Ｏ ｓ水溶液により、カリクレイ
ンを溶離させることによって、高純度なカリクレインを
高収率で得ることができる。

本発明で用いる粗製カリクレインは人を含む動物の尿、
血液、膵臓等の公知のカリクレイン含有原料から公知の
方法で調整することができる。

本発明者らは、カリクレインが溶液中、酸性側では不安
定であるが、アルカリ性側では比較的安定である事を見
出し、その特性を利用し、本精製法を確立した。

すなわち、本発明で用いる溶出液、例えば０． ２ Ｍ
Ｎ ａ ２ Ｃ Ｏ ｓ水溶液（ｐＨ１１．０〜１１
．５）中では２５℃で３時間処理後も９７％以上の活性
を残存することが見出されている。

さらに、本発明で用いるアルカリ性水溶液は不溶性担体
一抗体結合に何ら影響を与えず、ＰＨ８付近の適当な緩
衝液で再生することにより、半永久的に繰り返し使用が
可能であり、その吸着容量、活性回収率及び純度に変化
を与えることはない。

またその溶離剤は安価でその後の悦塩及び廃棄が非常に
容易であるという利点を有している。

以上の点より不溶型力リクレイン抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液を用いるカリクレインの精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。

次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれ
らの具体例により限定されるものではない○ 実施例 １ 成人尿４５ｌをＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調
整する。

これを瀘過し、瀘液を限外濾過器によって濃縮して全量
１０００ｍｌとする。

この濃縮液を抗カリクレイン抗体を固定化したセファロ
ーズ４Ｂのカラム（２００ｍのに流下し、吸着（１時間
）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５
ＭＩＪン酸緩衝液により充分洗浄する。

次に０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し、これをセフ
ァデツクスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表１に示される如く、比活性は１０４
倍上昇し、活性回収率は９４％であった。

実施例 ２ 部分精製ヒト尿中カリクレイン溶液５００ｌ７１ｌ（０
．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩
衝液ｐＨ８．０）を抗カリクレイン抗体を固定したセフ
ァローズ４Ｂのカラム（２００ｍ０に流下し、吸着（約
３０分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で充分洗浄後、０
．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し、これをセファデツ
クスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表２に示す如く、比活性は約８倍上昇
し、活性回収率は９７％であった。

実施例 ３ 部分精製カリクレイン溶液２ ０ ０７ｒＬｌ（ ０．
１ ５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝
液Ｉ）Ｈ８．０）を抗カリクレイン抗体を固定化したガ
ラスビーズのカラム（２００ｍのに流下し、吸着（約１
０分）後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液１）Ｈ８．Ｏで充分洗浄後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム
溶液で溶出し、これをセファデックスＧ 一２５により
脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表３に示す如く、比活性は７．５倍上
昇し、 活性回収率は８５％であった。

実施例 ４ 部分精製カリクレイン溶液５ ０ ０ｍｌ（ ０．１
５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝液
ＰＨ８．０）を抗カリクレイン抗体を固定化したセファ
ーローズ４Ｂのカラム（２００ｍＡ）に流下し、吸着（
約３０分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．０５ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ８．０で充分洗浄後０．
１Ｍグリシンー水酸化ナトリウム緩衝液（ ｐＨ１ １
．５ ’）で溶出し、セファデツクスＧ一２５により脱
塩後凍結乾燥する。

この処理によって表４に示す如く、比活性は７．３倍上
昇し、活性回収率は８０％であった。

実施例 ５ バンクレアチン１００ｇを冷水１０００′ｆＩＬｌに懸
濁し、約２時間攪拌抽出し、５０００回転１０分間遠心
分離後、上清を集め、０．ＩＮ水酸化ナトリウムでＰＨ
８．０に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定したセ
ファローズ４Ｂカラム（２００ｒｒＬｌ）に流下し、吸
着（約５０分）させた後０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含
むリン酸緩衝液ＰＨ８．０で充分洗浄後、０．２Ｍ炭酸
ナトリウム溶液で溶出し、セファデツクスＧ−２５によ
り脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表５に示す如く、比活性は３７００倍
上昇し、 活性回収率は９６％であった。

実施例 ６ 豚膵臓原末１ ００ｇから実施例５と同様の操作によっ
て得た抽出液を０．ＩＮ水酸化ナｌ− ＩＪウムでｐ
Ｈ ８． ０に調節した後、抗力リクレイン抗体を固定
化したセファローズ４Ｂカラム（２００７ｒｔのに流下
し、吸着（約５０分）させた後、０．１Ｍグリシンー水
酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．５で溶出し、セファデ
ツクスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥する。

この処理によって表６に示す如く、比活性は３６００倍
上昇し活性回収率は８２％であった。

実施例 ７ 豚生膵臓５００ｇをミンチし、水１５００ｍｌを加え、
自己消化させて抽出する。

この抽出液を瀘過して瀘液を取り、これを０，ＩＮ水酸
化ナトリウムでｐＨ８．０に調節した後、抗カリクレイ
ン抗体を固定化したガラスビーズのカラムに流下し、吸
着（約７０分）させた後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムによ
り溶出し、セファデツクスＧ−２５により脱塩後、凍結
乾燥する。

この処理によって表７に示す如く、比活性は３５００倍
上昇し、活性回収率は８５％であった。

０ 抗カリクレイン抗体固定化セファローズ４Ｂの調節
例 ＧＮＢｒ活性化セファローズ４ Ｂ （ Ｐｈａｒ−ｍ
ａｃｉｓ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 社製）１０
０ｇを１ｍＭＨＣ ｌにて洗浄、膨潤を行ない、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液ｐＨ８．３中で１．５ｇの抗カリクレイン抗体と結
合させ、室温で２時間攪拌し、未反応の活性基をＩＭの
エタノールアミンｐＨ８．０でプロツキング（２時間ノ
する。

次に上記の炭酸水素ナトリウム緩衝液によりプロツキン
グ試薬を洗浄し、抗力リクレイン抗体固定化セファロー
ズ４Ｂとする。

０ 抗カリクレイン抗体固定化ガラスビーズの調整 径２ｍｍのガラスビーズ２００ｇを十分に水洗した後、
１５０℃にて２４時間乾燥する。

その後２％ｒ−アミノプロビルトリエトキシシランーア
セトン溶液２００７７１ｌを加え、４５℃にて２４時間
還流する。

次にビーズを水洗後１％グルタルアルデヒド２００ｙｄ
を加え４℃にて２４時間振とウする。

その後５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液ｐ Ｈ ７． ０にて洗
浄し、同緩衝液２００ｍｌ，抗カリクレイン抗体１４０
■を添加し、４℃にて２４時間振とラする。

次いで０．１Ｍ炭酸ナトリウムに溶解した５０ｍＭエタ
ノールアミン２００１ｒＬｌを添加し、４°Ｃで２４時
間振とラする。

このビーズを５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で十分洗浄
後、０．９％塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリ
ウム、０．３％牛血清アルブミン及び０．６％トリトン
Ｘ−４０５を含む５ ０ ｍ Ｍ トリスー塩酸緩衝液
ＰＨ５．０中に４℃にて保存する。

Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −Ａｒｇ−ＭＣＡ活性測定法プロリル
ーフエニルアラニルーアルギニン−４−メチルークマリ
ル−７一アミドを基質とし、加藤らの方法（Ｊ ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．８７．１１２７−１１３２．１９８０）に
基づいて行なった。

０． ２ ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０に１０μｌの試料を加
え、３７°０５分間のプレインキュベートの後、１０ｍ
ＭＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ溶液を加え、６０分
間の酵素反応を行なう。

０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐ Ｈ ４． ５を２．５ｍｌ！加
え、反応を停止し、励起波長３ ８ ０ ｎｍ，蛍光波
長４４０ｎｍにおける蛍光を測定する。

カリクレイン活性は１分間当り１μモルの４メチルーク
マリン−７−アミンを遊離する酵素量をｌｕｎｉｔとし
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粗製カリクレイン溶液を不溶型カリクレイン抗体で
   処理してカリクレインを特異的に吸着せしめ、吸着物を
   洗浄したのち、溶離剤としてアルカリ性水溶液を用いて
   カリクレインを溶離することを特徴とするカリクレイン
   の精製法。