JPS5856684A - 微生物によるヒト血清アルブミンの生産 - Google Patents
微生物によるヒト血清アルブミンの生産Info
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- JPS5856684A JPS5856684A JP57149836A JP14983682A JPS5856684A JP S5856684 A JPS5856684 A JP S5856684A JP 57149836 A JP57149836 A JP 57149836A JP 14983682 A JP14983682 A JP 14983682A JP S5856684 A JPS5856684 A JP S5856684A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトの治療に使用されるヒト血清アルブミン
（ＨＳ Ａ ）を組換ＤＮＡ技術を使って微生物中で製
造する方法に関する。本発明の第１の目的は、実施可能
に（ｏｐｅｒａｂｌ ｙ）発現（表現）を促すプロモー
ター系と結合させた、ヒト血清アルブミンまたはその生
物学的に活性な成分を暗号化しているＤＮＡ配列を含有
する微生物発現ビヒクル（媒介物）の組立て方法および
組立てられた発現ビヒクルを提供することにある。本発
明のもう１つの目的は、上記のＤＮＡ配列を発現させる
ための、該発現ビヒクルで形質転換した微生物を提供す
ることにある。本発明の更にもう１つの目的は、この様
な発現の目的生成物を、例えばヒトの治療に有用な医薬
組成物の如き実際的なものに変換する手段および方法を
提供することにある。本発明の好ましい実施態様におい
ては、成熟ヒト血清アルブミンが直接生産される様に適
切に配列杢れた特定の発現ベクターを提供するものであ
る。
（ＨＳ Ａ ）を組換ＤＮＡ技術を使って微生物中で製
造する方法に関する。本発明の第１の目的は、実施可能
に（ｏｐｅｒａｂｌ ｙ）発現（表現）を促すプロモー
ター系と結合させた、ヒト血清アルブミンまたはその生
物学的に活性な成分を暗号化しているＤＮＡ配列を含有
する微生物発現ビヒクル（媒介物）の組立て方法および
組立てられた発現ビヒクルを提供することにある。本発
明のもう１つの目的は、上記のＤＮＡ配列を発現させる
ための、該発現ビヒクルで形質転換した微生物を提供す
ることにある。本発明の更にもう１つの目的は、この様
な発現の目的生成物を、例えばヒトの治療に有用な医薬
組成物の如き実際的なものに変換する手段および方法を
提供することにある。本発明の好ましい実施態様におい
ては、成熟ヒト血清アルブミンが直接生産される様に適
切に配列杢れた特定の発現ベクターを提供するものであ
る。
本発明の更にもう１つの目的は、ポリペプチド類または
その生物学的に活性な部分を暗号化しているｃＤＮＡを
調製する新規な方法を提供することである。ここでは、
逆転写によって、所望のポリペプチドの配列を暗号化し
ている一連のＤＮＡフラグメントを得るために、既知の
エンドヌクレアーゼ制限サイト（部位）に隣接する、該
ポリペプチドのｍＲＮＡの１部分に相当する合成プライ
マー（ｐｒｉｍｅｒ） Ｄ Ｎ Ａを利用する方法およ
び手段が提供される。これらの７ラグメントは、所望の
全蛋白質暗号配列が表わされ、個々のフラグメントは重
複するＤＮＡ配列を含んでおり、その重複する配列内に
共通のエンドヌクレアーゼ制限サイトをかくし持ってい
る様に調製される。この様にすることにより、それぞれ
のフラグメントを選択的に切断（開裂）シ、そして結合
させ、かくしてポリペプチドを暗号化している全ｃＤＮ
Ａ配列を適切な解読わく内で組立てることができる。こ
の発明方法によって、通常の逆転写酵素法および／また
は化学的合成によっては得ることができない高分子量蛋
白質のｃ ＤＮＡを得ることができる。
その生物学的に活性な部分を暗号化しているｃＤＮＡを
調製する新規な方法を提供することである。ここでは、
逆転写によって、所望のポリペプチドの配列を暗号化し
ている一連のＤＮＡフラグメントを得るために、既知の
エンドヌクレアーゼ制限サイト（部位）に隣接する、該
ポリペプチドのｍＲＮＡの１部分に相当する合成プライ
マー（ｐｒｉｍｅｒ） Ｄ Ｎ Ａを利用する方法およ
び手段が提供される。これらの７ラグメントは、所望の
全蛋白質暗号配列が表わされ、個々のフラグメントは重
複するＤＮＡ配列を含んでおり、その重複する配列内に
共通のエンドヌクレアーゼ制限サイトをかくし持ってい
る様に調製される。この様にすることにより、それぞれ
のフラグメントを選択的に切断（開裂）シ、そして結合
させ、かくしてポリペプチドを暗号化している全ｃＤＮ
Ａ配列を適切な解読わく内で組立てることができる。こ
の発明方法によって、通常の逆転写酵素法および／また
は化学的合成によっては得ることができない高分子量蛋
白質のｃ ＤＮＡを得ることができる。
本発明の詳細な説明するために、そしである場合には、
その実際面に関する詳細な事項を提供するために、参考
文献を本明細書の末尾に一括して挙げ、個々の文献に番
号を付して読者の参考に供した。以下の記載において、
（〕中の数字はかかる文献番号を表わすものとする。
その実際面に関する詳細な事項を提供するために、参考
文献を本明細書の末尾に一括して挙げ、個々の文献に番
号を付して読者の参考に供した。以下の記載において、
（〕中の数字はかかる文献番号を表わすものとする。
本発明の背景
（へ）ヒト血清アルブミン
ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）は、成人血清の主要な蛋
白質である。これは肝蔵で生産され、血１ 流の正常な浸透圧を維持するのに大いに役立っており、
また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持って
いる（文献１．２）。ＵＳＡの明らかな胎児の対応物は
α−フェトプロティンであり、これら２つのものの比較
実験が、ラット血清アルブミンとα−フェトプロティン
の比較実験と同様に行なわれて来た（文献３〜８）、Ｕ
ＳＡの完全な蛋白質の配列は発表されている（文献９〜
１２）。この発表されているＵＳＡの蛋白質の配列は、
成熟蛋白質の全アミノ酸数と同様に、約２０残余部分（
ｒｅｓｉｄｕｅｓ）において一致していない〔５８４ア
ミノ酸（文献９）、５８５（文献１２）］。
白質である。これは肝蔵で生産され、血１ 流の正常な浸透圧を維持するのに大いに役立っており、
また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持って
いる（文献１．２）。ＵＳＡの明らかな胎児の対応物は
α−フェトプロティンであり、これら２つのものの比較
実験が、ラット血清アルブミンとα−フェトプロティン
の比較実験と同様に行なわれて来た（文献３〜８）、Ｕ
ＳＡの完全な蛋白質の配列は発表されている（文献９〜
１２）。この発表されているＵＳＡの蛋白質の配列は、
成熟蛋白質の全アミノ酸数と同様に、約２０残余部分（
ｒｅｓｉｄｕｅｓ）において一致していない〔５８４ア
ミノ酸（文献９）、５８５（文献１２）］。
Ｈ８Ａは初め、［プレグＯＪ （ＰｒｅＰｒＯ） 配
列を含むプリカーサ−分子（文献１３．１４）として合
成されるという証拠がある。牛（文献１５）およびラッ
ト（文献１６）の血清アルブミンのプリカーサ−型も配
列化されている。
列を含むプリカーサ−分子（文献１３．１４）として合
成されるという証拠がある。牛（文献１５）およびラッ
ト（文献１６）の血清アルブミンのプリカーサ−型も配
列化されている。
医療にアルブミンを利用し得る根拠は、それが血液量減
少、低蛋白血症およびショックを治癒する点にある。ア
ルブミンは、最近、毛細管孔を通過し得ない溶質（コロ
イド）によって起る血漿コロイド浸透圧を改善するのに
使用されている。アルブミンの透過率は低いので、それ
は基本的には血管内に留まっている。細胞膜をはさむ両
側において、非分散性粒子の濃度が異なっていると、そ
の両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を通して水が
移行する。この浸透現象過程において、アルブミンは血
中の液体含量を維持する上で重要な働きをする。従って
、アルブミンを投与する基本的な治療上の意義は、外科
手術、ショック、火傷、浮腫を起す低蛋白血症における
がごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療
する点に存する。アルブミンはまた、診断にも使用する
ことができ、他の蛋白質と非特異的に結合し得る能力を
有するか故に種々の診断溶液に使用することができる。
少、低蛋白血症およびショックを治癒する点にある。ア
ルブミンは、最近、毛細管孔を通過し得ない溶質（コロ
イド）によって起る血漿コロイド浸透圧を改善するのに
使用されている。アルブミンの透過率は低いので、それ
は基本的には血管内に留まっている。細胞膜をはさむ両
側において、非分散性粒子の濃度が異なっていると、そ
の両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を通して水が
移行する。この浸透現象過程において、アルブミンは血
中の液体含量を維持する上で重要な働きをする。従って
、アルブミンを投与する基本的な治療上の意義は、外科
手術、ショック、火傷、浮腫を起す低蛋白血症における
がごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療
する点に存する。アルブミンはまた、診断にも使用する
ことができ、他の蛋白質と非特異的に結合し得る能力を
有するか故に種々の診断溶液に使用することができる。
現在、ヒト血清アルブミンは全血の分画によって生産さ
れており、合理的な価額で多量に得ることはできない。
れており、合理的な価額で多量に得ることはできない。
組換ＤＮＡ技術を使って、遺伝学的にヒト血清アルブミ
ンを効率よく生産するようにしむけた微生物を使って、
該アルブミンを豊富に生産することが出来る。本発明は
組換ＤＮＡ技術により、従来よりも廉価にかつ多量に、
純粋なＵＳＡを生産することを可能にしたものである。
ンを効率よく生産するようにしむけた微生物を使って、
該アルブミンを豊富に生産することが出来る。本発明は
組換ＤＮＡ技術により、従来よりも廉価にかつ多量に、
純粋なＵＳＡを生産することを可能にしたものである。
本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＤＮＡ配列体制お
よびそれから演緯されるアミノ酸配列についての知見を
提供するものであり、これはヒト血清アルブミンおよび
それに関連する蛋白質、例えばα−フェトプロティンの
進化論的、調整的および機能的性質を説明するのに役立
つものである。
よびそれから演緯されるアミノ酸配列についての知見を
提供するものであり、これはヒト血清アルブミンおよび
それに関連する蛋白質、例えばα−フェトプロティンの
進化論的、調整的および機能的性質を説明するのに役立
つものである。
更に詳細には、本発明は蛋白質遺伝暗号の全配列とｌ（
ＳＡｍλＮＡ の３′非翻訳部分にまたがるＣＬ１’
ｌｌＡクローンの単離法を提供するものである。これら
のｃ ＤＮＡクローンは、微生物株の中で、ｔｒｐ プ
ロモーターのコントロール（支配）下に成熟Ｈ５Ａｉ白
質を発現させるための組換発現ビヒクルを組立てるのに
使用された。本発明はまた、ＵＳＡの完全なヌクレオチ
ド配列および演鐸されるアミノ酸配列を提供するもので
ある。
ＳＡｍλＮＡ の３′非翻訳部分にまたがるＣＬ１’
ｌｌＡクローンの単離法を提供するものである。これら
のｃ ＤＮＡクローンは、微生物株の中で、ｔｒｐ プ
ロモーターのコントロール（支配）下に成熟Ｈ５Ａｉ白
質を発現させるための組換発現ビヒクルを組立てるのに
使用された。本発明はまた、ＵＳＡの完全なヌクレオチ
ド配列および演鐸されるアミノ酸配列を提供するもので
ある。
本明細書において、「成熟ヒト血清アルブミン」を発現
するとは、ヒト血清アルブミンｍＲＮＡの翻訳に直接関
与する前配列（プレプロ）を伴なっていないヒト血清ア
ルブミンを微生物により生産することをいう。本発明に
よれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻訳開始信号（ＡＴ
Ｇ）（これはまた、アルブミンの最初のアミノ酸に結合
しているアミノ酸メチオニンを暗号化している）から直
ちに発現される。このメチオニンアミノ酸は微生物によ
って自然に切断され、かくして直接ヒト血清アルブミン
が得られる。成熟ヒト血清アルブミンは、通常のリーダ
ー以外の複合蛋白質と共に発現させることができ、この
複合部（接合部、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は細胞内または
細胞外で特異的に切断することができる（英国特許公告
番号２００７６７６Ａ号参照）。
するとは、ヒト血清アルブミンｍＲＮＡの翻訳に直接関
与する前配列（プレプロ）を伴なっていないヒト血清ア
ルブミンを微生物により生産することをいう。本発明に
よれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻訳開始信号（ＡＴ
Ｇ）（これはまた、アルブミンの最初のアミノ酸に結合
しているアミノ酸メチオニンを暗号化している）から直
ちに発現される。このメチオニンアミノ酸は微生物によ
って自然に切断され、かくして直接ヒト血清アルブミン
が得られる。成熟ヒト血清アルブミンは、通常のリーダ
ー以外の複合蛋白質と共に発現させることができ、この
複合部（接合部、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は細胞内または
細胞外で特異的に切断することができる（英国特許公告
番号２００７６７６Ａ号参照）。
最後に、この成熟ヒト血清アルブミンは微生物信号（シ
グナル）ポリペプチドと結合させて生産することもでき
る（このシグナルポリペプチドによってその複合体は細
胞壁に輸送され、ここでこのシグナルは取り除かれ、成
熟ヒト血清アルブミンが分泌される）。
グナル）ポリペプチドと結合させて生産することもでき
る（このシグナルポリペプチドによってその複合体は細
胞壁に輸送され、ここでこのシグナルは取り除かれ、成
熟ヒト血清アルブミンが分泌される）。
Ｃ）組換ＤＮＡ技術
組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリ
ペプチドの微生物による生産が可能となった。多（の哺
乳動物ポリペプチド類、例えばヒト成長ホルモンおよび
ヒト並びに雑種白血球インターフェロンが既に種々の微
生物により生産されている。この技術によって種々の有
用なポリペプチドの微生物による生産が可能となり、種
々の薬物−標的応用に有用なワクチン、ホルモン、酵素
および抗体を微生物に生産させることができる様になっ
た。
ペプチドの微生物による生産が可能となった。多（の哺
乳動物ポリペプチド類、例えばヒト成長ホルモンおよび
ヒト並びに雑種白血球インターフェロンが既に種々の微
生物により生産されている。この技術によって種々の有
用なポリペプチドの微生物による生産が可能となり、種
々の薬物−標的応用に有用なワクチン、ホルモン、酵素
および抗体を微生物に生産させることができる様になっ
た。
組換ＤＮＡ技術の基本的要素はプラスミド、即ち細菌中
に、しばしば細胞当たり複数個のコピーの形で存在する
２本鎖ＤＮＡの染色体外ループである。このプラスミド
ＤＮＡに暗号化さもている情報には、このプラスミドを
娘細胞中で再生するのに必要となる情報（即ちレプリコ
ンまたは複製源）および通常、１種またはそれ以上の表
現型選択特性、例えば所望のプラスミドを含有している
宿主細胞のクローンを認識し、これを選択培地中で優先
的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含まれてい
る。細菌プラスミドを使用する理由は、それらは種々の
制限エンドヌクレアーゼ、即ち、「制限酵素」で特異的
に切断することができるからであり、それぞれの制限酵
素は、プラスミドＤＮＡ上の別々の位置を認識するから
である。
に、しばしば細胞当たり複数個のコピーの形で存在する
２本鎖ＤＮＡの染色体外ループである。このプラスミド
ＤＮＡに暗号化さもている情報には、このプラスミドを
娘細胞中で再生するのに必要となる情報（即ちレプリコ
ンまたは複製源）および通常、１種またはそれ以上の表
現型選択特性、例えば所望のプラスミドを含有している
宿主細胞のクローンを認識し、これを選択培地中で優先
的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含まれてい
る。細菌プラスミドを使用する理由は、それらは種々の
制限エンドヌクレアーゼ、即ち、「制限酵素」で特異的
に切断することができるからであり、それぞれの制限酵
素は、プラスミドＤＮＡ上の別々の位置を認識するから
である。
次いで外来性遺伝子または遺伝子フラグメントを、開裂
部位またはこれに隣接する改造末端で、端と端とをつな
ぎ合せることによりこのプラスミドに挿入することがで
きる（ここで「外来性」という用語は、問題にしている
微生物には通常存在しない遺伝子またはその微生物によ
っては通常は生産されないポリペプチド配列を表わすの
に使用し、一方、「内性」という用語は、対応する野性
株の微生物中に存在する遺伝子、あるいはそれによって
生産されるポリペプチドを表わすのに使用するものとす
る）。この様にして、いわゆる複製可能な発現ビヒクル
が形成される。
部位またはこれに隣接する改造末端で、端と端とをつな
ぎ合せることによりこのプラスミドに挿入することがで
きる（ここで「外来性」という用語は、問題にしている
微生物には通常存在しない遺伝子またはその微生物によ
っては通常は生産されないポリペプチド配列を表わすの
に使用し、一方、「内性」という用語は、対応する野性
株の微生物中に存在する遺伝子、あるいはそれによって
生産されるポリペプチドを表わすのに使用するものとす
る）。この様にして、いわゆる複製可能な発現ビヒクル
が形成される。
ＤＮＡ組換は微生物の外で行ない、得られた［組換」複
製可能発現ビヒクル（またはプラスミド）は、形質転換
として知られている工程によって微生物に挿入され、そ
してこの形質転換体を増殖させることによって外来性遺
伝子を持った組換ビヒクルを多量に得ることができる。
製可能発現ビヒクル（またはプラスミド）は、形質転換
として知られている工程によって微生物に挿入され、そ
してこの形質転換体を増殖させることによって外来性遺
伝子を持った組換ビヒクルを多量に得ることができる。
さらに、暗号化されたＤＮＡの情報（メツセージ）の転
写および翻訳を支配しているプラスミド部分に関して適
切な位置にこの遺伝子を挿入した場合は、得られた発現
ビヒクルは、その挿入された遺伝子が暗号化しているポ
リペプチド配列を実際に生産するのに使用することがで
きる。この過程を発現（表現）という。
写および翻訳を支配しているプラスミド部分に関して適
切な位置にこの遺伝子を挿入した場合は、得られた発現
ビヒクルは、その挿入された遺伝子が暗号化しているポ
リペプチド配列を実際に生産するのに使用することがで
きる。この過程を発現（表現）という。
発現はプロモーターとして知られているＤＮＡ領域で始
まる。発現の転写段階ではＤＮＡが巻きもどされ、全Ｄ
ＮＡ配列の５′末端から３末端へとメツセンジャーＲＮ
Ａの合成が開始される様にＤＮＡのセンス（意味のある
）暗号鎖が型板として露出する。次にメツセンジャーＲ
ＮＡがリボゾームに結合し、ここでこのメツセンジャー
ＲＮＡはＤＮＡが暗号化しているアミノ酸配列を持った
ポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチ
ドトリプレット（二連子）、即ち「コドン」によって暗
号化されている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
即ち発現されたポリペプチド生産物のアミノ酸配列を暗
号化しているＤＮＡ配列部分、を構成している。
まる。発現の転写段階ではＤＮＡが巻きもどされ、全Ｄ
ＮＡ配列の５′末端から３末端へとメツセンジャーＲＮ
Ａの合成が開始される様にＤＮＡのセンス（意味のある
）暗号鎖が型板として露出する。次にメツセンジャーＲ
ＮＡがリボゾームに結合し、ここでこのメツセンジャー
ＲＮＡはＤＮＡが暗号化しているアミノ酸配列を持った
ポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチ
ドトリプレット（二連子）、即ち「コドン」によって暗
号化されている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
即ち発現されたポリペプチド生産物のアミノ酸配列を暗
号化しているＤＮＡ配列部分、を構成している。
翻訳は「開始」信号（通常はＡＴＧ、これはメツセンジ
ャーＲＮＡではＡＵＧとなる）で始まる。
ャーＲＮＡではＡＵＧとなる）で始まる。
いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子の最後に転写さ
れるーは翻訳の終了、従ってそれ以上のアミノ酸単位の
生産の停止を指令する。生成した生産物は、宿主細胞を
分解し、他の蛋白質から適当な方法で精製することによ
り、回収して得ることができる。
れるーは翻訳の終了、従ってそれ以上のアミノ酸単位の
生産の停止を指令する。生成した生産物は、宿主細胞を
分解し、他の蛋白質から適当な方法で精製することによ
り、回収して得ることができる。
実際には、組換ＤＮＡ技術を使って完全な外来性ポリペ
プチドを発現することができるが（いわゆる直接発現）
、あるいはまた内性ポリペプチドのアミノ酸配列の一部
と結合した外来性ポリペプチドを発現することもできる
。後者の場合、所望の生物活性生成物は、細胞の外で開
裂されるまで、この融合した内性／外来性ポリペプチド
の中で不活性化されている（Ｗｅ ｔ ｚｅ ｌ 、Ａ
ｍｅｒ ｉ ｃａｎ ５ｃｉｅｎｔｉｓｔ郵 ６６４
（１９８０） 参照）。
プチドを発現することができるが（いわゆる直接発現）
、あるいはまた内性ポリペプチドのアミノ酸配列の一部
と結合した外来性ポリペプチドを発現することもできる
。後者の場合、所望の生物活性生成物は、細胞の外で開
裂されるまで、この融合した内性／外来性ポリペプチド
の中で不活性化されている（Ｗｅ ｔ ｚｅ ｌ 、Ａ
ｍｅｒ ｉ ｃａｎ ５ｃｉｅｎｔｉｓｔ郵 ６６４
（１９８０） 参照）。
組換ＤＮＡ技術が完全にその期待を裏切らないものであ
るならば、所望のポリペプチド生成物がコントロールさ
れた環境のもとで、そして高収率で得られる様に、遺伝
子挿入体の発現が最適となる様な系を工夫しなければな
らない。
るならば、所望のポリペプチド生成物がコントロールさ
れた環境のもとで、そして高収率で得られる様に、遺伝
子挿入体の発現が最適となる様な系を工夫しなければな
らない。
ｒ）当技術の現況
Ｓａｒｇｅｎｔらは、一連の組換ＤＮＡプラスミドとし
て、ラット血清アルブミンメツセンジャーＲＮＡのクロ
ーニングについて記載している（Ｐｒｏｃ、Ｆ’ｈｔｌ
。
て、ラット血清アルブミンメツセンジャーＲＮＡのクロ
ーニングについて記載している（Ｐｒｏｃ、Ｆ’ｈｔｌ
。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ） ７８２４３ （１９８
１）参照）。
１）参照）。
これは蛋白質物質の進化仮説を研究するため、クローン
のヌクレオチド配列を決定するために行なわれた。従っ
て、彼等は調製したｃｌ）ＮＡフラグメントを集めて組
立てる様なことはしなかった。
のヌクレオチド配列を決定するために行なわれた。従っ
て、彼等は調製したｃｌ）ＮＡフラグメントを集めて組
立てる様なことはしなかった。
一方、Ｄｕｇａｉｚｙｋらはヒト血清アルブミンのヒト
遺伝子についての研究の要約を発表している（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５．１９８１．Ａ
ｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｉｎｃ、ＮＹ、参照）。彼等
はｃＤＮＡフラグメントを得たが、α−フェトプロティ
ンおよび血清アルブミン遺伝子の基礎的な分子生物学を
研究する目的以外には、このフラグメントをクローンし
たり生産したりした形跡がない。
遺伝子についての研究の要約を発表している（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５．１９８１．Ａ
ｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｉｎｃ、ＮＹ、参照）。彼等
はｃＤＮＡフラグメントを得たが、α−フェトプロティ
ンおよび血清アルブミン遺伝子の基礎的な分子生物学を
研究する目的以外には、このフラグメントをクローンし
たり生産したりした形跡がない。
本発明の要約
本発明は、組換ＤＮＡ技術を使ってヒト血清アルブミン
を直接の形で好都合に、効率よく生産することができる
ことを見い出した事実に基くものである。この生産物は
、アルブミンの補給が必要な場合に、ヒトの治療に使用
するのに好適である。
を直接の形で好都合に、効率よく生産することができる
ことを見い出した事実に基くものである。この生産物は
、アルブミンの補給が必要な場合に、ヒトの治療に使用
するのに好適である。
この生成物は遺伝学的操作をほどこした微生物によって
生産されるので、現在の血液の分画技術による生産より
もずっと効率よ（ＵＳＡを製造し、分離することが可能
である。本発明の重要性は、約２０００塩基以上のｍＲ
ＮＡ転写体に相当する非常に長い蛋白質−〜５８４アミ
ノ酸−を生産する様に遺伝学的に微生物をしむけること
に成功した点にある。
生産されるので、現在の血液の分画技術による生産より
もずっと効率よ（ＵＳＡを製造し、分離することが可能
である。本発明の重要性は、約２０００塩基以上のｍＲ
ＮＡ転写体に相当する非常に長い蛋白質−〜５８４アミ
ノ酸−を生産する様に遺伝学的に微生物をしむけること
に成功した点にある。
本発明の目的はこの様にして生産されたヒト血清アルブ
ミンおよびその生産手段並びに方法を提供することにあ
る。更に本発明の目的は、直接発現し得る形でＵＳＡを
暗号化している遺伝子配列を含有している複製可能なり
ＮＡ発現ビヒクルを提供することにある。更にもう１つ
の本発明の目的は、上記の発現ビヒクルで形質転換した
微生物株およびＵＳＡを生産できる該微生物株の微生物
培養を提供することにある。更に、本発明はＨ８Ａ遺伝
子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および培養を調
製する種々の方法、およびその具体的な態様を提供する
ものである。更に本発明は、共通の制限エンドヌクレア
ーゼサイトを暗号化している領域において重複している
個々のｃＤＮＡフラグメントを調製し得る様に、その配
列が、既知の制限エンドヌクレアーゼサイトに隣接する
領域に相当する合成りＮＡプライマー配列を利用し、微
生物宿主にとって外来性のポリペプチド、例えばヒト血
清アルブミン、を暗号化しているｃ ＤＮＡ配列を調製
する方法を提供するものである。この方法によって、所
望のポリペプチドのために適切に暗号化されたＤＮＡ配
列を調製する様に、フラグメントを正確に切断し、結紮
することができる。
ミンおよびその生産手段並びに方法を提供することにあ
る。更に本発明の目的は、直接発現し得る形でＵＳＡを
暗号化している遺伝子配列を含有している複製可能なり
ＮＡ発現ビヒクルを提供することにある。更にもう１つ
の本発明の目的は、上記の発現ビヒクルで形質転換した
微生物株およびＵＳＡを生産できる該微生物株の微生物
培養を提供することにある。更に、本発明はＨ８Ａ遺伝
子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および培養を調
製する種々の方法、およびその具体的な態様を提供する
ものである。更に本発明は、共通の制限エンドヌクレア
ーゼサイトを暗号化している領域において重複している
個々のｃＤＮＡフラグメントを調製し得る様に、その配
列が、既知の制限エンドヌクレアーゼサイトに隣接する
領域に相当する合成りＮＡプライマー配列を利用し、微
生物宿主にとって外来性のポリペプチド、例えばヒト血
清アルブミン、を暗号化しているｃ ＤＮＡ配列を調製
する方法を提供するものである。この方法によって、所
望のポリペプチドのために適切に暗号化されたＤＮＡ配
列を調製する様に、フラグメントを正確に切断し、結紮
することができる。
好ましい実施の態様
本明細書に記載した研究は、宿主として用いられた微生
物にとって外来性である代表的なポリペプチドとしての
ヒト血清アルブミン（ＵＳＡ）の発現についてのもので
ある。同様に、この研究においては、英国特許出願公告
公報Ａ２０５５３８２Ａ号に記載されている微生物Ｅ、
ｃｏ目に一１２株２９４ （ｅｎｄ Ａ、Ｃｈｉ−、ｈ
ｓｒ 、ｋｈｓｍ＋） を使用した。
物にとって外来性である代表的なポリペプチドとしての
ヒト血清アルブミン（ＵＳＡ）の発現についてのもので
ある。同様に、この研究においては、英国特許出願公告
公報Ａ２０５５３８２Ａ号に記載されている微生物Ｅ、
ｃｏ目に一１２株２９４ （ｅｎｄ Ａ、Ｃｈｉ−、ｈ
ｓｒ 、ｋｈｓｍ＋） を使用した。
この菌株は７１ｖｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ寄託番号Ａ
３１４４６で寄託されている。
Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ寄託番号Ａ
３１４４６で寄託されている。
本発明の説明において、その最も好ましい実施態様にお
いては、上記のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４および
その他の既知のＥ、ｃｏｌｉ株、例えばＥ、ｃｏｌ ｉ
Ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉｘ１７７６およびＥ、ｃｏ目Ｗ３１１
０などを含むＥ、ｃｏｌｉ、またはその他の微生物株に
ついて記載した。これらの菌株の多くは公認の微生物機
関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）ニ寄託すレ、ソ
コカラ分譲が可能である（ＡＴＣＣカタログ参照、さら
に西独国特許公開公報第２６４４４３２号参照）。これ
らのその他の微生物としては、例えば枯草１５ｉ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉすなどの桿菌類（Ｂａｃｉ
ｌｌｉ）およびその他の腸内細菌、例えばねずみチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔ ｙｐｈ ｉｍｕｒ ｉ
ｕｍ）および霊菌（Ｓ ｅ ｒ ｒ ａ ｔ ｉ ａ
ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などを挙げることができ、これら
は外来性遺伝子配列を複製し、発現し得るプラスミドを
有する。
いては、上記のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４および
その他の既知のＥ、ｃｏｌｉ株、例えばＥ、ｃｏｌ ｉ
Ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉｘ１７７６およびＥ、ｃｏ目Ｗ３１１
０などを含むＥ、ｃｏｌｉ、またはその他の微生物株に
ついて記載した。これらの菌株の多くは公認の微生物機
関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）ニ寄託すレ、ソ
コカラ分譲が可能である（ＡＴＣＣカタログ参照、さら
に西独国特許公開公報第２６４４４３２号参照）。これ
らのその他の微生物としては、例えば枯草１５ｉ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉすなどの桿菌類（Ｂａｃｉ
ｌｌｉ）およびその他の腸内細菌、例えばねずみチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔ ｙｐｈ ｉｍｕｒ ｉ
ｕｍ）および霊菌（Ｓ ｅ ｒ ｒ ａ ｔ ｉ ａ
ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などを挙げることができ、これら
は外来性遺伝子配列を複製し、発現し得るプラスミドを
有する。
酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｃｒｅｖ
ｉｓｉａｅも、インターフェロン蛋白質を、これを暗号
化している遺伝子を酵母プロモーターのコントロール下
で発現させることによって、生産するための宿主微生物
として好適に使用することができる■ｔｚａｍｎらの同
時係属米国特許出願、譲受人：ジエネンテ亨り社ら、出
願臼；１９８１年２月２５日、代理人処理番号： １０
０／４３参照）。
ｉｓｉａｅも、インターフェロン蛋白質を、これを暗号
化している遺伝子を酵母プロモーターのコントロール下
で発現させることによって、生産するための宿主微生物
として好適に使用することができる■ｔｚａｍｎらの同
時係属米国特許出願、譲受人：ジエネンテ亨り社ら、出
願臼；１９８１年２月２５日、代理人処理番号： １０
０／４３参照）。
図面の説明
第１図はプラスミドｐ ＨＳ Ａ ｌの組み立てを示し
ている。
ている。
Ａ）第１番目の線はヒト血清アルブミン蛋白質を暗号化
しているｍＲＮＡを表わしており、その下は後に説明す
るｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ−６１およびＢ−４４
に含まれる領域を示している。成熟Ｈ８Ａ ｍＲＮＡ
の最初と最後のアミノ酸コドンは、円で囲った１および
５８５でそれぞれ示しである。ｐＨ５Ａｌの構造に含ま
れる制限エンドヌクレアーゼサイトは垂直の線で示しで
ある。この図にはヌクレオチドのおおよその寸法目盛も
示しである。
しているｍＲＮＡを表わしており、その下は後に説明す
るｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ−６１およびＢ−４４
に含まれる領域を示している。成熟Ｈ８Ａ ｍＲＮＡ
の最初と最後のアミノ酸コドンは、円で囲った１および
５８５でそれぞれ示しである。ｐＨ５Ａｌの構造に含ま
れる制限エンドヌクレアーゼサイトは垂直の線で示しで
ある。この図にはヌクレオチドのおおよその寸法目盛も
示しである。
Ｂ）図Ａ）で濃淡をつけたｃ ＤＮＡクローンから導か
れるＨ５Ａ暗号領域を持つ、完成したプラスミドｐ Ｈ
Ｓ Ａ ｌを示している。上と同様に、選択された制限
サイトおよび末端コドン番号１および５８５も描かれて
いる。Ｅ、ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターオペレーター
領域も、その転写の方向を示す矢印と共に示しである。
れるＨ５Ａ暗号領域を持つ、完成したプラスミドｐ Ｈ
Ｓ Ａ ｌを示している。上と同様に、選択された制限
サイトおよび末端コドン番号１および５８５も描かれて
いる。Ｅ、ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターオペレーター
領域も、その転写の方向を示す矢印と共に示しである。
Ｇ：Ｃはオリゴ（ｏｌ ｉｇｏ）ｄＧ ： ｄＧ尾を示
している。左端のＸｂａｌサイトおよび開始コドンＡＴ
Ｇは合成により付加された。ｐＨ５ＡｌのＰＢＲ３２２
部分のテトラサイクリン（Ｔりおよびアンピシリン（Ａ
Ｐ） 耐性遺伝子は太線で示しである。
している。左端のＸｂａｌサイトおよび開始コドンＡＴ
Ｇは合成により付加された。ｐＨ５ＡｌのＰＢＲ３２２
部分のテトラサイクリン（Ｔりおよびアンピシリン（Ａ
Ｐ） 耐性遺伝子は太線で示しである。
第２図は細菌により合成されたＵＳＡの免疫沈殿を示し
ている。
ている。
アルブミン表現プラスミドｐｉ（ＳＡＩ （４および５
レーン）で形質転換したＥ、ｃｏｌｉまたは対照プラス
ミドｐＬｅＩＦＡ２５ （同じ発現ビヒクルにインター
フェロンα遺伝子を含有している。２．３および７レー
ン。）で形質転換したＥ、ｃｏｌｉを３５５−メチオニ
ン添加培地中で増殖させた。２．４および７レーンの試
料は、トリプトファンを含まないＭ９培地でｔｒｐ
プロモーターにより発現が誘発（インジュース）された
。３および５レーンの試料は、ｔｒｐプロモーターを抑
えるためにトリプトファン含有ＬＢブロス中で増殖させ
た。ここに挙げた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフの各々の試料レーンは、密度Ａ５５゜
二１で０．７５４の細胞から免疫沈殿した標識蛋白質を
含んでいる。１および６レーンは放射活性蛋白質標準品
（ＢＲＬ）を含んでおり、その分子量が左側にキロダル
トンで示しである。細菌によって合成されたＵＳＡが、
６８，０００ｄ １４Ｃ−標識牛血清アルブミン標品と
混じり合って４レーンに見られる。ｐＨ３Ａｌの抑制培
養に対して誘発培養で血清アルブミンの生産が増大して
いることは、豊富培地に対する最少培地の３５５−メチ
オニンプール比活性の違いよりも、プラスミドに暗号化
された蛋白質合成の程度が高いことを示している（デー
タは示されていない）。６０，０００ｄの鋭い帯は明か
に人工物（ａｒｔｉｆａｃｔ）である。この帯は誘発お
よび抑制ｐＨ８Ａｌの両者および対照形質転換体にみら
れ、プレイミュン（ｐｒｅｉｒｒｒｎｕｎｅ） （７レ
ーン）および抗−ＵＳＡ Ｉｇｃｓ（２〜５レーン）に
結合している。４ンーンの小さい４７，０００ｄ 帯は
、明らかにプラスミドに暗号化されたものであり、早め
に終了した細菌合成Ｈ８Ａを表わしているかもしれない
。
レーン）で形質転換したＥ、ｃｏｌｉまたは対照プラス
ミドｐＬｅＩＦＡ２５ （同じ発現ビヒクルにインター
フェロンα遺伝子を含有している。２．３および７レー
ン。）で形質転換したＥ、ｃｏｌｉを３５５−メチオニ
ン添加培地中で増殖させた。２．４および７レーンの試
料は、トリプトファンを含まないＭ９培地でｔｒｐ
プロモーターにより発現が誘発（インジュース）された
。３および５レーンの試料は、ｔｒｐプロモーターを抑
えるためにトリプトファン含有ＬＢブロス中で増殖させ
た。ここに挙げた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフの各々の試料レーンは、密度Ａ５５゜
二１で０．７５４の細胞から免疫沈殿した標識蛋白質を
含んでいる。１および６レーンは放射活性蛋白質標準品
（ＢＲＬ）を含んでおり、その分子量が左側にキロダル
トンで示しである。細菌によって合成されたＵＳＡが、
６８，０００ｄ １４Ｃ−標識牛血清アルブミン標品と
混じり合って４レーンに見られる。ｐＨ３Ａｌの抑制培
養に対して誘発培養で血清アルブミンの生産が増大して
いることは、豊富培地に対する最少培地の３５５−メチ
オニンプール比活性の違いよりも、プラスミドに暗号化
された蛋白質合成の程度が高いことを示している（デー
タは示されていない）。６０，０００ｄの鋭い帯は明か
に人工物（ａｒｔｉｆａｃｔ）である。この帯は誘発お
よび抑制ｐＨ８Ａｌの両者および対照形質転換体にみら
れ、プレイミュン（ｐｒｅｉｒｒｒｎｕｎｅ） （７レ
ーン）および抗−ＵＳＡ Ｉｇｃｓ（２〜５レーン）に
結合している。４ンーンの小さい４７，０００ｄ 帯は
、明らかにプラスミドに暗号化されたものであり、早め
に終了した細菌合成Ｈ８Ａを表わしているかもしれない
。
第３図はヒト血清アルブミンのヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を示している。
ノ酸配列を示している。
Ｈ５ＡｍＲＮＡの３′非翻訳領域と成熟蛋白質遺伝暗号
のＤＮＡ配列は組換プラスミドＩ用ＳＡＩから決定し、
プレプロペプチド遺伝暗号および５′非翻訳領域のＤＮ
Ａ配列はプラスミドＰ−１４から決定した（テキスト参
照）。予想されたアミノ酸がこのＤＮＡ配列の上に含ま
れており、成熟蛋白質の最初の残余分から数える。先行
する２４アミノ酸はプレプロペプチドからなる。Ｄａｙ
ｈｏＥｆ （文献９）およびＭｏ ｕ Ｉ ｏ ｎら
（文献１２）によって報告されているＵＳＡの蛋白質配
列と一致しない５個のアミノ酸残余分には下線を引いた
。上記のヌクレオチド配列は多分、Ｈ５ＡｍＲＮＡの実
際の５′末端にのびていない。アルブミン直接発現プラ
スミドｐＨ５Ａｌにおいては、成熟蛋白質暗号領域の直
前にはＥ、ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターオペレーター
リーダーペプチドリボゾーム結合サイト（文献３６．３
７）、人工Ｘｂａｌサイトおよび人工開始コドンＡＴＧ
があり、プレプロ領′威は切り取られている。ｐ ＨＳ
Ａ ｌのＵＳＡ コドン魔１の前のヌクＬ／、ｔ
チｔ’Ｇ；！５’−ＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡ
ＴＣＴＡＧＡＴＧである。
のＤＮＡ配列は組換プラスミドＩ用ＳＡＩから決定し、
プレプロペプチド遺伝暗号および５′非翻訳領域のＤＮ
Ａ配列はプラスミドＰ−１４から決定した（テキスト参
照）。予想されたアミノ酸がこのＤＮＡ配列の上に含ま
れており、成熟蛋白質の最初の残余分から数える。先行
する２４アミノ酸はプレプロペプチドからなる。Ｄａｙ
ｈｏＥｆ （文献９）およびＭｏ ｕ Ｉ ｏ ｎら
（文献１２）によって報告されているＵＳＡの蛋白質配
列と一致しない５個のアミノ酸残余分には下線を引いた
。上記のヌクレオチド配列は多分、Ｈ５ＡｍＲＮＡの実
際の５′末端にのびていない。アルブミン直接発現プラ
スミドｐＨ５Ａｌにおいては、成熟蛋白質暗号領域の直
前にはＥ、ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターオペレーター
リーダーペプチドリボゾーム結合サイト（文献３６．３
７）、人工Ｘｂａｌサイトおよび人工開始コドンＡＴＧ
があり、プレプロ領′威は切り取られている。ｐ ＨＳ
Ａ ｌのＵＳＡ コドン魔１の前のヌクＬ／、ｔ
チｔ’Ｇ；！５’−ＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡ
ＴＣＴＡＧＡＴＧである。
詳細な説明
（ハ）ｃＤＮＡの合成およびクローニングリボヌクレオ
シド−バナジル錯体法（文献１７）またはグアニジニウ
ムチオシアネート法（文献１８）のいずれかにより、バ
イオプシー（生検）または死体から漬たヒトの迅速凍結
肝臓標本からポリ（へ）十ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ
の反応は、基本的には文献１９に記載された方法に従い
、ホスホトリエステル法（文献２０）により製造したオ
リゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリゴ（ｄＴｉｉｓ
（ＣｏｌｌａｂｏｒａＬｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
のいずれかをプライマーとして用いて行なった。典型的
なｃＤＮＡ反応では、２５〜３５μｍのポリ（ハ）＋Ｒ
ＮＡ と４０〜ｆ３ Ｑ ｐｍｏｌのオリゴヌクレオ
チドプライマーを５０ ｍＭ （７）Ｎａｃｌ中、９０
°で５分間加熱した。
シド−バナジル錯体法（文献１７）またはグアニジニウ
ムチオシアネート法（文献１８）のいずれかにより、バ
イオプシー（生検）または死体から漬たヒトの迅速凍結
肝臓標本からポリ（へ）十ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ
の反応は、基本的には文献１９に記載された方法に従い
、ホスホトリエステル法（文献２０）により製造したオ
リゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリゴ（ｄＴｉｉｓ
（ＣｏｌｌａｂｏｒａＬｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
のいずれかをプライマーとして用いて行なった。典型的
なｃＤＮＡ反応では、２５〜３５μｍのポリ（ハ）＋Ｒ
ＮＡ と４０〜ｆ３ Ｑ ｐｍｏｌのオリゴヌクレオ
チドプライマーを５０ ｍＭ （７）Ｎａｃｌ中、９０
°で５分間加熱した。
この反応混合物を、最終濃度が２０ｍＭＩＪス塩酸ｐＨ
８，３，２０ｍＭＫＣｌ！、８ｍＭＭｇＣ１２，３０ｍ
Ｍジチオトレイット、１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
８，３，２０ｍＭＫＣｌ！、８ｍＭＭｇＣ１２，３０ｍ
Ｍジチオトレイット、１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰｌｄＴＴＰ（プラス３２ Ｐ −ｄ ＣＴＰ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、生産物の回収を追跡するため）
となる様にし、４２°Ｃで５分間アニーリングした。１
００単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を加え、４２°
で４５分間インキュベートした。２本目のＤＮＡ鎖合成
、ＳＩ処理、ポリアクリルアミドゲル上でめ大きさの選
択、デオキシ（ｑティリングおよび、ＰｓｔＩにより開
裂し、デオキシ０テイリングしたｐＢＲ３２２へのアニ
ーリングは既述の方法（文献２１．２２）で行なった。
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、生産物の回収を追跡するため）
となる様にし、４２°Ｃで５分間アニーリングした。１
００単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を加え、４２°
で４５分間インキュベートした。２本目のＤＮＡ鎖合成
、ＳＩ処理、ポリアクリルアミドゲル上でめ大きさの選
択、デオキシ（ｑティリングおよび、ＰｓｔＩにより開
裂し、デオキシ０テイリングしたｐＢＲ３２２へのアニ
ーリングは既述の方法（文献２１．２２）で行なった。
アニーリングした混合物を使って、発表されている方法
（文献２４）に従ってＥ、ｃｏｌｉＫ−１２株２９４（
文献２３）を形質転換した。
（文献２４）に従ってＥ、ｃｏｌｉＫ−１２株２９４（
文献２３）を形質転換した。
（Ｂ）３２ｐ−標識プローブを用いた組換プラスミドの
スクリーニング Ｅ、ｃｏｌｉ形質転換体を５μｍ／ｒｎ１．のテトラサ
イタリン含有ＬＢ寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロ
ー スｌｐ紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅ
ｌ ｌ 、ＢＡ８５）に移し、系中（ｉｎ ｇｉｔｕ）
コロニースクリーニング法の改良法（文献２５）を使っ
て、雑種形成により試験した。長さ１２ないし１６のヌ
クレオチドノ３２Ｐ−末端標識（文献２６）オリゴデオ
キシヌクレオチドフラグメントを直接雑種形成プローブ
として用いた。あるいは、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ
デオキシヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡから３
２Ｐ−ｃＤＮＡプローブを合成した（文献１９）。フィ
ルターを５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液（文献２
７〕、５ｘ ＳＳＣ（ｌｘ ＳＳＣ＝ １．５ＭＮａｃ
ｌ。
スクリーニング Ｅ、ｃｏｌｉ形質転換体を５μｍ／ｒｎ１．のテトラサ
イタリン含有ＬＢ寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロ
ー スｌｐ紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅ
ｌ ｌ 、ＢＡ８５）に移し、系中（ｉｎ ｇｉｔｕ）
コロニースクリーニング法の改良法（文献２５）を使っ
て、雑種形成により試験した。長さ１２ないし１６のヌ
クレオチドノ３２Ｐ−末端標識（文献２６）オリゴデオ
キシヌクレオチドフラグメントを直接雑種形成プローブ
として用いた。あるいは、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ
デオキシヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡから３
２Ｐ−ｃＤＮＡプローブを合成した（文献１９）。フィ
ルターを５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液（文献２
７〕、５ｘ ＳＳＣ（ｌｘ ＳＳＣ＝ １．５ＭＮａｃ
ｌ。
０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）５０ｍＭ燐酸ナトリウ
ムｐＨ６，８，２０μｂ匂サケ精子ＤＮＡ中、４°〜４
２°の温度で１夜雑種形成させ、３２ｐ−標識プローブ
の長さに応じて４°〜４２°の温度で、１〜０．２ｘＳ
ＳＣの濃度の塩プラス０．１ ｌ Ｓ Ｄ Ｓ中で洗浄
した（文献２８）。ＤｕＰｏｎｔ Ｌｉｇｈｎｉｎｇ−
Ｐｌｕｓ強△ 化スクリーンを用い、乾燥したフィルターをコダックＸ
Ｒ−２Ｘ線フィルムに−８０’で感光させた。
ムｐＨ６，８，２０μｂ匂サケ精子ＤＮＡ中、４°〜４
２°の温度で１夜雑種形成させ、３２ｐ−標識プローブ
の長さに応じて４°〜４２°の温度で、１〜０．２ｘＳ
ＳＣの濃度の塩プラス０．１ ｌ Ｓ Ｄ Ｓ中で洗浄
した（文献２８）。ＤｕＰｏｎｔ Ｌｉｇｈｎｉｎｇ−
Ｐｌｕｓ強△ 化スクリーンを用い、乾燥したフィルターをコダックＸ
Ｒ−２Ｘ線フィルムに−８０’で感光させた。
（Ｃ）ＤＮＡの調製および制限酵素分析プラスミドＤＮ
Ａを大量スケール（文献２９）または少量スケ−Ａ−（
ｍｉｎｉｐｒｅｐ、文献３０）で調製し、製造条件に従
って制限酵素（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ ａｂ
ｓ 、ＢＲＬ）ｉＱπ開裂した。５１ａｂゲル電気泳動
条件およびゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出に
ついては文献３１に記載されている。
Ａを大量スケール（文献２９）または少量スケ−Ａ−（
ｍｉｎｉｐｒｅｐ、文献３０）で調製し、製造条件に従
って制限酵素（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ ａｂ
ｓ 、ＢＲＬ）ｉＱπ開裂した。５１ａｂゲル電気泳動
条件およびゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出に
ついては文献３１に記載されている。
（１１） Ｄ Ｎ Ａ配列法
ＤＮＡ配列は、末端標識Ｄ Ｎ Ａフラグメントを用い
てＭａＸａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ（文献２６）の方法
により、そして合成オリゴヌクレオチド（文献２０）プ
ライマーを用いて、ファージＭ１３ｍＰ７サブクローン
（文献３３）からの１本鎖ＤＮＡにおけるジデオキシ鎖
末端法（文献３２）の両方を用いて行なった。各領域は
独立して数回配列させた。
てＭａＸａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ（文献２６）の方法
により、そして合成オリゴヌクレオチド（文献２０）プ
ライマーを用いて、ファージＭ１３ｍＰ７サブクローン
（文献３３）からの１本鎖ＤＮＡにおけるジデオキシ鎖
末端法（文献３２）の両方を用いて行なった。各領域は
独立して数回配列させた。
（Ｅ）Ｈ５Ａ直接発現のためのアルブミン遺伝子の５′
末端の組み立て １０μグ（〜１６ｐ１６ｐのプラスミドＦ −４７の〜
１２００ｂｐ ＰｓＬＩ挿入体を水中で５分間煮沸し、
１００Ｐモルの３２ｐ−末端標識５′プライマー（ｄＡ
１℃ＧＡπｌ、Ｃ；ＡＣＡＣ〜６）と混合した。この混
合物を氷で冷やし、０°Ｃで６１ＭＭ トリス塩酸１１
ｆ（７，５，５ｍＭ ＭｙＣ１２，６ＱｍＭＮａＣ／
、０．５ｍＭｄＡＴＰ１ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
の最終容量１２０μｊにした。１０単位のＤＮＡｆ
！リメラーゼＩ ＩＱｅｎｏｗフラグメント（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加し、この混合
物を２４°で５時間インキュベートした。
末端の組み立て １０μグ（〜１６ｐ１６ｐのプラスミドＦ −４７の〜
１２００ｂｐ ＰｓＬＩ挿入体を水中で５分間煮沸し、
１００Ｐモルの３２ｐ−末端標識５′プライマー（ｄＡ
１℃ＧＡπｌ、Ｃ；ＡＣＡＣ〜６）と混合した。この混
合物を氷で冷やし、０°Ｃで６１ＭＭ トリス塩酸１１
ｆ（７，５，５ｍＭ ＭｙＣ１２，６ＱｍＭＮａＣ／
、０．５ｍＭｄＡＴＰ１ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
の最終容量１２０μｊにした。１０単位のＤＮＡｆ
！リメラーゼＩ ＩＱｅｎｏｗフラグメント（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加し、この混合
物を２４°で５時間インキュベートした。
フェノール／クロロホルム抽出の後、生成物をＨｐａｌ
ｌで消化し、５チポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
し、所望の４５０ ｂｐフラグメントを電気溶出した。
ｌで消化し、５チポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
し、所望の４５０ ｂｐフラグメントを電気溶出した。
１０ＭＭとなるデオキシヌクレオシドトリホスフェート
および１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混合物
に加え、１２°で１０分間インキュベートすることによ
り、ベクタープラスミドｐＬｅｌＦ Ａ２５（文献２１
）（ＤＸｂａＩ消化によって生成した１本鎖張り出し
部分を満たし、プラント（鈍感）ＤＮＡ末端を生成せし
めた。制限エンドヌクレアーゼフラグメント（はぼ当モ
ル、０．１〜１μグ）をアニーリングし、２０μｌの５
０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ７，６、ｌＱｍＭＭグＣ１２、Ｑ
、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ。
および１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混合物
に加え、１２°で１０分間インキュベートすることによ
り、ベクタープラスミドｐＬｅｌＦ Ａ２５（文献２１
）（ＤＸｂａＩ消化によって生成した１本鎖張り出し
部分を満たし、プラント（鈍感）ＤＮＡ末端を生成せし
めた。制限エンドヌクレアーゼフラグメント（はぼ当モ
ル、０．１〜１μグ）をアニーリングし、２０μｌの５
０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ７，６、ｌＱｍＭＭグＣ１２、Ｑ
、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ。
５ｍＭ ジチオトレイット、１ｍＭｒＡＴＰ中、５０単
位のＴ４リガーゼ（Ｎ、 Ｅ、 Ｂｉｏｌａｂりを用い
て１２°Ｃで１夜結紮した。プラスミド組み立てについ
ての詳細は後述する。
位のＴ４リガーゼ（Ｎ、 Ｅ、 Ｂｉｏｌａｂりを用い
て１２°Ｃで１夜結紮した。プラスミド組み立てについ
ての詳細は後述する。
店）蛋白質分析
組換Ｅ、ｃｏｌｉ 株の培養２ｒｎｌをＬＢまたはＭ
９培地（＋５μＶ／−のテトラサイクリン）中で密度Ａ
３５ｏ−１，０まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、
再びペレット化し、２ｒｎｔのＬＢまたは補足Ｍ９（Ｍ
９十０．２％グルコース、１ ｐ ｔ／ｍｌｆ ７ ミ
７．２０μｙ／−標準アミノ酸、ただしメチオニンは２
μｍ／−であり、トリプトファンは除く）に懸濁した。
９培地（＋５μＶ／−のテトラサイクリン）中で密度Ａ
３５ｏ−１，０まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、
再びペレット化し、２ｒｎｔのＬＢまたは補足Ｍ９（Ｍ
９十０．２％グルコース、１ ｐ ｔ／ｍｌｆ ７ ミ
７．２０μｙ／−標準アミノ酸、ただしメチオニンは２
μｍ／−であり、トリプトファンは除く）に懸濁した。
各増殖培地は５μｙ／１ｎｌのテトラサイクリンおよび
１００μＣ１３５Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ；１２００Ｃ
ｉ／ミリモル〕も含んでいた。１時間３７°でインキュ
ベートした後、バクテリアを釉レット化し、凍結融解し
、２００μｊの５０ｍＭ）！Ｊス塩酸ｐＨ７，５，０，
１２ｍＭＮａＥＤＴＡに再懇濁し、リゾチームを１ｌ−
１ＮＰ４Ｑを０．２％、ＮａＣ／剖、３５Ｍとなる様に
添加して１０分間氷の上に置いた。
１００μＣ１３５Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ；１２００Ｃ
ｉ／ミリモル〕も含んでいた。１時間３７°でインキュ
ベートした後、バクテリアを釉レット化し、凍結融解し
、２００μｊの５０ｍＭ）！Ｊス塩酸ｐＨ７，５，０，
１２ｍＭＮａＥＤＴＡに再懇濁し、リゾチームを１ｌ−
１ＮＰ４Ｑを０．２％、ＮａＣ／剖、３５Ｍとなる様に
添加して１０分間氷の上に置いた。
溶解質（ｌｙｓｉｔｅ）を１０ ｍＭ ＭＳｉ’Ｃ／
２ ニ調節し、５０ μｆ！／ｍ７のＤＮａ ｓ ｅ
Ｉ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と共に氷上で３０
分間インキュベートした。おだやかに遠心分離して不溶
性物質を除去した。試料を、文・Ｉ 献３４に記載されている様に、家兎抗−Ｈ５Ａ（Ｃａｐ
ｐｅｌ Ｌａｂｓ）およびぶどう状球菌性アブソーベン
ト（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ：Ｃａ／ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で
免疫沈殿させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（文献３５）にかけた。
２ ニ調節し、５０ μｆ！／ｍ７のＤＮａ ｓ ｅ
Ｉ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と共に氷上で３０
分間インキュベートした。おだやかに遠心分離して不溶
性物質を除去した。試料を、文・Ｉ 献３４に記載されている様に、家兎抗−Ｈ５Ａ（Ｃａｐ
ｐｅｌ Ｌａｂｓ）およびぶどう状球菌性アブソーベン
ト（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ：Ｃａ／ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で
免疫沈殿させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（文献３５）にかけた。
ｐ）ｃＤＮＡクローニング
オリゴ（ｄＴ）をつけた最初のｃＤＮＡクローンを、全
肝蔵ｃＤＮＡ （豊富なＲ−Ｎ Ａ種含有クローンを
同定するため）および、肝蔵ｍＲＮＡから、Ｈ８Ａの５
４６−５４９並びに２９４−２９７アミノ酸の可能な暗
号変化を表わすために合成された２セツトの４個の１１
塩基オリゴデオキシヌクレオチドをつけた２個の３２ｐ
標識ｃＤＮＡの両者とのコロニー雑種形成によりスクリ
ーニングした。陽性コロニーは、所望のＨ５ＡｍＲＮＡ
配列の蛋白質暗号領域の約３′１以上は含んでいなかっ
た（これらの組換体の最大のものはＢ−４４と命名され
た）。
肝蔵ｃＤＮＡ （豊富なＲ−Ｎ Ａ種含有クローンを
同定するため）および、肝蔵ｍＲＮＡから、Ｈ８Ａの５
４６−５４９並びに２９４−２９７アミノ酸の可能な暗
号変化を表わすために合成された２セツトの４個の１１
塩基オリゴデオキシヌクレオチドをつけた２個の３２ｐ
標識ｃＤＮＡの両者とのコロニー雑種形成によりスクリ
ーニングした。陽性コロニーは、所望のＨ５ＡｍＲＮＡ
配列の蛋白質暗号領域の約３′１以上は含んでいなかっ
た（これらの組換体の最大のものはＢ−４４と命名され
た）。
現在の方法では所望のサイズ（〜２００１ｂＰ）のｍ
ＲＮＡを直接コピーすることができないので、Ｂ−４４
の５′末端近くの領域のアンチメツセージ鎖に相当する
様に合成オリゴデオキシヌクレオチドを製造した。Ｂ−
４４のヌクレオチド配列から、アミノ酸３６９−３７３
に相当する１２塩基オリゴデオキシヌクレオチドを組み
立てた。これを肝臓ｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成に、そして
現在ノＢ −４４組換体と重複しているがＨ５Ａメツセ
ージの５御分を含んでいるｐＢＲ３２２中でｃＤＮＡク
ローンを生産するために使用した。本発明者らがこれま
でに決定したｍＲＮＡ配列の僅か上流に位置する１６塩
基オリゴデオキシヌ外レオチドフラグメントとのコロニ
ー雑種形成により、得られた約４００のクローンをスク
リーニングした。約４（ｌのコロニーが両プローブと雑
種形成した。雑種形成したプラスミドを含有していなか
ったコロニーの多くは、逆転写の間にＲＮＡが自己付着
（ｐｒｉｍｉｎｇルたかまたは混入したオリゴ（ｄＴ）
と付着したか、あるいはスクリーニングに使用した配列
を含んでいる３′領域を失なったかであると考えられる
。雑種形成コロニーからの少量（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）の
プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化した。３個の組換プ
ラスミドが Ｈ８Ａメツセージの残りの５′部分を暗号
化するのに十分大きい挿入体を含んでいた。これらの内
の２つ（Ｆ−１５およびＦ−４７）は遺伝子の５味端暗
号部分を含んでいたがＢ−４４と結合させて完全なアル
ブミン遺伝子を形成させるのに必要なＰｓｔＩサイトま
では延びていなかつｔこ。
ＲＮＡを直接コピーすることができないので、Ｂ−４４
の５′末端近くの領域のアンチメツセージ鎖に相当する
様に合成オリゴデオキシヌクレオチドを製造した。Ｂ−
４４のヌクレオチド配列から、アミノ酸３６９−３７３
に相当する１２塩基オリゴデオキシヌクレオチドを組み
立てた。これを肝臓ｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成に、そして
現在ノＢ −４４組換体と重複しているがＨ５Ａメツセ
ージの５御分を含んでいるｐＢＲ３２２中でｃＤＮＡク
ローンを生産するために使用した。本発明者らがこれま
でに決定したｍＲＮＡ配列の僅か上流に位置する１６塩
基オリゴデオキシヌ外レオチドフラグメントとのコロニ
ー雑種形成により、得られた約４００のクローンをスク
リーニングした。約４（ｌのコロニーが両プローブと雑
種形成した。雑種形成したプラスミドを含有していなか
ったコロニーの多くは、逆転写の間にＲＮＡが自己付着
（ｐｒｉｍｉｎｇルたかまたは混入したオリゴ（ｄＴ）
と付着したか、あるいはスクリーニングに使用した配列
を含んでいる３′領域を失なったかであると考えられる
。雑種形成コロニーからの少量（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）の
プラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化した。３個の組換プ
ラスミドが Ｈ８Ａメツセージの残りの５′部分を暗号
化するのに十分大きい挿入体を含んでいた。これらの内
の２つ（Ｆ−１５およびＦ−４７）は遺伝子の５味端暗
号部分を含んでいたがＢ−４４と結合させて完全なアル
ブミン遺伝子を形成させるのに必要なＰｓｔＩサイトま
では延びていなかつｔこ。
組換体Ｆ−６１はこのＰｓ（Ｉサイトを持っていたが５
味端が欠けていた。この部分的長さのクローンＦ−４７
、Ｆ−６１およびＢ−４４に共通する制限エンドヌクレ
アーゼサイトを使って、全メツセージ配列を３部分から
組立てることができた（第１図参照）。
味端が欠けていた。この部分的長さのクローンＦ−４７
、Ｆ−６１およびＢ−４４に共通する制限エンドヌクレ
アーゼサイトを使って、全メツセージ配列を３部分から
組立てることができた（第１図参照）。
５′にのびるもう１つのｃＤＮＡクローンは、同様のオ
リゴデオキシヌクレオチド付着ｃＤＮＡ合成によって得
られた（アミノ酸コドン番号１７５−１７９に相当する
プライマーから）。成熟Ｈ８Ａ発現プラスミドの組立て
には使用しなかったが、このＣＤＮＡり０−７（Ｐ−１
４）によってＨ５ＡｍＲＮＡの「プレプロ」ペプチド暗
号および５′非暗号領域のＤＮＡ配列を決定することが
できた。
リゴデオキシヌクレオチド付着ｃＤＮＡ合成によって得
られた（アミノ酸コドン番号１７５−１７９に相当する
プライマーから）。成熟Ｈ８Ａ発現プラスミドの組立て
には使用しなかったが、このＣＤＮＡり０−７（Ｐ−１
４）によってＨ５ＡｍＲＮＡの「プレプロ」ペプチド暗
号および５′非暗号領域のＤＮＡ配列を決定することが
できた。
ｔｒｐプロモーターオペレーターによって、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ中で成熟蛋白質を直接発現させるため、この成熟Ｈ８
ＡｍＲＮＡ配列をベクタープラスミドに結合させた。プ
ラスミドｐＬｅＩＦＡ２５はヒトの白血球インターフェ
ロンＡ（ＩＦＮα２）の発現を支配する（文献２１）。
ｉ中で成熟蛋白質を直接発現させるため、この成熟Ｈ８
ＡｍＲＮＡ配列をベクタープラスミドに結合させた。プ
ラスミドｐＬｅＩＦＡ２５はヒトの白血球インターフェ
ロンＡ（ＩＦＮα２）の発現を支配する（文献２１）。
このプラスミドをＸｂａＩで消化し、その開裂部位をＤ
ＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントとデオ
キシヌクレオシドトリホスフェートで「埋め」でプラン
ト（鈍感）ＤＮＡ末端を形成させた。次いでＰｓｔＩで
消化した後、Ｅ、ｃｏｌｉｔｒｐプロモーター、オペレ
ーターおよび人工的にプラント末端にしたＸｂａｌ開裂
部位で終っているｔｒｐリーダーペプチドのりボゾーム
結合サイトの３００ ｂｐフラグメントおよびｐ ＢＲ
３２２配列を含んでいる「ベクター」フラグメントをゲ
ル精製した。クローンＦ−４７のＤＮＡ配列分析により
決定したＨ５Ａの最初の４個のアミノ酸を暗号化してい
る１２のヌクレオチドが後に続いている開始コドンＡＴ
Ｇを含む様に１５の塩基オリゴデオキシヌクレオチドを
デザインした。［プライマー修復」と呼ばれる操作で、
Ｆ−４７のＰｓｔｌ フラグメントを含有している遺
伝子を変性し、過剰の１５−ｍｅｒ（１５量体）とアニ
ーリングし、ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌ ｅｎｏｗフ
ラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トと反応させた。この反応でアニーリングしたオリゴヌ
クレオチドの下流に新しい第２の鎖が延び、コドン番号
１の上流の１本鎖ＤＮＡが減成し、次いで上流でＡＴＧ
に相補的な３個のヌクレオチドがポリメリ化する。さら
に、この生成物を、調製したベクターフラグメントに鈍
感末端結紮させると、その初めのアデノシン残余物がＸ
ｂａＩ制限サイトを再生する。この「プライマー修復」
に続いて、このＤＮＡをＨｐａｌｌで消化し、成熟アル
ブミン遺伝子の５′部分を含有している４５０ｂｐフラ
グメントをゲル精製した（第１図参照）。このフラグメ
ントをアニーリングし、ベクターフラグメントおよびゲ
ル分離したＦ−４７のＨｐａｌＩないしＰｓｔＩ部分に
結紮し、Ｅ、ｃｏ目細胞の形質転換に使用した。
ＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントとデオ
キシヌクレオシドトリホスフェートで「埋め」でプラン
ト（鈍感）ＤＮＡ末端を形成させた。次いでＰｓｔＩで
消化した後、Ｅ、ｃｏｌｉｔｒｐプロモーター、オペレ
ーターおよび人工的にプラント末端にしたＸｂａｌ開裂
部位で終っているｔｒｐリーダーペプチドのりボゾーム
結合サイトの３００ ｂｐフラグメントおよびｐ ＢＲ
３２２配列を含んでいる「ベクター」フラグメントをゲ
ル精製した。クローンＦ−４７のＤＮＡ配列分析により
決定したＨ５Ａの最初の４個のアミノ酸を暗号化してい
る１２のヌクレオチドが後に続いている開始コドンＡＴ
Ｇを含む様に１５の塩基オリゴデオキシヌクレオチドを
デザインした。［プライマー修復」と呼ばれる操作で、
Ｆ−４７のＰｓｔｌ フラグメントを含有している遺
伝子を変性し、過剰の１５−ｍｅｒ（１５量体）とアニ
ーリングし、ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌ ｅｎｏｗフ
ラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トと反応させた。この反応でアニーリングしたオリゴヌ
クレオチドの下流に新しい第２の鎖が延び、コドン番号
１の上流の１本鎖ＤＮＡが減成し、次いで上流でＡＴＧ
に相補的な３個のヌクレオチドがポリメリ化する。さら
に、この生成物を、調製したベクターフラグメントに鈍
感末端結紮させると、その初めのアデノシン残余物がＸ
ｂａＩ制限サイトを再生する。この「プライマー修復」
に続いて、このＤＮＡをＨｐａｌｌで消化し、成熟アル
ブミン遺伝子の５′部分を含有している４５０ｂｐフラ
グメントをゲル精製した（第１図参照）。このフラグメ
ントをアニーリングし、ベクターフラグメントおよびゲ
ル分離したＦ−４７のＨｐａｌＩないしＰｓｔＩ部分に
結紮し、Ｅ、ｃｏ目細胞の形質転換に使用した。
少量の（ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）プラスミドを診断のため
に制限エンドヌクレアーゼで消化した結果、適切にｔｒ
ｐプロモーターオペレーターに結合した成°熟アルブミ
ン暗号領域の５１部分を含有している組換体Ａ−２６が
確認された。組立ての最終段階として、Ａ−２６プラス
ミドをＢＩｉＩＩＩプラスＰａｔＩで消化し、〜４ｋｂ
フラグメントをゲル精製した。これを、Ｆ−６１から精
製した３９ＱｂｐＰｓＬＩＳＢｙｌ１１部分消化フラグ
メントおよびＢ−４４の１０００ｂｐ ＰｓｔＩ フ
ラグメントとアニーリングし、結合させた。得られた形
質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した結果、成
熟蛋白質を直接発現するために適切に配置された全Ｈ５
Ａ暗号配列を含有するプラスミドであることが確認され
た。この様な組換体プラスミドの１つはｐＨ８Ａｌ と
命名された。ｐＨ８Ａｌを含有するＥ、ｃｏｌｉをトリ
プトファンを含んでいない最少培地で増殖させると、Ｈ
８Ａ抗体と特異的に反応し、ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動でＨ８Ａと混じり合う蛋白質を生産する（第２
図参照）。同じ組換体を豊富ブロス中で増殖させるとこ
の様な蛋白質は生産されない。
に制限エンドヌクレアーゼで消化した結果、適切にｔｒ
ｐプロモーターオペレーターに結合した成°熟アルブミ
ン暗号領域の５１部分を含有している組換体Ａ−２６が
確認された。組立ての最終段階として、Ａ−２６プラス
ミドをＢＩｉＩＩＩプラスＰａｔＩで消化し、〜４ｋｂ
フラグメントをゲル精製した。これを、Ｆ−６１から精
製した３９ＱｂｐＰｓＬＩＳＢｙｌ１１部分消化フラグ
メントおよびＢ−４４の１０００ｂｐ ＰｓｔＩ フ
ラグメントとアニーリングし、結合させた。得られた形
質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した結果、成
熟蛋白質を直接発現するために適切に配置された全Ｈ５
Ａ暗号配列を含有するプラスミドであることが確認され
た。この様な組換体プラスミドの１つはｐＨ８Ａｌ と
命名された。ｐＨ８Ａｌを含有するＥ、ｃｏｌｉをトリ
プトファンを含んでいない最少培地で増殖させると、Ｈ
８Ａ抗体と特異的に反応し、ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動でＨ８Ａと混じり合う蛋白質を生産する（第２
図参照）。同じ組換体を豊富ブロス中で増殖させるとこ
の様な蛋白質は生産されない。
このことは、Ｅ、ｃｏｌｉ中での推定Ｈ８Ａ蛋白質の生
産が、設計した様にｔｒｐプロモーターオペレーターの
コントロール下で行われることを示している。組換プラ
スミドにおけるＨ８Ａ構造遺伝子の完全さを確かめるた
めに、ｐＨ８Ａ ｌをＤＮＡ配列分析にかけた。
産が、設計した様にｔｒｐプロモーターオペレーターの
コントロール下で行われることを示している。組換プラ
スミドにおけるＨ８Ａ構造遺伝子の完全さを確かめるた
めに、ｐＨ８Ａ ｌをＤＮＡ配列分析にかけた。
鱈ＤＮＡ配列分析
ＭａＸａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ （文献２６）の化
学的分解法および１本鎖Ｍ １３ ｍＰ７フアージ誘導
体から誘導された型板を用いたジデオキシ鎖末端法によ
り、ｐＨ５Ａｌのアルブミンｃ Ｄ ＮＡ部分（および
その周辺領域）が完全に配列化された。全てのヌクレオ
チドは少なくとも２回配列化された。このＤＮＡ配列を
ＵＳＡ蛋白質の推定アミノ酸配列と共に第３図に示しで
ある。成熟Ｈ８Ａ暗号領域の５′以降のＤＮＡ配列もｃ
ＤＮＡクローンＰ−１４から決定し、第３図に示しで
ある。
学的分解法および１本鎖Ｍ １３ ｍＰ７フアージ誘導
体から誘導された型板を用いたジデオキシ鎖末端法によ
り、ｐＨ５Ａｌのアルブミンｃ Ｄ ＮＡ部分（および
その周辺領域）が完全に配列化された。全てのヌクレオ
チドは少なくとも２回配列化された。このＤＮＡ配列を
ＵＳＡ蛋白質の推定アミノ酸配列と共に第３図に示しで
ある。成熟Ｈ８Ａ暗号領域の５′以降のＤＮＡ配列もｃ
ＤＮＡクローンＰ−１４から決定し、第３図に示しで
ある。
ＤＮＡ配列分析の結果、人工的開始コドンおよび完全な
成熟ＵＳＡ暗号配列が所望通りＥ、ｃｏｌｉｔｒｐプロ
モーターオペレーターのすぐ後に続いていることが確認
された。このＡＴＧイニシエーターは、ｔｒｐ リー
ダーペプチド（文献３７）の推定Ｅ、ｃｏｌｉ リボゾ
ーム結合配列（文献３６）から９ヌクレオチドだけ後に
ある。
成熟ＵＳＡ暗号配列が所望通りＥ、ｃｏｌｉｔｒｐプロ
モーターオペレーターのすぐ後に続いていることが確認
された。このＡＴＧイニシエーターは、ｔｒｐ リー
ダーペプチド（文献３７）の推定Ｅ、ｃｏｌｉ リボゾ
ーム結合配列（文献３６）から９ヌクレオチドだけ後に
ある。
ｐ ＨＳ Ａ ｌのＤＮＡ配列の翻訳により、５８５ア
ミノ酸の成熟Ｈ８Ａ蛋白質が予想される。種々報告され
ているＨ８Ａの蛋白質配列とは約２０アミノ酸だけ一致
しない。本発明者１らによる配列は、ＭＯｕｌＯｎら（
文献１２）のものと１１残余分異なっており、もともと
Ｍｏｕｌｏｎら（文献１２〕の文献とＢｅｈｒｅｎｓら
（文献１０）の報告に基くと考えられるＤａｙｈｏｆ［
カタログ（文献９）に記載されているものとは２８残余
分異なっている。これらの違いのほとんどは、隣接残余
分のペアが正反対であるか、またはグルタミン−グルタ
ミン酸の不一致である。本発明者らの配列は、ｌ）ａ
ｙｈｏ ｆ ｆ （文献９〕およびＭｏｕｌｏｎら（文
献１２）の報告のものと５８５残余分の５個だけが違っ
ており、これらの５個の違いの内３個はグルタミンとグ
ルタミン酸が入れ替ったものである（第３図に於て下線
を引いた部分）。全ての不一致の部分につ０て、ヌクレ
オチド配列を注意深く再チェックした所、ＤＮＡ配列化
の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは考えら
れなかった。ｃ Ｄ Ｎ Ａクローニングによって導入
された人工物の可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告の中には、アミノ酸配列の違いについて
、その他のもつとありそうな説明がなされている。それ
らの１つは、インビボまたは蛋白質配列化中におこるア
ミド化の変化（グルタミン−グルタミン酸区別に影響を
与える）である（文献３８）。Ｈ５Ａ蛋白質の多形現象
が相違の原因になっているかもしれない。
ミノ酸の成熟Ｈ８Ａ蛋白質が予想される。種々報告され
ているＨ８Ａの蛋白質配列とは約２０アミノ酸だけ一致
しない。本発明者１らによる配列は、ＭＯｕｌＯｎら（
文献１２）のものと１１残余分異なっており、もともと
Ｍｏｕｌｏｎら（文献１２〕の文献とＢｅｈｒｅｎｓら
（文献１０）の報告に基くと考えられるＤａｙｈｏｆ［
カタログ（文献９）に記載されているものとは２８残余
分異なっている。これらの違いのほとんどは、隣接残余
分のペアが正反対であるか、またはグルタミン−グルタ
ミン酸の不一致である。本発明者らの配列は、ｌ）ａ
ｙｈｏ ｆ ｆ （文献９〕およびＭｏｕｌｏｎら（文
献１２）の報告のものと５８５残余分の５個だけが違っ
ており、これらの５個の違いの内３個はグルタミンとグ
ルタミン酸が入れ替ったものである（第３図に於て下線
を引いた部分）。全ての不一致の部分につ０て、ヌクレ
オチド配列を注意深く再チェックした所、ＤＮＡ配列化
の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは考えら
れなかった。ｃ Ｄ Ｎ Ａクローニングによって導入
された人工物の可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告の中には、アミノ酸配列の違いについて
、その他のもつとありそうな説明がなされている。それ
らの１つは、インビボまたは蛋白質配列化中におこるア
ミド化の変化（グルタミン−グルタミン酸区別に影響を
与える）である（文献３８）。Ｈ５Ａ蛋白質の多形現象
が相違の原因になっているかもしれない。
２０個以上のＨＳ Ａの遺伝的変異体が蛋白質電気泳動
（文献３９）により検出されているが、アミノ酸配列レ
ベルではまだ分析されていない。我々の予測したＨ Ｓ
Ａ蛋白質配列は５８５アミノ酸の長さであり、Ｍ□ｕ
ｌＯｎ （文献１２）とは一致するがＩ）ａｙｈｏｆｆ
（文献９）とは一致しないことも注目に値する。この違
いはアミノ酸１５６−１５７におけるＰｈｅ−Ｐｈｅペ
アの１個のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）残余分を削除（
文献９において）することによって説明される。
（文献３９）により検出されているが、アミノ酸配列レ
ベルではまだ分析されていない。我々の予測したＨ Ｓ
Ａ蛋白質配列は５８５アミノ酸の長さであり、Ｍ□ｕ
ｌＯｎ （文献１２）とは一致するがＩ）ａｙｈｏｆｆ
（文献９）とは一致しないことも注目に値する。この違
いはアミノ酸１５６−１５７におけるＰｈｅ−Ｐｈｅペ
アの１個のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）残余分を削除（
文献９において）することによって説明される。
ラット血清アルブミンｃＤＮＡクローン（文献１６）の
ＤＮＡ配列と比較すると、本発明者らの成熟Ｕ Ｓ Ａ
配列はヌクレオチドレベルで７４％、アミノ酸レベルで
７３チが一致（ｈｏｍｏｌｏｇｙ） している（ラット
のＳＡ蛋白質はＵＳＡよりアミノ酸１個だけ短い。ＵＳ
Ａのカルボキシ末端残余分はラット蛋白質には存在しな
い）。両組白質において、全ての３５個のシスティン残
余分は同じ位置に存在している。ＵＳＡの予測された「
プレプロ」ペプチド領域は、ラットｃＤＮＡクローン（
文献１６）から報告されているものと、７６チのヌクレ
オチド、および７５チのアミノ酸が一致している。種間
の配列相同性は、比較できる３′非翻訳領域（３′ｍ
ＲＮＡ末端の前の発表されているラットＣＤＮＡクロー
ン末端）の部分では減少する。Ｈ５ＡＣＤＮＡＧ；！、
ポリ（Ａ）付加サイトから２８ヌクレオチド前にヘキサ
ヌクレオチドＡＡＴＡＡＡを含んでいる。これはＰｒｏ
ｕｄｆｏｏｔおよびＢｙｏｗｎｌｅｅ ニよって初めて
注目された真核細胞ｍ ＲＮ Ａに共通の特徴である（
文献４０）。
ＤＮＡ配列と比較すると、本発明者らの成熟Ｕ Ｓ Ａ
配列はヌクレオチドレベルで７４％、アミノ酸レベルで
７３チが一致（ｈｏｍｏｌｏｇｙ） している（ラット
のＳＡ蛋白質はＵＳＡよりアミノ酸１個だけ短い。ＵＳ
Ａのカルボキシ末端残余分はラット蛋白質には存在しな
い）。両組白質において、全ての３５個のシスティン残
余分は同じ位置に存在している。ＵＳＡの予測された「
プレプロ」ペプチド領域は、ラットｃＤＮＡクローン（
文献１６）から報告されているものと、７６チのヌクレ
オチド、および７５チのアミノ酸が一致している。種間
の配列相同性は、比較できる３′非翻訳領域（３′ｍ
ＲＮＡ末端の前の発表されているラットＣＤＮＡクロー
ン末端）の部分では減少する。Ｈ５ＡＣＤＮＡＧ；！、
ポリ（Ａ）付加サイトから２８ヌクレオチド前にヘキサ
ヌクレオチドＡＡＴＡＡＡを含んでいる。これはＰｒｏ
ｕｄｆｏｏｔおよびＢｙｏｗｎｌｅｅ ニよって初めて
注目された真核細胞ｍ ＲＮ Ａに共通の特徴である（
文献４０）。
医薬組成物
本発明に係る化合物は、医薬組成物を製造する既知の方
法に従って製剤化することができる。この場合、本発明
のポリペプチドは薬学的に許容し得る担体と混合するの
が好ましい。好適な担体およびその製剤化法はＥ、Ｗ、
Ｍａｒｔ ｉｎ （７） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ に記載
されている。
法に従って製剤化することができる。この場合、本発明
のポリペプチドは薬学的に許容し得る担体と混合するの
が好ましい。好適な担体およびその製剤化法はＥ、Ｗ、
Ｍａｒｔ ｉｎ （７） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ に記載
されている。
この様な組成物は、有効量の本発明に係る蛋白質と共に
、受容者に有効に投与するのに適した薬学的に許容し得
る組成物を調製するための適当量の担体を含んでいる。
、受容者に有効に投与するのに適した薬学的に許容し得
る組成物を調製するための適当量の担体を含んでいる。
１つの好ましい投与方法は非経口投与である。
文献
１、Ｒｏｓｅｎｏｅｒ、Ｖ、Ｍ、、０ｒａｔｚ、Ｍ、、
Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ、Ｍ人ｅｄｓ 、（１９７７）Ａ
ｌｂｕｎｉｎ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｕｓｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ、ｅｓｓ
。
Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ、Ｍ人ｅｄｓ 、（１９７７）Ａ
ｌｂｕｎｉｎ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｕｓｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ、ｅｓｓ
。
Ｏｘ［ｏｒｄ。
２１）ｅｔｅｒｓ、Ｔ、（１９７７）ＣＩｉｎ、Ｑｉａ
ｎ、（Ｗｉｎｓｔｏｎ−８ａｌａｎ、Ｎ、Ｃ，）２３＊
５（２゜３、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、ａｎｄＴｅｒｒ
ｙ、Ｗ、Ｄ、（１９７６）Ｎａｃｕｒｅ ２６０＋８０
４−８０５゜４．５ａｌａ−Ｔｒｅｐａｔ、Ｊ、Ｍ、、
Ｄｅｖｅｒ、Ｊ、、Ｓａｒｇｅｎｔ、７ｒ、Ｄ、、Ｔｈ
ｏｆｒｌａｓ、に、。
ｎ、（Ｗｉｎｓｔｏｎ−８ａｌａｎ、Ｎ、Ｃ，）２３＊
５（２゜３、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、ａｎｄＴｅｒｒ
ｙ、Ｗ、Ｄ、（１９７６）Ｎａｃｕｒｅ ２６０＋８０
４−８０５゜４．５ａｌａ−Ｔｒｅｐａｔ、Ｊ、Ｍ、、
Ｄｅｖｅｒ、Ｊ、、Ｓａｒｇｅｎｔ、７ｒ、Ｄ、、Ｔｈ
ｏｆｒｌａｓ、に、。
５ｅｌｌ、Ｓ、 ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ、Ｊ、（１９７
９）Ｂｉｏｃｈｅｎｉｓｔｒｙ １８＋２１６７−２１
７８゜ ５、Ｊａｇｏｄｚｉｎｓｋｉ、Ｌ、Ｌ、、Ｓａｒｇｅｎ
ｔ、Ｔ、Ｄ、、Ｙａｎｇ、Ｍ、Ｇｌａｃｋｉｎ、Ｃ０ａ
ｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ、 Ｊ、（１９８１） ＰｒｏｃＪ
’Ｊａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８゜３５２
１−３５２５゜ ５、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ茜り
、（１９７６）ＮａＬｕｒｅ ２６０，８０４−８０５
゜７、Ｙａｃｈｎｉｎ、Ｓ、、Ｈｓｕ、Ｒ，、Ｈｅ１ｎ
ｒｉｋｓｏｎ、Ｒ，Ｌ、ａｎｄＭｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｂ。
９）Ｂｉｏｃｈｅｎｉｓｔｒｙ １８＋２１６７−２１
７８゜ ５、Ｊａｇｏｄｚｉｎｓｋｉ、Ｌ、Ｌ、、Ｓａｒｇｅｎ
ｔ、Ｔ、Ｄ、、Ｙａｎｇ、Ｍ、Ｇｌａｃｋｉｎ、Ｃ０ａ
ｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ、 Ｊ、（１９８１） ＰｒｏｃＪ
’Ｊａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８゜３５２
１−３５２５゜ ５、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、ａｎｄ Ｔｅｒｒｙ茜り
、（１９７６）ＮａＬｕｒｅ ２６０，８０４−８０５
゜７、Ｙａｃｈｎｉｎ、Ｓ、、Ｈｓｕ、Ｒ，、Ｈｅ１ｎ
ｒｉｋｓｏｎ、Ｒ，Ｌ、ａｎｄＭｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｂ。
（１９７７）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ
ａ ４９３，４１８−４２８−８、Ａｏｙａｇｉ、Ｙ、
、Ｉｋｅｎａｋａ、Ｔ、ａｎｄ Ｉｃｂｉｄａ、 Ｆ、
（１９７７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３７．３
６６３−３６６７゜９、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ、（１９７
８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、５． ５ｕ
ｐｐ１． ３．Ｐ、２６６、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ａｎｅｄｉｃａｌ’ｋｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉ
ｏｎ、Ｗｌｓｈｉｎｇｔｏｎ。
ａ ４９３，４１８−４２８−８、Ａｏｙａｇｉ、Ｙ、
、Ｉｋｅｎａｋａ、Ｔ、ａｎｄ Ｉｃｂｉｄａ、 Ｆ、
（１９７７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３７．３
６６３−３６６７゜９、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ、（１９７
８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、５． ５ｕ
ｐｐ１． ３．Ｐ、２６６、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ａｎｅｄｉｃａｌ’ｋｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉ
ｏｎ、Ｗｌｓｈｉｎｇｔｏｎ。
１０、 Ｂｅｈｒｅｎｓ 、Ｐ、Ｑ 、 、 Ｓｐｉ
ｅｋｅｒｍａｎ 、 Ａ、Ｍ、ａｎｄ Ｂｒｏｉｍ、Ｊ
、Ｒ，（１９７５）Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、 ３４．５９
１゜ １１、Ｂｒｏｗｎ、Ｊ、Ｒ，（１９７７） ｉｎ Ｒｏ
ｓｅｎｏｅｒ ｅｔ ａｌ 、 （１９７７）＋ＰＰ、
２７−５２゜１２、Ｍｅｌｏｕｎ、Ｂ、 ％ｒａｖｅｋ
、 Ｌ、 ａｎｄ Ｋｏｓｔｋａ、Ｖ、（１９７５）Ｆ
ｅｂｓ Ｉｚｔｔｅｒｓ５８、１３４−１３７゜ １３、 Ｊｕｄａｈ、Ｊ 、０．、 Ｇａｍｂｌｅ 、
Ｍ、、 ａｎｄ Ｓｔｅａｄｍａｎ、 Ｊ Ｊｌ、
（１９７３）Ｂｉｏｃｈａｎ、Ｊ、 １３４．１０８３
−１０９１１４、Ｒｕｓ ｓｅｌ ｌ 、 Ｊ 、Ｈ，
ａｎｄ Ｇｅ １１ ｅｒ 、 Ｄ、Ｍ、 （１９７３
）Ｂｉｏｃｈｃｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ 。
ｅｋｅｒｍａｎ 、 Ａ、Ｍ、ａｎｄ Ｂｒｏｉｍ、Ｊ
、Ｒ，（１９７５）Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、 ３４．５９
１゜ １１、Ｂｒｏｗｎ、Ｊ、Ｒ，（１９７７） ｉｎ Ｒｏ
ｓｅｎｏｅｒ ｅｔ ａｌ 、 （１９７７）＋ＰＰ、
２７−５２゜１２、Ｍｅｌｏｕｎ、Ｂ、 ％ｒａｖｅｋ
、 Ｌ、 ａｎｄ Ｋｏｓｔｋａ、Ｖ、（１９７５）Ｆ
ｅｂｓ Ｉｚｔｔｅｒｓ５８、１３４−１３７゜ １３、 Ｊｕｄａｈ、Ｊ 、０．、 Ｇａｍｂｌｅ 、
Ｍ、、 ａｎｄ Ｓｔｅａｄｍａｎ、 Ｊ Ｊｌ、
（１９７３）Ｂｉｏｃｈａｎ、Ｊ、 １３４．１０８３
−１０９１１４、Ｒｕｓ ｓｅｌ ｌ 、 Ｊ 、Ｈ，
ａｎｄ Ｇｅ １１ ｅｒ 、 Ｄ、Ｍ、 （１９７３
）Ｂｉｏｃｈｃｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ 。
Ｒｅｓ、 Ｑｎｍｎｎ、 ５５．２３９−２４５１５、
庵ｄ；ｉｌｌ １ｖｒａｙ、Ｒ，Ｔ、、Ｇｌｕｎｇ、Ｄ
、Ｗ、ａｎｄ Ｄａｖｉｅ、Ｅ、Ｗ （１９７９）Ｅａ
ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｃｍ、 ９８＋ ４７７−４８５゜
１６、 ＳａｒｇｅｎＬ 、ＴＪ）、 、 Ｙａｎｇ
、Ｍ、ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ 、Ｊ 、（１９８１）Ｐ
ｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 。
庵ｄ；ｉｌｌ １ｖｒａｙ、Ｒ，Ｔ、、Ｇｌｕｎｇ、Ｄ
、Ｗ、ａｎｄ Ｄａｖｉｅ、Ｅ、Ｗ （１９７９）Ｅａ
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、Ｍ、ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ 、Ｊ 、（１９８１）Ｐ
ｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＩＪＩＡ ７８，２４３２４６−
１７、Ｂｅｒｇｅｒ 、Ｓ、Ｌ、 ａｎｄ Ｂｉ ｒｋ
ｅｒｍｅ ｉｅｒ 、Ｃ，Ｓ 、 （１９’７９）Ｂｉ
ｏｃｈａｎｉ ｓ ｔ ｒｙ１８．５１４３−５１４９
゜ １３、ＩＪＩＩ ｒ ｉｃｈ、Ａ、、 ５ｈｉｎｅ、Ｊ
、 、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｒｏ、Ｐｉ ｃＬｅｔ 、
Ｒ，、Ｔｉ ５ｃｈｅｒ。
１７、Ｂｅｒｇｅｒ 、Ｓ、Ｌ、 ａｎｄ Ｂｉ ｒｋ
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ｏｃｈａｎｉ ｓ ｔ ｒｙ１８．５１４３−５１４９
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Ｒ，、Ｔｉ ５ｃｈｅｒ。
Ｅ、 、 Ｒｕｔｔｅｒ、ＷＪ、 ａｎｄ Ｇｏｏｄｎ
ａｎ、Ｈ，Ｍ、（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６゜
１３１３−１３１５゜ １９、Ｇｏｅｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 、Ｙｅｌ ｖｅｒ
ｔｏｎ 、Ｅ、 、Ｕｌ ｌ ｒ ｉ ｃｈ、Ａ、Ｊ
（ｅｙｎｅｋｅｒ 、Ｈ，Ｌ、 。
ａｎ、Ｈ，Ｍ、（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６゜
１３１３−１３１５゜ １９、Ｇｏｅｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 、Ｙｅｌ ｖｅｒ
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（ｅｙｎｅｋｅｒ 、Ｈ，Ｌ、 。
Ｍｉｏｚｚａｒｉ 、 Ｇ、μＩｍｐｓ ％、Ｓｅｅｂ
ｕｒｇ、ＰＪ（、、Ｄｕｌｌ 、Ｔ、、Ｍｉｙ、Ｌ。
ｕｒｇ、ＰＪ（、、Ｄｕｌｌ 、Ｔ、、Ｍｉｙ、Ｌ。
Ｓ ｔｅｂｂｉｎｇ、Ｎ、 、 Ｃｒｅａ 、Ｒｏ、Ｗ
ｂｅｔｈ 、Ｓ 、 ％ｃＣａｎｄｌ ｉ ｓ ｓ 、
ＲｌＳ ｊａｍ 。
ｂｅｔｈ 、Ｓ 、 ％ｃＣａｎｄｌ ｉ ｓ ｓ 、
ＲｌＳ ｊａｍ 。
Ａ、 、 ’Ｉａｂｏｒ、 Ｊ、Ｍ、、Ｇｒｏｓｓ、
Ｍ、、 Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、Ｃ０ａｎｄＰ
ｅｓｔｋａ、Ｓ、（１９ｇＱ） Ｎａｔｕｒｅ ２８７
，４１１−４１６゜２０、Ｃｒｅａ、Ｒ，ａｎｄ Ｈｏ
ｒｎ、Ｔ、 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、８゜２３３１−２３４８゜ ２１、Ｇｏｅｄｄｅ ｌ 、Ｄ、Ｖ、 、）ｉｅｙｎｅ
ｋｅ ｒ 、Ｈ６Ｌ、 、Ｈｏ ｚｕｎｉ 、Ｔ、 、
Ａｒｅｎｔ ｚｅｎ 、Ｒ，。
Ｍ、、 Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、Ｃ０ａｎｄＰ
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Ａｒｅｎｔ ｚｅｎ 、Ｒ，。
Ｉ ｔａｋｕｒａ 、 Ｋ、 、Ｙａｎｓｕｒａ、 Ｄ
、Ｇ、 、Ｒｏｓ ｓ 、Ｍ、Ｊ 、 、Ｍｉｏｚｚａ
ｒｉ 、Ｇ、 。
、Ｇ、 、Ｒｏｓ ｓ 、Ｍ、Ｊ 、 、Ｍｉｏｚｚａ
ｒｉ 、Ｇ、 。
Ｃｒｅａ、 Ｒ，ａｎｄ Ｓｅｅｂｕｒｇ、 ＰＪ（、
（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８１゜５４４−５４８
゜ ２２、Ｇｏｅｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 、５ｈｅｐａｒｄ
、Ｈ，Ｍ、 、Ｙｅｌ ｖｅｒ ｔｏｎ 、Ｅ 、、
Ｌｅｕｎｇ 、Ｄ。
（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８１゜５４４−５４８
゜ ２２、Ｇｏｅｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 、５ｈｅｐａｒｄ
、Ｈ，Ｍ、 、Ｙｅｌ ｖｅｒ ｔｏｎ 、Ｅ 、、
Ｌｅｕｎｇ 、Ｄ。
ａｎｄ Ｃｒｅａ、Ｒｏ（１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、８．４０５７−４０７４゜２３
、 Ｂａｃｋｎａｎ、に、、Ｐｃ ａ ５ｈｎｅ 、Ｍ
、ａｎｄ Ｇｉ １ ｂｅｒ ｔ 、Ｗ、（１ｇ７６）
Ｐｒ□（。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、８．４０５７−４０７４゜２３
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、ａｎｄ Ｇｉ １ ｂｅｒ ｔ 、Ｗ、（１ｇ７６）
Ｐｒ□（。
Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ７３，
４１７４−４１７８゜］、Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ 、
Ｖ、、 Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、、Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ
，、Ｌｏｖｅｔｔ。
４１７４−４１７８゜］、Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ 、
Ｖ、、 Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、、Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ
，、Ｌｏｖｅｔｔ。
Ｍ、Ａ、ａｎｄ Ｈｅｌ １ｎｓｋｉ 、Ｄ、Ｒ，（１
９７４）Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 、 Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ 。
９７４）Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 、 Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ 。
［Ｍ ７１．３４５５−３４５９゜
２５、Ｇｒｕｎ ｓ ｔｅ ｉｎ 、Ｍ、、 ａｎｄ
Ｈｎｇｎｅｓ ｓ 、Ｄ、Ｓ 、（１９７５）Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ Ｉ 、Ａｃａｄ 。
Ｈｎｇｎｅｓ ｓ 、Ｄ、Ｓ 、（１９７５）Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ Ｉ 、Ａｃａｄ 。
Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ３９５１−３９５５゜２６、ｌ１
４ｘａｎ、Ａ、Ｍ、ａｎｄ Ｇｉ ｌ ｂｅｒ ｔ 、
Ｗ、（１９８０） Ｍｅ ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｎｏ
ｌ 。
４ｘａｎ、Ａ、Ｍ、ａｎｄ Ｇｉ ｌ ｂｅｒ ｔ 、
Ｗ、（１９８０） Ｍｅ ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｎｏ
ｌ 。
６５．４９９−５６０゜
２７、 Ｄｅｎｈａｒｄ ｔ 、Ｄ、Ｔ、 （１９６６
）Ｂｉ ｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉ ｏｐｈｙ ｓ 、Ｒｅ
ｓ 、Ｃｏｍｎ５ｎ ；２３ 。
）Ｂｉ ｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉ ｏｐｈｙ ｓ 、Ｒｅ
ｓ 、Ｃｏｍｎ５ｎ ；２３ 。
４６１−４６７゜
２８、Ｗｌｌ ｌ ａ ｃｅ 、Ｒ，Ｂ、 、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ 、Ｍ、Ｊ 、 、Ｈｉ ｒｏｓ ｅ 、Ｔ、、
Ｍｉ ｙａｋｅ 、Ｔ、 。
ｓｏｎ 、Ｍ、Ｊ 、 、Ｈｉ ｒｏｓ ｅ 、Ｔ、、
Ｍｉ ｙａｋｅ 、Ｔ、 。
Ｋａｙｉｓｈｉｍａ、 ＥＪ（、ａｎｄ Ｉｔａｋｕｒ
ａ、に、（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ々１ｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ ９，８７９−８９３゜２９、Ｂｌ ｉｎ、Ｎ
、ａｎｄ ５Ｌａｆｆｏｒｄ、Ｄ、Ｗ、 （１９７６）
Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ 。
ａ、に、（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ々１ｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ ９，８７９−８９３゜２９、Ｂｌ ｉｎ、Ｎ
、ａｎｄ ５Ｌａｆｆｏｒｄ、Ｄ、Ｗ、 （１９７６）
Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ 。
３．２３０３−２３０８゜
３０、Ｂｉ ｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ０ａｎｄ Ｄｏｌ
ｙ 、Ｊ 、 （１９７９）Ｎｕｃｌ ｅ ｉ ｃ Ａ
ｃ ｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ７、１５１３−１５２３
゜ ３１、 Ｌｉｗｎ ｔＲ，Ｍ、 、Ａｄｅ １ｍａｎ
、Ｊ 、、Ｆｒａｎｋｅ 、Ａ、Ｅ、 、出ｕｃｋ 、
Ｃ、Ｍ、 、Ｇｒｏ ｓ ｓ 。
ｙ 、Ｊ 、 （１９７９）Ｎｕｃｌ ｅ ｉ ｃ Ａ
ｃ ｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ７、１５１３−１５２３
゜ ３１、 Ｌｉｗｎ ｔＲ，Ｍ、 、Ａｄｅ １ｍａｎ
、Ｊ 、、Ｆｒａｎｋｅ 、Ａ、Ｅ、 、出ｕｃｋ 、
Ｃ、Ｍ、 、Ｇｒｏ ｓ ｓ 。
Ｍ、 、Ｎａ ｊａｒ ｉａｎ 、Ｒ６ａｎｄ Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 （１９８１）Ｎｌｃｌ ｅ ｉ
ｃ Ａｃ １ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ９．１Ｑ４５−１
０５２゜３２、 Ｓａｎｇｅｒ 、Ｆ、 、Ｎｉ ｃｋ
ｌ ｅｎ 、Ｓ 、ａｎｄ Ｃｏｕｌ ｓｏｎ 、Ａ、
Ｒ，（１９７７） Ｐｒｏｃ。
ｄｄｅｌ 、Ｄ、Ｖ、 （１９８１）Ｎｌｃｌ ｅ ｉ
ｃ Ａｃ １ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ９．１Ｑ４５−１
０５２゜３２、 Ｓａｎｇｅｒ 、Ｆ、 、Ｎｉ ｃｋ
ｌ ｅｎ 、Ｓ 、ａｎｄ Ｃｏｕｌ ｓｏｎ 、Ａ、
Ｒ，（１９７７） Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ７４．
５４６３ ５４６７゜３３、Ｐ１４ｅｓｓ ｉｎｇＪ
、９ｅ１ 、Ｒ６ａｎｄ Ｓｅｅｂｕｒｇ、ｐ、Ｈ，（
１９８１）Ｎｕｃｌ ｅ １ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、９
３０９−３２２゜３４Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｓ、Ｗ、（１９
７６） Ｊ、Ｉｍｒｕｎｏｌｏｇｙ １１７．１４８２
−１４９０゜３５、Ｌｉａｎｎｌ ｉ 、Ｕ、に、（１
９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７、６Ｂ□ −６６５゜３
（３，５ｈｉｎｅ 、Ｊ 、ａｎｄ Ｄａｌ ｇａｒｎ
ｏ 、Ｌ、 （１９７４）ＰｒＯＣ、Ｎａ（１、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ 。
５４６３ ５４６７゜３３、Ｐ１４ｅｓｓ ｉｎｇＪ
、９ｅ１ 、Ｒ６ａｎｄ Ｓｅｅｂｕｒｇ、ｐ、Ｈ，（
１９８１）Ｎｕｃｌ ｅ １ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、９
３０９−３２２゜３４Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｓ、Ｗ、（１９
７６） Ｊ、Ｉｍｒｕｎｏｌｏｇｙ １１７．１４８２
−１４９０゜３５、Ｌｉａｎｎｌ ｉ 、Ｕ、に、（１
９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７、６Ｂ□ −６６５゜３
（３，５ｈｉｎｅ 、Ｊ 、ａｎｄ Ｄａｌ ｇａｒｎ
ｏ 、Ｌ、 （１９７４）ＰｒＯＣ、Ｎａ（１、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ 。
ＬＩＳＡ ７１ 、１３４２−１３４６゜３７、 ＰＩ
ａｔ ｔ 、Ｔ、 、５ｑｕｉｒｅ ｓ 、Ｃ０ａｎ
ｄ Ｙａｎｏ ｆ ｓｋｙ 、Ｃ０（１９７５）Ｊ 、
Ｆｉｌ 。
ａｔ ｔ 、Ｔ、 、５ｑｕｉｒｅ ｓ 、Ｃ０ａｎ
ｄ Ｙａｎｏ ｆ ｓｋｙ 、Ｃ０（１９７５）Ｊ 、
Ｆｉｌ 。
Ｂｉｏｌ 、 １０３．４１１−４２０３Ｂ、Ｒｏｂ
１ｎｓｏｎ 、 Ａ、Ｂ 、ａｎｄ Ｒｕｄｄ 、Ｃ，
Ｊ 、（１９７４）Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｔｏｐｉ ｃｓ
ｉｎ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、 ２
４７−２９５゜３９、Ｗｅ ｉ ｔｋａｍｐ、Ｌ、Ｒｏ
、Ｓａｌ ｚａｎｏ 、Ｆ、Ｍ、 、Ｎｅｅｌ 、Ｊ
、Ｖ、、Ｐｏｒ ｔａ、Ｆ、。
１ｎｓｏｎ 、 Ａ、Ｂ 、ａｎｄ Ｒｕｄｄ 、Ｃ，
Ｊ 、（１９７４）Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｔｏｐｉ ｃｓ
ｉｎ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、 ２
４７−２９５゜３９、Ｗｅ ｉ ｔｋａｍｐ、Ｌ、Ｒｏ
、Ｓａｌ ｚａｎｏ 、Ｆ、Ｍ、 、Ｎｅｅｌ 、Ｊ
、Ｖ、、Ｐｏｒ ｔａ、Ｆ、。
Ｇｅｅｒｄｉｎｋ、ＩＱ、ａｎｄ Ｔａｒｎｏｋｙ、Ａ
、Ｌ、（１９７３）Ａｎｎ、 ）ｋｍ。
、Ｌ、（１９７３）Ａｎｎ、 ）ｋｍ。
Ｇｅｎｅｔ、、 Ｌｏｎｄ、 ３６．３８１−３９１゜
ｇ）、 Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ八Ｊ、 ａｎｄ へｒｏｗ
ｎｌｅｅ、 Ｇ、Ｇ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２６
３゜２１１−２１４゜ ４１、Ｇｏｒｉｎ、 Ｍ、Ｂ、 、 Ｃｏｏｐｅｒ、
ｏ、ｔ、 、 Ｅｉ ｆｅｒｍａｎ、 Ｆ、 、Ｖａｎ
ｄｅＲｉ ｊｎ、 ｐ、ａｎｄ Ｔｉｌ ｇｔｍａｎ
、 Ｓ、Ｍ、 （１９８１） Ｊ、 Ｍ）ｌ 、 Ｂｉ
ｏｌ。
ｇ）、 Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ八Ｊ、 ａｎｄ へｒｏｗ
ｎｌｅｅ、 Ｇ、Ｇ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２６
３゜２１１−２１４゜ ４１、Ｇｏｒｉｎ、 Ｍ、Ｂ、 、 Ｃｏｏｐｅｒ、
ｏ、ｔ、 、 Ｅｉ ｆｅｒｍａｎ、 Ｆ、 、Ｖａｎ
ｄｅＲｉ ｊｎ、 ｐ、ａｎｄ Ｔｉｌ ｇｔｍａｎ
、 Ｓ、Ｍ、 （１９８１） Ｊ、 Ｍ）ｌ 、 Ｂｉ
ｏｌ。
２５６、１９５４−１９５９゜
４２、Ｋｉｏｕｓｏｉ ｓ 、Ｄ、、Ｅｉ ｆｅｒｒｍ
ｎ、 Ｆ、 、Ｖａｎ ｄｅ Ｒｉ ｊｎ、 Ｐ、、
Ｇｏｒｉｎ。
ｎ、 Ｆ、 、Ｖａｎ ｄｅ Ｒｉ ｊｎ、 Ｐ、、
Ｇｏｒｉｎ。
Ｍ、Ｂ、、 Ｉｎｇｒａｍ、 Ｒ，Ｓ、 ａｎｄ Ｔｉ
ｌｇｔｒｍｎ、 Ｓ、Ｍ、（１９８１）Ｊｊ１４）ｌ
。
ｌｇｔｒｍｎ、 Ｓ、Ｍ、（１９８１）Ｊｊ１４）ｌ
。
Ｂ１１１ 、２５６．１９６０−１９６７゜
第１図Ａ）はヒト血清アルブミン蛋白質を暗号化しティ
るｍＲＮ Ａ 、およびｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ
−６１およびＢ−４４に含まれる領域を示す模式図、Ｂ
）はプラスミドｐ ＨＳ Ａ １の模式図、第２図は細
菌により合成されたＵ Ｓ Ａの免疫沈殿を示すグラフ
、第３図はヒト血清アルブミンのヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を示す模式図である。 特許出願人 ジエネンテク・インコーポレイテッド代理
人 弁理士 青 山 葆 外１名、１．１〒１
．１．〒、１．．〒１．１．〒”Ａご９．ノ １ ２ ３４６ ６７ ノＣフなン＋ ２゜ 第１頁の続き １／４２ １／４２５ １／８２５
るｍＲＮ Ａ 、およびｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ
−６１およびＢ−４４に含まれる領域を示す模式図、Ｂ
）はプラスミドｐ ＨＳ Ａ １の模式図、第２図は細
菌により合成されたＵ Ｓ Ａの免疫沈殿を示すグラフ
、第３図はヒト血清アルブミンのヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を示す模式図である。 特許出願人 ジエネンテク・インコーポレイテッド代理
人 弁理士 青 山 葆 外１名、１．１〒１
．１．〒、１．．〒１．１．〒”Ａご９．ノ １ ２ ３４６ ６７ ノＣフなン＋ ２゜ 第１頁の続き １／４２ １／４２５ １／８２５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、発現ベクターの微生物学的に操作し得るプロモータ
ーのコントロール下に、適切に配置された翻訳開始信号
並びに停止信号と共に挿入すべく設― 計された１）ＮＡ配列であって、機能的蛋白質またはそ
の生物活性部分を含有するポリペプチドを暗号化してい
るＤＮＡ配列を組立てる方法であって、（ａ）該ポリペ
プチドの全暗号配列の暗号配列を含んでいるメツセンジ
ャーＲＮＡを用意し、（ｂ）工程（ａ）のメツセンジャ
ーＲＮＡからの逆転写によって、各フラグメントの配列
か該暗号配列の１部に相当しており従って該ポリペプチ
ドの１部を暗号化している一連の２本鎖ｃ ｌ）Ｎ Ａ
フラグメントを得、 （Ｃ）適切に結合すれば該ポリペプチドを暗号化する様
なフラグメントを調製するために工程（ｂ）で得たフラ
グメントを制限エンドヌクレアーゼ酵素で切断し、 （ｄ）工程（Ｃ）のフラグメントを結合し、得られた生
成物を発現プロモーターの適切な解読わくコントロール
下にベクターに導入する、 ことからなる改良方法であって、工程（ｂ）のフラグメ
ントはそれぞれの末端領域の配列が重複しており、その
重複部分は共通の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有し
ており、これらのフラグメントは全体として該ポリペプ
チドの全暗号配列を含んでおり、かくして該フラグメン
トを選択的に切断し、結合させると、該ポリペプチドを
暗号化している適切な解読わくを有する相当するｃＤＮ
Ａが得られることを特徴とする方法。 ２、該ポリペプチドがヒト血清アルブミンのアミノ酸配
列を含んでいる第１項に記載の方法。 ３、該ポリペプチドがヒト血清アルブミンのアミノ酸配
列であって、場合により、該ヒト血清アルブミンの本来
の第１アミノ酸のＮ末端に結合した切断可能な複合体ま
たは微生物信号蛋白質を含んでいるものである第１項に
記載の方法。 ４、切断可能な複合体がアミノ酸メチオニンである第３
項に記載の方法。 ５、第１項に記載の方法で生産される生成物。 ６、ヒト血清アルブミンを暗号化している遺伝子である
第５項に記載の生成物。 ７、基本的にヒト血清アルブミンを暗号化している配列
のみからなるＤＮＡ配列。 ８、相当するヒト血清アルブミンを生産する様に該配列
を微生物に発現させることができるＤＮＡベクターと実
施可能に結合された第７項に記載のＤＮＡ配列。 ９、形質転換微生物中で、第７項に記載のＤＮＡ配列を
発現することのできる複製可能な微生物発現ビヒクル。 １０、第９項に記載のビヒクルで形質転換した微生物。 １１、第１０項に記載の形質転換微生物を含む培養培地
。 １２、Ｅ、ｃｏｌｉ 細菌または酵母株の形質転換によ
り得られる第１０項に記載の微生物。 １３、プラスミドｐＨ８Ａｌ ０ １４、第１３項に記載のプラスミドで形質転換されたＥ
、ｃｏｌｉ細菌株からなる群から選ばれる形質転換微生
物。 １５、成熟した形でヒト血清アルブミンを微生物により
発現させる方法。 １６、第１５項の方法で生産されたヒト血清アルブミ
ン。 １７、ヒトの治療のためまたは該治療に有用な医薬組成
物を調製するために第１６項に記載のヒト血清アルブミ
ンを使用する方法。
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