JPS586473B2 - ３−メトキシトロポロンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法による３−メトキシトロポロンの製造法
に関する。

さらに詳しくはストレブトバーティシリウム属に属する
３−メトキシトロポロン生産菌を栄養培地に培養し、培
養物中に３−メトキシトロポロンを蓄積せしめ、該培養
物から３−メトキシトロポロンを採取することを特徴と
する発酵法による３−メトキシトロポロンの製造法に関
する。

３−メトキシトロポロンは抗生物質として有用な物質で
ある。

３−メトキシトロポロン即ち２−ハイドロキシ−３−メ
トキシー２，４．６−シクロヘキサトリエノンは下記の
構造式を有し従来有機化学的合成法により製造できるこ
とが知られている（Ｙ．Ｋｉｔａｈ一ａｒａ，Ｓｃｉ，
Ｒｅｐｔｓ．Ｔｏｈｏｋｕ Ｕｎｉｖ．Ｆｉｒｓｔｓｅ
ｒ．３９，２６５〜２７４（１９５６），Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＡｂｓｔｒａｃｔ ５１，１２８７４６（１９５７
））。

３−メトキシトロポロンの構造式。

しかしながら、３−メトキシトロポロンが発酵法により
得られたという知見はない。

本発明者らは、天然界より数多くの微生物を入手して３
−メトキシトロポロンの生産性について研究した。

その結果、神奈川県奏野市効外の畑の土壌から分離した
菌株（ＭＫ−１００株と称する）を培地に培養すると、
培養物中に３−メトキシトロポロンが生産する事実を見
出した。

以下３−メトキシトロポロンの製法について詳述する。

本発明において使用される好適な菌株はＭＫ−１００で
あり、その菌学的性質は次の通りである。

■ 形態的特徴 本菌株は、スターチ無機塩寒天培地、オートミール寒天
培地およびイースト麦芽寒天培地上で良好な生育を示し
、その基生菌糸の色は、薄茶色ないし濃茶色を呈する。

一方、気中菌糸の着生は全般に良好ではないが、白色な
いし灰白色を呈する。

気中菌糸を光学顕微鏡により観察すると、車軸分枝をな
しており、その先端に多くの場合１０個以上の胞子を着
生し、胞子柄の形態は、直状ないし曲状である。

胞子の形態は円筒状でその大きさは０．５×１μであり
、電子顕微鏡観察による胞子の表面はスムーズであり、
鞭毛を有さない。

また胞子嚢の形態も認められない。

■ 各種培地上での生育状態 １．ツアペック寒天培地 生 育：不良 基生菌糸の色：ブリツクレッド（６ｎｇ）〜ディープブ
ラウンマホガニー （６ｐｌ） 気中菌糸二着生不良、ホワイト（ａ） 可溶性色素：な し ２．グルコース・アスパラギン寒天培地 生 育：普通 基生菌子の色：マスタード（２１ｅ）〜キャメル（３ｉ
ｅ） 気中菌糸二着生不良 可溶性色素：薄紫色 ３．グリセロール・アスパラギン寒天培地生 育：
普通 基生菌糸の色：ゴールド（２１ｃ）〜アンバー（３１ｃ
） 気中菌糸二着生不良、ホワイト（ａ）〜エッグシエル（
２ｃａ） 可溶性色素：な し ４．スターチ無機塩寒天培地 生 育：良好 基生菌糸の色：マスタードゴールド（２ｎｅ）〜アンバ
ー（３ｎｃ） 気中菌糸二着生普通、ホワイト（ａ）〜ライトグレー（
ｃ） 可溶性色素：薄紫色 ５．チロシン寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：マスタード（２１ｅ）〜アンバ−（３ｎ
ｃ） 気中菌糸二着生不良 可溶性色素：な し ６．栄養寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：マスタード（２１ｅ）〜ダルゴールド（
２ｎｇ） 気中菌糸：着生不能 可溶性色素：な し ７．イースト麦芽寒天培地 生 育：良好 基生菌糸の色：バンブー（２ｇｃ）〜シナモン（３１ｅ
） 気中菌糸：着生不良、ホワイト（ａ） 可溶性色素：な し ８．オートミール寒天培地 生 育：良好 基生菌糸の色：ライトウイート（２ｅａ）〜キャメル（
３ｉｅ） 気中菌糸：着生不良、ホワイト（ａ）〜オイスターホワ
イト（ｂ） 可溶性色素：薄紫茶色 ９．ベネット寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：マスタードゴールド（２ｎｅ）気中菌素
二着生不良、ホワイト（ａ） 可溶性色素：薄茶色 １０．エマーソン寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：無色〜ブライトゴールド （２ｎｃ） 気中菌糸二着生不能 可溶性色素：薄茶色 １１．ペブトン・イースト鉄寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：セピアブラウン（３ｐｎ）〜チョコレー
トブラウン（４ｐｎ） 気中菌糸：着生不能 可溶性色素：濃茶紫色 以上は、３０℃、２週間後の観察結果である。

又、色の表示は、Ｃｏｌｏｒ Ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）による色の分類に従ったもの
である。

■ 生理的諸性質 １．炭素源の資化性 Ｄ−グルコースおよびｉ−イノシトールを資化する。

Ｄ−ラフイノース、Ｄ−アラピノース、Ｄ−マンニトー
ル、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースを資化しない。

また、Ｄ−フラクトースおよびサツカロースを、非常に
貧弱にしか資化しない。

２．ゲラチンの液化作用 ：あり ３．スターチの加水分解作用：あ り ４．脱脂乳のペブトン化 ：非常に弱い。

５．脱脂乳の凝固 ：あ り ６．メラニン様色素の生成 ：あり（チロシン寒天培地
および ペブトン・イー スト鉄寒天培地） ７．至適生育温度 ：２７℃〜３７℃以上は、
３０℃、２週間後の観察結果である。

但し、７の至適生育温度は５日後、４および５の脱脂乳
に対する作用については３週間後の結果である。

■ 同定 以上みたごとく、本菌株ＭＫ−１００は、寒天培地上で
真性気中菌糸を形成し、その分枝法は車軸分枝をなす典
型的なストレブトバーティシリウム属に属する菌株であ
る。

かくして、本ＭＫ−１００菌株をストレプトバーティシ
リウム・ｓｐ・ＭＫ−１００と称することにした。

ストレプトバーティシリウム属の分類については、Ｒ．
ＬｏｃｃｉらのＴＨＥ ＧＥＮＵＳ ＳＴＲＥＰ−
ＴＯＶＥＲＴＩＣＩＬＬＩＵＭ（Ｇｉｏｒｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１７（１９６９））および、Ｂｅｒｇｙ’
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ Ｅｄ． ｐ．８２
９〜があるが、後者の分類に従うと、基生菌糸および気
中菌糸の色から近縁な菌株として、ストレブトバーティ
シリウムビバーティシレイタム、ストレプトバーティシ
リウムサルモニスおよびストレブトバーティシリウム
リラシナム シリーズの菌株が挙げられる。

しかしこれらの菌株とＭＫ−１００株とを同時に培養し
て比較してみると次のことがわかる。

ストレブトバーティシリウム（以下Ｓｔｖ．と略す。

）ビバーティシレイタム シリーズの菌株として６株知
られているが、Ｓｔｖ．ビバーティシレイタムは、グル
コース・アスパラギン寒天培地およびチロシン寒天培地
での基生菌糸の色がそれぞれバーンレツド（６ｐｇ）、
ローズワイン（８ｎｃ ）を呈することから、ＭＫ−１
００株とは異なり、Ｓｔｖ．アウレオバーサレスおよび
Ｓｔｖ．ペンタテイウムは、スターチ無機塩寒天培地お
よびグルコース・アスパラギン寒天培地上で基生菌糸は
赤色系の色を呈する点でＭＫ−１００株と異なる。

またＳｔｖ．ロゼオバーティシレイタムもＳｔｖ．ビバ
ーティシレイタムの場合と同様の理由の他に１−イノシ
トールを資化せず、シュークロースを資化する点でもＭ
Ｋ−１００株とは異なる菌株である。

更に、Ｓｔｖ．ロゼオバーティシレイタム、サブスペシ
ーズアルボスボラムは、グリセロール・アスパラギン寒
天培地およびスターチ無機塩寒天培地で、赤色から赤紫
色の基生菌糸を生成する点で、またＳｔｖ．ルブロバー
ティシレイタムは、栄養寒天培地上で可溶性色素を生産
する点でＭＫ−１００株と異なるし、かつペプトン・イ
ースト鉄寒天培地上で無色からベージュ（３ｇｅ）の基
生菌糸を生成する点もＭＫ−１００株と異なる点である
。

次に、Ｓｔｖ．サルモニスシリーズの菌株としては、Ｓ
ｔｖ．サルモニシダの１菌株があるが、イースト麦芽寒
天培地上での基生菌糸の色はプリツクレツド（６ｎｇ）
でありかつ、栄養寒天培地上で可溶性色素の生成が認め
られる点でＭＫ−１００株とは異なる。

また、Ｓｔｖ．リラシナム シリーズの菌株としては、
Ｓｔｖ．リラシナムとＳｔｖ．カシュミレンスの２株が
あるが、Ｓｔｖ．リラシナムはグリセロール・アスパラ
ギン寒天培地での基生菌糸の色がプリツクレツド（６ｎ
ｇ）であって、ＭＫ−１００株と大きく異なり、かつｉ
−イノシトールを資化する点でも、Ｓｔｖ．’Ｊラシナ
ムは貧弱にしか資化しないのに対し、ＭＫ−１００株は
Ｄ−グルコースと同程度に良く資化することなどから、
ＭＫ−１００株は、Ｓｔｖ．リラシナムとは異なる。

またＳｔｖ．カシュミレンスは、イースト麦芽寒天培地
上で気中菌糸の色がローズミスト（７ｅｃ）であり、こ
の培地で可溶性色素を生産し、Ｄ−グルコース、ｉ−イ
ノシトールを全く資化しない点から、ＭＫ−１００株と
は異なる。

以上みたように、本菌株ＭＫ−１００は、これら３−シ
リーズの菌株とは一致するような特徴は見い出せなかっ
た。

かくしてＭＫ−１００株を新種とみなし、その採取地の
名に因んでストレプトバーティシリウム ハダノネンセ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｈａｄａｎ
ｏｎｅｎｓｅ ）ＭＫ−１０ ０と命名した。

なお、該菌株は、微工研に寄託されており、その菌寄番
号は第４０２５号である。

本菌株は、他の放線菌の場合にも見られるごとく、例え
ば紫外線、Ｃｏ６０照射、エックス線、種々の変異誘起
薬品などを用いる人工的変異手段で変異し得るものであ
り、このような変異株であっても３−メトキシトロポロ
ンの生産能をもつ株はすべて本発明において使用できる
ものである。

本発明の培養においては通常の放線菌の培養法が一般に
用いられる。

培養のための栄養源としてはいろいろのものが用いられ
る。

炭素源としてはブドウ糖、殿粉、グリセリン、マンノー
ス、フラクトース、イノシトール、シュークロース、糖
密などが単独または組み合わせて用いられる。

さらに、菌の資化性によっては炭化水素、アルコール類
、有機酸なども用いうる。

無機および有機窒素源としては塩化アンモン、硫酸アン
モン、尿素、硝酸アンモン、硝酸ソーダなどがまた天然
窒素源としてはペブトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥
酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸
、ソリュブル・ベジタブル・プロテインなどが単独また
は組み合わせて用いられる。

そのほか必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム
、燐酸塩などの無機塩類を加えるほか、本菌の生育や３
−メトキシトロポロンの生産を促進する有機物や無機物
を適当に添加することができる。

培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法が
もつとも適している。

培養温度は２０〜４０℃、ｐＨは中性付近で培養を行う
ことが望ましい。

液体培養で通常１日ないし５日間培養を行うと、３−メ
トキシトロポロンが培養液中に生成蓄積される。

培養液中の生成量が最大に達したときに培養を停止し、
菌体を沢別して得られる培養液中より目的物を精製単離
する。

培養ろ液から３−メトキシトロポロンの精製単離には、
微生物代謝生産物を、その培養液から単離するためにふ
つう用いられる分離、精製の方法が利用される。

３−メトキシトロボロンは、アルコール類や酢酸エチル
などの有機溶媒に溶けるので、その性質を用いた方法で
採取することができる。

すなわち、３−メトキシトロポロンの精製法としてはブ
タノールや酢酸エチルなどの非水溶性有機溶媒による抽
出法、あるいはアンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド
・ハース会社製、米国）やダイヤイオンＨＰ−１０（三
菱化成社製）などの樹脂を用いた吸脱着法、シリカゲル
やセファデツクスＬＨ−２０、セファデイクスＧ−１５
（ファーマシア・ファイン・ゲミカルズ・インコーポレ
ーション製、米国）などを用いたカラム・クロマトグラ
フイーなどの方法を適当に組合せて行なう精製法を挙げ
ることができる。

例えば、培養ｆ液をｐＨ７付近に調整し、ダイヤイオン
ＵＰ−１０を充填したカラムに通塔する。

３−メトキシトロポロンはダイヤイオンＨＰ−１０に吸
着するので水洗した後、８０％メタノール水溶液で溶出
する。

溶出された３−メトキシトロポロン区分を濃縮し、メタ
ノールを除去した後、濃縮液を鉱酸でｐＨ２に調整し、
酢酸エチルで抽出する。

酢酸エチル層を濃縮乾固することにより３−メトキシト
ロポロンの粗粉末を得る。

この粗粉末をシリカゲルカラムにのせ、酢酸エチルで溶
出し、溶出してきた３−メトキシトロボロンの区分を減
圧下で濃縮し、冷室（０℃）に放置することにより３−
メトキシトロポロンの淡黄色の結晶を得ることができる
。

得られた３−メトキシトロポロンの理化学的性状はつぎ
の通りで標品とよく一致した。

■ 淡黄色の針状結晶で１１３〜１１４℃に融点を示す
。

■ メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、
クロロホルム、四塩化炭素、水に可溶である。

■ 呈色反応 塩化第二鉄反応が陽性で、ニンヒドリン反応が陰性であ
る。

■ 紫外部吸収曲線は第１図に示す通りである。

メタノール溶液では２４６ｎｍ，３２５ｎｍに吸収極太
を示し、２６９ｎｍに肩を示す。

０．１Ｎ塩酸メタノール溶液（３−メトキシトロポロン
をメタノールに溶解し、０．１Ｎ塩酸で酸性にしたもの
）では２４８ｎｍおよび３２４ｎｍに吸収極大を示す。

０．１Ｎ苛性カリメタノール溶液（３−メトキシトロポ
ロンをメタノールに溶解し、０．１Ｎ苛性カリでアルカ
リ性にしたもの）では２４９ｎｍおよび３３８ｎｍに吸
収極大を示し、２６９ｎｍに肩を示す。

■ 高分解能マススペクトルによる分子量は１５２．０
４７０（理論量：１５２．０４７３）である。

分子式：Ｃ８Ｈ８Ｏ３■ 赤外部スペクトラムは第２
図に示す通りである。

吸収は３２６０、１５９８、１５５３、 １４２８、１２６０、１０８０、８４５および７９２ｃ
ｍ−１にある。

■ 核磁気共鳴スペクトラム（溶媒：重クロロホルム） δ４．０３に３プロトンのシングレット δ７．８〜６．７に４プロトンのマルチプレットδ８．
５０に１プロトンのブロードなシングレット ■ 各種展開剤によるペーバークロマトグラフイーのＲ
ｆ値は表１に示すとおりである。

表１ 上昇式ペーバークロマトグラフイ一つぎに３−メ
トキシトロポロンの各種微生物に対するｐＨ７．０にお
ける抗菌スペクトルを表２に示す。

表２ 寒天稀釈法による最少阻止濃度 ３−メトキシトロポロンのマウスにおける急性毒性値（
ＬＤ５０）は１３７．５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）である
。

以下、本発明の実施例を示す。

実施例 １ （Ａ）：種菌としてストレブトバーティシリウムハダノ
ネンセＭＫ−１００（微工研寄託受理番号第４０２５号
）を用い、第１種培地としてグルコース１ｇ／ｄｌ可溶
性でんぷん１ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．１ｇ／ｄｌ、ペ
プトン０．５ｇ／ｄｌ、ＣａＣＯ３０．１ｇ／ｄｌ（殺
菌前ｐＨ７．２）の培地を用いた。

種菌１白金耳を２５０ｍｌエルレン・マイヤーフラスコ
中３０ｍｌの上記第１種培地に植菌し、３０゜Ｃで４８
時間振盪培養した。

第１種培養液３０ｍｌを、２ｌ−バツフルつきエルレン
・マイヤーフラスコ中に入った３００ｍｌの第２種培地
に植菌する。

第２種培地は第１種培地と同じ組成の培地を使用する。

第２種培養も３０℃で４８時間振盪培養を行う。

この第２種培養液１．５４を３０ｌ−ステンレス製ジャ
ーファーメンター中の本培地１５ｌに植菌する。

この本培地の培地組成は、グルコース２ｇ／ｄｌ、ピー
・ビ・ラレツクス（動物油：アデカファイン・ケミカル
社製）２ｇ／ｄｌ大豆粕２ｇ／ｄｌ、肉エキス０．５ｇ
／ｄｌ，Ｋ２ＨＰＯ４０．０５ｇ／ｄ４ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０ ０．０５ｇ／ｄｌ、ＫＣｌ０．０３ｇ／ｄｌ、
ＣａＣＯ３０．３ｇ／ｄｌ（殺菌前ｐＨ８．０）である
。

このジャーファーメンター培養は３０゜Ｃで６０時間通
気攪拌方式（回転数３００ｒｐｍ．通気量１５ｌ／ｍｉ
ｎ）により行う。

その結果培養液中には約１００γ／ｍｌの３−メトキシ
トロポロンが蓄積する。

（Ｂ）：（Ａ）で得られた培養液を塩酸でｐＨ７．０に
調整し、８００ｇのＰ過助剤ラジオライトＮｏ．６００
（昭和化学工業社製）を加え、減圧下で沢過し、１５ｌ
のろ液を得る。

このろ液を１ｌのダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成社
製）を充填したカラムに通塔する。

３−メトキシトロポロンはこの樹脂に吸着し、水洗の後
、８．０％メタノール水溶液により溶出される。

この方法で３ｌの３−メトキシトロポロン活性区分が得
られ、３−メトキシトロポロンは３００γ／ｍｌの割合
で含まれていた。

（Ｃ）：（Ｂ）で得られた活性区分を減圧下で３００ｍ
ｌにまで濃縮し、濃縮液のｐＨを塩酸で２．０に調整し
、１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。

３−メトキシトロポロンは酢酸エチル層に転溶する。

この酢酸エチル層を減圧下で濃縮乾固し、純度約３０％
の粗粉末約１．８ｇを得た。

（Ｄ）：（Ｃ）で得られた粗粉末を５００ｍｌのシリカ
ゲル力ラムにのせ、酢酸エチルで溶出し、得られた活性
区分を約１ｍｌにまで濃縮し、１晩冷室（０’Ｃ）に放
置すると淡黄色の結晶を得る。

この結晶をろ別し、四塩化炭素中で再結して、約１５０
−の３−メトキシトロポロンの淡黄色の結晶を得ること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３−メトキシトロポロンの紫外部吸収スペク
トラムを示す。 実線はメタノール溶液、点線は０．１ＮＨＣ１メタノー
ル溶液（３−メトキシトロポロンをメタノールに溶解し
、０．１ＮＨＣｌで酸性にしたもの）、破線は０．ＩＮ
ＫＯＨメタノール溶液（３−メトキシトロポロンをメタ
ノールに溶解し、ｏ． ＩＮＫＯＨでアルカリ性にした
もの）を使用した場合を示す。 第２図は３−メトキシトロボロンの赤外部吸収スペクト
ラムを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトバーティシリウム属に属する３一メトキ
   シトロポロン生産菌を栄養培地に培養し、培養物から生
   成蓄積した３−メトキシトロポロンを採取することを特
   徴とする発酵法による３−メトキシトロポロンの製造法
   。