JPS5867184A - アスパルタ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアスパルターゼの製造法、特に７マル酸アンモ
ニウムをアスパラギン酸に変えるため使用されるアスパ
ルターゼの無細胞水溶液を得る方法に関する。

Ｌ−アスパラギン酸は薬品として、あるいはＬアラニン
およびアスノくルターメのような特定化学製品ｔ−５る
原料として使用される重要なアミノ酸である。このアミ
ノ酸はまた動物の飼料や人間の食料に対する添加物とし
て使用される。アスノ（アミノ酸は化学的手段により製
造されたが化学的な方法では一般にＤｆｆｉおよびＬ型
のラセミ、ｓ合物ｂｔえられた。Ｌ型のアスパラギン酸
のみが生物学的に同化できる。従ってアスノくアミノ酸
のより望ましい製造法として適当な培養基上でアスノ＜
２ギン酸塩を造出する微生物を培養する方法が挙げられ
る。（本明細中培養なる語は広義は使用され、ｃｕｌｔ
ｕｒｅ、　１ｎｃｕｂａｔ１ｏｎ、　１ｎｏｃｕｌａｔ
１ｏｎ、　ｆｅｒｍｅｎｔａ−ｔｉＯｎ　　等を含むも
のとする。）例えばチノく夕等に対する米国特許８，２
１４，８４５は主たる炭素供給源としてフマル酸（アン
モニヤ塩として）を使用するアスパラギン酸の生物学的
製造法を開示している。この方法は微生物を培養基上に
接種し一定時間培養後上記培養基からアスパラギン酸を
回収するバッチ型製造法を含んでいる。

不動化された細胞反応体を使用するアスパラギン酸の製
造法についても報告されており、例えばチパ等に対する
米国特許８，７９１，９２６はアスノくアミノ酸塩生産
性微生物細胞をアクリルアミン重合体中に捕束すること
による不動化細胞反応体の製法を開示している。アスパ
ラギン酸はこの不動化細胞をフマル酸アンモニヤと接触
せしめてえられる。上記変心はバッチ歴であっても連続
型であってもよい。連続型反応の場合、上記不動化細胞
は円筒中に充填され、この円筒を通じてフマル酸アンモ
ニウムの溶液が連続的に通過せしめられる。

不動化された細胞反応体はパッチ盟の培養法に比べて種
々の利点をもっている。バッチ型方法では生成物の回収
に複雑な手法を必要とし、このため全体としての産出量
が減少せしめられる。また多くの場合それ忙よる生産物
は培養基に含まれる細胞１代謝物質等により汚染される
。不動化された細胞の使用はこれらの問題の多くを排除
するが。

それＫよる最終製品中に相当量の細胞性不純物を含むこ
とはさけられない。

パッチ製および不動化細胞による製造法に伴５上記回収
および汚染の問題を解決する手段として分離法、精製法
、および＃素特［１望の反応を促進する酵素の使用が挙
げられる。これら酵素中７マル酸ア／モニャをアスパラ
ギン酸に変化せしめるに適したものはアスパルターゼで
ある。アスパルターゼを円筒中あるいは固体支持体上に
不動化してフマル酸アンモニヤから直接アスパラギン酸
をうる種々の試みが行われた。例えば米国特許鶴７９１
．９２１Ｆ）前段の記載はアスパルターゼｔ−ｍイオン
交換性ポリサッカライドと結合させ、あるいはアスパル
ターゼをアクリルアミン重合化中に捕束する方法に触れ
ている。これらの方法はアスパルターゼ酵素の抽出およ
び精製が困難なこと、およびその精製、濃縮、および不
動化工程中酵素作用の大部分が先われることによりその
成功は制限された。

上記酵素の不動化の目的で透析型の反応装置もまた提案
されている。ここに云う透析は広義のもので真実の透析
（隔膜により隔てられた２種の液体の間で溶質分子を交
換する）以外に浸透（隔膜を通じて溶媒を変換する）お
よび超濾過（隔膜を通じる圧力ＭＫより溶媒と溶質の移
動が行なわれる）を含む。上記透析型反応装置において
酵素溶液は半透過性隔膜の片面上に有数に保持される。

酵素反応用の基質が上記半透膜の他の面と接触せしめら
れる。上記半透膜は上記基質および生産物を透過せしめ
るが酵素は透過しないようなされている。従って基質は
半透膜の酵素側に移動して生産物に変化せしめられ、生
産物は基質溶液中に再移動せしめられてこの溶液中から
回収される。

透析型反応装置は種々の形態に作られており、例えば産
槃用のものは概してフィルタープレスの形状を有し、こ
れは液体を通過せしめる複数の富により隔てられた多数
の平行な隔膜板よりなっている。

１バイオテクノロジーおよびバイオエンジニャリンク１
巻２０．２１７−２８０頁（１９７ｇ）においてカン・
ジエー・ケーおよびミエーラー・エム・エルは中空繊維
製腎臓透析装置の上記透析型反応装置中の利用について
述べている。このような装置の使用において、微生物細
胞のすべては腎臓透析装置の外殻側に不動状Ｈｖｃ保持
され、基質溶液はこの装置の中空繊維の管側を通じて循
環せしめられる。基質はこれら繊維を透過して細胞に達
し、ここで反応が行われる。えられた生産物は再び循還
流中和英される。上記方式のあるものはＬ−ヒスチリジ
ンをウロカニツク酸に変化せしめるため螢光性桿菌（プ
ソイドモナス　フルオレッセンス）の一種を不動化せし
める。

これまでアスパラギン酸をうるため透析型反応装置中に
不動化されたアスパルターゼ酵素を使用する試みは概し
て不成功であった（前述の米国特許８，７９１，９２６
参照）。上記不成功の原因はアスパルターゼの分離精製
に用いられる従来の方法が酵素作用を大幅に失わせるた
めと考えられる。

本発明によりアスパルターゼのはぼ無細胞の水溶液をう
るための方法が開示され、この方法はアスパルターゼを
含む微生物細胞の水性懸濁液を形成し、この水性懸濁液
をアスパルターゼ釈放条件下に細脂内のアスパルターゼ
の大部分が細胞外の液中和釈放されるに充分な時間中培
養し、上記細胞の懸濁液から固形物を取除いて透明なア
スパルターゼ含有溶液をえ、上記細胞の懸濁液または上
記透明なアスパルターゼ含有溶液中和アスパルターゼ安
定化塩の充分な量を加えて上記溶液を上記微生物細胞に
関して高滲透圧とする各工程よりなっている。

本発明の望ましい実施例において上記細胞の水性懸濁液
は上記アスパルターゼ安定化塩の高滲・透圧溶液（又は
高侭液）を用いて形成される。

本発明による方法は簡単且有効であり、細胞のアスパル
ターゼ活性の８０−以上が通常上記無細胞のアスパルタ
ーゼ溶液中に回収される。さらにこの酵素は上記溶液中
で相当期間その活性を維持することが見出され、従って
この溶液は１述の透析型反応装置中において有効に使用
しえられる。

アスパルターゼ酵素は非常に広範な種類の微生物により
作られ、従って本発明はその特定の種、属、あるいは類
により制限されない。例えば螢光性桿菌（プソイドモナ
ス　フルオレッセンス）。

プソイドモナス　アエロギノサ、パシラス　サプチヲス
、パシラス　マガテリウム、プロテウスバルガリス、セ
ラチャ　マルセツセンス、エスチェリシャ　コリ、およ
びアエロバクチル　アエロゲネスがアスパラギン酸の生
産に遍していることが記載されている。アスパルターゼ
が回収された特定の微生物はグルタミン酸塩を用いてえ
られた上記エスチェリシャ　コリの置種（ＡＴＣＣＮｏ
。

８１９７６）である。

７　スハｋ　ｌ　−セノ生［１源として、この［Ｃの生
産および細胞の急速な生長に適した培養基中で上記アス
パルターゼ生産用の細胞が培養される。上記細胞の培養
法はよく知られており本発明の一部を構成するものでは
ない。

概説すると必要なミネラルおよび生長剤を含み炭素およ
び窒素の同化しうる供給源である培養基が使用される。

特にこの培養基中和フマル酸を含み、また窒素、ビタン
ン、および生長剤の供給源トシテイースト抽出物を、追
加の窒素源としてアンモニヤイオンを、また必要なミネ
ラルとしてカルシウムおよびマグネシウム塩を含んでい
ると好都合である。またバッファーとしてカリウムおよ
びナトリウムのリン酸塩あるいは炭酸塩が含まれる。

接種された培養基は通常生育条件下にリットル当り約２
グラムから約６グ２ムの固形物を生産するに充分な時間
培養される。通常的８７℃で約１２〜１４時間培養する
と所要の細胞密質がえられる。

適当な生育期間の後に細胞は培養基の細胞以外の部分か
ら（例えば遠心分離機または濾過機によい）分離され、
洗浄される。アスパルターゼは上記細胞を水性液中に懸
濁させアスパルターゼ釈放条件下にさらに培養すること
により細胞から取出される。上記水性の懸濁液としては
水あるいは他の１紀酵素に有害でない水性溶液（例えば
通常のバッファー）が用いられる。望ましい水性懸濁液
としてはアスパルターゼ安定化塩（後述される）の高滲
透圧溶液（又は高張液）が用いられ、特に望ましい懸濁
用液とし【は７マル酸またはアルバラギン酸塩の高滲透
圧溶液が用いられる。約１０モルから飽和までの濃度を
もったフマル酸アンモニウム、特にその１４モル濃濃度
ものが上記懸濁用液として遍している。

細胞はリットル当り少くも約５グラムの濃度（乾燥状態
の細胞重量）において、より望ましくはリットル当り約
１０グラムから約１５グラムの一度で上記懸濁液中に懸
濁せしめられる。

このように懸濁せしめられた細胞はアスパルターゼ釈放
条件のＦで細胞内のアスパルター（の大部分が上記フマ
ル酸塩溶液巾に釈放されるに充分な時間培養される。培
養温度は約２℃から約７０℃迄、より望ましくは約２５
℃から約６０℃迄が使用される。特に望ましい培養温度
は約８７℃である。培養温度が低い場合は酵素釈放の時
間的割合が低下すると共に酵素の作用も低下する。１方
培養温度が余り高いと酵素に有害な影響を与える。

培養時間は成程度培讐温変に依存するが通常中くも約１
０分、望ましくは少くも約１時間、より望ましくは約１
２から６０時間が用いられる。

培養後例えば遠心分離または濾過により固形物が細胞の
懸濁液から除かれて透明なアスパルターゼ含有液がえら
れる。アスパルターゼの活性を損じない限り任意の分離
あるいは濾過手段が用いえられる。このよ５＆Ｃしてえ
られた液は通常細胞内に当初含まれていたアスパルター
ゼ活性の約８０憾を保有している。この液はほぼ望まし
からぬ汚染を免かれており、・８７℃において４０日以
上保有するアスパルターゼ活性を維持しうる。

上記透明溶液に対しアスパルターゼ安定化塩の充分な量
が加えられてこの溶液を高滲透圧溶液（又は高張液）と
する。本発明の望ましい実施例において上記アスパルタ
ーゼ安定化塩が水性の細胞Ｓ濁用液として用いられ、こ
の場合は上記透明溶液に対するアスパルターゼ安定化塩
の添加は通常不必要である。

上記アスパルターゼ安定化塩は一定期間酵素活性を保持
せしめると共にその熱による劣化を防止する。例えば６
６℃における溶液のアスパルターゼ活性を比較した所に
よると、バッファーにより抽出された酵素は８０分後に
その活性のほぼ全部ヲ失っタカ１４モルの７マル酸アン
モニウム中に抽出された酵素はその活性の少くとも８０
１Ｇを２時間の貯蔵後も保有していた。

望ｔしいアスパルターゼ安定化塩は７−ｒ　ｋ　酸ｉた
はアスパラギン酸の可溶性塩である。フマル酸はアスパ
ラギン酸の生産のための酵素基質やあ（従ってこれらの
酸の塩を使用することＫより後にアスパルターゼからこ
の塩の分ＩＩｍを不要にする。

さらにこれらの塩、特にフマル酸アｙモ二りムは酵素の
抽出および安定化に有効であることが見出された。７マ
ル酸塩およびアスパラギン酸塩は上述の様に望ましいが
酵素を安定化し５る任意の水溶性塩も使用可能である。

このような塩！！　４　常ＭＸで示され、ことにＭは陽
イオン例えばアルカリまたはアルカリ土類金属、アンモ
ニウム、低級アルキルアンモニウム、低級アルキル４ア
ンモニウム等を示し、Ｘは陰イオン例えばハロゲンイオ
ン、硝酸、炭酸、リン酸、硫酸、マレイン酸、７マル酸
、アスパラギン酸等のイオンを示す。上記透明溶液中の
アスパルターゼ安定化塩の濃度は約０５モルから飽和迄
、望ましくは約１０モルから約１４モル迄の範囲ＴｌＣ
１１ばれる。

この方法によりえられたアスパルターゼ溶液は透析製反
応装置、特に中空繊維型反応装ｆｌｌＫ使用可能である
。上記無細胞の溶液は単に上記反応装置の管側に吸引力
を加えることにより容昼にこの装置の外殻中和導入しぇ
られる。酵素が反応装置中和導入された後に７マル酸ア
ンモニウム溶液がこの装置の管側を通じて循還せしめら
れる。７マル酸アンモニウム基質およびえられたアスパ
ラギン酸は透析管壁を自由に通過し、アスパラギ／＃は
循還溶液から回収される。１方アスパルターゼ酵素は上
記管壁を通過できず反応装置中和保持される。透析可能
な不純物および看色生成物の除去は反応開始直後から行
われ、従って生産物の汚染は防止される。

使用された反応装置の反応条件は装置のＩＩＫより異る
が１通常上記基質は例えば約１モルから飽和１り望まし
くは約１８モルの７マル酸アン毫ニウム濃縮溶液である
。反応物質はアスパラギン酸生成条件下で培養される。

反応装置は１紀基質から生成物えの塩化が有効に行われ
る温度に保持される。約２℃から約７０℃、望ましくは
約２６℃から６０℃、より望ましくは約８７℃の温度が
通常用いられる。上記酵素反応は発熱反応であり。

従って低流速の基質が用いられる大型反応装置において
は過剰の熱を除去する手段が必要である。

反応装置内での基質溶液の流速は使用される反応ａｍ、
基質濃賀温間応系の構成（例えばｌｌｆｆｉ式あるいは
単−通過式）、酵素の添加レベル、および希望の放熱度
等により異る。

上述の中空繊維反応装置は、この装置から排出された溶
液流が貯液槽に返えされる再循還バッチモードで動作せ
しめられることも可能である。この場合基質溶液の再循
還は７マル酸アンモニウムの大部分がアスパラギン酸に
変化するまで続けられる。反応装置動作の他の形態とし
て複数の反応装置が直列的忙動作せしめられる単−流過
型のものも使用される。

本発明によりアスパルターゼを生産する細胞からアスパ
ルターゼを回収する簡単で有効な方法が設けられた。こ
の方法によつえられた細胞を含まないアスパルターゼ浴
液はバッチ型あるいは不動化モードで使用しえられ、特
に中空透析型反応装置に使用されるに適している。

本発明の方法によりえられた無細胞のアスパルターゼ溶
液は透析型反応装置に使用された場合完全細胞を含むも
のに比べて次のような利点全もっテイル。完全細胞を含
むものにおいて高レベルの酵素作用をうるためＫはその
溶液は濃縮されねばならない。濃縮された含細胞溶液は
高粘性であり本発明による無細−胞溶液においては存在
しない少くも２つの問題を生じる。その１つの藺題は細
胞スラリーから透析膜を通じて生産物溶液中和不純物お
よび着色物質が移動せしめられる点にある。

無細胞の場合のよ５［反応初期の短時間（ではなく、王
妃不純物および着色物質は長期間に亘って完全細胞から
浸出される。ｆＪＩｉ２０問題は完全ａｍ系の拡散に関
する。アスパルターゼに細胞内酵素と考えられ、従って
反応物質および生産物質は反応装置の隔膜のみならず細
胞外流体および細胞構成物質を通じて拡散されねばなら
ない。従ってこの場合の反応７度はより低下せしめられ
る。例えばほぼ等しい量の酵素活性を用いた場合におい
ても無細胞の中空繊維反応装置は完全細胞を含むものく
比べて約４５−大きい反応速ヅを示す。

本発明は以下の実施例により更に詳述されるがこれらの
例に限定されるものではない。

例　　　１ 種々の置のイースト抽出物を含む栄養物質がアスパルタ
ーゼをうる目的で培養された。これらの物質の夫々は１
リットル当り２４〜６０グラムのイースト抽出物、フマ
ール酸８０グラム、リン酸カリ２グラム、炭酸ナトリウ
ム０６グラム、硫酸マグネシウム２ミリモル、塩化カル
シウムＱｌξリモルを含み、その水素イオン濃度は水酸
化アンモニウムを用いて約′Ｚ２に調整された。各資料
はエスチェリシャコリ（ＡＴＣＣＮｏ、　８１９７６　
）１ミリリツトルと共に培養された。上記エスチェリシ
ャ　コリはα６チグルタミン酸モノソジユームを含むペ
プトン中で８７℃で１２〜１６時間培養されたものであ
った。各資料の上記培養は８７℃において１２〜１４時
間行われ、ついで細胞が収穫された。えられた細胞の乾
燥状態における重量は使用されたイースト抽出物の量に
より毎リットル当り約２〜７グラムの範囲＆Ｃ変化せし
められた。各資′料によるアスパルターゼ生１１１率は
第１表に示す通りであった。

さらに種々の濃度のフマル酸アンモニウムを含む培養物
質が上述のように調整され培養された。

これら物質の夫々はイースト抽出部８憾と上述の各成分
の上記と等しい温間を含んでいた。これら培養の結果が
第■表に示される。イースト抽出物′Ｌ４Ｗ／Ｖ）とフ
マル酸ア／モニウムａＯ嗟を含む培養物質からえられた
細胞培養物が遠心分離され、液状部分はデカントされ廃
秦された。細胞はついで水洗され、再び遠心分離され、
デカントされ、さらにｐ１４ａｓのα０５トリスＨＣＩ
、バッファー中に当初容積の１／２ｏにまで再び懸濁せ
しめられた。えられたスラリーはフマル酸アンモニウム
のＬ８モル溶液（ｐＨ＆５）Ｋより希釈されて当初培養
時のＶ６の容積をもつ細胞懸濁液かえられた。

この懸濁液は６個の部分に分割され、８７℃において表
■に表示期間培養され、ついで遠心分離された。液状部
分はデカントされ固形物は廃秦された。液状部分はつい
でアスパルターゼ活性について試験されその結果は表■
に示されている。

例　　　２ 例１の方法（イースト抽出物２４−、フマル酸アンモニ
ウム８％）ＫよりＩＬ５グラムの細胞（乾燥状態重量）
からえられた細胞を含まない溶液がコーデイスードウム
工腎臓（ＣＤＡＫ　　２．５　Ｄ）の管側に吸引力を加
えることによりその外殻中和導入された。この反応装置
中に酵素を導入した後上記外殻は封止され、ｐＨ＆５の
７マル酸アンモニウムの１８モル溶液が毎時的１１−１
５　リットルの流速で上記反応装置の管側中を通過せし
められた。基質溶液が貯液槽から反応装置中に再び循還
せしめられる再循還方式が採用された。反応装置は８７
℃に維持された。貯液槽の内容中に残存するフマル酸塩
が定期的に測定され、この測定結果は表■中に示される
。アスパラギン酸はＨ，８０４の添加によるｐＨ’２．
８において沈殿せしめられ、濾過され、洗浄され、乾燥
された。フマル酸の平均ｚ１に２からアスパラギン酸２
．０−　ｚ　Ｉ　ＫＦが回収された（３ｍ論的収率は８
８１Ｇから８６チ）、このように生産されたデスパラギ
ン酸はＣ，Ｈ，ＮおよびＯＫついて元素分析することに
より確められ、その結果は９７−９９１１理論と一致し
ていた。生＋２６（２ＮのＨＣｌ中でＣ−１Ｏ）であっ
た。この生産物は結合酵素試験法により試験されて真正
アスパラギン酸標準と９６９１合致していた。

表　　　Ｉ 培養液の容積アスパルターゼ活性に対する。培養物質（
フマル酸アンモニウム８−ｔ−含む）中ノイースト抽出
物濃度の影響。

イースト抽出物　　　　　アスパルターゼＬＯＱ２２ Ｌ８　　　　　　　　　　　（Ｌ６４ ２７　　　　　　　　　　α９０ １０　　　　　　　　　　　Ｌ２０ ４０　　　　　　　　　　１５Ｇ ＫＧ　　　　　　　　　　　Ｌ７６ ［０２，１４ ？０　　　　　　　　　　２．２６ ＆Ｏ５Ｌ２４ 表　　　■ 培養液の容積アスパルターゼ活性に対する。培養物質（
イースト抽出物８チを含む）中の７マル酸アンモニウム
濃質の影響。

フマル酸　　　　　アスパルターゼ Ｑ　　　　　　　　　　　ＬＯＯ ！０　　　　　　　　　　２．５０ ４０　　　　　　　　　　２．５２ ａｏ　　　　　　　　　　　０４８ 表　　　■ フマル酸アンモニウム上４モルを含む細胞群からアスパ
ルターゼの抽出。

Ｏ− ４７０ ７７８ １４７９ ２４８０ ４８８４ 表　　　■ 中空繊維反応装Ｗｔ（ＣＤＡＫ　　２．５　Ｄ　）が無
細胞の酵素（乾燥状態で約ＩＬ５グラムの細胞から抽出
された）を用い、７マル酸アンモニウム１８４ルを含む
ｌＯリットルの攪拌された貯液槽と共に再循還パッチモ
ードで動作せしめられた。

ａＯＬ８１ α２５　　　　　　　１６ｇ α６　　　　　　　　Ｌ６２ ＬＯＬ８　０ Ｌ５　　　　　　　　　Ｌ１２ ！Ｏ（１９８ ２６α８２ ａＯα７０ ａ６　　　　　　　０５８ 表Ｏａ４ｇ １０　　　　　　　　０８２ ｔｏ　　　　　　　　　Ｃ２１ ？Ｏα１４ 第１頁の続き ｏＩｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（Ｃ
１２Ｎ　　９／８８ Ｃ１２Ｒ１／４２５） （Ｃ１２Ｎ　　９／８８ Ｃ１２Ｒ１７１８５） （ＣＩ２　Ｎ　　９／８８ Ｃ１２Ｒ１１０１） ０発　明　者　ロイズ・ジーン・モザーアメリカ合衆国
２１７０１メリーラ ンド州フレデリック・アップル ・ツリー・コート１３１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アスパルターゼを含む微生物細胞の水性細胞懸濁液
   を作り、 上記水性細胞懸濁液をアスパルターゼ釈放条件下に、上
   記細胞内のアスパルターゼの大部分が細胞外の液中に釈
   放されるに充分な時間培書し。 上記細胞懸濁液から固形物を取除いて透明なアスパルタ
   ーゼ含有溶液をえ。 上記細胞懸濁液または上記透明なアスパルターゼ含有溶
   液にアスパルターゼ安定化塩を加えて上記透明なアスパ
   ルターゼ含有溶液を上記微生物細胞に関して高張液（又
   は高滲透圧液）とする各工程よりなる、はぼ細胞を含ま
   ないアスパルターゼの水性溶液を生産する方法。 ２、上記水性の細胞懸濁液が微生物のａ胞を上記アスパ
   ルターゼ安定化塩の高張溶液中和懸濁することによりえ
   られる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、上記アスパルターゼ安定化塩が７マル酸またはアス
   パラギン酸の水溶性塩よりなる特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の方法。 ４、上記アスパルターゼ安定化塩が７マル酸アンモニウ
   ムまたはアスパラギン酸アンモニウムよりなる特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 ５、上記アスパルターゼ安定化塩がフマル酸アンモニウ
   ムよりなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ６、上記フマル酸アンモニウムの高張液中におけるフマ
   ル酸アンモニウムの濃度カ約α６モルから飽和濃度まで
   の範囲内にある特許請求の範囲第６項記載の方法。 ７、上記フマル酸アンモニウムの高張液中におけるフマ
   ル酸アンモニウムの濃度が約ＬＯから約１４モルの範囲
   内にある特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、上記アスパルターゼ釈放条件が約２℃から約７０℃
   までの培養温度を含み、上記細胞の懸濁液が少くも約１
   ０分間培養される特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、上記アスパルターゼ釈放条件が約２５℃から約６０
   ℃までの培養温度を含み、細胞懸濁液が約１２から約６
   ０時間培養される特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、　　上記培養温度が約８７℃である特許請求の範
   囲第９項記載の方法。 ■　バクテリヤの細胞が７マル酸アンモニクムの充分に
   高い高張液中ＶＣｌ２濁されて、乾燥状態の細胞重量で
   １リットル当り少くも約６グラムの細胞温間をえ、上記
   アスパルターゼ釈放条件がさらに約７から約９までＱｐ
   Ｈ＠ｌを含む特許請求の範囲第９項記載の方法。 ｌλ　上記バクテリヤの細胞がフマル酸アンモニウムの
   充分高い高張液中に懸濁されて、乾燥状態の細胞重量で
   、１リットル当り約ｌＯグ２ムから１゜ 約１５グラムの細胞を含む温間をえ、かつ上記ｐＨ値が
   約８から約９迄の範囲内にある特許請求の範囲第１１項
   記載の方法。 １３、上記バクテリヤの細胞が、プソイドモナスフルオ
   レッセンス、プソイドモナス　アエロギノサ、バシラス
   　サブチラス、ノくシラス　マガテリウム、プロテウス
   　ノ（ルガリス、上２チャ　マルセツセンス、エスチェ
   リシャ　コｌ）、およびアエロバクチル　アエロゲネス
   のアスノくルターゼ生産性品種群から遍らばれた特許請
   求の範囲第１゜５．６，７．９または１２項記載の方法
   。 １４、上記バクテリヤの細胞カ１ニスチェＩＪシャコリ
   である特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、上記バクテリヤの細胞が品種ＡＴＣＣ８１９７６
   のエスチェリシャ　コリである特許請求の範囲第１４項
   記載の方法。 １６、特許請求の範囲第１項記載の方法によりえられた
   アスパルターゼのはぼ細胞を含まな〜・水性溶液。 １７、　　特許請求の範囲第１１項記載の方法によりえ
   られたアスパルターゼのほぼ細胞を含まなり・水性溶液
   。 １８、特許請求の範囲［１３項記載の方法によりえられ
   たアスパルターゼのほぼ細胞を含まない水性溶液。 １９、第１の室および第２の室、および第１の室を第一
   ２の室から分離する半透膜−よりなる反応装置を備え、
   上記半透膜はアスパラギン酸塩によびフマル酸塩全透過
   するがアスパルターゼに対しては不透過性であり、特許
   請求の範囲＠１６項または１７項記載のほぼ細胞を含ま
   ないアスパルターゼの水性溶液が上記第１の室（導びか
   れて上記半透膜と流体接触せしめられ、フマル酸アンモ
   ニウム溶液が第２の室に導びかれて上記半透膜と流体接
   触壁しめられ、これら溶液をアスパラギン酸生成条件下
   に培養し、アスパラギン酸を上記第２の室中潰溶液から
   回収することを特徴とするアスパラギン酸の製・遣方法
   。 ２０、上記反応装置が封止可能な外殻と、この外殻を液
   体で充す装置と、この外殻の内部から封止されるよう上
   記外殻を通過せしめられる複数の中空で半透性外１１ｅ
   ４．つた繊維とよりなり、上記各繊維の１端は入口端マ
   ニホールド中に開口すると共和その他端は出ロ端マニホ
   ールド中に開口し。 上記はぼ細胞を含まないアスパルターゼの水性溶液は上
   記外殻内に導入され、上記フマル酸アンモニウムは上記
   中空の一半透性繊維中を通過せしめられ、アスパラギン
   酸が上記フマル酸アンモニウム溶液中から回収されるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、　　上記フマル酸アンモニウム溶液中の７マル酸
   アンモニウムの温間が約１モルから飽和温度迄の範囲に
   ある特許請求の範囲第四項記載の方法。 ｎ、フマル酸アンモニウムのほぼ飽和溶液が使用された
   特許請求の範囲第２１項記載の方法。 田、上記アスパラギン酸生成条件が約２℃から約７０℃
   迄の培養温度を含む特許請求の範囲第四項記載の方法。 Ｕ、上記アスパラギン酸生成条件が約２５℃から約５０
   ℃迄の培養温度を含む特許請求の範囲第四項記載の方法
   。 器、上記反応装置が再循還バッチモードで動作せしめら
   れ、このモードにおいてフマル酸アンモニウム溶液は貯
   液槽から上記反応装置を通じて。 上記７ｖル酸アンモニウムのほぼ全量がアスノくアミノ
   酸に変化せしめられる迄再循還せしめられる特許請求の
   範囲ｌＩ２４項記載の方法。