JPS63258593A - 抗血液凝固物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗血液凝固物質の工業的製造法、更に詳細には
、ヒト組織由来細胞の組織培養細胞から分離採取する方
法に関する。

〔従来の技術〕

本発明者らは、ヒト胎盤より新規な抗血液凝固物質を分
離採取することに成功し、先に特許出願した（特願昭６
０−２１７５１２号）。

この方法は、ヒト胎盤から胎盤ホモシュネートを調製し
、その沈渣をキレート剤及び／又は界面活性剤を含む緩
衝液で抽出し、その抽出液から硫安分画及び公知の分離
・精製手段を用いて抗血液凝固物質（以下、「ＰＣＩ」
と略称する）を分離採取する方法である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、この方法は、（１）原料胎盤中のＰＣＩ
含量が微量である、（２）原料の安定供給及び大量確保
が困難である、（３）原料のウィルス汚染による衛生上
の管理に常時腐心しなければならない、（４）細胞内容
物等の夾雑物が多量に混入されるので精製に多工程を要
し、収率も低いという欠点があり、工業的製造法として
は必ずし２も満足し得るものではなかった。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者らは上記欠点を克服せん
と鋭意研究を行った結果、ヒト組織由来細胞の組織培養
細胞中にもに工が存在すること、そして、これから簡単
な操作で高収率にてＰＣＩ　２分離採取できることを見
出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ヒト組織由来細胞を組織培養し、
その培養物からＰＣＩ　ｉ分離採取する方法である。

本発明で用いられる細胞は、ヒトに由来する細胞であっ
て、ＰＣＩを産生ずる能力を有するものであれば何れで
もよい。このような細胞としては、例えば、ヒト胎児の
腎臓、肺臓、小腸、皮膚、心臓由来細胞；ヒト成人の腎
臓、肺臓、包皮、胎盤、リンノｅ球由来細胞が挙げられ
る。

斯かる細胞の組織培養は、通常の動物細胞の培養に用い
られる方法、例えば、Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（
Ｐ、　Ｋ。

Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｍ＋に、　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　
、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、、　１９７３　）に
記載の方法に準じて行うことができる。

このようにして培養増殖させた培養細胞はそのまま本発
明に使用できるが、これからインター７二ロン類、イン
ターロイキン類、ゾラスミノーグンアクテベーター類、
ホルモン類を抽出した細胞を使用することもできる。

培養細胞からのＰＣＩの分離採取は、例えば次の如くし
て行われる。すなわち、まず、培養細胞をＥＤＴＡ　、
　ＥＧＴＡ　、シュウ酸、クエン酸。

ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン酸等のキレート剤を含
む緩衝液及び／又はトリトンＸ−１００、ルプロール、
　ＳＤＳ　、デオキシコール酸等の界面活性剤を含む緩
衝液で処理する。

当該処理は、培養細胞をキレート剤及び／又ｉ界面活性
剤溶液に浸し、４〜８℃にて一晩放置後、遠心分離して
上清を集めて抽出液とすることによって行われる。更に
また、上記残渣の細胞をキレート剤及び／又は界面活性
剤溶液に入れ、ホモジナイザー等で細胞を破壊し、遠心
分離して上清を集めて抽出液とする。斯かる処理により
、細胞内に産生されたＰＣＩは細胞外に溶出され、高濃
度のＰＣＩを含む抽出液が得られる。

次いで、この抽出液から、公知の分離・精製手段９例え
ば透析、イオン交換クロマトグラフィー、ダル濾過、吸
着クロマトグラフィー、疏水性クロマトグラフィー、等
電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたアフ
ィニティー拳クロマトグラフィー等を単独または組み合
わせ用いることによりＰＣＩを単離精製することができ
る。

上記アフィニティー〇クロマトグラフィー及びＰＣｒの
確認に使用される抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、例え
ば、先に本発明者によって見出された（特願昭６１−２
６９５８８号）次の方法により製造される。すなわち、
（１）抗原としてＰＣＩｉ用いて免疫した動物から抗体
産生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫細胞を調製し、（
３）これらの細胞を融合させ、（４）得られたノ・イブ
リドーマを選択的に増殖させ、（５）該ノ・イブリドー
マから抗体産生ハイプリドーマを検索し、（６）クロー
ニングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハイプ
リドーマを得る。

（１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＰＣＩで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞
を取得する方法によればよい。動物としては、マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示され、
抗体産生細胞としては牌臓、リン、Ｑ節、末梢血液等か
ら分離した細胞などが使用される。

免疫方法としては、フロイントのコンプリードアシュバ
ントを併用する方法が使用される。

０）骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄肺細胞は、特に限定されず、多
くの哨乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。

用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞
が選択培地で生存できず、ハイプリドーマだけが増殖で
きるようにすることによって、未融合細胞と融合細胞と
を分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有するも
のが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の細胞は
、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため好んで
用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株ＰＡＩ、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８゜Ｐａ−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　
、Ｐａ−Ｎ５Ｉ／１−Ａｇ４−１　、Ｘ６３−Ａｇ　８
−６．５．３．、　ＳＰ２１０−Ａｇｌ　４　。

ＦＯ，５１９４１５ＸＸＯ，ＢＵ、１　、ＭＰＣＩＩ−
４５，６゜ＴＧ、１．７等が用いられる。

（３）細胞融合 細胞融合は、通常ｇＭ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、工
■屓培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を
混合（混合比は通常ｌ：４〜１：１０）することにより
行なわれる。融合促進剤としては、平均分子量１，００
０〜６，０００の？リエチレングリコール（ＰＥＧ　）
が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５０％で
ある。

（４）ハイプリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、１０％ＦＣ８含有工１■■培
地などで適当に希釈し、遠心分離する。

沈渣を選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地）で浮遊し、９
６ウエルマイクロプレートに接種した後、５％炭酸ガス
培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハ
イプリドーマである。

（５）抗体産生ノ・イブリドーマの検索抗体産生ハイプ
リドーマの検索は、常法に従えばよく、特に限定されな
い。たとえば、ハイブリドーマの増殖した培養液を採取
し、ＰＣＩと反応させたのち、酵素、ケイ光物質、発光
物質などでラベルした第２抗体との反応により検索でき
る。

（６）クローニング 抗体産生ハイプリドーマを含むことを確認した培養ウェ
ル中の細胞を限界希釈法などにヨリクローニングを行な
い、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得る。

以上の操作によってに工に特異的なモノクローナル抗体
産生ハイプリドーマＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６、
にｌ−Ｈ１６７、にｌ−Ｈ１６９、ＰＣＩ−Ｈ１７６、
ＰＣＩ−Ｈ１８０を得た。これらのハイプリドーマはそ
れぞれＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体を産生ずる
新規な細胞である。

そこでこれらの細胞について工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託すべく手続を行なったが、６１微寄文第１
４１５号として拒否された。

ＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体は、上記で得られ
た抗体産生ノ・イブリドーマを利用することにより調製
される。すなわち、抗体産生ハイプリドーマを適当な培
地中で培養することにより、その培養上清からモノクロ
ーナル抗体が得られる。また、モノクローナル抗体を大
量に製造するには、骨髄種細胞の由来動物と同種の動物
にシリスタン（２，６゜１０．１４−テトラメチルペン
タデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、抗体産生
ハイプリドーマを接種することにより、インビｌで抗体
産生ハイプリドーマを大量に増殖させる方法が用いられ
る。この方法によれば、接種した動物の血清および腹水
中に高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モノクロー
ナル抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精製に
使用されている方法に従って実施できる。

斯くして得られた本発明モノクローナル抗体は、使用す
る抗体産生ノ・イブリドーマの種類ニヨリＰＣＩ　−Ａ
３９、ＰＣＩ　−Ａ４６、ＰＣＩ−Ａ−１６７、ＰＣＩ
−Ａ１６９、ＰＣＩ−Ａ１７６およびＰＣＩ−Ａ１８０
の６種類存在する。

このようにして得られるに工は次の性質を有する。

■　分子量（ＳＤＳ　−、ｔＰソリアクリルアミドダル
電気泳動法還元状態） ３４．０００十４０００ ■　等電点（アンフオライ）ｋ用いる等電点カラム′亀
気泳動法） ４．７±０．１ ■　安定性 ■　５０℃、３０分加熱処理で失活 ＠ｐＨ４〜１０で安定 Ｏ血漿中３７℃、３０・分で安定 ■作　用 ■　カルシウム古訓凝固時間を延長 ＠　プロトロンビン時間を延長 θ　活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アス、Ｑラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、ゾロリン、グリシン、アラニン、％
シスチン、バリン、メチオニン、インロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リシン
及びアルギニンの存在が認められる。

■　糖分析 フェノール・硫酸試験にて、糖の存在を認めない。

〔発明の効果〕

軟土の如く、本発明方法は、原料入手が制限を受けるこ
とがなく、シかも純度の高いＰＣＩ高濃度溶液を得るこ
とができるので簡単な精製操作で高収率にてＰＣＩｆ、
！！造することができる工業的に優れた方法である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１ ヒト胎児由来の表−１に示す各種細胞を、１０％ｈｖｓ
　（牛胎児血清）加ＤＭＥＭでローラー＋１ゲトル（７
５０彪、フアシヨン）に１〜３×１０’個接種し、３７
℃、９０秒／回転の条件で５〜７日間培養した。単層に
増殖した細胞の表面ｔ−ＰＢＳ　（ＩＪン酸緩衝液）で
十分洗った後、４℃に冷やした２５ｍＭのＥＤＴＡ　１
７）入った生理的食塩液を入れ、ゴム製のヘラを用い物
理的に＆）ルから細胞を剥離した。細胞が単層に増殖す
ると細胞数はボトルあたり１〜２Ｘ１０７個存在した。

細胞の剥離液を３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清
（抽出液■）に含まれるＰＣＩ量を、モノクローナル抗
体ＰＣＩ−Ａ４６’ｉ用いるＥＬＩＳＡ　（酵素免疫測
定法）によって測定した。さらに、沈渣（細胞）に同Ｅ
ＤＴＡ液を加えホモジナイザーを用い、４℃で細胞を破
砕して遠心上溝液（抽出液■）に含まれるＰＣＩ量を上
記と同様にして測定した。

その結果を表−１に示す。

表−１ 単位：μｒ、’ｔｏ’細胞 実施例２ （１）抗にエモノクローナル抗体カラムの作成ブロムシ
アン活性化セファロース４Ｂ （０，４ｔ　）を、１ｍＭ塩酸、０，１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム−０，５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８，３）緩衝液で
順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファロース４Ｂのカ
ップリング緩衝ｌ（１，５ｍ）溶液を調製した。

これに１精製モノクロ一ナル抗体ＰＣＩ−Ａ４６２薦９
のカップリング緩衝液（１７り溶液を加え、室温で２時
間振とうしグラスフィルターで脱水した。更に、０．１
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０−を加え、室
温で２時間振とうし、残った活性部位をブロックした。

得られた抗体結合セファロース４Ｂを、０、１　Ｍ　）
リス−塩酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
３）、０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（
ｐＨ４，０）で交互に３回洗浄し、０．１Ｍ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化し、抗体カラムを得た
。

（ｕ）　　アフィニティークロマトグラフィーによる精
製 （１）で得た抗体カラムに、実施例１で得た培養肺細胞
の抽出ｆｆＩｅ通してＰＣＩを吸着させ、平衡化に用い
た緩衝液で充分に洗浄した後、０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ
塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）でに工を溶出させ
た。その結果を表−２に示す。

表−２ 以上 手続補正書、（自発） 昭和６２年４月２３日 １、　事件の表示 昭和６２年４月１６日提出の特許願 ２　発明の名称 抗血液凝固物質の製造法 １　補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　興和株式会社 ４、代理人 住　所　東京都中央区日本橋人形町１丁目３番６号（〒
１０３）共同ビル　電話（６６９）０９０４（代）民　
名　　（６８７０）　　弁理士　有　賀　三　幸　　　
。

住　所　同　　　上　　　　　　　　　　　　　−−一
」氏　名　　（７７５６）　　弁理士　高　野　登志雄
住　所　　同　　　上　　　　　　　　　　　　１−１
氏名　（８６３２）弁理士小野信夫　゛６、　補正の対
象 明細書全文 ７、補正の内容 （１）別紙のとおり （浄書につき内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養細胞から
   下記の性質を有する抗血液凝固物質を分離採取すること
   を特徴とする抗血液凝固物質の製造法。 （１）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法、還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電
   気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 （イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 （ロ）ｐＨ４〜１０で安定 （ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 （イ）カルシウム再加凝固時間を延長 （ロ）プロトロンビン時間を延長 （ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレ オニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、
   アラニン、１／２シスチン、バリン、メチオニン、イソ
   ロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒ
   スチジン、リジン及びアルギニンの存在が認められる。 （６）糖分析 フェノール・硫酸試験にて、糖の存在を認めない。 ２、分離採取が、培養細胞を界面活性剤及び／又はキレ
   ート剤を含む抽出液で抽出し、次いでこの抽出液より単
   離する方法である特許請求の範囲第１項記載の製造法。