JPS5881798A - 体液のビカ−ボネ−ト濃度を測定するための試薬と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液、−例えば血漿や血清のビカーざネート含
量の酵素学的測定、より詳細には、ホスホエノールピル
ベートカルボキシラーゼ存在下でのホスホエノールピル
ベートのカルボキシル化反応をマレートデヒドロデナー
ゼ存在下でのオキゾロアセテートによるニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドの還元体の酸化反応と組み合わ
せた測定に関する。

ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ４，
１，１，３１）は次反応によシホスホエノールビルベー
トのカルボキシル化の固定を触媒する。

＠ＰＥＰ”はホスホエノールピルベート；−ＨＣｏ；−
はビカーざネー）：＠ＰＥＰＣ”はホスホエノールピル
ベートカルボキシラーゼ：’Ｍｇ＋２ｍは２価Ｍｇカチ
オン：＠ＯＡＡ”はオキゾロアセテ−）　ニーＰｉ＝は
無機オルトホスフェート。簡略にする九め上記反応を以
後１反応■”と呼ぶ。

オキずロアセテートはクレデ即ちクエン酸代謝サイクル
の反応体であり、次反応（反応ＩＩ）Ｋより、マレート
デヒドロゲナーゼ存在下で補酵素ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドの還元体によりマレートに転化される
。

ＤＨ ＯＡＡ　＋　ＮＡＤＨ−−→マレー）　十ＮＡＤ”＠Ｍ
ＤＨ’　　はマレートデヒドロデナーゼ；＠ＮＡＤＨ”
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元体：＠
ＮＡＤ＋”はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
酸化体。

ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化される酵累反応では、酸化さ
れたＮＡＤＨＯ量は対応する基質の転化量即ち生成物量
にモル的に等しい。反Ｚｌｌでは、ＮＡＩ）”に酸化さ
れたＮＡＤＨの１モル当たり１モルのＯＡＡがマレート
に転化される。

ある化合物の吸光度はその溶液中の濃度の測定値ニ関連
する。補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは
その還元状１１１（ＮＡＤＨ）で約６２０〜４００ｎｍ
　　（ノナメータ）の紫外（ＶＶ）光を吸収し、吸収ピ
ークは約３４　Ｄ　ｎｍである。酸化状態のニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）の吸光度はこ
れらスペクトルでは無視できる。従って、ある反応で酸
化されたＮＡＤＨＯ量は便宜上、６２０〜４００　ｎｍ
の範囲内の所定波長（３４０ｎｍ前後が好ましい）での
反応溶液の吸光度の減少を進行することによシ測定され
る。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは全ての臨床的
に重要な酵素反応に対する補酵素ではないが、主として
重要な他酵素反応（主反応）と組み合せて主反応での基
質転化即ち生成物形成を進行でき、又、その例が多い。

ここで主反応の生成物は組み合せられた即ち、補酵素Ｎ
ＡＤＨが必要とされる１副”酵素反応で基質として使わ
れる。これはかなり前からの反応Ｉに関する測定技術で
ある０例えば、Ｔｃｈｅｎ　Ｔ、　Ｔ、とＶｅｎｎｅｓ
ｌａｎｄ　Ｂとの−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　Ｃａｒｂｏ
ｎ　　Ｄｉｏｘｉｄｅ　　Ｆｌｘａｔｉｏｎｉｎｔｏ　
０ｘａｌａｃｅｔａｔｅ　ｉｎ　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ
’　。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ−，２１３，５３３
〜５４６頁（１９５５）　　：　Ｂａｎｄｕｒｓｋｉ　
Ｒ，、、Ｓ、の＠Ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ
　ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　
ｏｆＯｘａｌａｃｅｔａｔｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｈｏｓｐｈ
ｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｄ
ｉ　ｏｘｉｄｅ’　、Ｊ　、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈａｎ、　
。

Ｖｏｌ−２１７、１３７〜１５０頁（１９５５）：Ｍａ
ｒｕｙａｍａ　Ｈ，ＥａｇｔｅｒｄａｙＨ，Ｃｈａｎｇ
　Ｈ，ＬａｎｅＭ、　Ｄ、共著の″Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ　ＣａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎｏｆＰｈｏｓｐ
ｈ６ｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ”、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、２４１．２４０５〜２４１２頁（
１９６６）　：Ｓｍ１ｔｈ　Ｔ、　Ｅ、の−Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ　Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒ
ｕｖａｔｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　：Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｓｅｄｉｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎＢｅｈａｖｉｏｒ”、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈ
、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ）’ａ・５Ｖｏｒ、１２８，６１
１〜６２２頁（１９６８）：Ｃｏｏｐｅｒ　Ｔ、　Ｇ、
とＷｏｏｄ　Ｈ，Ｇ、の−ＴｈｅＣａｒｂｏｘｙｌａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔ
ｅａｎｄ　ＰＦｒｕｖａｔｅ”、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、Ｖｏｌ　。

２４６．５４８８〜５４９０頁（１９７１）を参照され
たい。

ビカーボネートは血清又は血漿中のイオンの第２に大き
いフラクションである０血清又は血漿のピカーざネート
含量の測定値は電解質分散、アニオン不足の有意な標識
である。血清や血秦のビカーボネート含量（及びｐＨ）
を知れば呼吸、代謝系の酸−塩基不均衡の医学的診断の
助けになる。

最近、反応Ｉと反応■を組み合せ比酵素学的方法により
体液中のビカーボネートを測定する努力がなされている
。例えばＷｉｌｓｏｎ　Ｗ、　Ｊｅｓｙｋ　ｐ。

Ｒａｎｄ　Ｒ，Ｂｅｖｉｌｌ　Ｒ，Ｄ、共著のＣｌ１ｎ
、　Ｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ　、　１９．６４０頁（１９７３）　：Ｍｅｎｓ
ｏｎ　Ｒ，Ｃ，。

Ｎａｒａｙａｎｓｗａｎｙ　Ｖ、　Ｂｕｓｓｉａｎ　Ｒ
，Ｗ、、　ＡｄａｍａＴ、　Ｈ，共著のＣｌ１ｎ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　２０　。

８７２頁（１９７４）；米国特許３９７４０３７号；Ｆ
ｏｒｒｅｓｔｅｒ　Ｒ，Ｌ、、　Ｗａｔａｊｉ　Ｌ、　
Ｊ、。

Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ　Ｄ、　Ａ、、　Ｐｉｅｒｒｅ　Ｋ
、　Ｊ−共著のＣｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　
２２　＊２４３〜２４５頁（１９７６）を参照されたい
。

岨み合された副反応で働く酵素は生物学的触媒である。

それらは反応で消費されたり反応生成物として現れるこ
となく反応速度を高める。一般に、それらは基質を効率
良く組織化して反応進行に必要なエネルギーを減らすこ
とにより反応を速める。

酵素は反応で形成される最終生成物の量は定めない。生
成物形成速度即ち一定期間内に形成される生成物の鎗を
定めるのみである。基質量が一定ならば酵素活性が様々
でも最終生成物量社同−だが、酵素活性上昇につれ形成
時間は短くなる。溶液中の酵素濃度は活性単位で定義さ
れる。活性単位は反応進行速度の尺度であシ、一定ｉ１
度で一定時間に消費される基質又は形成される生成物の
蓋から誘導される。

酵素触媒反応では基質製置は反応を完了させるか速度測
定法により決定できる。例えばＰｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　
ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｈａ
ｎｓＶｌｒｉｃｈ　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　Ｅｄ、、　Ｖ
ｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ。

ニューヨーク（１９７８）　、４０頁、８１頁を参照さ
れたい。反応を完了させる方法による基質量ＩｆＦ！、
、例えば、主反応に組み合された副ＮＡＩ］［（反応で
、副反応での限１吸光度の減少速度が無意義な速度に迄
減少する反応期間中の皺吸光度の合計減少値によシ測定
できる。この１最終点１で、主反応によシ　（反応粂件
下で）形成される生成物の全量は有効に生成されてお巾
、従って、生成物量に見合う基質の全てが有効に転化さ
れている。

ＮＡＤ＋に転化されるＮＡＤＨ（副反応）と生成物に転
化される基質（主反応）との間にはモル量換算で量的対
応性があるので、ＮＡＤＨ吸光度の全変化量は、主反応
で消費された基質の皺の指椋である。

血清や血漿等の体液のビカーボネート含量の臨床化学分
析では、終点決定には試薬（ＰＥＰ、　ＰＥＰＣ。

ＮＡＤＨ、ＭＤＨ含有）量と血清や血漿のサンゾル量と
の比が比較的大であることと、高吸光度を読み取れる分
光光度計が必要である。例えば、サンプルのビカーざネ
ート含量が４０ミリ当量／ｌの場合（２−の試薬を１０
μｔのサンプルと合わせる）には吸光度変化量は１．２
４吸光単位である。これら要件は多くの自動的な臨床分
析装置では許容され得ない。

血清等のサンプルの基質含量を決定するための終点測定
の代わりに、該含量は基質を生成物に転化する反応の速
度の関数として決定できる。この１速度決定依存１即ち
１動力学的”測定法は、反応速度はその反応で転化され
る基質の濃度に比例する（基質濃度が反応速度を限定す
る）との原理に基づく。この原理の基礎は、＃素反応で
は、生成物への基質の転化速度は酵素触媒反応の基本的
物理速１と酵素分子と基質分子との衝突頻度とに依存す
るということアある。衝突速度は基質分子濃度に比例す
る。基質濃度上昇につれ衝突頻度は最大に達し、反応速
度決定因子でなくなる。この基質濃度では反応を酵素学
的に進行できる速度は限定されず、酵素活性のみが生成
物分子への基質分子の転化速度を決定する。従って、サ
ンプルの基質濃度の速度決定依存測定法では、反応に参
加する他基質の全てが反応速度を制限しない濃にで存在
しなければならず、従って、基質に関する限り被験基質
の濃度のみが１速度制限”因子である。

従って、サンプル中のビカーボネート量を動力学的に測
定するための反応■の使用においてはビカーボネート量
のみが１速ｌ制限”因子となる。

ＰＥＰは、ｐＥｐｃがＰＥＰをＯＡＡにカルボキシル化
するのを触媒する速度を制限しない量で提供すべきであ
る。反応Ｉを反応■と組み合わせる場合にａ　ＮＡＤＨ
も１速度を制限しない量１で提供しなければならず、Ｍ
Ｉ）Ｈの活性単位を用いられるＰＥＰＣの活性単位より
充分に大きくして反応■の速度を反応Ｉの速度より遅く
ない速度に触媒させる必要がある。従って、ＯＡＡ形成
速度がＮＡＤ＋へのＮＡＤＨの転化速度を制限し、又、
ＯＡＡ形成速度はサンプルのビカーボネート濃度に依存
するので、−足時間間隔内でのＮＡＤＨの吸光度の減少
本位（即ち吸光度変化速度）の分光光学的測定を使いサ
ンプルのビカーボネート濃度を決定できる。

吸光度変化速度測定値を該速度での基質濃度と相関させ
るためには、吸光度変化速度が基質濃度に直接比例する
か、より複雑な形で比例することが知られていなければ
ならない。これは、同一試薬を同一条件で使い、同−一
定一間間隔で吸光度変化速度を測定し、但し基質濃度（
既知）を変えながら同一テストをくり返すことで学習さ
れる。

使用する各基質濃度に対し、濃度に対応する吸光度変化
（ｙ軸）を基質濃度（Ｘ軸）に対しプロットする。該一
定時間間隔での吸光度変化速度と基質濃度との間の関係
が、座標（０，０）から測定可能の穀大基質濃度迄実質
上直線ならば、吸光度変化速度が（同一条件、同一時間
）で得られている未知基質濃度を決定するにＦｉｌつの
既知基質濃度に対する吸光度変化速度が知られているの
みでよい。しかし、吸光度減少速度と基質濃度の間のプ
ロットされた関係が直線でないなら、測定された吸光度
変化速度に対応する未知の基質濃度を決定するために、
かかる関係により描かれた曲線に依存しなければならな
い。かくて用いられる曲線を１標準曲１ｍ＃と呼ぶ。体
液中のビカーボネート量の速度依存決定に反応Ｉ、■を
用いる将来法（米国特許３９７４０３７号発明に例示さ
れている）では標準曲線の一般化と利用が必要である。

ＮＡＤＨ吸光度変化速度とビカーボネート濃度の関係が
全てのピカーボネート濃度に対して直線ではないからで
ある。

更に、反応Ｉ、■に対する試薬を使う従来の、体液中の
ビカーボネート量の速度依存決定法では虚偽に高い結果
が得られることがある。血清は普通、内因性のピルベー
トとラクテートデヒドロデナーゼ（ＥＣ１１，１，２７
３を含む。反応■に対する試薬中に提供されているＮＡ
ＤＨの存在下でＮＡＤＨは次反応（反応■）によりＮＡ
Ｄ＋に転化される。

ピルベート十ＮＡＤＨ−ＪＤ旦→ラクテート十ＮＡＤ”
ＬＤＨ”はラクテートデヒドロデナーゼである。

体液のビカーボネート含量はＮＡＤＨ吸光度の減少の追
打により決定されるので、反応■に起因するＮＡＤＨの
転化とその結果としてのＮＡＤＨ吸光度の減少が反応■
に起因するＮＡＤＨ吸光度の減少と読み誤まれ、反応Ｉ
で実際以上に多くのαμが生成された（それ故、実際以
上に多くのビカーボネートが存在した）という虚偽の結
果が示される。この正確さに対する妨害は相当になるこ
とがある。

Ｈａｎｓｅｎ　Ｎ、　Ｑ、とＹａｓｍｉｎｅｈ　Ｗ、　
Ｇ、はＣ１ｉｎ。

Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ−２５，１１５９頁（１９７９）に
、ある感染ショック患者のピルベート濃度が１．４ミリ
モル／ｌ、’ＬＸ旧活性が３０００単位１ｔであると報
告している。

体液を反応Ｉ、■で使う緩衝剤と合わせ、ついで生成溶
液を１予備培養”して、ビカーボネートに対する分析反
応を（試薬の残り成分を加えることにより）開始する前
に反応■を完了させることにより錯誤源を除くことが可
能である。外因性■冴を加えて予備培養中のピルベート
転化速度を上昇させてもよい。Ｌｉｅｓｅ　Ｗ、　、　
Ｊｕｎｇ　Ｋ、。

Ｌｕｄｔｋｅ　Ｂ、、　Ｇｒｕｔｚｍａｎｎ　Ｋ、　Ｄ
、共著＠Ｚｅｎｔｒａｂｌ　、　Ｐｈａｒｍ、″”、　
Ｖｏｌ　、　　１１４．１０５１〜１０６４頁（１９７
５１を参照されたい。この補正的測定法では、しかし、
予備培養が必要で、予備培養終点で最初の吸光度を読み
、ついで、ビカーボネートに対する分析反応を出発させ
る成分を加える必要があるので、多くの自動分析計では
実施不能である。

虚偽に高い結果を与える第２の原因〔例えばＢｅｒｇｍ
ｅｙｅｒ　Ｈ，Ｖ、　、　５ｅｈｅｉｂｅ　Ｐ、、　Ｗ
ａｈｌｅｆｅｌｄＡ、Ｗ、共著の”’Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、’、　Ｖｏｌ、　２４　＊５８〜７３頁（１９７
８）　：Ｒｅｊ、　Ｒ，とＶａｎｄｅｒ　ｌ　１ｎｅＲ
，Ｅ、の共著＠Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、’、　Ｍｏ１．
２０　＊４５４〜４６４頁（１９７４））は、恐らくは
、次反応によるピルベートへのＯＡＡの酵素学的　（微
生物による）又は非酵素学的脱カルボキシル化である。

０ＡＡ−ピルベート＋ＣＯ□ この反応で形成されたＣ０２はビカーボネートとして反
応に貴参加しく反応Ｉ　）　、ＬＤＨ存在下でこのピル
ベートはＮＡＤＨと反応する（反応ＩＩＩ）ｏこの結果
、サンプルに元々存在したビカーがネートに由来するＯ
ＡＡ　Ｉ当量当たり２当量のＮＡＩ）ＨがＮＡＤ＋に転
化される。ＯＡＡは定常の低濃度であ択反応はす早く完
了するのでカルボキシル化の程度は無視できる。しかし
、前述の如く外因性ＬＤＨを加えると、虚偽に高い結果
の第２の原因が強まるのみである。

血清や血漿中のビカーボネートの１正常２の濃度域は約
２２〜約６２ミリ当量／ｌである。異常の、即ち、血中
の酸−塩基平衡が不均衡な条件では、ビカーボネートイ
オン濃度は１５ミリ当量／Ｌという低い値から４０ミリ
当量／Ｌという高い値に渡る。本発明の一目的は、正常
、異常の条件下での全ビカーざネート濃度の−１次関数
として体液のビカーボネートＴＩＩｋ＆を動力学的に決
定できる手段の提供である。

＠２目的は、内因性ＬＩ）Ｈが内因性ピルベートに及は
丁影響をなくすことにより、本発明の速贋依存ビカーボ
ネート奮決定法の精度を高めることである。

基質が一種である反応、即ち、只−穫の基質が速度制限
因子である場合は、反応速度は良く知られたミバエリス
−メンテ７式で記載されるＯＶは実際の反応速度；ｖｔ
ｉ最大反応速度；脂は基質に対する酵素のミノ・エリス
ーメンテン定数：〔Ｓ〕は基質濃度。

反応速度を基質濃度の一次関数とするには、基質濃Ｉｆ
（［８３）がミノ・エリスーメンテン定数０伽）Ｋ関し
て無視できるものでなければならない０ ８ｍ４ｔｈ（前掲）が報告している大腸菌からのＰＥＰ
Ｃの場合のＫｍ（基質としてのビカーボネートイオン）
はｔ７５Ｘ１０　　　モル／ｌ　である。

４０ミリ当量／ｌのビカーボネートを含む血清サングル
の場合、２．５−の試薬（反応Ｉ、■に対する）と２０
μｔのサンプルを使う　（米国特許３９７４０３７号公
報を参照されたい）と、反応混合物のビカーボネート濃
度は３．２Ｘ１０−４モル／ｌである。従って、基質濃
度が脂に関して無視できるという条件は満たされていな
い。これが、反応Ｉ、ＩＩを用いる将来の速度依存測定
法で速度結果を基質濃度と相関させる時に観察される非
直線性と、反応Ｉ、■を使いビカーボネート量を動力学
的に決定するには標準曲線が作られていなければならな
いという条件を説明している。体液中のビカーボネート
を測定するための従来の酵素学的速度依存法に包含され
る曲線的反応動力学により強いられる条件は本発明では
除去されている。

本発明により、所定量の体液と所定量の試薬との組合せ
で形成された反応混合物との関連で、（１）速度を制限
しない量のＰＥＰとＮＡＤＨ：　（ｉ＋）反３混合物の
一定時間間隔吸光度測定に適した速度で反応混合物中の
ＰＥＰとビカーボネートとからのＯＭの形成を触媒する
に充分な活性単位のＰＥＰＣ：及びＧｉＤ　ＯＡＡ形成
速度よシ遅くはない速度でＮＡＯＨとＯＡＡとからのマ
レート形成を触媒するに充分な活性単位のＭＤＨ：と組
み合せられた無機ピロホス７エー）（ＰＰｌ）からなる
試薬が提供される。

ＰＰｉ　　ＦｉＰＥＰ＆との関連で、反応混合物中に存
在する可能性のある異常高濃度のビカーボネートを、用
いるＰＥＰＣの見掛けのビカーボネートミバエリス−メ
ンテン定数との関連で無視できるものとするのに有効な
量で使う。

競合的阻止剤で影響される反応に対する既知の速度式は
次の通りである。

記号Ｖ、（Ｓ）、脂は前記定義通りであり、ＣＩ）は競
合的阻止剤の濃度であｐ、Ｋｌは酵素と阻止剤との組合
せで生ずる酵素複合体の解離定数である。この式は（１
＋　ＣＩ　）　／Ｋｉ）だけに関してミバエリス−メン
テン式とは異なっている。上記式ではｈ賠されており、
積Ｋｍ　（１＋（Ｉ　］／Ｋｉ）は用いられたＰＥＰＣ
の１見掛けのミバエリス−メンテン定数″である　（ビ
カーボネートが基質）。

本発明では、用いられる、速度を制限しない量のＰＥＰ
との関連から選択される蓋で競合的阻止剤としてＰＰ１
−’を使用することにより、　（体液サンプルを採堆し
友人における異常条件下での）最大ビカーボネート濃度
は、用いられるＰＲＰＣの見掛けのビカーざネートミバ
エリス−メンテン定数との関係では無視できるものであ
り、従って、反応速度は、体液サンプル中の全ビカーボ
ネート濃度に直線即ち正比例する。

Ｍａｒｕｙａｍａ　吟（前掲）は、ＰＥＰＣ＜ビーナツ
ツ子葉から抽出）の最適ｐＨをホスフェート緩衝剤、ト
リス（Ｃ１Ｎ緩衝剤で調べ、無機ホスフエートジアニオ
ンがＰＥＰＣに対して阻止的であると観察し、これは、
酵素結合部位に対してＰＥＰホスホリールゾアニオンと
ホスフエートジアニオンが競合するためと考え友。これ
に関連して彼等は、トリス（ＣＩ　−）緩衝剤（ｐＨ７
，８）との反応Ｉで生成されたオルトホスフエートジア
ニオンＦｉＰＥＰと明らかに競合する（生成物阻止）こ
とを記録した。

ＰＥＰ濃度上昇によりこの阻止は逆転できたからである
０従って％Ｍａｒｕｙａｍａ等は、反応Ｉ、ＩＩを用い
る時には、明らかに以後の研究者と同様に非ホスフェー
ト緩衝剤に頼った。画壇、アンモニウム塩の存在下では
リン酸アンモニウムマグネシウム沈殿物の形成により、
飽和硫酸アンモニウムに浮遊された酵素を用いる方法を
複雑にする可能性があるので、ホスフェート緩衝剤を反
応Ｉ、ＩＩで使うのは避けるべきである。

明らかに少くとも一部はこれら要因の故に四価アニオン
ＰＰ１−’は反応Ｉ、ＩＩを用いる速度依存測定でわざ
とＰＥＰＣ活性を阻止するためには使用されていない。

速度を制限しない量の円２との関連で、体液中に予想さ
れるビカーボネート基質濃度に対する曲線状から、（正
常、異常の条件下で）発生すると予想できるビカーボネ
ート製置の全てに対する直線状へ反応速度を変えるのに
有効な量よりはるかに少ない蓋で使用されている。

本発明による体液中ビカーボネートの直線的速度依存測
定法の精度を上げるためには、反応■によるラクテート
への内因性ピルベートへの転化による錯娯源は、オキサ
ミド酸の可溶性塩（オキサメート）、例えばオキサミド
酸Ｎａを、体液サンプルと共に反応混合物を形成する成
分に加えることで実質上除かれている。オキサメートは
、反応■を強力に阻止するｔ　−ＬＩ）Ｈ−ＮＡＤＨ−
オキサメート複合体を形成する。４０ミリモル／を迄の
オキサメート濃度ではＰＥＰＣにもＭＤＨにも全く影響
しない。適当には約５〜約４０ミリモル／　ｔ　ｓ好ま
しくは約１０〜約２０ミリモル／ｌのオキサメートを用
いる。オキサメートは既知のＬＤＨ阻止剤であり（Ｎｏ
ｖｏａ　Ｗ、　Ｂ、　、　Ｗｉｎｅｒ　Ａ、　Ｄ、、・
ＧｌａｉｒｅＡ、　Ｊ、、　Ｓｃｈｗｅｒｔ　Ｇ、　Ｗ
、共著のＪ、Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ−２３４，
１１４３〜１１４８頁（１９５９））、アスパレートア
ミノトランスフエラーゼ活性分析のための体液中の内因
性ざルベートの内因性ＬＤＨ触媒転化の阻止に使用され
ている（　Ｔｒｉｖｅｄｉ　Ｒ，Ｃ−、Ｓｔｒｏｎｇ　
Ｌ、　Ｊ−ｅＤｉｃｋａｔｅｉｎ　Ｒ−、Ｄｅｓａｉ　
Ｋ、共著のＣｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ。

Ｖｏｌ　　、　２３，１１７１頁　（１９７７ン　　：
　　Ｌｕｓｔｉｇ　　Ｖ。

とＲｅｄｍａｎ　Ｌ、　Ｗ、のＣ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、
、　Ｖｏｌ　　。

２４．９８９頁（１９７８）　：Ｒｅｊ、　Ｒ，のＣ１
１ｎ。

Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、２５．５５５頁（１９７９））
ｏ　　しかし、オキサメートはビカーボネート測定値の
精度を高めるためには使用されておらず、反応Ｉ５■を
使っての体液中ビカーボネートの速度依存測定法でのＰ
Ｐ　ｉ−’の存在下では特にそうである。

実際には、体液サンプル中のビカーボネートを速度依存
測定法で決定するのを可能にする次めに、サンゾル量と
、正常、異常条件でのサンプルのカカーボネート濃度を
確立し、サンプルと反応成分との組合せで得られる反応
混合物の最終容量をセットする。この容量に対し、反応
混合物中の予想される最大ビカーボネート濃度に関連し
て、反応混合物の一定時間間隔吸光度測定に適し九反応
■の速度を提供する活性単位のＰＥＰＣを用いる。反応
Ｉの速度は、反応■でのＮＡＤ＋へのＮＡＤＨの転化に
対厄する反応混合物の吸光度減少速度により＋１１Ｊ定
されるので、用いられる分光光度計のエレクトロニクス
パーツの信号ノイズ量を考慮に入れて正確な吸光度測定
を可能にするに充分だが、少くとも１セツトの一定時間
間隔のＮＡＤＨ吸光度減少測定値をマニュアル通りに、
或は、使用可能の自動配録の制限特性にそいとれる前に
反応Ｉを完了させる程に大でない活性単位のＰＥＰＣを
少くとも提供する。一定時間間隔での測定値は、通常通
り、実質上一定のｐＨ１温度で反応を行いながら、反応
Ｉの初期１遅延相１後（反応速度が上昇している時）で
ビカーギネート枯渇開始前（反応速度が減少している時
）に、即ち、反応が一定速度で進行中にとる。速度測定
のためには、一定時間間隔の期間は、使用装置の容量に
従い、間隔の始点と終点での反応混合物の吸光度測定が
便利にできる様に選択し、好ましくは、（平均化するた
め）複数セットの一定間隔測定が可能になる様に選択す
る。

反応Ｉの速度に影響するために用いられるＰＥＰＣの鏝
大活性単位は、一定時間間隔吸光度測定に用いられる５
１ｍ１に由来する制限と関連している。吸光度測定のた
めに選択される一定時間間隔の期間は、使用条件下で反
応Ｉの完了に要する時間より短くなる様に反応■の速度
をコントロールする活性単位のＰＥＰＣの利用が普通便
利である。例えば、サンプルと反応成分の組合せの約２
０分後に反応を完了させるとすれば６０〜６０秒の間隔
では短い０ 反応Ｉの速度を制限しない量のＰＥＰを用いる。

通常は、速度を制限しない鎗は酵素に対する基質（ここ
ではＰＥＰ　）の−の少くとも２０倍である。

反応■は反応Ｉよシ遅い速度で進行させてはならず、従
って、ＭＤＩは、使用するＰＥＰＣの活性単位より実質
上多い活性単位で提供する。ＭＤＨの活性単位はＰＥＰ
Ｃの活性単位の５倍とするのが適当である。速度を制限
しない量のＮＡＤＨを使用するが、この量は用いられる
分光光度計の測定可能の極限吸光度と関連がある。通常
は、２．０という光学密度が分光光度計で測定可能の限
度である。

本発明により、ＰＥＰ　１モル当た９約０．２〜約０．
８モル、好ましくは約０．４〜約０，６モル、最も好ま
しくは０．５１モルのＰＰ１　　を用いて、反応混合物
中の予想されるビカーボネート量を、用いられるＰＲＰ
Ｃの見掛けのミバエリス−メンテン定数との関係で無視
できるものとするのが適当である。

この目的に適当に用いられる可溶性ＰＰ１−’塩はシナ
トリウム　ジホスフェート　ピロホスフェート、テトラ
カリウム　ピロホスフェート、テトラナトリウム　ピロ
ホスフェート、シカルシウム　ピロホスフェートである
。

ＰＥＰＣはホウレン草の葉（Ｂａｎｄｗｕｓｋｊ　Ｒ−
Ｓ。

とＧｒｅｉｎｅｒ　Ｃ，Ｍ、のＪ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅ
ｍ、ｔ　２０４　。

７８１　（１９５３１］、小麦麦芽（Ｔｃｈｅｎ　Ｔ−
ＴとＶｅｎｎｅｓｌａｎｄ　Ｂ、のＪ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、、　２１３　ｔ５３３　（１９５５））、ビ
ーナツツの子葉（Ｍａｒｒｕｙａｍａ　Ｈ，とＬａｎｅ
　Ｍ、　Ｄ、のＢｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　６５　＊　２０７　（
１９６２）　）、ジャガイモの塊茎、エントウ、マイゼ
［ＮｏｒｒｉｓＫ、　Ａ、、　Ａｔｋｉｎｓｏｎ　Ａ、
　Ｒ，及びＳｍ１ｔｈ　Ｗ、　Ｇ。

のＣ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ−、２１、１０９３（１９７５
）　］、チオバチルス　チオオキシダンス（５ｕｚｕｋ
ｉ　Ｉ　＋とＷｅｒｋｍａｎ　Ｃ，Ｈ，のＡｒｃｈ、Ｂ
ｉｏｅｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈ７ｓ、Ａｃｔａ、９６．１６９　　（１９６
５））、大腸菌（Ｃａｎｏｖａｓ　Ｊ　、　Ｌ、とＫｏ
ｒｎｂｅｒｇ　Ｈ，Ｌ。

のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　−Ａｃｔａ　、
　９６　ｓ　１６９（１９６５））等の植物組織、微生
物に幅広く分布しており、現在はＭＤＨとＮ様に市販さ
れている。

ＭｇイオンＦｉＰＥＰＣ活性に対する補因子として良く
知られている。大腸菌からのＰＥＰＣはアセチル−補酵
素Ａで活性化されるが、小麦麦芽はアセチル−補酵素Ａ
を必要としない。反応Ｉ、ＩＩを行うに用いられるＰＥ
ＰＣとその活性度の選択、約７〜約９５の範囲内の適当
な塩基性ｐＨ２一般には２０〜５０℃の範囲内の反応温
度の選択に影響するこれら及び他の同様な因子は前記論
文及び、Ｓｍ１ｔｈＴ、Ｅ、　　の　Ａｒｃｈ、　　Ｂ
ｉｏｃｈ、　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｂｙｓ、、　　Ｖｏ
ｌ。

１２８．６１１〜６２２頁（１９６８’）　、Ｃｏｏｐ
ｅｒ　’ｒ。

Ｇ、とＷｏｏｄ　Ｈ，Ｇ、のＪ　、Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈ
ｅｍ、　、　Ｖｏｌ　。

２４６．５４８８〜５４９０頁（１９７１）等の公開文
献に教示されている。

本発明の試薬処方物は約６〜約４０ミリモル／ｌのＰＥ
Ｐ　、約０．２〜約０．６ミリモル／ｌのＮＡＤＨ。

約０．１〜約０．８　Ｕ　／−のＰＥＰＣ，約０．５〜
約４Ｕ／−のマレートデヒドロデナーゼ、約１〜約ろＯ
ミリモル／ｌのＰＰ１−’　、約０．５〜約５ミリモル
／ｌの隨イオン、約７〜９５の塩基性ｐＨを提供するに
有効なｐｋａの緩衝剤を含むと好ましい。

約５〜約４０ミリモル／ｌのオキサメートも含めると一
層好ましい。試薬ｐＨを約７〜約９５の塩基性ｐＨにコ
ントロールするに有効なｐｋａの緩衝剤はトリス　（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン；Ｎ−トリス−（ヒドロ
キシメチル−ピペラジｙ　＋　Ｎ　／　−２−エタンス
ルホン酸）：Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−
Ｎ’−３−７’ロパンスルホン酸だが、これらに限定は
されない。約５〜約１００ミリモル／ｌの緩衝剤の使用
が適当である。

体液サングル中のビカーボネートは、前述の如く反応混
合物を形成し、更に、前述した試薬を既知濃度のビカー
ボネートを含む溶液とあわせることにより第２の反応混
合物を形成することにより測定する。これら混合物の各
々の吸光度減少値は、谷混合物を実質上−足の選択＠度
、塩基性ｐＨに維持しながら、約６２０〜約４００ｎｍ
内の四−波長、同一の一定時間間隔で同一経過時間（反
応混合物形成時から記録）後に測定する。ついで、テス
ト反応混合物の測定された吸光度減少値に、分子が第２
反芯温合物形成に使用の溶液の既知ビカーボネート濃度
で分母が第２反６混合物の測定された吸光度減少値であ
る係数をかける。

塩基性ｐＨでは次の平衡によシＣＯ□がビカーボネート
に転化する。

Ｈ２０＋■２＝ヨＨ２ＣＯ荘＝Ｈ”＋Ｈα巧これは、ビ
カーボネートがＰＥＰＣの作用で反応Ｉで除かれ、平衡
がビカーボネート形成の方向へ移動する時に特にそうで
ある。大気中のＣＯ□は試薬溶液中の水と反応してビカ
ーボネートを形成する可能性があるので、体液中のビカ
ーボネートの速度依存測定法では試薬ブランクの使用が
好ましい０ 試薬ブランクの使用は、試薬と体液サンプルとを合すこ
とによシ形成されたテスト反応混合物と同−の温度、ｐ
Ｈ条件、同一時間に試薬を付すことを意味し、又、テス
ト反応混合物で吸光度の読みを取る時と同一の波長、同
一の経過時間、同一の一定時間間隔で試薬の吸光度の読
みを取ることを意味する。（ＣＯ２と試薬中の水との反
応の結果として）試薬中に存在するビカーボネートに起
因する吸光度変化量は、反応混合物、本発明の試薬をビ
カーボネート１ＩＩｆが既知の溶液と合せることで形成
される第２混合物で測定された吸光度変化量の各々から
減する。ついで、体液サンプルのビカーボネート濃度を
、テスト反応混合物の正味の測定された吸光度減少値に
、分子が該溶液の既知の一カーボネート濃度で分母が該
第２反６混合物の正味の測定された吸光度減少値である
係数を掛けることにより決定する。

“シラ／り１での読みが分光光度計の感度を有意に低下
させる程に高くならない様に溶存ＣＯ２の存在量を最小
にする注意を払うべきである。例えば、試薬成分は脱イ
オンしたてか蒸留したての水に溶かすべきである。

実施例Ｉ 緩衝剤−基質成分と酵素浮遊液成分という２成分からな
る試薬キットを処方した。緩衝剤−基質成分は次要素を
含んでいた。

（ミリモル／１） ＰＥＰ　　　　　　　　　　　　　３２ビロリン酸Ｎａ
　　　　　　１５ ＮＡＤＨＯ，５２ 酢酸Ｍｇ　　　　　　　　　　１．５ トリス−塩基（ｐＨ８，０１１０ オキサミド酸Ｎａ　　　　　　１Ｏ ＮＡ　ＤＨとＰＥＰは米国インジアナ州インゾアナポリ
スのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社から
、ビロリン酸Ｎａは米国ニューシャーシー州ヒリップス
パーグのＪ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社
から、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリ
ス−塩基）　とオキサミド酸Ｎａは米国ミズーリー州セ
ントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅａ１社から得次
。

米国カンサス州マンハッタンのＢｌｏ−Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＰｒｏｄｕｃｔｓ社から得た＃素成分は５０％飽和硫
酸アンモニウムに次要素を浮遊させてｆＷした。

ＰＥＰＣ（小麦麦芽）　　　１２．ＯＵ／ｄＭＤＨ（豚
の心臓）６０．０’ （１Ｕ／−は１μモル１−／分の基質を３７℃で転化す
るのを触媒する酵素活性である）４１．２ミリ当量／ｌ
のナトリウム　ビカーざネートを含む保存人血清サンプ
ルを系列希釈して、後述する表Ｉの“予想ビカーざネー
ト値”の欄に示したビカーざネート含量の１６の血清サ
ンプルを提供した。試薬キットの酵素浮遊液成分の１０
０μｔを１．５ｗｔの緩衝剤−基質成分に加えて実用試
薬を６７℃で３分間うす巻き攪拌して予備培養した。つ
いで、調製した血清サンプルのうちの１つの２５μ硅実
用試薬に加えて反応混合物を形成し３４０　ｎｍ、　３
７℃での反応混合物の吸光度の減少値を６分間、Ｈｅｗ
ｌ　ｅ　ｔ　ｔ　−Ｐａ　ｃｋａ　ｒｄ記録式分光光度
計でモニターした。この方法を１３サンプルの各各と、
２５ミリ当量／ｌの既知ビカーボネート含量を持つ、米
国Ｒ，１，州イーストプロピデンスのＮｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ７から得
た一ＮＥＲＬ″″ビカーボネート標準品で実施した。実
用試薬も予備培養し、その吸光度減少速度を同様に決定
した（ブランク）。３つの３０秒間隔での吸光度変化量
を平均して、１３血清サンプル、標準品、ブランクの各
々の平均の吸光度変化量を得た。

系列血清サンプルの各々のビカーボネート濃度を、次の
如く、３０秒にわたってのブランクの吸光度の平均変化
量を通常通り考慮に入れて、ビカーボネート標準品に対
する３０秒間隔での吸光度の平均変化量の直接比として
代数的に定めた。

（濃度はミＩＪ当ｆｌｋ／ｌであり、″Ａ／３０秒”は
一定時間間隔６０秒での吸光度の平均変化量を示す） ブランク、標準品、系列サンプルのΔＡ／３０秒、系列
サンプルの既知ビカーボネート含量に比較してのビカー
ボネート回収量を表ＩＫ示す。

表１ ブランク　　　　０．０２６ 血清　１　　　　０．０５１　　　２．４　　　３．０
２　　　　０．０４０　　　６．６　　　６．２３　　
　　０．０４６　　　９．４　　９．４４　　　　０．
０５１　　１１．８　　１２．６５　　　　０．０５９
　　１５．６　　１５．８６０．０６８　　１９．８　
　１９．０７　　　　０．０７４　　２２゜６　　２２
．１８　　　　０．０Ｂ２　　２６．４　　２５．３９
　　　　０．０８６　　２Ｂ、５　　２８．５１　Ｄ　
　　　　Ｏ，０９４３２，１３ｔ７１１　　　　０．１
０１　　３５．４　　３４．９０．１０６　　３７．７
　　　！１８．００．１１２　　４０．６　　４１．２ 表Ｉのデータでの系列血清サンプルの既知ビカーがネー
ト含量（Ｘ軸）に対するビカーボネート含を測定値（ｙ
軸）の回帰分析により次の直線パラメータが得られた。

傾き１．００４：切片０．０１６：相関係数０．９９９
゜非良に良好な直線性が示された０ 実施例■ 実施例■記載の動力学的方法の１日内精度をランダム順
位の１８反復試験で６つの保存人血清を使い計算した。

保存血清の平均ビカーボネート含量が１４．７ミリ当ｔ
／／−の場合、変動系数は４．０チ：２４．３ミリ当１
１に／ｌの場合、変動系数は３．８チ：３８．７ミリ当
ｔ／ｌの場合、変動系数は２．６チ；であり、非常に良
好な精度が示された０実施例■ 実施例■の動力学的方法と終点法との相関をテストした
。ソデイウム　ビカーざネート含量が既知の血清の系列
希釈で得友別セットの血清サンプルを、実施例Ｉの動力
学的方法と、終点法とでビカーボネート濃度測定テスト
に付した０終点法の場合、試薬キットは凍結体で次要素
： ＰＥＰ　　　　　　　６．４ミリモル／１ＮＡＤＨ１，
２’ 酢酸Ｍｇ　　　　　３．０１ トリス−塩［１１Ｎ（８，［ｌ）１［ＩＯ−オキサミド
酸Ｎａ　　　　　２０　　　　’（これら化合物の供給
源は実施例１で述べたと同一だった） を含む基質−緩衝剤成分と、 ＰＥＰＣ（小麦麦芽）ＩＵ／ｗｔ ＭＤＨ（豚心臓）　　５　＃ を含む酵素浮遊液とを含んでいた。

ＰＫＰＣとＭＤＨは米国インジアナ州インジアナポリス
のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｒｈｔｉｍ　　社から
得た。

終点法では０．８−の再生試薬を０．８−の酵素浮遊液
と合わせて１．６−の実用試薬を形成した０２つのかか
る実用試薬を調製し、１つは１ブランク“として使った
。各実用試薬を温度平衡が確立される迄６７℃で予備培
養し、７５μｔのサンプルを一方に加えて反応混合物を
形成した。反応混合物とブランクを６７℃で５分間維持
し、反応平衡を達成した。反応混合物とブランクとの正
味の吸光度変化を０．５３キユベツトで３４０　ｎｍで
記録した。

濃ｆはＮＡＤＨ消光系消光便数計算した。

実施例Ｉの動力学的方法と実施例Ｈの終点法で系列血清
サンプルをテストして得た比較結果を表■に示す。

表■ サンプルム　　ビカーボネート　（ミリ当量／１）動力
学的測定値　　　　終点法測定値 １　　　　４．８　　　　　　　　　５．７２　　　　
８．３　　　　　　　　　７．７３　　　　１０．２　
　　　　　　　１１８４　　　１４．２　　　　　　　
　１４．７５　　　　１６．１　　　　　　　　１７．
０６　　　１９．１　　　　　　　　２１．５７　　　
２２．９　　　　　　　　２３．３８　　　２７．２　
　　　　　　　２８．２９　　　３０．５　　　　　　
　　３１．５１０　　　３７．３　　　　　　　　３６
．２１１　　　３８．８　　　　　　　　３９．１ｙ軸
を実施例Ｉの動力学的方法で決定され友系列血清サンプ
ルのビカーボネート濃度とし、Ｘ軸を実施例■の終点法
で決定された同一サンダルのビカーボネート濃度とした
表Ｈのデータの回帰分析により直線パラメータが得られ
た。傾き１．０２；切片−１，０；相関係数０．９９７
　ｏ終点法で得られた結果に非良に良く対応することが
示された。

実施例■ 実施例■の終点法と同一の材料、方法を使い反応■の阻
止剤としてのオキサメートの有効性を決定した。まず、
実用試薬から酵素浮遊液を除き、２０００Ｕ／ｌの正常
、超正常ＬＤＨ活性を持つ血清に２ミリモル／ｌのぎル
ベートと様々な濃度のオキサメートを加えることにより
反応■を追打した（ＩＵ／ｌは１μモル／１／分のピル
ベートの６７℃での転位を触媒する酵素活性単位である
）０分光光度計のシグナルを増幅する几めサンプル量を
Ｚ５μｔから５０μｔに増し友。ＮＡＤＨの酸化を１０
分間５４０ｎｍ、５７℃で行ない、酸化されたＮＡＤＨ
の濃度を１０分にわ次る吸光度変化量から計算した。結
果は次の通りだった。

ａ、各結果は２回の反復試験の平均である。

ｂ、結果は１０個の正常血清の平均を表す。

Ｃ１このサンプルはピルベートで固定しなかった０ 表ＩＩＩ−Ａから明らかな如く、オキサメートが存在し
なければ約１ｏ〜４ｏミリモル／ｌのＮＡＤＨが酸化さ
れニオキサメートを漸増的に加えていくと酸化は対応し
て減った。１ｏ〜２ｏミリモル／ｌのオキサメート濃度
で聞活性は完全に阻止された。

次表に示される如く　（結果は３つの反復試験の平均を
表す）、様々な量のオキサメートの存在下で別の酵素分
析を行うととｋよりオキサメートはＰＥＰＣＫも矧■に
も有意な効果は及ぼさないことが決定された。

表ｍ−Ｂ オキサメート　　　　ＰＥＰＣＭＤＨ ｏ　　　　　　１００　　　　　１００５　　　　１０
２±２　　１０２±２ １０　　　　９５±１１　　　１０２±２２０　　　　
　１０！ｉ±２　　　９９±１４０　　　　９９±２　
　　９８±５ ８０　　　　８６±４　　　９２±２ 最後に、ルーチンのビカーボネート測定では通常、表ｍ
−Ａに示すデータを得るに使用したよりもはるかに小量
のサンプルを使うので、１０ミリモル／ｌのオキサメー
トを実用杯薬に配合しｆＦ−。

１ミリモル／１１２ミリモル／ｌのピルベートの添加前
後にＬＩ）Ｈ活性度が様々な血清サンプルを実施例■の
終点法で分析した。２つの反復試験の平均を表す結果は
次表通りだった。

表■−Ｃ ６００６，８７６，９７ １０７０７，１１６，３７ １５３０７、２１７，０４ ２０００７、０８７，０３ 表ＩＩＩ−Ｃの結果は多量のＬＤＨ、ピルベートが存在
してもビカーボネート濃度に変化がないことを示してい
る。本発明の速度依存測定法と本実施例で使用と同一の
終点法との相関性（実施例■）は、本発明によるビカー
ボネートの速度依存測定法の精度の向上にオキサメート
が有効であることを実証している。

それ故、本発明の体液中ビカーボネートの速度依存測定
法は用意を簡略にし、ビカーボネート濃度増加に伴なう
ＮＡＩ）Ｈ吸光度減少値の速度変化を示す標準曲線に依
存するものである。本発明により、ビカーボネート濃度
増加に伴なうＮＡＤＨ吸光度減少値の変化速度はビカー
ボネート濃度に正比例する。従って、コンピューターに
基く自動分析機の製造者はＮＡＤＨ吸光度減少値の読み
を標準曲線に関係づけるプログラムを開発する必要はな
く、分析機使用者及マニュアルテスト使用者は様々な濃
度での多数のビカーボネート標準品を使って実験し、該
標準曲線を作るためのデータを得ることから解放される
。本発明によれば単一の目盛ｐ入り標準曲線が必要のみ
である。本発明の一態様においては、体液内因性ラクテ
ートデヒドロデナーゼとピルベートに起因する虚偽に高
いビカーボネートの速度依存測定値はオキサメートの利
用により防止される。

特許出願人　　ペーリンゾヤー〇マンハイム・ダイアイ
ノステイツクス・ インコーホレーテッド 手続補正書 昭和り７年７２月６日 特許庁友官若　杉　和　夫殿 １、事件の表示 昭和や７年特許願第　／７ζ２ダ３号 ２、発明の名称 事件との関係　　特許出願人 住所 Ｑ４　　△゛−りンレマー・マンハ１ム・り“イアコ゛
′／２ティアクスイ、クーでＶ−７，１Ｆ ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 第１項 所定量の体液と所定量の試薬とを合わせて形成される反
   応混合物の容量から体液のビカーポーネート濃度を一次
   速度測定するための試薬において、速度を制限しない量
   のホスホエノールピルベートと、ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドの還元体： 該反応混合物の一定時間間隔での吸光匿測定に適した速
   度で該反応混合物中でホスホエノールピルベートとビカ
   ーボネートとからのオキゾロアセテートの形成を触媒す
   るに充分な活性単位のホスホエノールピルベートカルブ
   キシラーゼ；該オキずロアセテートの形成速度以上の速
   度での、該反応混合物中め鍍ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド還元体と該形成オキゾロアセテートとから
   のマレートの形成を触媒するに充分な活性単位のマレー
   トデヒドロデナーゼ； 該反応混合物中に存在する可能性のある異常高濃度のビ
   カーボネートを、ホスホエノールピルベートカルボキシ
   ラーゼの見掛けのピカーボネートミバエリス−メンテン
   定数との関連で無視できるものとするのに有効であり、
   該ホスホエノールピルベート量に相対した量の無機ピロ
   ホスフェート；からなる試薬。 第２項 ホスホエノールピルベートの１モル当たり約０．２〜約
   ０．８モルの無機ピロホスフェートを含む、特許請求の
   範囲第１項記載の試薬。 第６項 体液内因性ラクテートデヒドロデナーゼの存在下での体
   液内因性ピルベートのラクテートへの転化を実質上なく
   すのに有効量のオキサメートを更に含む、特許請求の範
   囲第１項記載の試薬。 第４項 反応混合物の１を当たり約５〜約４０ミリモルのオキサ
   メートを含む、特許請求の範囲第６項記載の試薬。 第５項 溶解性Ｍｇ塩を更に言む、特許請求の範囲第１．２．６
   又は４項記載の試薬。 第６項 約３〜約４０ミリモル／ｌのホスホエノールピルベート
   、約０．２〜約０．６ミリモル／ｌのニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチド還元体、約０．１〜約０．８Ｕ／
   ｗ１１のホスホノエノールピルベートカルボキシラーゼ
   、 約０．５〜約４Ｕ／−のマレートデヒドロゲナーゼ、約
   １〜約６０ミリモル／ｌの無機ピロホスフェート、 約０．５〜約５ミリモル／ｌの溶解性魔塩、７〜９５の
   範囲内の塩基性ｐＨを提供するのに有効なｐＫ門を持つ
   緩衝剤、 からなる特許請求の範囲第１又は４項記載の試薬。 第７項 体液のビカーボネー）＃［の動力学的測定法において、 所定容量の体液を所定容量の試薬と合わせて所定容量の
   テスト反応混合物を形成し、但し、該試薬は、 速度を制限しない量のホスホエノールピルベートと、ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元体； 核テスト反応混合物の一定時間間隔での吸光度測定に適
   した速度で該反応混合物中でホスホエノールピルベート
   とビカーボネートとからのオキずロアセテートの形成を
   触媒するに充分な活性単位のホスホエノールピルベート
   カルボキシラーゼ；該オキゾロアセテートの形成速度以
   上の速度での、該テスト反応混合物中の該ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド還元体と該形成オキゾロアセ
   テートとからのマレートの形成を触媒するに充分表情性
   単位のマレートデヒドロデネーゼ；該反応混合物中に存
   在する可能性のある異常高濃度のビカーボネートを、ホ
   スホエノールピルベートカルボキシラーゼの見掛けのビ
   カーざネートミバエリス−メンテン定数との関連で無視
   できるものとするのに有効であり、該ホスホエノールピ
   ルベート量に相対した量の無機ピロホス７エート；から
   なり、 約り０℃〜約５０℃の範囲内の実質上恒温、約７〜約９
   ５の範囲内の冥質上一定のｐＨに該テスト反応混合物を
   維持し、 該オキゾロアセテート形成が一定速度で生じている間に
   、−足時間間隔で約３２０　ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲
   内の波長での反応混合物の吸光度の減少を測定し、 該試薬を、ビカーボネート濃度が既知の溶液と合せるこ
   とによりテスト反応混合物と同一容量の第２の反応混合
   物を形成し、 該テスト反応混合物と同一のＰＨ，温度、時間の条件下
   に該第二反広混合物を維持し、 骸テスト反応混合物と同一の経過時間、同一の一定時間
   間隔で該第２反応混合物の吸光度の減少を測定し、 骸テスト反応混合物の吸光度の測定減少値に、分子が該
   溶液の該既知ビカーボネート濃度であり、分母が該第２
   反応混合物の吸光度の測定減少値である係数を掛ける、 ことからなる方法。 第８項 体液のビカーボネート濃度の動力学的測定法において、 所定容量の体液を所定容量の試薬と合わせて所定容量の
   テスト反応混合物を形成し、但し、該試薬は、 速度全制限しない量のホスホエノールピルベートと、ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元体； 該反応混合物の一定時間間隔での吸光度測定に適した速
   度で該反応混合物中でホスホエノールピルベートとビカ
   ーボネートとからのオキゾロアセテートの形成を触媒す
   るに充分な活性単位のホスホエノールピルベートカルボ
   キシラーゼ；該オキゾロアセテートの形成速度以上の速
   度での、該反応混合物中の該二コチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド還元体と該形成オキゾロアセテートとから
   のマレートの形成を触媒するに充分な活性単位のマレー
   トデヒドロデナーゼ； 該反応混合物中に存在する可能性のある異常高濃度のビ
   カーボネートを、ホスホエノールぎルベートカルボキシ
   ラーゼの見掛けのビカーボネートミハエリスーメ／テン
   定数との関連で無視できるものとするのに有効であり、
   該ホスホエノールピルベート量に相対した量の無機ピロ
   ホスフェート；からなり、 約り０℃〜約５０℃の範囲内の実質上恒温、約７〜約９
   ５の範囲内の実質上一定のｐＨに該テスト反応混合物を
   維持し、 該オキザロアセテート形成が一定速度で生じている間に
   、一定時間間隔で約３２０　ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲
   内の波長での反応混合物の吸光度の減少を測定し、　　
   　　□ 該試薬を、ビカーボネート濃度が既知の溶液と合せるこ
   とによシテスト反応混合物と同一容量の＠２の反応混合
   物を形成し、 骸テスト反応混合物と同一のｐＨ１温度、時間の条件下
   に該第二反応混合物を維持し、該テスト反応混合物と同
   一の一定時間間隔で該第２反応混合物の吸光度の減少を
   測定し、該テスト反応混合物と同一の温度、ｐＨ，時間
   の条件に該テスト反応混合物と同一容量の該試薬を維持
   し、 テスト反応混合物と同一の波長、同一の一定時間間隔で
   核試薬の吸光度の減少値を測定し、該テスト反応混合物
   と該第２反応混合・物の各々の吸光度の測定減少値から
   該試薬の吸光層の減少値を減じ、 該テスト反応混合物の吸光度の測定減少値に、分子が該
   溶液の該既知ビカーボネート濃度であり、分母が該第２
   反応混合物の吸光度の測定減少値である係数を掛ける、 ことからなる方法。