JPS5886457A - 過酸化水素の定量方法及びその方法を実施するための多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発−はペルオキシダーゼが触媒するか又は関与する反
応系において生成する過酸化水素を定量する方法、その
ために用いられる多層分析要素ならびにこ゛の多層分析
シートを用いる過酸化水素の定量方法に関する。

近年、臨床検査における酵素学的分析方法は急速に畳重
しつつある◎例えば、グルコース、！酸、！レスチロー
ル、コリンエステラーゼ、クレアテｙ、クレアチニン等
の生体成分ｔｌ＃Ｊ定する方法として、その酸化酵素の
作用によって生威す為過酸化水素を定量し、或いは酵素
反応ＯＡｍで生成した反応物に更に＃ｌＬ化＃Ｘｔ作用
させて生成する過酸化水素上定量することＫよｐ％砿分
析物（アナライト）ｔ一定量する方法の重要性が高まっ
ている◎ これらの過酸化水素の定量方法を大別すると、（ｌａ）
ペルオキシダーゼの酵素作用にょ９色原体ｔ−置化置の
発色体に変化せしめ、その元学的鎖＊１測定して定量す
る方法、（ｌｂ）ペルオキシダーゼの酵素作用によりｌ
櫨または２種の色原体ｔ−１！！１１！化縮合させて発
色体とし、その光学的濃度を＃ｊ足して定量する方法、
（２）アルコールの共存下に１カメラーゼを作用させて
生成したアルデヒドを発色系に導くか、又はアルデヒド
脱水系酵素ｔ−ＮＡ　Ｄの共存下に作用させて生成する
ＮＡＤＨ量ｔ？醐定して定量する方法、に分けることが
できる。

従来、（ｌａ）の方法の色原体としては％６−トリシン
、２．７−ジアミツフルオレン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ
−フェニレンジアミン、０−ジアニシジン、０−アミノ
フェノール等が用いらｔＬ、（ｌｂ）の方法の色原体と
しては、４−アミノアンチピリンとフェノール、Ｎ、Ｎ
−ジアルキルアニリンあるいはＮ、Ｎ−ジアルキルトル
イジンとの組合わせ、３−メチル−２−ペンゾテアゾリ
ノンヒドクゾ／と０−）リジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リンあるいはＮ、Ｎ−ジエチルアニリンとの組合わせ、
または、二量体を形成する４−メトキシ−１−ナフトー
ル及びその誘導体等が用いられており、これらの色原体
の単１１１１あるいは組合わせが、過酸化水素の定量用
の発色試薬として供されている〇 一方、測定対象物を酸化分解する酸化酵素は、至適ｐＨ
の領域は狭いものの、その分布範囲が広＜ｐＨ約５〜９
の範囲に散在している。この至適１１Ｈが発色反応の至
適ｐＨと一致するかあるいは少くとも近似していないと
、測定摺度や測定操作の簡便性及び迅速性４しくは経済
性が維持で自１にい。

％！ｌｌ１ｌＳ４１５８９２ＫＨ１ＪＪｅＯ如（Ｌ範に
分布する酸化酵素の至適ｐＨの全領域に対応して高−感
度を発現することができるというｅａｒ掲けて、特定の
置換基を有するアユ９ン発色剤が提案され九〇さらに特
開１ｉｆｌ１５６−２０４７１Ｋａ、％にビリルビｙや
７スコルビン歇等の液体試料に共存して色素の生成上阻
害する成分の影譬をうけな％／ｈ４１定の置換ｊ＆を有
するアニリン発色剤が提案された。これらのアニリン綽
導体は、従来使用されてＩ！た４−アミノアンチピリン
や０−）リジン等の水素供与体とフェノールあるいはＮ
、Ｎ−ジメチルアニリンとの組合せに比較すると、通用
できるｐＨ領域あるいは呈色安定性においてすぐれてい
るとされている◎しかしなｐＫら、いずれの定量方法も
いわゆる湿式分析と称されるタイプのものであり、従っ
て、液体試料上ＭＷに秤量しなければならないし、又反
応系に必要な試柴痢も同様にその一定量を厳密に秤量し
開時１１＃！Ｌなければならない・このよりなｌ！請が
いきおい分析熟練者を必要とし、測定の簡便性を損うこ
とは明らかである。現に、試薬類の敵憂な秤取という不
便を解消しようとして、特開昭５６−３９０７２及ＵＩ
ＪＳ６−４２５９９には４−アミノアンチピリンと水素
供与体とを予め縮合させて得られる生成物を発色剤とし
て使用する過酸化水素の定量方法が開示されている。こ
れらの方＆によると、特開昭５４−２５８９２や同５５
−２０４７１Ｋｆｉ求されるように、４−アミノアンチ
ピリンと置換アニリン化合物との混合比を一定の割合に
保持しなければならないという不便さは改善されている
が、なお、その他の必要な試薬の秤量という問題は残っ
ているし、液体試料の秤取にも厳密を期さなければなら
ない。

上記のような従来の湿式定量法に代わって、反応試１１
ｔ−含有させた多層分析シートを使用するいわゆる乾式
定量法が開発されている・乾式定量法においては反応試
＃に浴液の供給を必要とせず、質って、その操作には表
んら高度の熟練ｔｌＩＬ＆％ｌＡばか９でなく、液体試
料ならびに臥！［類の秤量操作を行なう必要がないので
操作時間が蝋纏されるから蔽済性にもすぐれている０本
発明肴らは公知の過酸化水素定量法における前記Ｏ問題
点を解決すべく研冗をすすめた結果％特定の置換基を有
するＮ、Ｎ−ジＩ１１換アニリンを発色剤として便用す
ると、試薬の保存安定性が改善されるばか９でなく発色
後の着色化合物もすぐれて安定で６９、極めて正−な過
絃化水嵩Ｏ定量が可能となることｔ見出した。不発明省
らは東に必ｌＩな反応試薬を含有させた多層分析シート
を使用する過酸化水素の乾式定量法を採用することによ
って反応試薬や液体試料を正確に秤量することによる時
間的、操作的ロスの問題が解消できると、そして４−ア
建ノアンテピリン系やパラフェニレンジアミン系等の水
素供与体と反応する発色剤のうち、上記特定め置換基を
有するアニリン化合物が多層分析シートに含有されるべ
き発色剤としても好適である仁とを見出し、本発明を光
成するに至ったものである。

本発明の目的はまず極めて広蛇なＩＩＨ領域において貴
れた感度及び発色後の呈色安定性を与える発色試薬を用
いる過酸化水素の定量方法會提供することにある。

本発明の目的は又広いＰＨ域にわたって１ｌｌｌｌＩＩ
ｖｈ感ｔｔ示すことができ呈色反応波にもすぐれた安定
性を有する着色化合物を与える発色試＃＆を含有してな
る過酸化水素定置用多層分析シートを提供することにあ
る。

本発明の目的はさらに試薬そのものの安定性が優れて１
Ｐｊ１、従って、保存安定性のよめ過敏化水素°定食用
多層分析シー）ｆ提供することＫある。

また、本発明の目的はそのような多層分析シート管領１
することによシ、液体試料の一５ＩＩｔＳ／−）ＪＥＫ
点着する操作と色変化の濃度測定操作との二りの基本的
な操作のみで過酸化水素の定量を可能にする乾式定量法
を提供することにある◎ 不発＠は、ペルオキシダーゼの存在下に水素供与体と一
般式 式中、凰１はＣ１〜Ｃ８の置換又は非置換のアルキル基
を表わし、Ｒ３は−ＣＯＲ’　、−８０，Ｒ’ｔ＋ｒｔ
ｃＳ〜Ｃ５の置換または非置換アルキル基會表わし、Ｒ
１は水素、Ｃ３〜Ｃ１の置換又は非置換のアルキル基又
はアルコキシ基を表わし、Ｒ４はＣ８〜Ｃ１の置換又は
非置換のアル（Ｒ’　ｌ’は水素、Ｃ１〜Ｃ１の置換又
は非置換のアルキル基又はアリール基ｆｔ１ｌわすＯ）
を表わし、Ｒ１はＣ１〜Ｃ１の置換又は非置換のアルキ
ル基又はアリール基を表わす０で表わされるアニリン化
合物とを共存させて着色化合物を生成させ、前記着色化
合物を光学的に測定することを！徴とする過阪化水素の
定量方法である。

上記の如き本発明の定量方法は乾式法のみならず従来の
湿式法にも勿論適用することができるＯ 本発明においては又、ペルオキシダーゼ作用を示す物質
、水素供与体及び上記式（１）で示されるアニリン化合
物からなる発色試薬を過酸化水素定量用多層分析景素に
含有させて過酸化水素の乾式定電を行なうこともできる
。

本尭明に使用される一般式〔１〕のアニリン化合物は、
その綜合対象物たる水素供与体との反応性が高く非常に
幅広いｐＨ領域にわたって高い感ｍｅ鎗持することがで
きる。その上、さらに重要なことは、一般式国で示され
るアニリン化合物が多層分析シーＦに含有され九場合に
、発色剤として致命的な析出を生じないという点である
・多層分析シートは乾燥工程を経て充分に乾燥されてい
るとはいうものの通常なお、１ＯＳＳ直の水分を含有し
てお塾、公知の置換アニリン化合物を多層分析シートに
適用しようとすると、それらアニリン化合物は多層分析
シート中において析出してしまい、被分析物の定量に訃
いて負誤差を与える。ところが、一般式〔υで示される
アニリン化合物にはこのような析出がみられな−のであ
る・これは、アニリン化合物が特定ｅｔａ基ｔ１＃定の
位置に有することによって、層形成時における他の成分
との混相性にすぐれ、あるいは水溶性にすぐれている仁
とＫよるものと思われる・ 一般式〔υにおいて置換基Ｒ１、Ｒｓ及びＲｌＫついて
さらに詳１１１に説明する〇 （１）　　Ｒ″＝ 包二１ Ｒ１で表わされるＣ１〜Ｃ１の非置換アルキル基として
は、メチル基、エチル基、ブービル基、ブチル基、アイ
ル基等がある００１以上のアルキル基は直鎖でも分岐し
ていてもよい（特記しない限り以下同じ）・（１）−２ ８で表わされるＣ８〜Ｃ，の置換アル キル基は、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基、ア
建ド基、カルボキシ基環で置換された直鎖又は分岐のア
ルキル基であや、例えば、２−ヒドロキシエチルＩｓ、
２−１トキシエチル基、２−エトキシエチル基、２−シ
アノエチル基、２−カルボキシエチル基、２−カルボキ
シ−１−メチルエチル基、２−シアノ−１−メチルエチ
ル基などがあけられる。

（２）　Ｂ　： （至）−１ 翼　で表わされる一〇〇Ｒ’基中のＲ４はＣ８〜Ｃ，の
非置換アルキル基てあハエチに基、ブービル基、ブチル
基又はアン＃基が代表的である。

（２）−雪 −ＣＯＲ’基中の８４は前記＠−１ｏフルキに基がアル
コキシ基（メトキシなど）、力＃ぽ中シ１等で置換萼れ
てぃてもよい。

（２）−易 ｌＬカ意味ｔ！−０−Ｒ＠基中ｏＲ’ＩｄＣ１〜Ｃ１の
置換又紘非置換アルキル基であ参、それぞれ、（１）−
１又／ｌ１（１）−２に示す翼　と同義である。

＠−４ 基はα）−１又は（１）−２に示すＲ１と同義である。

いて非置換アリール基はＣ６〜Ｃ、，０アリール基であ
り、フェニル基又はナフチル基をあけることができる。

（２）−６ 同じく８　及びＲｓにおいて上記＠＋Ｓに示すアリール
基はアルキル基（メチル、エチルなど）、ハ關ゲン原子
（塩素などン、アルコキシ基（メトキシなどンで置換さ
れていてもよく、例えば、０−メチル７エ二ル基、鳳−
り■ロフェニル基、ｐ−メト中ジフェニル基などをあげ
ることができる。

＠−７ Ｒ４が意味する一８ｏ、Ｒ″中ＯＲ１において非置換の
アルキル基は（１）−１に示す８　のそれと同義、置換
アルキル基は（１）　−２に示すＲ１のそれと同表。

儲）−８ 岡じくＲ″において非置換アリール基は（２）−１に示
すＲ又はＲのそれとＩＩ！ｊ義。

置換アリール基は＠−６に示すＲ７又はＲＩＯそれと同
義。

（３）Ｒ”： 温ニュ Ｉにおいて非置換アルキル基は（１）−１で示す翼１０
それと同義、を換アルキル基ａ（１）−ｚで示すＲ１の
それと同義・体）−８ １Ｋ＞イて非置換アルコキＶ＆１ｉＣ１〜Ｃ６Ｏアル：
ＩＩＩＦシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プ關ポ
キシ基、メトキシ基、アミルオキシ基等がある〇 上記アニリン化合物の中でも特に好ましいのは％Ｒ’が
Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基又はヒドロキシ、シアノ、カル
ボキシ、アミドあるい＃ｉｔ級アルコ中シで置換された
Ｃ１〜Ｃ，の置換フルキル基を示し、Ｂ１が−Ｃｏ−Ｒ
’（Ｒ’はＣ３〜Ｃ，０非置換アルキル基、低級アルコ
キシで置換されたＣ　　−Ｃ，の置換アルキル基：禽 −０−Ｒ’（Ｒ＠はＣ１〜Ｃ１の非置換アルキ置換Ｃ２
〜Ｃ，アルキル基又ｔｉｃ、の非置換ア亨−ル基）〕又
は−８０，Ｒ’　（Ｒ’はＣ１〜ＣＳＣ非置換アルキル
基、非置換又は低級アル′：ＩＩ？シ置換Ｃ，アリール
基）を示し、ＲはＨ１Ｃ３〜Ｃ１の非置換アルキル基又
ＦｉＣ，〜Ｃ。

の非置換アルコキシ基金示す化合物である。

一般式■で表わされるＮ−置換アニリンのうち、籍に好
ましい化合物例を第１表に示す・ｊｌｌｉｌ　　表 本発明の発色剤であるこれらアニリン系化合番は、一般
には一般式（２）で表わされる対応するアミン會原料に
して合成することが出来る０次に、代表的な化合物の合
成例につき記述するＯ 合成例１（化合物ｌの合成］ Ｎ−（２−アミノエチルツーＮ−エテル−３−メチルア
ニリン１７．８ｇ（０，１モル）を５０−のア七ト二ト
リル中に俗解した０次いで一プロピオン１１！無水物１
３ｇ（０，１モル）を室温攪拌下にて徐々に一下した。

ｍ下終了後、混合溶献ｔ１時間加熱遁流させ、反応終了
後、アセトニトリル全減圧にて追い出し、水ＩＱＱＩｌ
ｊｔ加え九。次いで、２８チナトリウムメトキシト°の
メタノ−４４１１１２０ｇ（０，１モル）ｔ″４７Ａ々
に添加し、氷冷した◎得られた結晶を水／メタノール＝
！／１（容量比）の混合−ａ媒にて再結晶すると融点７
２℃の無色針状結晶（化合物ｌ）１６ｇ（収率６８−）
が得られた。

合成例Ｓ（化合物６の合成） Ｎ−（２−アミノエチルンーＮ−エテＡ−３−メチルア
エッソ１７．８ｇ（０，１モル）ｔ−５ｏｄＯアセトニ
トリル中に＃解した◎この浴液にりＩｌ關暖酸メチルｌ
１ｇ（０，１モルノ、次いで、トリエチルアミン１０．
５ｇ（０，１（ル）を加え、３０分間加熱還流させた。

析出した結晶ＶｔＰ去した後、反応液を氷水２００ｄ中
に注入した＠析出した蘭状物買ｔ−ｒＩ′Ｐ緻エテルで
抽出し、無水硫ａＩＹグネシウムを加えて乾−した・硫
酸！グネシ９ムをＣ去し酢酸エチル【留去すると、無色
油状物質（化合物６３１３．３ｇ（収率１＄８’ｌｌ）
が得られた。

こうして得られた化合物６のＩＯ，９１１ｆｔ７０−の
エタノールに溶解し、これに８．２ｇＯシュウＩＩ！を
７９ｄのエタノールに溶解して加えた０氷冷後、析出し
た結晶をｔ’Ｂｉｔし、５ｏｄＯ冷エタノールで洗滌し
友後乾■すると、融点２０７−２０８℃（分解）の無色
結晶として化合１１６の１シ工ウ酸塩１２ｇが得られ九
Ｏ合成例３（化合″４ＩＪ７の合成） Ｎ−（２−アばノエテルノーＮ−エチルー３−メチルア
ニリｙ１７．８ｇ（０，１モル）１−５０１７のアセト
ニトリル中に溶解したＯ次いで、コハク緻無水物１２ｇ
（１，２モル）ｔ−室温攪拌下にて徐々に冷加した０縫
加料了後、混合溶液管２時間加熱還流させた。反応終了
後、アセ）＝）リルを減圧＃に締し、得られ九結晶ｔＰ
堆シ、酢酸エチルエステル−ｎ−へキサン（容量比に１
）の混合溶媒にて再結晶した。Ｍ点９５℃の無色針状結
晶（化合’１ＩＪ７）８Ｋが得られた０ Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルア
ニリン１７．８ｇ（０，１モル）１−５０１４０ア七ト
ニトリル中に溶解した０この酸１ｆＬＫ夕冒■アセトア
ンド１３ｇ（０，１ｘモル）會室温にて徐々に僑加した
後、加熱１１ｆｉｔ−２時間行つ九〇富温妨置後、得ら
れた結１をｆ”）ＩｊＬ九〇得られた結晶ｇ、ｓｇｔ水
１０１１ｊＫ溶解させ、ナＦリクムメトキシドの２８−
メタノール溶液６ｇｔ−滴下し、室温にて放置し友０得
られた結晶を水にて再結晶すると、一点９１〜９２℃の
化合物−１８のｈｇが得られたＧ本発明において用いら
れる発色剤である弐〇〕の７工リン化合物は、本発明の
多層分析ｌ！素に液体試料が点着されると、試果層に含
有されている４−アンノアンチビリ７等の水嵩供与体と
次式に従って酸化縮合し、インドフェノール型色素（Ｉ
ｔ影形成る０ （３） こうして得られる色素■全常法によや比色定量すること
により、過酸化水素のｋｔ知ることができる。

上記の呈色反応の原理は従来の洟式定を法のそれと同じ
であるが、本発明において、多層分析シー）１−用いる
場合には、従来法の如く試験管の準備、試幕溶淑の詞員
秤量、添加、＊＊な試料秤堆なとを一切必豪とせず、た
だ−調の液体試料点着操作と色変化の＃１ＩＩｉ！測定
操作とを行なうだけでよ−ことが大きく異なる点である
。そして、このような乾式定量法は上記式〔幻に示す特
定のアニリン化合物を発色剤として選択したことによっ
て始めて可能となったものである０水嵩供与体としては
４１１Ｎ昭４８−５２１５８に開示されている４−置換
アンチビリン（４−置換−２ｅ　３−ジメチル−１−フ
ェニル−３−ピラゾリン−５−オン）およびその他の公
知の４−置換アンチビリン、特開昭−５（１−１３７１
９ＨＣＩｌ示されているＮ、Ｎ−ジ置換オルト−または
バラ−７エエレンジアきンおよびその他の全知ＯＮ、Ｎ
−ジ置換オルト−またはパラ−７エエレンジアミン、特
開［１５＆−２０４７１ＫＮ示されている２−ヒドラジ
ノベンゾチアゾリンおよび七〇＠１０公知の２−ヒドラ
ジノベンゾチアゾリン、％Ｉ４昭５５−１４８１００に
開示されて−るｐ−ハロゲノフェノールおよびその他の
ｐ−ハロゲノフェノール、および前述の一般式（２）で
表わされるＮ、Ｎ−ジ置換−ｐ−フェニレンジアミンの
うちから選択して用いることができる。

４−置換アンチピリンの具体例としては４−ア建ノアン
テビリｙ　（ＣＡ　Ｓ　　Ｒ＠ｇｌｓｔｒ７Ｎｕｍｂｅ
ｒ　（８３−０７−８）ン、４−（ジメチルアミノ）ア
ンチピリン（ビラミドン（５８−１５−１３）、４−（
エテルアミノ）アンチピリン（１５１６６−１０−６３
，４−（メチルアミノコアンチピリン（ノラミドビリン
、〔５１９−９８−２）フ、４−（ナトリウムスルホナ
トメチルアミノ）アンチピリン（スルフアミピリン、［
１２９−８９−５］）、４−〔（ナトリウムスルホナト
メチル）（イソブチル）アンノコアンチピリン（ジブピ
ロン、（１０４６−１７−９））、４−〔（ナトリウム
スルホナトメチル）（メチル］アンノ〕アンプビリン（
メタムビクン、Ｃ５９０７−８８−０”Ｊ）、４−イソ
プロピルアンチピリン（プロピ７エナゾン、（４７８−
９２−５））がある０その他Ｋ１１ｌ造類似Ｏ化会物と
して４−アミノ−２，３−ジメチル−１−ｐ−トリル−
３−ピラゾリン−５−オン（４１６４３０−１０−５）
、４−アξノーｉ、ｓ−ジフェニルー２−メチル−３−
ピラゾリノ−５−オン（５！？４４−７３−７）、があ
る・その他ＫＮ　−（ジメチルアミノ）−５−７エエル
ー２−オキサゾリン−４−オン（トザνノン、（１０４
６−１７−９））も用いる仁とがで龜る。

一般式ωで表わされるＮ、Ｎ−ジ置換−ｐ−フェニレン
ジアミンにおける置換基Ｒお工びＲ６がアルキル基の場
合、ケルキル基としては炭素原子ｌｌｌ１ｌ乃至Ｓの直
鎮状または分岐状の低級アルキル基で、その具体例とし
てはメチル基、ｚｆｔｗｇ、グ四ビル、ブチル基、ベン
ｆ　ｋ　Ｊｉ、イソプロピル基、イソブチル基、イソア
ミル基、ｔ−ブチル基、ネオペンチル基がある。アルコ
キシアルキル基の場合、アルコキシアルキル基としては
炭素原子数１乃至３の低減アルコ中シ基が置換した炭素
原子数１乃至３の低級アルキル基で、その具体例として
はメトキシメチル基、２−メトキシエチル基、１−メト
キシエチル基、３−エトキシプロピル基、２−メトキシ
エチル基、エトキシプロピル基、２−エトキシエチル基
がある０ヒドロキシアルキル基の場合、ヒドロキシアル
キル基としてはヒドロキシル基が置換した縦索原子数１
乃至５０ｇ！Ｌ＠状または分較状の低級アルキル基で、
その具体例として社ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキ
シエチル基、ｌ−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシ
プロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキ
シブチル基、５−ヒドロキシペンチル基がある。シアノ
アルキル基の場合、シアノアルキル基としてはシアノ基
がＩ１１挾した畿素臘子数１乃至５の直−状または分駁
状の低級アルキル基で、その具体例としてはシアノメチ
ル基、２−シアノエチル＆、ｌ−シアノエチル基、３−
シアノプロピル基、２−シアツブ四ピル基、５−シアノ
ペンチル基がある０／″−ロゲノアルキル基ノ場合、ハ
ロゲノアルキル基としてはハロゲン原子として弗素、塩
素、臭素または沃素原子が置換した炭素原子数１乃至５
の直鎖状または分岐状Ｏ低級アルキル基で、その具体例
としてはフルオーメチル基、り四ロメテル基、ブロモメ
チルｇ、２−フルオロエチル基、１−クロはエチル基、
２−りｌｌＣｌエチル基、２−ブロモエテル基、３−ク
ロロプロピル基がある０アシルアミノフルキル基の場合
、アシルアミノアルキル基として紘アシルアンノ基とし
てアセトアミド基、プ四ビオンア叱ド基、ベンズアミド
基、トルアンド基、メタンスルホンアミド基、エタンス
ルホンア（ド基、プロパ／スルホンアミド基、ペン４１
３／スルホンアイド基、トルエンスルホンアンド基が置
換した炭素原子数ｌ乃至５の直−状または分皺状の低級
アルキル基で、その具体例としてはアセトアミドメチル
基、プＩビオンア々トメチル基、ベンズアミドエチル基
、ｐ−トルアミトメチル基、メタンスルホンアミドメチ
ル基、メタンスルホンアミドエチル基、ベンゼンスルホ
ンアミドメチル基、ｐ−）ルエンスルホンアきトメチル
基、２−アセトアミドメチル基、２−プロビオンアイド
エチル基、２−ベンズアミドエチル基、２−ｐ−）ルア
Ｚドエチル基、２−メタンスルホンアミドエチル基、２
−（エタンスルホンアミトンエテルｆｉ、２−（ベンゼ
ンスルホンアミドメチル基 −トルエンスルホンア（１’）エチルｆｉ、＄−７４）
７１ドプロビル基、３−ベンズアミドプロピル基がある
Ｏ ＲまたはＲとして好ましい置換基はアルキル基、ヒドロ
キシアルキル基、アルコキシアルキル基、アシルアミノ
アルキル基、ハロゲノアルキル基、シアノアルキル基で
あり、好ましい置換基の具体例としてメチル基、エテル
基、メトキシメチル基、２−メトキシエチル基、エトキ
シメチル基、２−エトキシエチル基；ヒト−キシメチル
基、２−ヒドロキシエチル基、ｌ−ヒドロキシエチル基
、２−ヒドロキシフ關ヒル基：アセトアミドメチル基、
２−アセドア建ドエデ＃基、メタンスルホンアミドエチ
ルメチル基、ｚ−メタンスルホンアミドエチル基；り費
−メチル基、２−クロ四エデル基；シアノメチル基、ｚ
−シアノエチル基があるＯ 一般式■で表わされるＮ、Ｎ−ジ置換−ｐ−フエエレｙ
ジアミンにおける置換基Ｒがアルキル基の場合、その具
体例は前述のＲ“また社Ｒ６がアにキに基の場合ＯＡ体
例と同じである。

８１がアルコキシ基の場合、アルコキシ基としてｒｉ員
素鳳子＠１乃至Ｓの直鎖状または分岐状の低級アに命ル
基ｔ−肩するアルコキシ基で、その具体例としてはメト
命シ基、工Ｆキシ基、プーボ命Ｖ基、イソプロホキＶ基
、ブトキシ基、インブトキシ基、べｙチルオキシ基、イ
ンアミルオキシ基がある　ＲＷがハロゲン原子の場合、
その異体例として弗素原子、塩素原子、沃素原子が６ｈ
・ Ｒ１として好まし一置換基は水素原子、アルキル基、ハ
ロゲン原子であり、アルキル基の具体例としてメチル基
、エチル基、グロビル基、ハロゲン原子の具体例として
弗素原子、塩素原子がある＠ 一般式（２）で表わされるＮ、Ｎ−ジ置換−ｐ−フェニ
レンジアミンの共体狗としては次の化合物がある。

Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−７二二レンジア電ンＮ、Ｎ−ジ
エチル−ｐ−フェニレンシア建ン二リン ペルオキシダーゼ作用をもつ物質としては、特開ｌｓｓ
・−１３７１９２に開示されている諸種の生物から抽出
されたペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダーゼ、諸種
の生物から抽出されたベルオ命Ｖ〆−（機作用を示す他
の化学物質をあけることができる。これらのうちで、ベ
ルオキシ〆−（が好ましい。

本発ｌｌＯ過酸化水嵩定量用多層分析シートは上記式ω
で示されるアニリノ化合物を発色剤とし、これと水素供
与体およびペルオキシダーゼ作用を示す物質からなる組
合せ試薬を含有する試薬層を含んでいる・ 本発−の多層分析シートは基本的には少くとも一つＯ試
薬層と液体試料展開層（以下、展開層ということがある
）と【積層一体化してなる。

必要′＆らば、筐体試料ｊＩｌ開層から遠い肯に元透過
性疎本像支持体を設けてもよいｏＫＫ層は反応試薬ｓｌ
を（ラテンの如きバインダー中に含有させて薄層にした
もので、単層として構成されているものの外に、試薬＠
を反応朧に分類して第−試薬層、第二試薬層の如く別層
にし九９、検出の対象物を捕促して検出を行なうための
検出層中生成した色素を受容する色素受容層などと呼ば
れる層を追加することができる０又展開層と試薬層との
層間に、又は複数試薬層の層間には後記する機能補助層
を設けることもできる０いずれにしても展開層は分析シ
ートの最外面に位置して液体試料が点着される面であり
、その作用は、点着された液体試料の容量とは無関係に
、単位両横あた９はソ一定容量の液体試料を試薬層に供
給する試料展延作用をするものである◎すなわち、点着
された液体試料容量はｍｅｓ層によって展延される試料
面積が比例的に拡がるので、単位−槓尚りはソ不変であ
る０仁れは、分析に際して液体試料を正確に杵堆しなく
ても定量分析が遂行できることｔ意味し、その意義は大
きい。

本発嘴の多層分析シートに用いられる展開層は、ｍ（Ｐ
紙、合成紙、不織布、ポリエチレンバルブ等］や布（天
然及び合成の臓物等、％罠千織り等Ｏ繊維質多孔性材料
やプッッシェボリマ−（−数基メンプランフィルター）
、珪藻土、微結晶材料（たとえば微結晶セルロース（Ｆ
ＭＣコーポレーシ曹ンの商標名アビセル））などの非繊
維質多孔性材料を結合剤中に分散した分散物、ガラスや
樹脂の微小球形ビーズをお互に点接着させた多孔性材料
から構成するのが好適である・ζＯ中でも繊維質多孔性
材料、特に繊物が好まし−・４１に、たて糸とよこ糸と
で織った平織が展一層の材料として好都合であり、２０
番手かｈｌＺＱ番手の範囲のえて糸及びょこ糸で構成堪
れた平織が最適である・平織物としては、細布、命中、
プ四−ド、ボブリンとよばれるｓＩｌ類Ｏ細繊物が好ま
しい。これらと同じ練り方をし禽天然繊維（★ポック、
亜麻、大麻、うｔ−１１１等）ｔたは化学線１ｍ（ビス
コ−スレー曹ン、鋼アノ令エアレー曹ン、セルレースア
セ？　−ト、七ルｏ　−、Ｘ　）　９アセテート、ビニ
ロン、ポリエチレンテレフタレート等）と柄との混紡織
物、化学線維糸を用いてこれらと同じ賊り方をした織物
も用いることができる。

これら数置は、特開昭５５−１６４３５ｇに記載の方法
に従い、界面活性剤、湿調剤、親水性ポリ１−などを用
いる親水化処理に付してもよい。親水化処理した織物で
展開層ｔ１１成すると、展開さ、れて試薬層に供給され
る液体試料の単位画横轟りの容量がどの部分において４
’ＰＩＫ約ｌＯＳの変ｍｌ＠囲内にあり、着しく定量性
ｔ＾めている。

試薬層は、液体試料中の特定成分を定量するタメのｆ：
、秦會ゼラチン、ポリビニルア）　：＝ｒ　−＃、ポリ
ビニルピロリドン、アガロース、ポリヒニルベンインス
ルホン酸ナトリウムなど公知０＠水性バインダー中に分
散包含させた組成物ｔ１ｆｉ＠からｌＱＱ＃ｓａの厚さ
に設けたものである。

友とえは、液体試料中のブドウＳを定量するための試薬
層の主要組成としては、グルコースオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、アンノアンチビリン、式〔Ｖのアニリン
化合物の４成分をゼラチンをバインダーとして用いてｌ
Ｏμ凰からｚＯμＩＩＯ厚さの層に設けることができる
◇こ０１Ｋａ層Ｏ上に液体試料展開層をラミネート接着
する・ 上記Ｏ如（構成した多層分析シートが自己支持性を有し
ない場合には、展開層がライネート畜れている個とは反
対側の試薬層の表面に水率滲透性支持体、例えば、ポリ
エチレンテレフタレート、七ルーースエステル（セルロ
ースシア七チー）％＊ルｐ−ストリアセテート、セルロ
ースア令デートグロビオネートなどン、ポリカーボネー
ト、ポリメチルメタクリレートなどのフィルム類やガラ
ス板など厚さ約５０μ諺から約２諺盲での公知の水軍−
過性透明支持体を設けることができる。

本発１１０筐体試料分析用多層分析シートは、菖１１ｇ
１に示す如く、支持体ｌの片面に存在する試薬層重に直
接ｉｌ接して、液体試料展開層３か設けられる場合と、
籐２図に示す如く、賦業層補助層４ｔ−設け、その上に
液体試料展開層３が積層される場合、第３図に示す如く
、試薬層２０上に色３ｍ蔽層または光反射層などの分析
機能補助層４を設け、さらにその上に接着層などの構造
補助層Ｓｔ−設け、その上に液体試料展開層が積層され
る場合、および凶示していな＾が、１ｉＣＩｓ層２の上
Ｋｍ着層などの栴造補助層ｓｔ設け、その上に液体試料
展開層が積層される場合が含まれるが、いずれも支持体
、試薬層、液体試料展開層の配ｌ１ｉｌ−序は変らない
０色遮蔽層４は、例えば、亦血球を含む全血の如く、液
体試料が着色粒子會含む場合に有用な層である０即ち、
色達斂層の片側にある着色粒子の色はこの層によってさ
えぎられて反対側、すなわち、光透過性支持体細からは
着色粒子の８は全く見えず、従って比色定電にｍりてｓ
ｔ已粒子が定量の妨ｔｔＬない０色遮蔽層は、二酸化チ
タン値粉末、憾酸バリウム値粉末、アルミニウム微粉末
の如き′４ｉｌＬ粉体を水梗透性の栽水性ポリマーパイ
ｙダー中に分散した層で、５μ飢からｌ　ＯＧＪｉｍ、
好ましくは５ｊ１１１１Ｌから３０＃虱の範囲の厚さが
あり、液体試料は通過しりるものである。

構造補助層として接着層を設ける場合、接着層は試薬層
、または色迩蔽層または光反射層などの分析機能補助層
と液体試料展開層との接着【強化する作用を主として来
すものである。接着層としては試薬層、または色ａ散層
または光反射層などの分析機＊！補助層のバインダーと
して用いられている嵐水性ポリマーを用いることかで亀
、この場合には接着層の親水性ポリマーが半乾會の状態
のとき、または栽水性ポリ！−を水または界面活性剤を
含む水でｆｆｌ調させておいて、筐体試料展開層【適当
な圧力をかけて接着層Ｋ１１着することができる０蚕着
層の厚さはＧ、５ｓ１ａから１ａｊａｓ好ましくはＯ，
５１ｍから５ＪｌＩＩＬの範囲である 本発＠によれば、ペルオキシダーゼ作用を示す物質の存
在下、水素供与体と反応して色素を形成すｈ発色剤とし
て式０：）Ｋ示すアユ９ン化合物ｔＳ択したことによっ
て、すぐれた発色感度および呈色安定性ｔ−備えた発色
系を多層分析シートに組みこむことが可能となったｏｉ
ｋに、該アニリン化合物はバインダーとして多層分析シ
ートに繁用されるゼ２テ／の水分によって析出を生じる
ことがなく、多層分析シートの保存安定性に重大な貢献
をしている０また、式〔υのアニリン化合物は液体試料
中に共存する色素生成１ｌｔｉ書成分（ヘモグロビン、
ビリルビン、アスコルビン置等）ＩＩＣよる影ＩＩＩＩ
ｔ受けることが少ないので、本発明の多層分析シートは
臨床検査分野において有用である。例えは、コレステ藺
−ル、リン臓買、コリンエステラーゼ、グルコース、尿
酸等會定重するに＠しては、対応するオキタダーゼ（尿
酸の場合は、クリカーゼ）を作用させて生成する過酸化
水素を、式ＬＩＪのア＝９７化合物奮発色剤とする発色
系に尋き、生成した色素の元学績度を光学的に測定する
ことによシ、コレステロール等の液体試料中における含
量を知ることができる。この場合、本祐明においては、
液体試料の一滴を多層分析シートに点着し、呈色反応の
完結をまって生成した色素ａｔの光学的測定を行なうだ
けという簡単な操作で過酸化水素を定量することができ
る〇 以下、実施例によって本発明ｔさらに評１１１ｆｉに説
明する。

実施例１ Ｏ，ＯＩＭＯｐＨ６の燐酸緩衝液１．４Ｘ１Ｇ−’Ｍの
第２表に示すアニリン化合物及び０　、７　ＸＩＯ”’
ＭＯ４−ア々ノアンテピリン會含む２．８ｄの水溶液に
４ＩＵのペルオキシダーゼ及び８ＩＵのダルツースオキ
シダーゼを添加して、グルコース分析用試薬を作襄した
。これをキエベットに入れｓ７℃の恒温槽で５分間プレ
インキエベーシ曹ｙした０次いで、本試粂系にグルコー
ス１１度ＳＯＯダ／ｄｊの水溶液會２０μ！添加し、攪
拌後更ＫＩＯ分間３７℃で反応させた。

比較の為に轡−紹６４−２５８９２及び特開１８５＆−
２０４７１に記載＋２）Ｎ、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチ
ル）−凰一トルイジン及びＮ−ｘイジン及びＴｒｉｎｄ
＠ｒ　　試薬であるフェノールについて４同様の実験を
実施した。

第２表 第２表から明らかなように、式Ｅｌ）に含有されるアニ
リン化合物を発色剤として用いた場合には、フェノール
とくらべてｌｔｔ以上もＪＩＪｆが為い。又、公知のＮ
、Ｎ−ジ置換アニリン化合物とくらべてもその１ＩｋＫ
は篇くなっている。

実施例２ （ラチ）／３．２ｇ及び水Ｐ５１１ｊより成るゼラテ）
／ＩＪＩＩ［Ｋ１１７ｊｌｐ（２ｏｏθモル）のアニリ
ン化合物（υを添加し加熱Ｓ解した０次いで、１２〇−
↓− ＊（４ル）の４−７ミノアンチビリン塩ｚ９曽０ ｉ１１塩、１１０Ｇユニツトのペルオキシダーゼ及びｌ
ＯＯダのノニルフエ二ルオキシボリグリセリンが主成分
であるサーファクタントＩＯＧ■會均−に溶解して試薬
層塗布液ｉｆ’）＃した０写真用支持体であるポリエチ
レンテレ７タレー）ＣＰＥＴ）透明フィルム上に、等電
量のゼラチン及びポリスチレン−４−スルホン酸カリウ
ム塩を含む水溶液を乾燥後の厚さが１０ｓ１１になる様
に塗布、乾燥して染料固定層を設けた。

次いで、この染料固定層上に前記試薬層塗布液を乾燥厚
が１５μ翼になる様に塗布し部課した。

ここで得られ九重層皇布フィルム上に７ジミクロフイル
タ−ＦＭ６００■（富士写真フィルム（株）＃ｌ）のメ
ンブラシフィルターｅｍ式圧着してグルコース多層分析
景嵩を製造した。

この過酸化水素分析用多層分析フィルムに１０””Ｍ濃
度の過酸化水素水溶液８μ！を点着し、５分後の発色１
１１度を透明支持体フィルム側より反射細光したところ
２．５４の櫨を与えた。

実施？１３ 試県層ｌｌ！布液組成： カプラー　　　　　　　　　　　　□モルｚｏｏ。

４−７ミノアンテピリン塩歇塩　　　　　　　　１２〇
Ｍｇインブチルガレー）　　　　　　　　　　６０８ｇ
ペルオキシダーゼ　　　　　　　１１００社ットグルコ
ースオキシダーゼ　　　　１５００−ットサー７アクタ
ントＩＯＧ”　　　　　　ＺＯＯ■ゼラチン　　　　　
　　　　　　　　３°２ｇ水　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＩＳｍＳｍアニリン物としては、化
合物（１）及び化合物＠を選択した。

実ｍ？ｌ１２と同様に写真用透明フィルム上に染料固定
層をまずｊ＠■し、次いで、上記試榮層を１５声翼の乾
ＩＩＲ厚に慮布した０史に、メンブランフィルタ−ｔ″
１式圧盾してこれｔ展開層として設け、グルー−ス分析
用多層分析要素（Ｉ）（化合物（１））及び（Ｉ）（化
合物＠］ｔ−作成した。比較のため、脣開昭５５−２０
４７１に記載ＯＮ、Ｎ−ビス（Ｉ−ヒト胃キシエチル）
−ｌ−トルイジンを用−５同様にしてグルコース分析用
多層分析要素０１Ｏｔ作襄した。

こむで展進したグルコース分析用多層分析要素Ｋ１１）
μＩの検体を点着し、２５℃で５分恢の反射員度を測定
したところ、第３表に示すようにグルー−黒濃度に比例
した菫の染料を形成していえ。

奉　反射＃ｆ：４１００ｎｍで測定 次いで、各多層分？ｒ景索ｔ１カ月間４５℃に保存した
０この試料をグルコース嵌置５０偽〆ｄｊの検体を用い
て上記の方法で発色させフレツシエ時との揃定象嵐の比
（ＯＤ１＊　　−→を発色ＯＤフレッシュ 率として求めた。

結果を第４表に示す０ 壓　４　表 ａｇ４表より本発明の発色剤を用いた場合、従来のカプ
ラーと比軟して、抹仔女定性が看しく改良されることか
判る０

【図面の簡単な説明】

３＠を図から第３凶はともに本発明の液体試料分析用多
膚分併シートの俣型凶である０図において、叙事および
アルファベットは下記のとおりの意味【もつ０ １　光避遥性疎水性末持体　Ａ　　ＩＨ１０４を付着す
る方向４　分析機能補助層　　Ｄ　観察する方向５　構
造補層 以　　上 一３１′ 第１図 第２図 第３図 手続輛正薔（自発） Ｌ６和５７′年７月ｚ１日 １％許庁長官　　島　１）蕃　慟　殿 １、事件の表示 ｍａ５６年行許願第１８５８５０号 ２、発明の名称 過酸化水素の定量方法及びその方法を実施するための多
層分析要素 ３、補正をする省 事件との関係二荷許出紐人 住所　　神栄用県肩足悄市中沼２１ｏ４ｉ庵名ｑＸ（５
２０）　　冨士写真フィルム株式会社代衣者　　大　　
西　　　　　賞 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　　　　　　自　発６、補正の対
象 鴫柚裔の狩許副釆の範囲の一及ルイ！へ詐祠な説明の― （２）明細書１３頁１２行の式〔１）７）ＪＲ’Ｊを［
ＲＩ　Ｊと訂正する。 （３）同１９頁１８行の「−Ｃｏ　−Ｒ’　Ｊｋｒ　−
ＣＯ−Ｒ’Ｊと１正する。 （４）同２２頁４行の式（２）の下にｒ　Ｒｌ　、　Ｒ
３の定義は一般式〔υと同じ。」ン押入する。 （５）同２６頁２行の式〔印を削除し、次の式を押入す
る。 ４ （３） （６）同２７頁８行から１１行全８１１眩し「水素υ１
〈与体としては、４−アミノアンチピリン（４−アミノ
−２，３−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−
５−オニ／；　ＣＡＳ　ＲｅｇｉｓｔｒｙＮｕｍｂｅｒ
　（８３−０７−８：］　）およびその類似体、例えば
、４−アミノ−２，３−ジメチル−１−Ｐ−）ジル−３
−ビラリゾリン−５−オン（５６４３０−１０−５）、
４−アミノ−１，３−ジフェニル−２−メチル−３−ピ
ラゾリ／−５−オン（５２７４４−７３−７）が承けら
れる。その他の公知の」を挿入する。 （７）同２８頁１〜２行の「前述の一収式１″２ＪＪを
「一般式〔軸」と訂正する。同頁４行のあとに、次一般
式０において、Ｒ５およヒＲ６′はそれぞれアルキル基
または直侠アルキル基（置換基の列：アルコキシ藤、ヒ
ドロキシ壓、シアン基、ハロゲン原子、アシルアミノ基
）も表わし、互いに同じでも異なってもよい。Ｒ”は水
素原子、アルキル基、アルコキシ基またはハロゲン原子
を表わす。」０同頁５行〜２９頁１０行の「・１−置換
アンチピリン・・・・とができる。」全削除する。 （８）同２９頁１１行、３３頁５行及び３４頁３行の「
一般式（２）」ヲ「一般式（４）」゛と訂正する。 （９）同２９頁１２．１３行、３２頁１１行、３３頁６
．７．８．９．１５．１８行の「Ｒ５」、「Ｒ６」、Ｉ
Ｒ’　Ｊを「Ｒ５」、［ｌ七６′」、［Ｒ７Ｊとそれぞ
れ訂正する。 特許請求の範囲 （１）ペルオキシダーゼ作用を示す物質の存在下に水素
供与体と発色剤としての一般式〔υで表わされるアニリ
ン化合物とを共存させて眉色化合物を生成させ、前記着
色化合物を光学的に測定することヲ時徴とする過酸化水
素の定量方法。 一５Ｏ３Ｒ５またはＣ１へ−Ｃ６の置換または非置換ア
リール基金表わし、Ｒ３は水系、Ｃ８〜Ｃ１の置換又は
非置換のアルキル基又はアルコキシ基を表わし、Ｒ４は
Ｃ２〜Ｃ５の置換又は非置換のアルキル基、−０−Ｒ’
（Ｒ６はＣ１〜Ｃ６の置換又は非置換のアルキル元素、
Ｃ１〜Ｃ６の置換又は非置換のアルキル基又はアリール
基を表わす。）を表わし、Ｒ５、はＣ８〜Ｃ６の置換又
は非置換のアルキル基又は了り−ル基を表わす。 （２）前記式〇〕で示されるアニリン化合物のうち、Ｒ
がＣ１〜Ｃ３のアルキル基又はヒドロキシ、シアン、カ
ルボキシ、アミドあるいは低級アルコキシで置換された
Ｃ１〜Ｃ５の置換アルキル基を示し、Ｒ２が−Ｃ立−Ｒ
’　［’は０２〜Ｃ６の非置換アルキル基、低級アルコ
キシで置換されたＣ２〜Ｃ５の置換アルキル基；−ＯＲ
’（Ｒ’は０１〜Ｃ５の非１１侯及びＲはＣ１〜Ｃ６の
非置換アルキル基、ヒドロキシｔｍｃ、〜Ｃ，アルキル
基又ぼ。 の非置換アリール基〕〕又は−８ｏ２Ｒ’　（Ｒ５はＣ
１〜Ｃ５の非置換アルキル基、非置換又は低級アルコキ
シ置換Ｃ６アリール基）を示し、Ｒ３はＨ，Ｃ，〜Ｃ５
の非置換アルキル基又はＣ１〜Ｃ６の非置換アルコキシ
基を示すアニリン化合物ｋｍｌ記発色剤として使用する
ことを特徴とする請求 過酸化水素の家電方法。 （３）　　液体試料展開層および試薬層からなる過酸化
水累定意用多層分析要累において、試薬層／　　　　　
　がペルオキシダーゼ作用を示す物質、水素供与体およ
び発色剤として式（１）で示されるアニリン化合物から
なる試薬を含有することを特徴とする多着分析要素。 Ｒ　’　　ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ” ＼／ 一ＳＯ□Ｒ６またはＣ１〜Ｃ６の置換または非置換アル
キル基を表わし、Ｒ３は水系、Ｃ１〜Ｃ，の置換又は非
置臭のアルキル基又はアルコキシ基を表わし、Ｒ４は０
２〜Ｃ５の置換又は非置換のアルキル基、−０−Ｒ’（
Ｒ６はＣ８〜Ｃ，の置換又は非置換のアルキは水素、Ｃ
□〜Ｃ，の１侠又は非置換のアルキル基又はアリール基
を表わｔ。）を表わし、Ｒ５はＣ，〜Ｃ５の置換又は非
ｔＩＩｔ換のアルキル基又はアリール基を表わす。 （４）液体試料展開層および試薬層からなる過鈑化水素
定量用多層分析要素に液体試料を照看して酸化縮合反応
１に進行させ、次いで、生成した色素を測定する過酸化
水系の定量方法ＶＣおいて、試薬層がベルオキシダーゼ
作用ヲホす物質、水素供与体および発色Ｍｌとして式１
、１１で示されるアニリン化合物からなる試薬を含有す
ることを特徴とする過酸化水素の定量方法。 式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ５の置換又は非置換のアルキルＩ
Ｅ、を表わし、Ｒ２は−ＣＯＲ’。 −８Ｏ２Ｒ５またはＣ１〜Ｃ５の置換または非ｆ撲アル
キル丞を表わし、Ｒ３は水素、Ｃ□〜Ｃ６の置換又は非
置換のアルキル基又はアルコキシ基を表わし、Ｒ４はＣ
−Ｃ。 の置換又は非置換のアルキル＆、−０−Ｒ’＜　Ｒ６は
Ｃ□〜Ｃ５の置換又は非置換のアルは水素、Ｃ１〜Ｃ５
の置換又は非置換のアルキル基又はアリール基を表わす
。）を表わし、Ｒ５はＣ１〜Ｃ６の置換又は非置換のア
ルキル基又は了り−ル基ヲ表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ペルオキシダーゼ作用を示す物質の存在下に
   水素供与体と発色剤としての一般式〔υで表わされるア
   ニリン化合物とを共存させて膚色化合物を生成させ、前
   記着色化合物ｔ−元学的に測定することを特徴とする過
   酸化水素の定量方法◎ Ｒ、、ＣＨ，Ｃ１（、ＮＨＲ” −８０，Ｒまたは０１〜Ｃ５の置換または非置換アルキ
   ル基を表わし、Ｒ１は水素、−Ｃ１〜Ｃ１の置換又は非
   置換のアルキル基又はアルコキシ基を嶽わし、Ｒ４はＣ
   ３〜Ｃ１の置換又は非置換のアルキル基、−０−Ｒ（Ｒ
   Ｆｉ、Ｃ＊　−Ｃｓの置換又は非置換のアルキル基素、
   Ｃ１〜Ｃ，の置換又は非置換のアルキル基又はアリール
   基を表わす。）ｋ表わし、Ｒ“は０１〜Ｃ１の置換又は
   非置換のアルキル基又はアリール基を表わすＯ 伐）　前記式〔υで示されるアニリン化合物のうち、Ｒ
   がＣ１〜Ｃ１のアルキル基又はヒドロ中シ、シアノ、カ
   ルボキシ、ア建ドあるいは低級アルコキシで置換された
   Ｃ１〜Ｃ，の置換アルキル基を示し、Ｒ８が−Ｃｏ−Ｒ
   ’（Ｒ’ｒｉＣ，〜Ｃ１の非１１％アルキル基、低級ア
   ルコキシで置換されたＣ８〜Ｃ１の置換アルキル基；−
   ＯＲ’（Ｒ＠はＣ１−Ｃ，の非置換及びＲｔｉＣ，〜Ｃ
   ，の非置換アルキル基、ヒトＷｄＦシ置換Ｃ８〜Ｃ，ア
   ルキル基又ぼ。 の非置換アリール基）〕又は−８ｏ、Ｒ’（ｍｌはＣ３
   〜Ｃ１の非置換アルキル基、非置換又は低級アルコキシ
   置換Ｃ，アリール基）を示し、Ｒ３はＨ，Ｃ，〜Ｃ１の
   非置換アルキル基又はＣ３〜Ｃ１の非置換アルコキシ基
   を示す７！リン化合物ｔ−前記発色剤として使用するこ
   と【特徴とする特許請求の範囲（１）の過ｌＩ化本素の
   定量方法。　。 （３）液体試料展開層および試薬層からなる過欽化水素
   定量用多層分析資累において、試薬層がペルオキシダー
   ゼ作用を示す物質、水素供与体および発色剤として式〔
   １〕で示されるアニリン化合物からなる試薬を含有する
   ことを特徴とすゐ多層分析要素・ 一８Ｏ□Ｒまたは０１〜Ｃ１の置換または非置換アルキ
   ル基を表わし％Ｒ”は水素、Ｃ１〜Ｃ１の置換又は非置
   換のアルキル基又はアルコキシ基を表わし、Ｒ４はＣ８
   〜Ｃ，の置換又は非置換のアルキル＆、−０−Ｒ（Ｒは
   Ｃ４〜Ｃ１のｌｌｃ換又は非置換のアル中は水素、Ｃ０
   〜Ｃ１のｔｉｌｌ換又は非置換のアルキル基又はアリー
   ル基を表わす。）を表わし、ＲｔｉＣ１〜Ｃ１のｔ候又
   は非置換のアルキル基又はアリール基を表わす〇 （４）筺体試料ｍ開層および試薬層からなる過酸化水素
   定量用多層分析要素に液体試料を点着して酸化−合反応
   を進行させ、次いで、生成した色＊　ｔ　ｍ定する過酸
   化水素の定量方法において、試薬層がペルオキシダーゼ
   作用を示す物質、水素供与体および発色剤として弐〇〕
   で示堪れるアニリン化合物からなる試薬（含有する仁と
   ｔ−特徴とする過酸化水素の定量方法Ｏ Ｂ　”　　　ＣＭ、Ｃ）ｌ、ＮＨＲ” ＼　／ 式中、ＲはＣ８〜Ｃ１の置換又は非を懺のアルキル基を
   嵌わし％Ｒ”は−ＣＯＲ’　。 −８０，ＲまたはＣ３〜Ｃ１のｉｔ供または非置換アル
   キル基ｔｌ！わし　Ｒ１は水素、Ｃ８〜Ｃ１の置換又は
   非置換のアルキル基又はアルコキシ基を表わし、ＲはＣ
   ８〜Ｃ１の置換又は非置換のアルキル基、−０−Ｒ’（
   Ｒ’紘Ｃ１〜Ｃ１の置換又は非Ｉｌ供のアルは水素％Ｃ
   ，〜Ｃ１の置換又は非置換のアルキル基又はアリール基
   を表わす。）を表わし、Ｒ１はＣ４〜Ｃ，のｗ侠又は非
   置換のアルキル基又はアリール基を表わす０