JPS63255659A - 呈色試薬及びそれを含む多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、イミダゾール誘導体からなる呈色試薬及びこ
れを含む多層分析要素に関するものである。さらに詳し
くは、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼなど酸化
作用を有する物質が触媒として働き、呈色する新規な発
色体、及びこれを含む過酸化水素または過酸化水素を生
成しうるアナライト（被検体）の定量分析またはベルオ
ギシダーゼ活性′の定量分析に適した多層分析要素に関
するものである。

〔従来の技術〕

生成成分、血液、尿等の体液中に含まれる被検成分（ア
ナライト）を測定することは疾患の診断、病態の解明、
治療経過の判定を行なう上で役立っていることは周知の
通りである。これらの中で体液中のアナライトとしてコ
レステロール、グルコース、乳酸、トリグリセリド、原
産、タレアチニン、遊離脂肪酸などを測定する方法とし
て過酸化水素生成能を有するオキシダーゼ酵素を作用さ
せて、過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ
及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色させ
て色素に導き、この色素量に対応する光学濃度を測定し
て比色法の原理でアナライトａを求める方法が多用され
ている。

過酸化水素の定量方法としては、例えば、４−アミノア
ンチピリンと、ソエノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換
アニリン系化合物とを組合せた呈色試薬組成物、３−メ
チルベンゾチアプリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアユ
“リン系化合物との組合せ呈色試薬組成物、２，７−ジ
アミツフルオレン、０−トリジン誘導体、Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−ｐ−フェニレンジアミン、０−ジアニシジン、〇
−アミノフェノール等を用いる方法が周知である。

しかしながら、これら従来から用いられている呈色試薬
は、１モルの発色体（色素）を形成するために２モルの
過酸化水素を必要とするため相対的に感度が低いので微
量成分の定量にとって不利な呈色試薬であった。又、４
−アミノアンチピリジンとの組合せ呈色試薬組成物を除
いて、いずれも発色体（色素）の安定性が低い等の問題
点を有する。

一方、１モルの発色体（色素）が１モルの過酸化水素で
形成される、高感度の過酸化水素試薬で、比較的発色体
（色素）の安定性が良く、又呈色波長が比較的長波長側
にある染料前駆体（ロイコ色素）のドリアリールイミダ
ゾール誘導体が提案されている。（特公昭５７−５５１
９、特公昭５７−２６１１８、特開昭５８−４５５５７
、特開昭６１、−２２９８６８、米国特許第３，２９７
，７１０号等）。またジアリールイミダゾールロイコ色
素（特開昭５９−１９３３５２）、ジアリールインドリ
ルイミダゾールロイコ色素（特開昭６ｌ−４９６０）も
提案されている。

しかしながら、これら既存のトリアリールイミダゾール
誘導体の分子吸光係数（ε値）は約５万であって、血液
や尿などの生体試料中の微量成分の定量にとって充分満
足のいくものである。＝　ｔ′、Ｊ：言−えない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は一ヒ記した従来技術の諸問題点を解決し
、ペルオキシダーゼの触媒作用または関与の下に１モル
の過酸化水素で１モルの色素を形成しろる高感度の、す
なわち、分子吸光係数約６万以上の呈色試薬、呈色試薬
組成物、およびその試薬又は試薬組成物を含む多層分析
要素を提供することである。

本発明は、 （１）一般式〔１〕で表されるイミダゾール誘導体から
なる呈色試薬、 （２）一般式〔１〕で表されるイミダゾール誘導体、ペ
ルオキシダーゼ及び過酸化水素を生成しうるオキシダー
ゼ酵素を含む呈色試薬組成物、ならびに （３）光透過性水不透過性支持体の上に親水性ポリマー
バインダを含む層及び多孔性層がこの順に積層一体化さ
れてなる多層分析要素ムこおいて、前記親水性ポリマー
パンイダを含む層又は前記多孔性層に一般式〔１〕で表
されるイミダゾール誘導体を含む呈色試薬組成物が含有
されている多層分析要素であるである。

一般式〔１〕において、 Ｒ’　はアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニ
ド０基、シアン基、−８０３１ｆ基又は−５Ｏ３１１Ｉ
’基、−ＣＱＯＩ（基又は−Ｃ００Ｍ２基、置換フェニ
ル基又は置換ナフチル基を表す。「および「はそれぞれ
アルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンを表す。置
換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基としてはアル
キル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シア
ン基、アルキルアミノ基又は（ジアルキルアミン）基の
いずれかで、置換基の数は１個又は２個で、置換基は互
いに同じでも異なっていてもよい。

Ｒ２及びＲ３はそれぞれフェニル基、ナフチル基、置換
フェニル基又は置換ナフチル基を表す。置換フェニル基
又は置換ナフチル基の置換基としてはアルキル基、アル
コキシ基、アルキルアミノ基、（ジアルキルアミノ）基
、（アルコキシアルキル）アミノ基又は〔ジ（アルコキ
シアルキル）〕アミノ基のいずれかで、置換基の数は１
個ないし３個で、置換基は互いに同じでも異なっていて
もよい。

あるいはＲ２とＲ３は相互に連結してイミダゾール環の
２個の炭素原子を含めて縮合６員環構造部分を形成して
もよい。

Ｒ４はフェニル基、ナフチル基、！換フェニル基又は置
換ナフチル基を表す。置換フェニル基又は置換ナフチル
基の置換基としてはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲ
ン原子、ニトロ基、シアノ基、−３０３Ｈ基又は−３Ｏ
ｆｆＭ’基、−ＣＱＯＩ基又は−Ｃ００Ｍ２基（Ｍ’お
よびＭ２はそれぞれアルカリ金属イオン又はアンモニウ
ムイオンを表す）のいずれかで、置換基の数は１個又は
２個で、置換基は互いに同じでも異なっていてもよい。

Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。

〔発明の構成の詳細な説明〕

一般式〔１〕で表わされるイミダゾール誘導体（２−ピ
ラゾロニル−４，５−ジアリールイミダゾール誘導体ロ
イコ色素）において、Ｒ１で表わされる、アルキル基と
してはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘ
キシル基、オクチル基、デシル基等の炭素原子数１ない
し約１０の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる
。アルキル基には、さらに置換基として、ハロゲン原子
（塩素、臭素等）シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基又
はスルホン酸基等が結合していてもよい。アルコキシ基
とし′ては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、
ブトキシ基、ベルチルオキシ基等の炭素原子数１ないし
約１０の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基が挙げられる
。置換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基としては
、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、
ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基等の炭
素原子数１ないし約１０の直鎖状又は分岐状のアルキル
基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ
基等の炭素原子数１ないし約１０の直鎖状又は分岐状の
アルコキシ基、塩素、臭素、弗素、沃素等のハロゲン原
子、ニトロ基、シアノ基、−５Ｏ，Ｈ基又はＳ０３「基
（Ｍ＋はナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ
金属イオン又はアンモニウムイオンを表わす）　、−Ｃ
ＯＯＨ基又は−Ｃ００Ｍ２基（Ｍ２はナトリウム、カリ
ウム、リチウム等のアルカリ金属イオン又はアンモニウ
ムイオンを表わす）等が挙げられる。置換基の数は１個
又は２個で、２個の置換基を有する場合には、置換基は
互いに同じでも異なってもよい。

Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ、イミダゾール環に結合している
位置からみて１．２−位又は１．４−位（置換フェニル
基の場合、オルト位又はパラ位）の少くなくとも一方に
置換基を有するフェニル基又はナフチル基を表わす。置
換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基としては、炭
素原子数１ないし約５の直鎖状又は分岐状のアルキル基
（例、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）、
炭素原子数１ないし約５の直鎖状又は分岐状のアルコキ
シ基（例、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基）、炭素原子数１ないし約１０の直鎖状又は分
岐状のアルキル基を１個又は２個有するアルキルアミノ
基（例、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルア
ミノ基）又はジアルキルアミノ基、（例、ジメチルアミ
ノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基）、全炭
素原子数２ないし約１０の直鎖状又は分岐状のアルコキ
シアルキル基を１個又は２個有する（アルコキシアルキ
ルアミノ）基（例、メトキシメチルアミノ基、メトキシ
エチルアミノ基）又は〔ジ（アルコキシアルキル）〕ア
ミノ基（例、〔ジ（メトキシメチル）〕アミノ基、〔ジ
（メトキシエチル）〕アミノ基）があげられる。置換基
の数は１個ないし３個で、２個又は３個の置換基がある
場合には、置換基は互いに同じでも異なってもよい。

Ｒ４が置換フェニル基又は置換ナフチル基の場合、置換
基としては、炭素原子数１ないし約１０の直鎖状又は分
岐状のアルキル基（例、メチル基、エチル’ｌ＝、プロ
ピル基、ブチル基、ペンチル基、イソプロピル基）、炭
素原子数１ないし約５の直鎖状又は分岐状のアルコキシ
基（例、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブト
キシ基）、ハロゲン原子（例、塩素原子、臭素原子、沃
素原子、弗素原子）、ニトロ基、シアノ基、−３Ｏ３Ｈ
基又はＳＯ３Ｍ’基、−ＣＯＯＨ基又は−３０３Ｍ２基
（「およびＭ２はそれぞれ、ナトリウム、カリウム、リ
チウム等のアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオン
を表わす）等があげられる。置換基の数は１個ないし３
個で、２個又は３個の置換基がある場合には、置換は互
いに同じでも異なってもよい。

以下に一般式（１〕で表わされるインミダゾール誘導体
の好ましい具体例を示す。本発明に用いられる化合物は
これらの化合物だけに限定されるものではないことはい
うまでもない。以下の化学構造式において、Ｍｅはメチ
ル基、Ｅｔはエチル基を表わす。

Ｎ門ｅ２ Ｍｅ Ｍｅ Ｕ３ｔｌ Ｎドｅ２ 　Ｏｘ 一般式［１］で表わされるイミダゾール誘導体は、米国
特許第３，２９７，７１０号に記載されている方法に従
って合成することができる。次に一般式〔１〕で表わさ
れる化合物の合成例を示すが具体的に示されていない化
合物も以下の合成例に準して容易に合成することができ
る。

〔合成例１〕５−メトキシー３−メチル−１−フェニル
−２−ピラゾール−４−カル ボアルデヒドの合成 ３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
１７．４ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬ
に？容かし、２０分かけてＰＯＣｌ、　４５゜９ｇを加
え、４時間加熱還流して反応させた。冷却後氷水に注ぎ
、塩化メチレンで生成物を抽出した。飽和食塩水で洗浄
後、硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を減圧留去した。シ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液塩化メチレ
ン）で黒色部分を除き、粗結晶の５−クロロ−３−メチ
ル−１−フェニル−２−ピラゾール−４−カルボアルデ
ヒド４．５３ｇを得た。これをメタノール５０ｍＬに溶
かし炭酸ナトリウム５．６８ｇを加え、２時間加熱還流
した。メタノールを約半量に減圧留去し、水を加え、塩
化メチレンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグ
ネシウムで乾燥し溶媒を減圧留去し油状の目的化合物３
．５３ｇを得た。

［合成例２］２−（３−メチル−１−フェニル−５−オ
キソ−２−ビラプリン−４− イル）−４，５−ビス〔４−（ジメ チルアミノ）フェニルシイミダゾー ル（化合物１）の合成 ■、２−ビス〔４−（ジメチルアミノ）フェニル〕エタ
ンー１，２−ジオン４．４６ｇと合成例１で得た５−メ
トキシ−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾール−
４−カルボアルデヒド３゜２６ｇ、酢酸アンモニウム１
６．５ｇを酢酸９０ｍＬ中で２時間加熱還流して反応さ
せた。冷却後水１２０ｍρを加え氷冷下アンモニウム水
で中和したところ結晶が析出した。析出した結晶を濾取
、水洗、乾燥後、エタノールで再結晶して白色の目的化
合物１．２ｇを得た。融点１６３°Ｃ酸化呈色時のλｍ
ａｘ　６８０ｎｍ（ε６９０００）本発明の過酸化水素
分析用試薬と過酸化水素との反応（呈色反応）は例えば
〔２〕式により表わされる。

反応〔２〕により色素（色素Ａ）が化学量論的に生成す
るので、生成した色素の吸光度測定または反射分光光度
測定を実施することによりあらかじめ作成した検量線に
もとづいて過酸化水素の定量を行うことができる。

本発明の分析方法は、例えば次のように実施することが
できる。被検試料に一般式〔１〕で表わされるイミダゾ
ール誘導体、および反応触媒としてのペルオキシダーゼ
を前記の形で同時に、または適宜の順序で添加し、混合
物を５°Ｃから４０°Ｃ１好ましくは２０°Ｃから４０
°Ｃの範囲の温度およびｐＨ３，０から９．０、好まし
くはｐｌ＋４．５から８゜０の範囲において１分から６
０分の時間範囲において反応を進行させ、生成した色素
を含有する反応混合物の吸光度を測定する。あるいは多
層分析要素（フィルムまたはシート）中に一般式〔１〕
で表わされるイミダゾール誘導体およびペルオキシダー
ゼを含有させ、その多孔性展開層に約６μＬから約１５
μＬの被検試料液、またはその定価積多孔性層に約１０
μｌ、から約３０μｍ、の範囲の一定量の被検試料液を
点着し、２０°Ｃから４０’Ｃ１好ましくは２５°Ｃか
ら４０°Ｃの範囲の温度で１分から２０分、好ましくは
２分から１０分の時間範囲でインクヘーションし多層分
析要素の光学濃度を反射分光測光する。吸光度または反
射光学濃度の測定方法はｅｎｄ　ｐｏｉｎｔ法およびｒ
ｅａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ法を適宜に選択して実施する
ことができる。

本発明の呈色試薬、呈色試薬組成物および多層分析要素
はアナライトとして微量の過酸化水素（または過酸化水
素を生成しうるアナライト）を含む試料の過酸化水素の
比色定量分析に特に有利である。

呈色試薬として一般式〔１〕で示されるイミダゾール誘
導体およびペルオキシダーゼのほかに、さらに酸化酵素
（オキシダーゼ）を組合わせることによって、より広い
範囲への応用が可能となる。

すなわち、最終的に定量すべき物質が酸化酵素の作用に
より過酸化水素を生成する場合に、酸化酵素を本発明の
試薬に組み合わせることによって、生成する過酸化水素
を定量して目的とする種々の物質を定量することが可能
になる。具体的には、尿および体液（例、血液）の中の
グルコース、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、
乳酸、タレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸ト
ランスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、タレアチンボ
スホキナーゼ、乳酸脱水素酵素などを測定することがで
きる。これらの測定に用いる酸化酵素としては、グルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、２コレステロールオキ
シダーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ、ピル
ビン酸オキシダーゼなどが挙げられる。これらの酸化酵
素はいかなる起源のものでもよい。

酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用によりＨ
ｚ　Ｏ２をあらかじめ生成させてもよいが、１１□０□
生成反応と発色反応を同時に進行させることが好ましい
。酸化酵素の使用量はその種類、目的とする基質、また
は混在物などに応じて適宜定められる。

本発明に用いられるペルオキシダーゼは過酸化水素によ
る水素供与体の酸化反応の触媒である。

ペルオキシダーゼとして特公昭５６−４５５９９、特公
昭５７−５５２０等に開示の植物起源および動物起源の
ペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１゜７）、および特開昭
５７−９９１９２等に開示の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（ＥＣ１，１１゜７）のうちから適宜に１種または
２種以上を組合せて用いることができる。

植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋わさび、
じゃがいも、いちじく樹液、かぷ、だいこんから抽出さ
れたペルオキシダーゼを、動物起源のペルオキシダーゼ
の例として、牛乳から抽出されたラクトペルオキシダー
ゼ、白血球から抽出されたヘルドペルオキシダーゼを、
微生物起源のペルオキシダーゼとしてＡｌｔｅｒｎａｒ
ｉａ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｃｕｒｖｕｌａ
ｒｉａ属、Ｐｅ１ｌｉｃｕｌａｒｉａ属に属し非特異的
ペルオキシダーゼ生産能を有する微生物起源のペルオキ
シダーゼを、それぞれあげることができる。

その他に特公昭５６　４５５９９、特公昭５７−５５２
０等に開示のチオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フユロシ
アン化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、クロム硫酸カ
リウム、沃化ナトリウム、沃化カリウム、モリブデン酸
アンモニウム、モリブデン酸カリウム等のペルオキシダ
ーゼ活性を有する無機化合物を用いることもできる。

これらのうちで植物起源または微生物起源の非特異的ペ
ルオキシダーゼが好ましい。

前述の式〔２〕の例にみられるように、ペルオキシダー
ゼの触媒作用のもとて一般式〔１〕で表わされるイミダ
ゾール化合物と過酸化水素とが化学量論に従って反応し
て色素を生成するので、試薬として一般式〔１〕で表わ
されるイミダゾール化合物とＨｚＯ□を組みあわせた呈
色試薬組成物、および両者を含む多層化学分析要素に活
性値が未知のペルオキシダーゼを含む試料を添加または
点着し生成する色素の光学濃度を測定することにより比
色法の原理により試料中のペルオキシダーゼ活性を分析
または定量することができる。この方法はペルオキシダ
ーゼを標識物質として用いた酵素免疫測定法に利用でき
る。

１０、明の多層分析要素およびその好ましい実施態様は
次のとおりである。

（１）光透過性水不透過性支持体の上に親水性ポリマー
バインダを含む層及び多孔性層がこの順に積層一体化さ
れてなる多層分析要素において、前記親水性ポリマーバ
インダを含む層又は前記多孔性層に前記一般式〔１〕で
表されるイミダゾール誘導体を含む呈色試薬組成物が含
有されている多層分析要素。

（２）前記呈色試薬組成物にさらにペルオキシダーゼ及
び過酸化水素を生成しうるオキシダーゼ酵素が含有され
ている（１）に記載の多層分析要素。

（３）前記多孔性層が多孔性展開層である（１）又は（
２）に記載の多層分析要素。

（４）前記多孔性層が定面積多孔性層である（１）又は
（２）に記載の多層分析要素。

（５）前記呈色試薬組成物が前記親水性ポリマーバイン
ダを含む層に含有されている（１）ないしく４）に記載
の多層分析要素。

（６）前記呈色試薬組成物が前記展開層に含有されてい
る（３）に記載の多層分析要素。

（７）前記呈色試薬組成物が前記定面積多孔性層に含有
されている（４）に記載の多層分析要素。

本発明の多層分析要素及び前記各態様の多層分析要素は
、特開昭５５−４６４３５６、特開昭５７−６６３５９
等に記載の織物展開層（例、ブロード、ボブリン等の平
織）を有する一体型多層分析要素、特開昭６０−２２２
７６９等に記載の織物展開Ｎ（例、トリコット編、ダブ
ルトリコット編、ミテニーズ組等）を有する一体型多層
分析要素、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ポリ
マー繊維パルプ含有抄造紙からなる展開層を有する一体
型多層分析要素、特公昭５３−２１６７７、米国特許３
，９９２，１５８等に記載のメンブランフィルタ（プラ
ッシュポリマ一層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミ
クロビーズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持
されてなる連続微空隙含有多孔性層等の非繊維等方的多
孔性展開層を有する一体型多層分析要素、特開昭５５−
９０８５９に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物質層）から
なる非繊維等方的多孔性展開層を有する一体型多層分析
要素、実開昭５７−４２９５１等に記載の定面積多孔性
層を有する一体型多層分析要素等の構成諸材料・諸成分
を用い、これらの諸特許明細書に記載の方法に従って製
造することができる。

これらのうちで酵素を少なくとも１種含む試薬組成物を
展開層中に含有保持させる態様においては、試薬組成物
を展開層中に含有保持させやすい点で織物展開層、編物
展開層に代表される繊維質展開層を有する一体型多層分
析要素が好ましい。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍ
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１、実開昭５６−１４２４５４、
特開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特
表昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて
化学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸
送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的
によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。すなわち約５μ！、から約３０μし、好ましくは８μ
Ｌから１５μＬの範囲の全血、血漿、血清、尿等の水性
液体試料部を展開層に点着し：、１分から１０分の範囲
で、約２０°Ｃから約４０°Ｃの範囲の実質的に一定の
温度で、好ましくは３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度
でインクヘーションし、要素内の発色を可視光の吸収極
大波長またはその近傍の波長の光を用いて光透過性支持
体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色
測定法の原理により液体試料中のアナライトの含有量を
求めることができる。点着する液体試料の量、インクヘ
ーション時間及び温度を一定にすることによりアナライ
トの定量分析を高精度で実施できる。測定操作は特開昭
６０−１２−５５４３、特開昭６０−２２０８６２、特
開昭６１−２９４．３６７、特開昭５８−１６１８６７
等に記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精
度の定量分析を実施できる。

本発明の呈色試薬、呈色試薬組成物、およびそれを含む
多層分析要素は人ばかりでなく種々の動物、例えば家畜
、愛玩動物などの尿、体液（例、血液）などの過酸化水
素または過酸化水素を生成しろるアナライトの分析にも
もちろん利用できる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に詳細に説明
する。

実施例１ （１）発色液の調整：化合物（１）１５ｍｇをアセトン
に溶解しペルオキシダーゼ５０００単位をｐＨ７゜５の
硼酸塩緩衝水溶液に溶解し全容を２５ｍＬになるように
して発色液を調製した。

（２）過酸化水素の定量二発色液３ｍＬを試料セルにと
り、濃度既知の過酸化水素２０μＩ、を加えて、ブラン
ク（過酸化水素水溶液のかわりに蒸留水を加えたもの）
を対照として３７°Ｃで１０秒後６９０波長ｎｍで吸光
度を測定し次の結果を得た。

実施例２ ゼラチン下塗り層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ポ
リエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの上に次
の成分からなる試薬層塗布液を塗し乾燥させた。

試薬層塗布液の成分（溶媒二適宜量の水）ウリカーゼ　
　　　　　　　　　１５００／ボ化合物（］）　　　　
　　　　　　　０．２ｇ／ボベルオキシダーゼ　　　　
　２５００Ｕ／ボゼラチン　　　　　　　　　　　１０
　ｇ／ｎ（ｐＨ８，５硼酸塩緩衝剤 調製された試薬層を水で湿潤させ、その上に多孔性展開
層としてセルロースアセテートメンブランフィルタ−（
平均孔径３．０μｍ、厚さ１８０μｍ）をラミネートし
て一体化させて尿酸定量用多層分析要素を調製した。

えられた多層分析要素を評価するために尿酸水溶液（濃
度６　；　１０　；　１２ｍｇ／ｄＬおよび尿酸不含の
ブランク溶液）の各１０μＬを多孔性展開層に点着し、
３７°Ｃで２分インクヘーションした後直ちにシアンフ
ィルターを備えたマクヘス反射分光光度計を用いてＰＥ
Ｔフ、イルム側から発色光度濃度を測定波長６９０ｎｍ
近傍で反射測光し、次の値をえた。

（濃度ｍｇ　／　ｄ　Ｌ　） ０（ブランク）　　　　　０．４３ ６　　　　　　　　　　　０．８０ １０　　　　　　　　　　　１．７７ １２　　　　　　　　　　　１．９に の結果から、この多層分析要素を用い、反射測光により
比色法によって尿酸濃度の定量を実施できることが明ら
かになった。

実施例３ ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ＰＥ
Ｔフィルムの上に次の成分からなる試薬層塗布液を塗布
し乾燥させた。

試薬層塗布液の成分（溶媒二適宜量の水）ウリカーゼ　
　　　　　　　　２００　Ｕ／ボ化合物（１）　　　　
　　　　　　０．２５ｇ／ポゼラチン　　　　　　　　
　　　１０ｇ／ポペルオキシダーゼ　　　　　３０００
Ｕ／ポオクチルフエノキシポリエ トキシエタノール （平均１０オキシエチレン 単位含有”）　　　　　　　　０．１５ｇ／ｒＩ′！９
Ｈ８，５硼酸塩緩衝剤 試薬層の上に次の成分からなる光反射層塗布分散液を塗
布し乾燥させた。

光反射層塗布分散液の成分（分散媒：適宜量の水） 二酸化チタン微粉末　　　　　　　３ｇ／ｎ（ゼラチン
　　　　　　　　　　　　Ｉｇ／ボオクチルフエノキシ
ボリエ トキシエタノール （平均１０オキシエチレン 単位含有）　　　　　　　　　０．１ｇ／ボ光反射層の
上にさらに次の成分からなる妨害物質排除層塗布液を塗
布乾燥させた。

妨害物排除面塗布液の成分（溶媒：適宜量の水）アスコ
ルビン酸オキシダーゼ ４０００　Ｕ／ｒｆｌ ゼラチン　　　　　　　　　　　　４ｇ／ｒｌ？オクチ
ルフェノキシポリエ トキシエタノール （平均１０オキシエチレン 単位含有）　　　　　　　　　０．１ｇ／ポｐＨ８，５
硼酸塩緩衝剤 ついで妨害物排除層を水で湿潤させておき、１００番手
の綿糸から織られたブロード布（水洗し脱脂された後乾
燥された布）をラミネートし一体化させて尿酸定量用多
層分析要素を調製した。

つい′で実施例２と同様にして既知の尿酸濃度に対する
多層分析要素の発色反射光学濃度値をえた。

（濃度ｍｇ　／　ｄ　１．） ０（ブランク）　　　　　０．２５ ６　　　　　　　　　　０．９３ １０　　　　　　　　　　１．１９ １２　　　　　　　　　　１．３６ 〔発明の効果〕 本発明のイミダゾール誘導体からなる呈色試薬は、いず
れも１モルの過酸化水素がら１モルの色素が生成し、そ
の分子吸光係数が６万以上であるので、血液や尿などの
生物体液中の成分、特に微量成分の定量分析を比色法の
原理により高感度で実施できる。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式〔１〕で表されるイミダゾール誘導体から
   なる呈色試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１はアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニ
   トロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−ＳＯ＿３Ｍ＾
   １基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基、置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基を表す。Ｍ＾１およびＭ＾２は
   それぞれアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンを
   表す。置換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基とし
   てはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ
   基、シアノ基、アルキルアミノ基又は（ジアルキルアミ
   ノ）基のいずれかで、置換基のなっていてもよい。 Ｒ＾２及びＲ＾３はそれぞれフェニル基、ナフチル基、
   置換フェニル基又は置換ナフチル基を表す。置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基の置換基としてはアルキル基、
   アルコキシ基、アルキルアミノ基、（ジアルキルアミノ
   ）基、（アルコキシアルキル）アミノ基又は〔ジ（アル
   コキシアルキル）〕アミノ基のいずれかで、置換基の数
   は１個ないし３個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 あるいはＲ＾２とＲ＾３は相互に連結してイミダゾール
   環の２個の炭素原子を含めて縮合６員環構造部分を形成
   してもよい。 Ｒ＾４はフェニル基、ナフチル基、置換フェニル基又は
   置換ナフチル基を表す。置換フェニル基又は置換ナフチ
   ル基の置換基としてはアルキル基、アルコキシ基、ハロ
   ゲン原子、ニトロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−
   ＳＯ＿３Ｍ＾１基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基
   （Ｍ＾１およびＭ＾２はそれぞれアルカリ金属イオン又
   はアンモニウムイオンを表す）のいずれかで、置換基の
   数は１個又は２個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。
2. （２）一般式〔１〕で表されるイミダゾール誘導体、ペ
   ルオキシダーゼ及び過酸化水素を生成しうるオキシダー
   ゼ酵素を含む呈色試薬組成物。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１はアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニ
   トロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−ＳＯ＿３Ｍ＾
   １基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基、置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基を表す。Ｍ＾１およびＭ＾２は
   それぞれアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンを
   表す。置換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基とし
   てはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ
   基、シアノ基、アルキルアミノ基又は（ジアルキルアミ
   ノ）基のいずれかで、置換基の数は１個又は２個で、置
   換基は互いに同じでも異なっていてもよい。 Ｒ＾２及びＲ＾３はそれぞれフェニル基、ナフチル基、
   置換フェニル基又は置換ナフチル基を表す。置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基の置換基としてはアルキル基、
   アルコキシ基、アルキルアミノ基、（ジアルキルアミノ
   ）基、（アルコキシアルキル）アミノ基又は〔ジ（アル
   コキシアルキル）〕アミノ基のいずれかで、置換基の数
   は１個ないし３個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 あるいはＲ＾２とＲ＾３は相互に連結してイミダゾール
   環の２個の炭素原子を含めて縮合６員環構造部分を形成
   してもよい。 Ｒ＾４はフェニル基、ナフチル基、置換フェニル基又は
   置換ナフチル基を表す。置換フェニル基又は置換ナフチ
   ル基の置換基としてはアルキル基、アルコキシ基、ハロ
   ゲン原子、ニトロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−
   ＳＯ＿３Ｍ＾１基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基
   （Ｍ＾１およびＭ＾２はそれぞれアルカリ金属イオン又
   はアンモニウムイオンを表す）のいずれかで、置換基の
   数は１個又は２個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。
3. （３）光透過性水不透過性支持体の上に親水性ポリマー
   バインダを含む層及び多孔性層がこの順に積層一体化さ
   れてなる多層分析要素において、前記親水性ポリマーバ
   インダを含む層又は前記多孔性層に一般式〔１〕で表さ
   れるイミダゾール誘導体を含む呈色試薬組成物が含有さ
   れていることを特徴とする多層分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１はアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニ
   トロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−ＳＯ＿３Ｍ＾
   １基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基、置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基を表す。Ｍ＾１およびＭ＾２は
   それぞれアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンを
   表す。置換フェニル基又は置換ナフチル基の置換基とし
   てはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ
   基、シアノ基、アルキルアミノ基又は（ジアルキルアミ
   ノ）基のいずれかで、置換基の数は１個又は２個で、置
   換基は互いに同じでも異なっていてもよい。 Ｒ＾２及びＲ＾３はそれぞれフェニル基、ナフチル基、
   置換フェニル基又は置換ナフチル基を表す。置換フェニ
   ル基又は置換ナフチル基の置換基としてはアルキル基、
   アルコキシ基、アルキルアミノ基、（ジアルキルアミノ
   ）基、（アルコキシアルキル）アミノ基又は〔ジ（アル
   コキシアルキル）〕アミノ基のいずれかで、置換基の数
   は１個ないし３個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 あるいはＲ＾２とＲ＾３は相互に連結してイミダゾール
   環の２個の炭素原子を含めて縮合６員環構造部分を形成
   してもよい。 Ｒ＾４はフェニル基、ナフチル基、置換フェニル基又は
   置換ナフチル基を表す。置換フェニル基又は置換ナフチ
   ル基の置換基としてはアルキル基、アルコキシ基、ハロ
   ゲン原子、ニトロ基、シアノ基、−ＳＯ＿３Ｈ基又は−
   ＳＯ＿３Ｍ＾１基、−ＣＯＯＨ基又は−ＣＯＯＭ＾２基
   （Ｍ＾１およびＭ＾２はそれぞれアルカリ金属イオン又
   はアンモニウムイオンを表す）のいずれかで、置換基の
   数は１個又は２個で、置換基は互いに同じでも異なって
   いてもよい。 Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。
4. （４）前記呈色試薬組成物にさらにペルオキシダーゼ及
   び過酸化水素を生成しうるオキシダーゼ酵素が含有され
   ている特許請求の範囲３に記載の多層分析要素。
5. （５）前記多孔性層が多孔展開層である特許請求の範囲
   ３又は４に記載の多層分析要素。
6. （６）前記多孔性層が定面積多孔性層である特許請求の
   範囲３又は４に記載の多層分析要素。
7. （７）前記呈色試薬組成物が前記親水性ポリマーバイン
   ダを含む層に含有されている特許請求の範囲３ないし６
   に記載の多層分析要素。
8. （８）前記呈色試薬組成物が前記展開層に含有されてい
   る特許請求の範囲５に記載の多層分析要素。
9. （９）前記呈色試薬組成物が前記定面積多孔性層に含有
   されている特許請求の範囲６に記載の多層分析要素。